Miguel A. Castro R.

El ADN y la Ingeniería genética

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Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten

manipular el genoma de un ser vivo.

• Producción de alimentos y bebidas• Obtención de medicamentos

• Clonación, mapas genéticos,• Organismos transgénicos, terapia génica

Biotecnología

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Ingeniería genética

BiotecnologíaUtilización de los seres vivos para

obtener productos útiles al ser humano

AlimentosMedicamentos

Bebidas

Tecnología del ADN

recombinante(década 70)

Si hay modificación de genes

Animales y plantas transgénicas

No hay modificación de genes

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Obtención de ADN

recombinante

Clonación de ADN PCR Secuenciación

de ADN

Técnicas utilizadas en Ingeniería genética

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Medicina• Diagnóstico de enfermedades• Medicina forense• Producción de medicamentos

Agricultura• Plantas resistentes• “Fábricas” de medicamentos

Ganadería• Mejora del rendimiento• Obtención de órganos• Obtención de medicamentos

Medio ambiente• Biorremediación• Biolixiviación

Aplicaciones de la ingeniería genética

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Genómica

• Estudio genoma• Estructural• Funcional

Proteómica

• Estudio de las proteínas de un organismo

Farmacogenética

• Fabricación de medicamentos personalizados

Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética

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Tecnología del ADN recombinante

1. Fragmentar y aislar el ADN2. Unión a vectores.3. Introducción en las células.4. Clonación5. Búsqueda del clon idóneo.6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,7. Secuenciación.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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Enzimas de restricción

1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida.

2. Las secuencias de corte son palindrómicas

3. El corte puede ser:

o Lisoo Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)

Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrán unir mediante otro enzima, una ADN ligasa

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ADN recombinante

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Formación de ADN complementario por hibridación

• Tenemos dos tipos distintos de ADN• Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).• Se devuelven las condiciones adecuadas y se

produce la renaturalización.• Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos

tipos de ADN

• El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo

• Estas técnicas permiten localizar enfermedades genéticas

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Síntesis de ADNc usando ARNm como molde

Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones

1. Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm. 2. La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los

intrones, y añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP. 3. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula. 4. Se hibrida un oligoncleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de

ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar.

5. Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G. 6. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando

la cadena de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc).7. Se sintetiza la doble cadena

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AAAAAA 3’5’TTTTTT 5’

AAAAAA 3’5’TTTTTT 5’3’

TTTTTT 5’3’

Transcriptasa inversaADNc

Degradación del ARN

Síntesis de la otra cadena de ADNADN polimerasa INucleasa S1

elimina el bucle

ADN de doble cadena

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Clonación de ADN

En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador.

Estos organismos deben cumplir las siguientes características:

1. Crecimiento rápido2. No debe ser patógeno3. Debe favorecer la entrada del transgén4. Debe ser muy bien conocido5. Debe ser fácilmente manipulable

Escherichia coli

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Vectores de clonación

• Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.

• Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. • Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del

fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

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Tipos de vectores de clonación

• Plásmidos• Virus bacteriófagos• Cósmidos• YAC’s (cromosomas artificiales de levadura)• Cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s)• Cromosomas artificiales humanos

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• Son moléculas de ADN bicatenario circular.

• Se localizan en las bacterias.• Tienen replicación independiente.• Genes propios (resistencias a

antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente

• Facilidad para la manipulación.• Puntos de corte específicos para

enzimas de restricción

Plásmidos

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• Virus que infectan bacterias• Incorporan material genético mediante el proceso de

transducción. • Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material

del antiguo huésped.

Bacteriófagos

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• Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago.

• Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético)

• Lleva varios genes de plásmidos• Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos)• Tiene varios sitios de restricción• Permite transportar grandes cantidades de ADN.

Cósmidos

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Son vectores de clonación de alta capacidad.

Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.

Cromosoma artificial de levadura

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Clonación de los fragmentos de ADN

1. Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos

2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido.3. Se mezclan los fragmentos.4. Obtención de plásmidos recombinantes.5. Se juntan los plásmidos con bacterias. 6. Incorporación de los plásmidos por transformación

bacteriana.7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico.8. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no

son resistentes).

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• Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.

• La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo.

• Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.

• Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc

Almacenamiento de genes clonados

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Identificación de clones

Una genoteca contiene muchos

clones

Hay que identificar el que nos interesa Sondas de ADN

Sondas de ADN

• Oligonucleótidos de cadena sencilla• Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la

secuencia de aminoácidos de la proteína• Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser

identificadas

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Una vez localizadas, las colonias que contienen el gen de interés se cultivan en grandes cantidades

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo.

La reacción es un proceso cíclico: 1. La molécula de ADN que va a copiarse se calienta

para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.

2. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas).

3. Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.

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* Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA).

* Elementos necesarios:

- DNA polimerasa - Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar - Mezcla de los 4 desoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) - Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidos trifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos)

Secuenciación del ADN

OHDesoxi nucleótido Didesoxi nucleótido(bloqueo de la síntesis de DNA)

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Aplicaciones de la PCR

Amplificación de:

• ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…• ADN obtenidos de la escena de un crimen

(medicina forense).• ADN de células embrionarias (diagnostico

prenatal de trastornos genéticos)• ADN de genes virales (en células infectadas

por virus difíciles de detectar, como el VIH)

Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

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Pasos de la secuenciación

1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación)

2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples)3. Mezcla de todos los componentes de la reacción4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un

ddNTP marcado5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.

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Materiales necesarios para la secuenciación

Obtención de cadenas de distinto tamaño

acabadas en un ddNTP*Separación de

fragmentos por tamaños e identificación por

color

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Identificación de genes codificadores de proteínas

Genes que interactúan entre sí

Comparación de genomas de distintas especies

El estudio de la genómica es el conocimiento del genoma completo y

de las interacciones entre los genes que lo forman.

objetivoGenómica

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Genómica

Conocimiento del genoma completo

Identificación de genes

Rastreo de secuencias de inicio de transcripción

Comparación con genes conocidos

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Genómica

Interacciones entre los genes del genoma

Genes que interactúan entre sí

La expresión de un gen afecta a otros y varía en función de las condiciones

La expresión del genoma se evalúa con chips de ADN

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Ensayo de micromatrices de ADN

Sirve para saber si un tejido normal presenta genes alterados que podrían provocar una enfermedad

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http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

Animación secuenciación genoma humano http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html#

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Estudios sistemáticos de las proteínas codificadas por el genoma de un

organismo.

Conjunto de proteínas de una célula, tejido o genoma completo

PROTEÓMICA

Proteoma

Proteómica

El conjunto de proteínas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en que son ellas las que desempeñan las actividades celulares

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Ingeniería genética y medicina

Obtención de productos farmacéuticos

Insulina

Hormona de crecimiento

Factor VIII de coagulación

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Obtención de productos farmacéuticos

Insulina

Hormona de crecimiento

Factor VIII de coagulación

1. Secuencia de la proteína (insulina)2. Síntesis de los ADN3. Obtención de plásmidos

recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina.

4. Expresión en E. coli5. Purificación y procesado químico6. Obtención de insulina activa

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Medicina forense

Huella genética

Marcadores genéticos

1. Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma.

2. Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas.

3. Estas zonas se usan como marcadores genéticos

4. Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southern blot)

5. La comparación de huellas genéticas permite resolver casos policiales.

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MÉTODO DE SOUTHERN BLOT

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Ingeniería genética y medicina

Terapia génica

Ex vivo

In vivo

In situ

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Ingeniería genética y agricultura

Obtención de plantas transgénicas

Resistencia a herbicidas

Mejora del producto

Plantas farmacéuticas

Se introduce un gen de E. coli que permite

usar mayores concentraciones de

herbicidas sin dañar a la planta de interés, y

eliminando malas hierbas.

Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos

(planticuerpos).

Se mejora el valor nutricional del

producto, por ejemplo añadiendo beta-caroteno al arroz

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Ingeniería genética y medio ambiente

Biorremediación Bioadsorción Biolixiviación

Uso de bacterias modificadas para degradar materia

orgánica (petróleo)

Obtención de metales a partir de minerales

de baja ley

Fijación de metales pesados a la superficie

de la célula para limpieza de suelos

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Ingeniería genética y ganadería

MEJORA DE RAZAS

PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS

ESTUDIO DE ENFERMEDADES

HUMANASObtener razas mas

resistentes, mas productivas, con mayor desarrollo, resistentes

a condiciones más difíciles

Se estudia la expresión de genes humanos en

organismos transgénicos

Se usan animales transgénicos.

Se pueden obtener sustancias de interés

como proteínas humanas para combatir

enfermedades:Enfisema hereditario

Factores de coagulación

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