Prof. Dra. Adriana DantasUERGS, Bento Gonçalves, RS

Mutação: Alteração no material genético Mutação: alteração na seqüência de DNA Alteração na seqüência altera no produto codificado

por algum gene Quando o gene para uma enzima sofre mutação, a

enzima codificada pelo gene pode se tornar inativa ou menos ativa, pois sua seqüência de aminoácidos foi alterada.

Mutação de uma região da proteína-codificação de um gene.

(Note que nem todas as mutações levam a proteínas alteradas e que nem todas as mutações são regiões que codificam proteínas)

Mapa de restrição de DNA

Kb 13 5 6 2 8

M1 M2

A

B

C

Kb 9 4 5 6 2 8

Kb 9 4 11 2 8

A B C

13

8

6 5

2

11

9

4

Duas mutações podem ser deduzidas Mutação 1 - novo sítio de restrição aparece no

fragmento 13 Kb, produzindo os fragmentos de 4 e 9 Kb

Mutação 2 - um sítio de restrição foi perdido na amostra C, causando o aparecimento de fragmentos 11 Kb e a perda dos fragmentos de 6 e 5 Kb

Estase x Evolução

A DNA polimerase é extremamente fiel (1 erro a cada 3 bilhões de bases)Os organismos vivos apresentam grande

variabilidade genéticaQual a fonte da imensa variabilidade da

vida?

O que são mutações? São alterações ou modificações súbitas,

espontâneas, em genes ou cromossomas, podendo acarretar variação hereditária.

As mutações podem ser gênicas quando alteram a estrutura do DNA, num determinado gene, ou cromossômicas quando alteram a estrutura ou o número de cromossomos.

O que provocam? As mutações são espontâneas e podem ser

silenciosas, ou seja, não alterar a proteína ou sua acção. Podem ainda ser letais, quando provocam a morte, ou ainda acarretar doenças ou anomalias.

As mutações também promovem a evolução já que determinam aumento na variabilidade genética.

Onde e como ocorrem? Por erros na replicação de DNA que antecede

uma divisão celular (mitose ou meiose).

Por erros relacionados com a individualização dos cromossomas, por exemplo no crossing-over, na separação de cromossomas ou de cromatídeos, durante uma divisão celular (meiose ou mitose)

Onde ocorrem? Nas células somáticas (durante a mitose)

refletindo-se nas células, desse indivíduo, descendentes da que sofreu a mutação (ex: tumores).

Na formação dos gâmetas (meiose) - células da linhagem germinativa - e serão transmitidas hereditariamente.

Classificação das mutações 1. Quanto a Origem: Espontâneas Induzidas

2. Quanto a Localização: Somáticas Germinativas 3. Quanto a Expressão Fenotípica:

Substituição silenciosa Sentido trocado

Sem sentido

Alterações no código genético As alterações podem ser desvantajosas ou mesmo

letal, se a célula perder uma característica fenotípica que ela necessite.

As mutações podem ser benéficas, se a enzima alterada codificada pelo gene mutante possuir uma atividade nova ou intensificada que beneficie a célula, provoca forma alternativa – alelo.

Muitas mutações são silenciosas (neutras), pois a alteração na seqüência do DNA não causa alterações na atividade do produto codificado pelo gene.

Mutações gênicas As mutações gênicas são responsáveis

por alterações nos genes e consequentemente nas proteínas, determinando, muitas vezes, a formação de novas proteínas ou alterando a ação de enzimas importantes no metabolismo.

Mutações gênicas Alteram a sequência de nucleotídeos de um

gene (alteram uma ou mais bases do DNA), o que afetará a leitura durante a replicação ou durante a transcrição.

Constitui-se assim um alelo, uma nova versão, do gene alterado: Subtituição de bases (transição, transversão) Adição ou deleção de bases

Tipos de mutações1. Substituição de nucleotídio a) Transições: substituição de pirimidina por

pirimidina ou purina por purina; b) Transversões: substituição de pirimidina por

purina ou vice-versa.2. Mudança de pauta de leitura a) Inserção de base b) Deleção de base

Malpareamento devido a mudanças tautoméricas

2. Base Análogas: DNA incorpora 5-BU no lugar da Timina

common rare

Changes T-A pair > C-G pair. T > C, and A > G are both Transitions

Formação de TA para CG Durante a replicação do DNA

Transition is a purine replaced by different purine or pyrimidinereplaced by different pyrimidine.

Erros na Replicação do DNA

Substituição de bases

ocorre a troca de um ou mais pares de bases.

Surge uma ou várias formas, chamadas, tautômeras, que são isomeros que diferem na posiçào de seus atomos e nas ligações entre eles.

Mutação expontânea (replicação)

Substituição de Bases Pode ocorrer vários tipos de trocas, as quais recebem

denominações especiais: Troca entre purinas (A, G) ou entre pirimidinas (C, T)

= TRANSIÇÃO Substituição de uma purina por uma pirimidina, ou

vice-versa = TRANSVERSÃO. Possibilidade de 4 diferentes transições e 8 diferentes

transversões.

AA C C

GG TT

TRANSIÇÃO

TRANSVERSÃO

AA C C

GG TT

TRANSIÇÃO

TRANSVERSÃO

Formas em equilibrio Forma ceto de cada base esta presente no DNA Formas imino e enol das bases são raras. Gera possiveis pareamentos errados, resulta em

mudanças tautoméricas. O mal pareamento também pode ocorrer quando uma

das bases torna-se ionizada.

Figura de bases malpareadas

Mutações gênicas Inserção e deleção

acontece quando uma ou mais bases são adicionadas ou removidas, respectivamente, ao DNA, modificando a sequência de leitura da molécula durante a replicação ou a transcrição.

Substituição de bases Base de mutação (ponto de mutação) Resulta mudança de aminoácido – mutação missense

Substituição de bases Única base em um ponto na seqüência de DNA é

substituída por uma base diferente Se a troca de bases ocorre dentro de um gene que

codifica uma proteína, o mRNA transcrito a partir de um gene transportará uma base incorreta naquela posição.

Se ocorre na terceira posição do códon do mRNA, devido a degeneração do código genético, o novo códon pode ainda resultar no mesmo aminoácido.

Mutação missense Quando o mRNA for traduzido em proteína, a base

incorreta poderá causar a inserção de um aminoácido incorreto na proteína.

A substituição de bases resulta em uma substituição do aminoácido na proteína sintetizada.

Mutação anti-senso Cria-se um códon de parada (anti-senso) no meio de

uma molécula de mRNA, as substituições de bases impedem efetivamente a síntese de uma proteína funcional completa.

Resulta num códon anti-senso

Mutação anti-senso

Mutação de troca de fase de leitura Mutação frameshift Um ou alguns pares de nucleotídeos são deletados ou

inseridos no DNA Altera a fase de leitura da tradução, no agrupamento de

três nucleotídeos reconhecidos como códons de tRNA durante a tradução.

Resulta numa longa seqüência de aminoácidos alterada e produção de proteínas inativadora do gene que sofreu a mutação até o encontro com um códon anti-senso.

Essas substituições de bases de troca de fase de leitura podem ocorrer espontaneamente durante a replicação do DNA.

Mutação de troca de fase de leitura Inserção ou deleção de um ou mais pares de

nucleotídeos

Mutações: considerações Quais são as causas de mutações espontâneas?

Replicação do DNA, bem como durante a fase G do ciclo celular Qual é a taxa de mutação espontânea por gene por geração de eucariontes?

04/10 a 4 x 10-6 por gene por geração Como é que a célula manter essa taxa tão baixa?

DNA polimerases de reparação e auto-correção Quais são os tipos de mutações podem resultar de erros de replicação de DNA

polimerase e durante qual fase do ciclo celular, isso pode acontecer? Quais são as fontes mais comuns de mutações espontâneas, e quais são as

conseqüências diretas de tais mudanças? Chemical depurinação, desaminação,

Descreva um ponto de mutação que ocorre mais freqüentemente em "hot spots mutacionais" de um genoma.

Citosina metilada é desaminado para produzir uma timina? Esta alteração não é detectada pelos sistemas de reparo?

Taxas de mutação As taxas de mutações espontâneas são extremamente baixas

em todos os organismos estudados;

Estas taxas variam consideravelmente dependendo do organismo;

Na mesma espécie estas taxas variam de gene para gene;

A taxa média de mutação espontânea é de cerca de 10-5.

Taxas de mutação espontânea em alguns organismos OrganismoOrganismo Taxa de mutaTaxa de mutaçção ão

espontâneaespontânea

Virus, BactVirus, Bactéérias, rias, NeurosporaNeurospora 1010-8-8 (uma em 100 milhões (uma em 100 milhões de divisões)de divisões)

Milho, Milho, DrosophilaDrosophila, Humanos, Humanos 1010-6-6 a 10 a 10-5-5 (entre uma em 1 (entre uma em 1 milhão a uma em 100 mil milhão a uma em 100 mil divisões)divisões)

CamundongosCamundongos 10-10-55 a 10- a 10-44 (entre uma em (entre uma em 100 mil a uma em 10 mil 100 mil a uma em 10 mil divisões)divisões)

Bases moleculares das mutações

1. Mudanças tautoméricas: alterações na estrutura química das bases (ceto-enol para Guanina e Timina e imino-amino para Citosina e Adenina);

2. Análogos de bases: substâncias químicas que podem substituir as purinas ou pirimidinas durante a síntese do DNA, como a 5-bromouracila (5-BrU) e a 2-aminopurina (2-AP);

Análogos de bases

3. Agente alquilantes: Ethylmethane Sulfonate (EMS) Alkylates Guanine

Note: changes a G-C pair into an A-T pair(G > A is a transition, C > T is a transition)

Another example: mustard gases first used in WWII.

4. Agentes intercalantes: intercalam-se entre as bases do DNA, produzindo uma distorção física, seguida de remoção e erro na reparação (proflavina, acridina orange).

Intercalantes: proflavina, acridina e brometo de etídio inseri-se entre as bases adjacentes em uma ou ambas as cadeias de dupla hélice do DNA fazendo-a relaxar

Durante a replicação, uma base extra deve ser inserida em frente ao agente (adiantamento)

Se ele se insere no novo DNA no lugar de uma base, em seguida, quando o DNA duplica o agente é perdido, resultando em uma supressão

Mutagênese sítio-específico, na geração in vitro de mutações específicas

Brometo de Etideo

5. Desaminação causada por ácido nitroso

Cromossomos de levedura visualizados com intercalação de brometo de etídio sob luz UV, após separação em gel por eletroforese de campo pulsado.

6. Radiação Ultravioleta causa dimeros de timina

260 nanometerwavelength

Disrupts synthesis;good for sterilizationof bacteria, bad for skin cancer.

What type of radiation does a tanning booth produce? Is it safe?Figure 7.10 Production of thymine dimers by ultraviolet light irradiation. The two components of the dimer are covalently linked in such a way that the DNA double helix is distorted at that position.

Mutation UV radiation causes

thymine dimers Light-repair

separates thymine dimers

Figure 8.20

Efeitos da radiação ionizante

Causa das mutações pontuais ou quebra nas ligações fosfodiéster da cadeia do DNA.

As células em divisão são mais sensíveis à terapêutica de raios-X que os não-divisão de células (terapia de radiação para câncer).

A radiação ionizante transforma átomos estáveis em radicais livres reativos e íons, que causam mutações no DNA

Mecanismos de reparo de DNA

• Prokaryotic:– Photoactivation Repair– Base Excision Repair– Post-replication Repair and SOS Repair

• Eukaryotic:– Nucleotide Excision Repair– Proofreading and Mismatch Repair– Double-Strand Break Repair

Photoactivation Repair in Prokaryotes

PhotoreactivationEnzyme Cleavesbond between T’s

UV

Visible light

Base Excision Repair in Prokaryotes

DNA glycosylase

Apyrimidinic endonuclease

DNA Pol I, DNA ligase

Nucleotide Excision Repair:Prokaryotes and Eukaryotes

DNA Pol I

DNA ligase

uvr nuclease

Fenômeno Epigenético

Qualquer atividade de genes que não envolve mudanças na seqüência do DNA (código genético) em que pode persistir por uma ou mais gerações.

Bases areNormallyIn the ketoForm—if inThe enol form;Base pairincorrectly

Figure 7.6 Normal Watson–Crick and non–Watson–Crick base pairing in DNA. (a) Normal Watson–Crick base pairing between the normal forms of T and A and of C and G. (b) Non–Watson–Crick base pairing between normal forms of pyrimidines and rare tautomeric forms of purines. (c) Non–Watson–Crick base pairing between rare tautomeric forms of pyrimidines and normal forms of purines.

Figure 7.7 Production of a mutation as a result of a mismatch caused by wobble base pairing. The details are explained in the text.

Figure 7.7 Production of a mutation as a result of a mismatch caused by wobble base pairing. The details are explained in the text.

Spontaneous Chemical Changes

Figure 7.9 (a) Deamination of cytosine to uracil. (b) Deamination of 5-methylcytosine (5mC) to thymine.

Mutações induzidas Quais são alguns exemplos de alguns agentes mutagênicos físico?

Radiação ou produtos químicos Porque são os tipos de mutações diferentes, quando causada por luz ultravioleta, em comparação com

radiação ionizante? ionizante produz íons quebrar ligações covalentes (por exemplo, açúcar-fosfato espinha dorsal, o efeito

é acumulativo) os anéis de absorver a luz UV e são alterados quimicamente formam dímeros TT

Quais são as conseqüências diretas da formação de um dímero de timina? Protuberância no DNA

Quais são as três classes gerais de mutagênicos químicos?análogos de base, base de modificar e intercalando

Em que partes do ciclo celular que essas diferentes classes de mutágenos se manifestam? análogos de base e trabalhar intercalando durante a replicação; base modificada a qualquer hora

Que tipo de mutação do análogos base induzir? tomar o lugar da base; transições

Que outros tipos de perturbações pode um efeito análogo de base? Um exemplo disso e como é usada medicinalmente?

O AZT é um análogo da T (replicação para) Quais são os três tipos de agentes modificadores da base de mutações que causam e quais são seus efeitos

diretos? Desaminação, Hidroxilação e Alquilação)

Figure 7.16 Nucleotide excision repair (NER) of pyrimidine dimer and other damage induced distortions of DNA.

Figure 7.17 Mechanism of mismatch repair. The mismatch correction enzyme recognizes which strand the base mismatch is on by reading the methylation state of a nearby GATC sequence. If the sequence is unmethylated, a segment of that DNA strand containing the mismatch is excised and new DNA is inserted.

Transposons Se dividem em duas classes gerais com relação a como eles

se movem.Uma classe de proteínas que codifica mover o elemento DNA diretamente para uma nova posição ou replicar o DNA. Encontrados em procariotos e eucarioto

A outra classe estão relacionados aos retrovírus na medida em que codifica uma transcriptase reversa para fazer cópias de DNA de seu RNA transcritos, que depois integrar em novos locais no genoma. Encontrado apenas em eucariotas.

Agentes mutagênicos

1. Físicos: Radiação UV, Radiação ionizante (raios X, raios g e raios cósmicos)

2. Químicos: Análogos de bases, agentes alquilantes

EMA DIZ BOM DIA

EMA DEMA DAAZ BOM DIAZ BOM DIAEMA DIZ BOEMA DIZ BOAA DIA DIAEMA DIZ BOM DIEMA DIZ BOM DIZZ

EMA IZB OMD IAEMA IZB OMD IA

DeleçãoDeleção

EMA EMA AADI ZBO MDI ADI ZBO MDI A

InserçãoInserção

Troca de uma letra

Perda de uma letra

Ganho de uma letra

Consequências das mutações

Ames Test (know this test and its controls)

The chemical Causes a reversionMutation in the bacteriaSo it now can growWithout histidine

Replica-plating technique to screen for mutant strains of a colony-forming microorganism.

How would youSelect for Trp-Auxotrophic mutant?(doesn’t make tryptophanRequires it)

Detecção do potencial mutagênico1. Teste de Ames

Utiliza linhagens especiais da bactéria Salmonella typhimurium. Uma linhagem detecta substituição de bases e outras detectam mudança de pauta de leitura.

Teste de Ames