Produção e controle de qualidade de vacinas

Universidade Federal da Bahia

Instituto de Ciências da Saúde

Departamento de Biointeração

Tecnologia do Desenvolvimento de Vacinas

PatógenoPatógeno

CulturaAtenuaçã

oPurificação Ag

Inativação

Vacina

“Semente”

Cultura

Vacina

Inativação

Vacina Purificação

Vacina

Processamento primário

(Up-stream)

Processamento primário

(Up-stream)

Etapas na produção de vacinas

SELEÇÃO DA LINHAGEM VACINAL (I)

Padronização da linhagem “semente”

Uma vez que a semente candidata foi selecionada…

Antígenos devem passar por testes de identidadeAvaliação da sua aplicabilidade no produto final

Níveis satisfatórios quando cultivados em ovos embrionados ou culturas celulares (vírus)

Estabiliade antigênica após passagens em meios de cultura, e pelos processos de inativação e purificação

Crescimento de microrganismos

“Bulk production” - produção a granel ou em escalaCultivo do microrganismo em um fermentador equipado

com controle de parâmetros como temperatura, pH, oxigênio dissolvido, etc.

Crescimento dos Mos ao

nível máximo

Cultura “Batch” ou fechada (Bac)

MO cresce em um ambiente fechadoTodas matérias primas são adicionadas

ao fermentador ao início e então o MO é inoculado.

O sistema é mantido fechado (uma semana), até que tenha havido o consumo dos nutrientes e geração dos produtos de interesse.

O fermentador é esvaziado e o material é posteriormente separado.

Cultura contínua (Bac)

Crescimento de Mos em sistema aberto

Cultura contínua mantém os Mos em

crescimento por tempo indeterminado.

Pode ser aplicado se:

Nutrientes frescos são continuamente

fornecidos

Células acumuladas e produtos / dejetos são

removidos na mesma taxa

Cultivo celular para vírus (I)

Cultivo celular é um processo complexo através do qual células crescem sob condições controladas, geralmente fora do seu ambiente natural

Cultura primária (menos utilizada) Células cultivadas diretamente dos tecidos hospedeiros (humano ou

animal) e podem ser subcultivadas por apenas 1 ou 2 vezes. Ex. Cultura primária de células renais de macacos

Animais SPF

Cultura secundária São derivadas de tecidos fetais humanos e podem ser subcultivadas por até

20 - 50 vezes. Fibroblastos diplóides (MRC-5)

Cultivo celular para vírus (II)

Linhagens celulares contínuas Um tipo celular que pode ser propagado indefinidamente em cultura Ex. Células Vero, Hep2

Seleção da linhagem celular: Linhagem de acordo com o “Sistema de Lotes de sementes” Histórico da linhagem celular obtida (origem, numero de passagens em

cultivo, meios de propagção…) Linhagem capaz de multiplicar o vírus em grandes quantidades,

rapidamente, eficiente na expressão das moléculas virais, e aplicável a outros tipos virais

Células deve sem primeiramente checadas – aparância, taxa de crescimento, contaminação, mycoplasmas

Propagação do cultivo celular (I)

Em sistemas de microcarreadoresCélulas dependentes de ancoragem e crescimento em superfícies

sólidas (microcarreadores, microesferas)Células crescem recobrindo as microesferas uniformementeGrande superfície – área/volumeMaiores densidades celulares

Propagação do cultivo celular (II)

Cultivo em suspensãoCélulas que não dependem de aderência para o crescimentoHomogenização contínuaSistema fácil, sem limites de volume para a escala industrial

Ovos embrionados para vírus

Ovos de origem certificada, SPFPode ser aplicado para diferentes vírusAtualmente, utilizado para vírus da Influenza Confecção de um orifício na casca entre 5 a 14 dias após

fertilizaçãoIncubação a 33 ° C por 2-3 dias, testes de viabilidade dos ovos e

recuperação do fluido alantóideo

Regiões de aplicação viral

Herpes simplex virusPox virusRous sarcoma virus

Herpes simplex virusPox virusRous sarcoma virus

Influenza virusMumps virusInfluenza virusMumps virus

Herpes simplex virusHerpes simplex virus

Influenza virusMumps virusNew castle disease virusAvian adenovirus

Influenza virusMumps virusNew castle disease virusAvian adenovirus

Recuperação e purificação viral

Após propagação viral….

Recuperação das células infectadasPurificação das partículas viraisInativação (calor , formalina, Triton X-100)Purificação de subunidades

Métodos empregados: Centrifugação Filtração Cromatografia

Para vacinas inativadas / Mos mortos

Inativação QuímicaBeta-propiolactona (Lo Grippo, 1960; Gard, 1960).Formalina (Weil & Gall, 1940; Kim & Sharp, 1967).

Inativação por Solventes e detergentes (S/D)

Vírus envelopados

Detergente tipicamente utilizado: Triton-X 100.

Inativação Térmica (Calor) : 56°C por 30 minutos.

Inativação por Luz UV: Dimerização de timinas – vírus DNA

Processo de produção da vacina inativada

Bakker et al., 2011

Fig. 1. Schematics of the inactivated polio vaccine production process. During upstream processing cells are expanded using two pre-culture steps prior to cell culture and virus culture. The downstream processing consists of clarification, concentration, size exclusion chromatography and ion exchange chromatography followed by inactivation. To obtain trivalent polio vaccine this procedure is followed for each polio virus type separately prior to mixing for end product formulation.

Formulação da vacina

A formulação da vacina ocorre pela adição dos adjuvantes, estabilizantes, conservantes, caso necessários.

Componente Função Exemplo Examplos de vacinas

Adjuvantes Melhorar a resposta imune a uma vacina

Sais de alumínio

Diphtheria-pertussis-tetanusDiphtheria tetanus (DT)DT combinada com Hepatite B (HBV)Haemophilus influenza BPolio virus inativado (IPV)Hepatite A (HAV)

Conservantes Prevenir contra contaminações bacterianas e fúngicas

Timerosal Diphtheria-tetanus-pertussis acelular (DTaP)Hepatite B,Haemophilus influenza type B (Hib).

Componente

Função ExemploExemplo de

vaacinas

Estabilizantes Proteção contra condições adversas, congelamento, descongelamento, aquecimento, mantendo a potência da vacina

Gelatina, Glutamato Monossódico (MSG)

17D Febre Amarela, Raiva,Varicela

Resíduos do processo de fabricação

Agentes inativadores

Antibioticos – prevenir contra contaminação bacteriana das culturas

Fluidos de suspensão de microrganismos

Formaldeído

β-propiolactona

Glutaraldeido

Neomycin, Streptomycin, Polymyxin B

Proteínas dos ovos

Proteínas de leveduras

Influenza virus, Poliovirus, Diphtheria and Tetanus toxins.

Rabies virus

Acellular pertussis

DTaP-IPV/Hib

Influenza, MMR

Influenza and yellow fever vaccines

Vacina Hepatitis B

Controle de qualidade e liberação de lotes

Testes finais para a liberação do produto para comercialização

Teste Função do teste

Esterilidade Demonstrar que não existem microrganismos vivos no produto

Pureza / Segurança

Demonstrar que doses elevadas não proporcionam riscos à saúde

Toxicidade residual

Demonstrar que o produto não possui substâncias que proporcionem riscos

Potência / Eficácia

Demonstrar que os antígenos do produto se enquadram em padrões internacionalmente reconhecidos (quantidade e proteção)

Reversão da atenuação

Emvacinas vivas, demonstrar que o microrganismo não apresenta virulência em passagens em aniamis de laboratório

Interferência antigênica

Em produtos com 2 ou mais componentes antigênicos, demonstrar que não há interferência de componentes individuais na resposta protetora dos outros componentes

Controle de qualidade

X

Garantia da qualidade