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• Coleta• Intercâmbio• Quarentena• Identificação• Caracterização• Conservação• Educação• Valoração• Documentação• Uso
ATIVIDADES INERENTES À QUARENTENA
Cultivo
in vitro
Inspeção Fitossanitária
Remessa
Detecção por PCR
Inspeção
Plantas daninhas
Conservação
Fiel depositário
Manejo cultural
em quarentena
Quarentena
Introdução
INFRA DO COMPLEXO IAC
QUARENTENÁRIO
LABORATÓRIOS
SERVIÇOS
Expurgosementes
Sala de abertura
Coordenação Intercâmbio e quarentena
Desinfecçãodo solo
Câmara friasêca
Casa de vegetação
Sementes daninhas
Vírus
PCRPatologia de
sementes
Insetos Fungos
Ácaros
Nematóides Bactérias
In vitro
Secretaria intercâmbio
Secretaria quarentena
Tese Elisa
Microscopia Eletrônica
Plantas Indicadoras
Cultura in vitro
ATIVIDADES DA COMISSÃO DE QUARENTENA DO IAC
PARTE I
EQUIPE E ATIVIDADES
COMITÊ DE QUARENTENA DO IAC
•COORDENAÇÃO GERAL: Renato Ferraz de Arruda Veiga e Christina Dudienas
•• COORD.TÉC./SECRETARIA: Miriam Aparecida
Bonatto e Murilo do Canto Batista Alves
• CONTATO DFA / AMOSTRAGEM: Murilo do Canto Batista Alves, Moacir Moises, Lucas Storer.
EQUIPE DO QUARENTENÁRIO IAC
INSPEÇÃO QUARENTENÁRIA• BACTÉRIAS: sintomatologia em plântulas, germinação em
papel toalha, meios seletivos e isolamento direto (SCHAAD,1982);
• FUNGOS: exame direto, plaqueamento em meio de cultura e papel filtro. Tratamentos consecutivos para limpeza (NEEGARD, 1973 e 1978; TUITE, 1969);
• INSETOS: exame de presença de ovos, vestígios de ataque e do próprio inseto vivo, em sala a prova de insetos;
• NEMATÓIDES: trituração, peneiramento em funil de Baermann, bem como flutuação para extração de cistos (JENKINS, 1964; BYRD et al.,1966).
• PLANTAS DANINHAS: exame visual de presença de sementes e plantio para identificação taxonômica;
• VÍRUS: sintomatologia de plântulas, serologia, uso de plantas indicadoras, microscópio eletrônico, cultura de meristema, caracterização genética (KITAJIMA, 1965; OUTCHERLONY, 1968; HAMPTON et al., 1978).
15-12-1988
• PORTARIA DG-15 – CRIA O SISTEMA DE INTRODUÇÃO E QUARENTENA DE
PLANTAS E A COMISSÃO DE QUARENTENA DE PLANTAS DO IAC
Em plantas vivas (enraizadas e material propagativo): o exame em estereomicroscópio de folhas ou outras partes com sintomas, para exame em laboratório. Isolamento de material suspeito em gaiolas, placas de Petri ou outro recipiente adequado até eclosão de larvas ou emergência de adultos.- Em sementes e grãos: exame sob microscópio estereoscópio e manutenção de amostras em recipientes adequados para observação de possível emergência de insetos, ácaros ou outros artrópodos.- Em substratos utilizados para plantio: exame direto sob microscópio estereoscópio e manutenção de amostras em recipientes adequados para observação de possível emergência de insetos, ácaros ou outros artrópodos.- A identificação taxonômica: o organismo detectado é preparado/conservado de acordo com as técnicas preconizadas ao grupo ou ao estágio de desenvolvimento (larva, pupa, adulto etc) (Vanzolini & Papavero 1967; Pastrana 1985, Borror et al. 1992, Almeida et al. 1998) e a identificação, onde o organismo será enviado a especialista do grupo para correta identificação.
Em plantas vivas (enraizadas e material propagativo): o exame em estereomicroscópio de folhas ou outras partes com sintomas, para exame em laboratório. Isolamento de material suspeito em gaiolas, placas de Petri ou outro recipiente adequado até eclosão de larvas ou emergência de adultos.- Em sementes e grãos: exame sob microscópio estereoscópio e manutenção de amostras em recipientes adequados para observação de possível emergência de insetos, ácaros ou outros artrópodos.- Em substratos utilizados para plantio: exame direto sob microscópio estereoscópio e manutenção de amostras em recipientes adequados para observação de possível emergência de insetos, ácaros ou outros artrópodos.- A identificação taxonômica: o organismo detectado é preparado/conservado de acordo com as técnicas preconizadas ao grupo ou ao estágio de desenvolvimento (larva, pupa, adulto etc) (Vanzolini & Papavero 1967; Pastrana 1985, Borror et al. 1992, Almeida et al. 1998) e a identificação, onde o organismo será enviado a especialista do grupo para correta identificação.
INSETOSESPECIALISTAS: André Luiz Lourenção e Edson Possidônio Teixeira
PLANTAS DANINHASEspecialistas: Waldemir Peressin e Maria
do Carmo de Santos Soares Novo
• Exame através de estereomicroscópio, em amostras tomadas de todos os recipientes (sacos, pacotes, caixas, etc.) e colocadas em placas de vidro.
• Em caso de dúvidas quanto à presença de propágulos nas amostras examinadas, o material é colocado para germinar, em substratos adequados.
• Caso seja detectada a praga procede-se a sua identificação taxonômica, através da forma, tamanho, coloração, textura e a superfície do tegumento ou pericarpo, assim como a presença ou ausência de aristas das sementes.
MICOLOGIAEspecialistas: Christina Dudienas e João
José Dias Parisi • Identificação direta: planta hospedeira com sintomas (lesões) com esporos do
fungo quarentenário, realiza a identificação no estereomicroscópio ótico. Já se for sem esporos do fungo quarentenário, colocar em câmara úmida, constituída de caixa gerbox contendo papel de filtro umedecido com água esterilizada, incubado por 24-48 h
• O isolamento em meio de cultura: isolar o fungo da planta hospedeira, obtendo-se assim uma cultura do mesmo para identificação (apenas patógenos não obrigados), efetua-se o corte do tecido infectado (zona de transição sadio/doente) da planta hospedeira. Desinfecção do tecido com álcool seguido de imersão em solução de hipoclorito de sódio a 1%, por 1,5 minutos. Plaqueamento destes pedaços de tecido em placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata Dextrose Ágar) e incubação em câmara com controle de temperatura, por 4-7 dias.
• No caso de sementes com fungos sem esporulação, estes serão cultivados em meios de cultura mais específicos e incubados em presença de luz branca, para indução de esporulação e posterior identificação. Isolamento de fungos quarentenários de solo ou substratos diversos (turfa, vermiculita, etc.). Pesagem de amostra de 1g do material a ser analisado. Colocação do material em tubo de ensaio contendo 9ml de água destilada esterilizada e agitação por 1 minuto. Diluição em série, até 10-5 e plaqueamento em meio de cultura (meio de Martim e BDA). São plaqueados 0,1ml da suspensão por placa (3 placas por diluição), com incubação em câmara com controle de temperatura, por 4-7 dias. Posterior avaliação (contagem do no de colônias).
PATOLOGIA DE SEMENTESEspecialistas: Margarida Fumiko Ito e João José
Dias Parisi
1) Papel de filtro (“blotter test”): sementes são distribuídas, em número variável (dependendo do tamanho da amostra), eqüidistantes entre si, sobre três folhas de papel de filtro, previamente umedecidas em água destilada e esterilizada e contidas em recipientes como placas de Petri. As sementes são incubadas por 7 ou 8 dias à 20 °C a 22 °C, sob fotoperíodo de 12 horas, utilizando-se luz fluorescente de 40 watts. Identificação dos fungos: em sementes realizada após a incubação, examinando-se, individualmente, todas as sementes em estéreomicroscópio, com aumento de cinqüenta vezes e identificação de lâminas em microscópio composto.
2) Plaqueamento em Agar: sementes em placas de Petri contendo meio de BDA (batata 20g, dextrose 20g, agar 15g a 17g, água destilada 1.000 mL), eqüidistantes entre si e mantendo distância suficiente para não haver contaminação. Para este procedimento utiliza-se a câmara de fluxo laminar e o número de sementes por placa é variável, em função do tamanho da semente. Antes do plaqueamento, as sementes são submetidas a um pré-tratamento com solução de hipoclorito de sódio a 1%, que tem por finalidade a assepsia superficial, para evitar o crescimento de saprófitas contaminantes. A incubação, idem ao método do papel de filtro. Identificação dos fungos: observação das colônias sobre as sementes ou meio de cultura, pela forma, tamanho e coloração. A identificação dos patógenos é complementada pelo exame das estruturas fúngicas em lâminas, ao microscópio.
1) Papel de filtro (“blotter test”): sementes são distribuídas, em número variável (dependendo do tamanho da amostra), eqüidistantes entre si, sobre três folhas de papel de filtro, previamente umedecidas em água destilada e esterilizada e contidas em recipientes como placas de Petri. As sementes são incubadas por 7 ou 8 dias à 20 °C a 22 °C, sob fotoperíodo de 12 horas, utilizando-se luz fluorescente de 40 watts. Identificação dos fungos: em sementes realizada após a incubação, examinando-se, individualmente, todas as sementes em estéreomicroscópio, com aumento de cinqüenta vezes e identificação de lâminas em microscópio composto.
2) Plaqueamento em Agar: sementes em placas de Petri contendo meio de BDA (batata 20g, dextrose 20g, agar 15g a 17g, água destilada 1.000 mL), eqüidistantes entre si e mantendo distância suficiente para não haver contaminação. Para este procedimento utiliza-se a câmara de fluxo laminar e o número de sementes por placa é variável, em função do tamanho da semente. Antes do plaqueamento, as sementes são submetidas a um pré-tratamento com solução de hipoclorito de sódio a 1%, que tem por finalidade a assepsia superficial, para evitar o crescimento de saprófitas contaminantes. A incubação, idem ao método do papel de filtro. Identificação dos fungos: observação das colônias sobre as sementes ou meio de cultura, pela forma, tamanho e coloração. A identificação dos patógenos é complementada pelo exame das estruturas fúngicas em lâminas, ao microscópio.
VÍRUSEspecialistas: Valdir Atsushi Yuki e José Alberto Caram de Souza
Dias
• (a) Teste de sintomatologia: baseada nas reações das plantas sob inspeção, das plântulas delas originadas, das plantas indicadoras de vírus e nas comparações com as descritas na literatura especializada, incluindo o círculo de hospedeiras;
• (b) Teste de transmissibilidade: efetuada por inoculação mecânica. A aplicabilidade desses métodos depende exclusivamente das características vegetativas de cada espécie vegetal, das propriedades intrínsecas dos vírus quanto a transmissibilidade e da maior ou menor capacidade de as plantas exibirem sintomas à infecção por vírus;
• (c) Teste Eliza: é aplicado quando existe a sorologia para os fungos que se deseja detectar.
• (a) Teste de sintomatologia: baseada nas reações das plantas sob inspeção, das plântulas delas originadas, das plantas indicadoras de vírus e nas comparações com as descritas na literatura especializada, incluindo o círculo de hospedeiras;
• (b) Teste de transmissibilidade: efetuada por inoculação mecânica. A aplicabilidade desses métodos depende exclusivamente das características vegetativas de cada espécie vegetal, das propriedades intrínsecas dos vírus quanto a transmissibilidade e da maior ou menor capacidade de as plantas exibirem sintomas à infecção por vírus;
• (c) Teste Eliza: é aplicado quando existe a sorologia para os fungos que se deseja detectar.
NEMATÓIDESEspecialistas: Carlos Eduardo Rossi e Wallace
GonçalvesNa extração de formas livres no solo: a) O método de centrifugação de Jenkisn, que combina o peneiramento e flotação
centrífuga. Tem a vantagem de permitir a extração de estágios ativos e não móveis. b) O método de funil de Baermann é amplamente utilizado com o inconveniente de
extrair apenas nematóides com boa mobilidade. Para nematóides grandes do tipo dos gêneros Longidorus e Xiphinema, o método de peneiramento e catação individual é o mais indicado.
Na extração de cistos (Heterodera e Globodera), a amostra deve ser parcial ou totalmente seca ao ar. Isso pode ser feito espalhando-se a terra em bandejas ou, se os sacos forem porosos, as amostras podem ser deixadas em local onde haja ventilação constante. As seguir as amostras, com 100 cm3, devem ser destorroadas e peneiradas (peneira de 24 e 60 mesh) e o material retido na peneira 60 é examinado em microscópio estereoscópico, sobre discos de papel de filtro branco.
A extração de nematóide, em estacas enraizadas, pode ser uma extração direta onde pequenas porções de tecidos são examinadas utilizando-se um estereomicroscópio. Na extração de formas ativas e móveis as técnicas mais utilizadas são as de extração de Baermann e incubação de Young, embora os métodos de maceração-peneiramento ou centrifugação, trituração em liquidificador e peneiramento sejam os mais eficientes, pois removem os nematóides independentemente da sua atividade. Em extração de formas sedentárias utiliza-se a lavagem direta em peneiras largas (32 mesh) e estreitas (325 mesh) concomitantemente e, quando necessário, outros métodos tais como maceração e peneiramento, maceração e flotação centrífuga, são utilizados. Para extração de ovos de Meloidogyne utiliza-se do método de Hussey & Barker, 1973.
Na extração de formas livres no solo: a) O método de centrifugação de Jenkisn, que combina o peneiramento e flotação
centrífuga. Tem a vantagem de permitir a extração de estágios ativos e não móveis. b) O método de funil de Baermann é amplamente utilizado com o inconveniente de
extrair apenas nematóides com boa mobilidade. Para nematóides grandes do tipo dos gêneros Longidorus e Xiphinema, o método de peneiramento e catação individual é o mais indicado.
Na extração de cistos (Heterodera e Globodera), a amostra deve ser parcial ou totalmente seca ao ar. Isso pode ser feito espalhando-se a terra em bandejas ou, se os sacos forem porosos, as amostras podem ser deixadas em local onde haja ventilação constante. As seguir as amostras, com 100 cm3, devem ser destorroadas e peneiradas (peneira de 24 e 60 mesh) e o material retido na peneira 60 é examinado em microscópio estereoscópico, sobre discos de papel de filtro branco.
A extração de nematóide, em estacas enraizadas, pode ser uma extração direta onde pequenas porções de tecidos são examinadas utilizando-se um estereomicroscópio. Na extração de formas ativas e móveis as técnicas mais utilizadas são as de extração de Baermann e incubação de Young, embora os métodos de maceração-peneiramento ou centrifugação, trituração em liquidificador e peneiramento sejam os mais eficientes, pois removem os nematóides independentemente da sua atividade. Em extração de formas sedentárias utiliza-se a lavagem direta em peneiras largas (32 mesh) e estreitas (325 mesh) concomitantemente e, quando necessário, outros métodos tais como maceração e peneiramento, maceração e flotação centrífuga, são utilizados. Para extração de ovos de Meloidogyne utiliza-se do método de Hussey & Barker, 1973.
BACTÉRIASEspecialistas: Luís Otávio Saggion Beriam e
Christina Dudienas
• Coleta do material suspeito: o material é macerado e semeado em meios de cultura específicos para ocorrer o crescimento e desenvolvimento da bactéria.
• Taxonomia: Da bactéria isolada e purificada faz-se a sua identificação, através da realização de vários testes bioquímicos, fisiológicos e sorológicos. Realizados os testes conhecidos e rotineiros, determina-se o patógeno quanto ao gênero e espécie.
•Haiko Enok Sawazaki•Carlos Augusto Colombo
ANÁLISES POR PCR
RETIRA DE SEIVA DOS INTERNÓDIOSFaze os testes a partir de DNA extraído de folhas.Colocar um internódio de cana dentro de um tubo Falcon 50 mL;Centrifugar os tubos a 4.000 g por 2 min.;Retirar o internódio do tubo e coletar, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, a seiva do
fundo do tubo;Transferi a seiva (~300 µL/internódio) para um tubo eppendorf e armazenar em banho
de gelo até o processamento ou congelar a -20ºC por tempo indeterminado.
RETIRA DE SEIVA DOS INTERNÓDIOSFaze os testes a partir de DNA extraído de folhas.Colocar um internódio de cana dentro de um tubo Falcon 50 mL;Centrifugar os tubos a 4.000 g por 2 min.;Retirar o internódio do tubo e coletar, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, a seiva do
fundo do tubo;Transferi a seiva (~300 µL/internódio) para um tubo eppendorf e armazenar em banho
de gelo até o processamento ou congelar a -20ºC por tempo indeterminado.
QUARENTENA IN VITRO
1. manipulação das plântulas: Se necessário acordamos com a empresa importadora para que esta disponibilize um técnico com prática no manejo de plantas in vitro com a cultura, durante o período do in vitro e da aclimatação em quarentena.
2. Análises de diagnóstico fitossanitário: Ao chegar, o material in vitro será inspecionado para a detecção de insetos, vírus, fungos e bactérias. Para material in vitro inspeções de plantas daninhas e nematóides normalmente não se aplicam.
3. As plântulas são inspecionadas e amostras avaliadas nos laboratórios de fitopatologia e virologia.
4. Estão previstas análises moleculares específicas, e de alta sensibilidade, para detecção de vírus e bactérias das patologias mais importantes, para determinadas espécies como exemplo a cana-de-açúcar.
1. manipulação das plântulas: Se necessário acordamos com a empresa importadora para que esta disponibilize um técnico com prática no manejo de plantas in vitro com a cultura, durante o período do in vitro e da aclimatação em quarentena.
2. Análises de diagnóstico fitossanitário: Ao chegar, o material in vitro será inspecionado para a detecção de insetos, vírus, fungos e bactérias. Para material in vitro inspeções de plantas daninhas e nematóides normalmente não se aplicam.
3. As plântulas são inspecionadas e amostras avaliadas nos laboratórios de fitopatologia e virologia.
4. Estão previstas análises moleculares específicas, e de alta sensibilidade, para detecção de vírus e bactérias das patologias mais importantes, para determinadas espécies como exemplo a cana-de-açúcar.
Antonio Fernando Caetano Tombolato e Luiz Carlos da Silva Ramos
PARTE II
• FLUXOGRAMA DO QUARENTENÁRIO
INSPEÇÃO PÓS-PLANTIO
3 meses = anuais6 meses = perenes a partir da recepção
1 mês a partir da recepção
FIM
FLUXOGRAMA(Centro de Fitossanidade + Centro Experimental Central + Centro de Ecofisiologia
e Biofísica + Centro de Cana + Centro de Café + Instituto Biológico)
a) Solicitação do aceite do IAC, enviado pela empresa;
b) Emissão do aceite pelo IAC;
c) Efetivação do Pedido de Importação, pela empresa interessada.
a) Deferimento do pedido de importação;b) Termo de Fiscalização;c) A Prescrição de Quarentena;d) Dado número de controle;e) Aviso ao importador.
a) Abertura em sala à prova de insetos;b) Se in vitro – segue para o laboratório.c) Check list.
a) Dar numeração IAC (I);b) Dar no. ano de chegada no quarentenário;c) Cadastro Intranet no programa IAC.
a) Chamados os especialistas em: Nematologia, Entomologia, Patologia de Sementes, Plantas daninhas, que emitem seu boletim de análise;
c) Germoplasma é guardado na Câmara Fria, como Fiel depositário;
d) Definido o Expurgo do material, se recomendado pelos especilistas.
a) Se possuir + de 100 acessos, são feitas amostras compostas (bulk) a cada 10 acessos.
a) Preparo do solo;b) Identificação dos vasos;c) Amostragem;d) Plantioe) manejo e irrigação.
INSPEÇÃO PÓS-PLANTIO
a) Inspeção em Folhas expandidas; b) Boletim de Análises: contendo a metodologia empregada e resultado obtido, observações,e recomendações, pelos especialistas em - Fitopatologista, Virologista, Entomologista e Bacteriologista.
a) Plantas: podem ser incineradas ou autoclavadas;b) Substratos: Tratados com Fosfina;
c) Vasos: Tratados com Hipoclorito de Sódio a 2,4%;d) Salas: Pulverizadas com Piretrinas e/ou Piretroides.
a) Laudo de Inspeção (Li): Após liberação dada pelos especialistas.b) Laudo de Eliminação (Le): Emitido, em conjunto com o Li.
3 meses = anuais6 meses = perenes2 meses = in vitro
OBRIGADO!
