CRITÉRIOS PARA ESCOLHA DE TESTESDE IMUNODIAGNÓSTICO:

NA BANCADA E NO LABORATÓRIO CLÍNICO

RICARDO WAGNER DIAS PORTELA, DVM PhDLABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA E BIOLOGIA

MOLECULARINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

UFBA

COM TANTAS TÉCNICAS DIFERENTES, E COM MUITAS DELAS DESTINADAS A DIAGNOSTICAR AS MESMAS PATOLOGIAS, QUAIS ESCOLHER? EM QUE SE BASEAR NA HORA DE RECEITAR OU UTILIZAR NA ROTINA LABORATORIAL?

1- INTRODUÇÃO

1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:-Especificidade-Diversidade-Memória-Especialização-Autolimitação-Não reatividade ao próprio

1- INTRODUÇÃO

1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:-Especificidade – conferida por duas moléculas principais:

- TCR – presente na membrana de linfócitos;

- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.

1- INTRODUÇÃO

1.2- Principais isotipos de anticorpos-IgM-IgG-IgA-IgE-IgD

1- INTRODUÇÃO

1.2- Principais isotipos de anticorpos:-IgMIgM-IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade-IgAIgA-IgEIgE-IgDIgD

1- INTRODUÇÃO

1.2- Principais isotipos de anticorpos:-IgMIgM-IgG – MARCADOR DE CONTATO DO INDIVÍDUO COM O AGENTE INFECCIOSO-IgAIgA-IgEIgE-IgDIgD

Testes sorológicos

Detecção de anticorpos específicos no soro, produzidos por um

indivíduo após contato com agente infeccioso

Anticorpo – marcador de infecção

Somente produzido após contato com o Antígeno – RI Adaptativa

Estrutura dos Isotipos de Anticorpos:

Os diferentes isotipos de Acs apresentam estruturas variadas

IgM- Neutralizam toxinas

- Fixam o complemento-Receptor de antígenos na superfície dos Linf. B-Marcador de fase aguda de doenças infecciosas

IgG- Quatro subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4

- neutralizam toxinas (todos)- fazem opsonização (IgG1 e IgG3)

- fixam complemento (IgG1, IgG2 e IgG3)- são os únicos que podem atravessar a placenta (IgG2)

IgA- neutralizam toxinas

- bloqueiam a ligação de antígenos nas mucosas-Apresentam-se na forma dimérica

IgE-Levam a degranulação de mastócitos e basófilos.-Participam da imunidade contra helmintos-Participam das reações de Hipersensibilidades

Características dos Isotipos de Anticorpos:

Características dos Isotipos de Anticorpos:

Características dos Isotipos de Anticorpos:

Principais Características dos Ensaios deImunodiagnóstico:

-Especificidade

-Sensibilidade

-Repetitividade

-Reprodutibilidade

-Limite de Detecção

-Linearidade

ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE

-Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado.

-Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas.

ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE

-Especificidade: Importante principalmente quando aplicada a doenças infecciosas.

Doenças de notificação obrigatória – confere a certeza sobre o status infeccioso do paciente ou, no caso animal, evitando sacrifícios desnecessários e prejuízos.

Importante para um correto controle sanitário de rebanho, evitando a introdução de animais infectados e a disseminação da doença.

OBRIGATÓRIA ALTA ESPECIFICIDADE EM TESTES CONFIRMATÓRIOS

ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE

-Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada

-Quanto MAIOR a sensibilidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-negativos, MAIOR a possibilidade de detecção precoce de doenças.

-Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.

ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE

-Sensibilidade: Importante característica que se aplica principalmente a doenças infecciosas, marcadores tumorais e hormônios encontrados em baixa concentração.

Um kit de alta sensibilidade permite a detecção precoce de patologias, levando a um tratamento mais efetivo e mais rápido, melhorando o prognóstico do paciente.

ALTA SENSIBILIDADE OBRIGATÓRIA EM TESTES DE TRIAGEM

Curso do Processo Infeccioso:Parasitemia / Viremia / Bacteremia

Curso da Infecção:Concentração de Anticorpos e Número de

Linfócitos T Efetores

ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE

-Exemplos Práticos:

Ensaio com boa especificidade e baixa sensibilidade

Interpretação dos Resultados:

Resultado + - Confiável

Resultado - - A confirmar

ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE

-Exemplos Práticos:

Ensaio com alta sensibilidade e média especificidade

Interpretação dos Resultados:

Resultado + - A confirmar

Resultado - - Confiável

CUSTO DO ENSAIO

+

SENSIBILIDADE / ESPECIFICIDADE

=

RELAÇÃO CUSTO / BENEFÍCIO

ADEQUAÇÃO DA AMOSTRA

- As amostras disponíveis são compatíveis com a metodologia a ser empregada/proposta

- AMOSTRA NÃO É SÓ SORO:Urina

FezesLíquido Céfalo-raquidiano

SêmenLágrima

Saliva

- O perfil dos componentes das amostras podem interferir nos testes, p. ex. as enzimas da saliva, as bactérias das fezes...

Um teste sorológico pode ser qualitativo, semi-quantitativo ou quantitativo:

- qualitativo, se os seus resultados informam apenas sehouve ou não reação / detecção (positivo ou negativo).

Veja um laudo imaginário: Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra rubéola

Resultado: positivo

- semi-quantitativo, se a amostra testada (soro) foi diluída –a maior diluição a apresentar reação é o seu título.

Veja um laudo imaginário:Teste – detecção por imunofluorescência de anticorpos IgG contra o T. cruzi

Resultado: positivo até a diluição de 1:320

- quantitativo, se é capaz de informar a quantidade absoluta do material detectado.Veja um laudo imaginário:

Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra o T. gondiiResultado: 63 UI/ml

Cont. negativoCut-offCont. positivo

Resultado de um teste ELISA

Esta placa será lida por um fotocolorímetro, que informará os valores de den-sidade ótica.

Todos aqueles que apresentarem resultados abaixo do “cut-off” serão considerados negativos, enquanto que os que mos-

trarem valores maiores, serão positivos.

Trata-se portanto de um teste qualitativo

Hemoaglutinação PassivaTeste semi-quantitativo

Sorostestes

controle positivocontrole negativo diluições seriadas dos soros testes

de 1: 2 a .................. 1:1024

Na primeira fileira (de cima para baixo), a reação foi positiva até adiluição de 1:32 . Já na segunda fileira o resultado foi negativo em todas as

diluições.O resultado do primeiro soro teste acima referido é: reagente até a

diluição de 1:32 (ou título:1:32). O segundo soro teste é não reagente.

A maior ou menor sensibilidade e especificidade de um teste sorológico depende de qual é a sua finalidade.

- Para diagnóstico - é necessário a utilização de testes mais específicos. Nestes casos, é importante que sejam evitados

os testes falso-positivos.

- Para triagem em Banco de Sangue (ou outras finalidades similares)– os testes são usados com fins preventivos, ou seja, a função é prevenir a contaminação do receptor. Aqui busca-se evitar os testes falso-negativos (a repetição de um teste com resultado falso-positivo custa pouco, entretanto, a disseminação da doença em conseqüência de um resultado falso-negativo, tem que ser impedida a todo custo).

O QUE LEVAR EM CONTA NA HORA DE ESCOLHER O MÉTODO DE DIAGNÓSTICO?

-Sensibilidade;

-Especificidade (confiabilidade de resultados);

-Custo (PRIMORDIAL NA MED. VETERINÁRIA);

-Disponibilidade de material;

-Segurança;

-Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser

detectado e espécie animal a ser analisada;

-Tempo de realização do método.

Utilização de ensaios sorológicos:

Definição da suspeita clínica

Diferenciação de fases da doença

Diagnóstico de doença congênita

Triagem sorológica em banco de sangue

Seleção de doadores e receptores de órgãos para transplante

Prognóstico da doença

Avaliação / monitoramento da terapêutica

Diferenciação da imunidade naturalmente adquirida ou artificialmente

induzida

Estabelecimento da prevalência da doença

Verificação de erradicação da doença

Verificação de reintrodução de novos casos em áreas consolidadas

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

HISTÓRICO

CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM

ANTICORPOS

VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.1- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar)

- Diversos tipos:- Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente;

- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

Método qualitativo empregado para doenças infecciosas e autoimunes – Baixa Sensibilidade, boa especificidadeUsado antigamente para diagnóstico sorológico de

Brucelose, e algumas doenças viraisEM DESUSO

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

Método quantitativo empregado para dosagem de moléculas presentes em alta quantidade em amostras, por

exemplo, dosagem de Imunoglobulinas Totais.Baixa Precisão, baixa sensibilidade

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.2- Imunodifusão:-Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado

-Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.

-- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos.

- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac;- Variações no método: Inibição da Aglutinação.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

Método qualitativo e semi-quantitativo empregado para detecção de anticorpos específicos e moléculas

abundantes em membranas de células.Utilizado ainda em Med. Veterinária, apesar de impreciso.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.3- Hemoaglutinação:- Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido;

- Desvantagens: Baixa sensibilidade e média especificidade, devido a mau armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac.

-Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.4- Fixação do Complemento:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.4- Fixação do Complemento: -Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo;

-Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor;

-Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

Outros componentes do soro

ELISA “SANDWICH”

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Anticorpo conjugado

TMB

Enzima Peroxidase

ELISA DE COMPETIÇÃO

Outros componentes do soro

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Antígeno biotinilado

TMB

ST-AV- Peroxidase

ELISA DE CAPTURA

Anticorpo anti-IgM

IgM a ser detectada

IgM inespecífica

Antígeno biotinilado

TMB

ST-AV- Peroxidase

ELISA INDIRETA

Antígeno purificadoIgM a ser detectada

IgM inespecífica

Anticorpo conjugado

TMB

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA:- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio.

- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA:- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio.

- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA:- Método Quantitativo de melhor relação custo/benefício em veterinária, para quantificação de hormônios (sexuais, tireoidianos, hipofisários, metabólicos...)

- Método de triagem para detecção de doenças infecciosas, alta sensibilidade, alta especificidade, mas podendo apresentar resultados falso-positivos, que devem ser confirmados por outros ensaios.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos (IF Direta) e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos (IF Indireta)

- Métodos de alta especificidade e boa especificidade

- Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC)

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:- Vantagens: Alta especificidade e boa sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular.

- Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas

- Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido

- Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot:

Pode auxiliar na diferenciação de espécies de Leishmaniaque infectam o animal

Diferenciação do animal infectado do vacinado(dependendo do tipo de vacina)

2.7- Western-Blot:- Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes;

- Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.

POUCO DISPONÍVEL AINDA PARA VETERINÁRIA

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

Métodos de Diagnóstico utilizando

Avanços Biotecnológicos no Brasil

-Leishmaniose canina – PCR, RFLP.

-Babesia canis, Ehrlichia canis – RFLP, RAPD.

-Leishmaniose – Citometria de Fluxo, Ags específicos

-Animais de Produção – Busca de diagnóstico rápido e

preciso, podendo ser realizado a campo.

SITUAÇÃO DA BIOTECNOLOGIAANIMAL NO BRASIL:

MERCADO BIOTECNOLÓGICO ANIMAL:

Mercado brasileiro de vacinas: US$ 221 milhões (2006)

Principalmente animais de produção, com participação de animais de companhia

MERCADO EM FRANCA EXPANSÃO

Não há dados disponíveis quanto ao diagnóstico veterinário

Colaboradores:

Prof. Vasco Azevedo – ICB/UFMG

Profa. Maria de Fátima Costa – ICS/UFBA

Prof. Luis Pita – EMEV/UFBA

Dr. Rodrigo Soares – CPqRR/FIOCRUZ-MG

Dr. Lain Pontes-Carvalho – CPqGM/FIOCRUZ-BA

Prof. Joaquin Patarroyo – DVT/UFV

Doutorandos:

Bruno Bastos

Soraya Correa

Mestrandos:

Daniele Dantas

Miriam Rebouças

Gabrielle Rodrigues

Ítala Fehlberg

Inara Rodrigues

Marcos Silva

Andrea Magalhaes

Osman Silva Jr.

Patrícia CisneirosIniciação Científica:

Ana Paula Portela

Marilia Marques

Jose Tadeu Raynal

Ludmila Sena

Aretha Alves

Rejane Rodrigues

Pesquisadores:

Prof. Roberto Meyer

Dra. Songeli Freire

Profa. Lilia Moura Costa

Profa. Vera Vale

Prof. Ricardo Portela

Dr. Edson Rodrigues

Profa. Kyioko Abe-Sandes

Profa. Ivana Nascimento

www.labimuno.org.br