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Cromatografia Líquida
Analítica V: Analítica V: Aula 10
ATENÇÃOATENÇÃO À SEQUENCIA DAS PRÁTICAS:À SEQUENCIA DAS PRÁTICAS:
Prof. Rafael SousaDepartamento de Química Departamento de Química -- ICEICErafael.arromba@ufjf.edu.brrafael.arromba@ufjf.edu.br
Notas de aula: www.ufjf.br/baccanNotas de aula: www.ufjf.br/baccan
Para a Prática de 08/11 cada grupo deverá trazer: Para a Prática de 08/11 cada grupo deverá trazer: -- um pacote de um pacote de M&MM&M (embalagem marrom, de 104 g)(embalagem marrom, de 104 g)-- um par de luvas de procedimentoum par de luvas de procedimento
CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA LÍQUIDALÍQUIDA (C(CLL))
KromaKroma = cor= cor
em Inglêsem Inglês
GregoGregoGraphiaGraphia = escrever= escrever
1903 1903 –– 1906:1906:M M TsweetTsweet coloriu uma coluna de CaCOcoloriu uma coluna de CaCO33 com uma com uma
mistura de pigmentos vegetaismistura de pigmentos vegetais
GregoGrego
Início da cromatografia
CaCO3 (s)
Éter de petróleo(solvente)
Mistura de Mistura de substânciassubstâncias((amostraamostra))
Diferentes interaçõesDiferentes interações
Mistura de substâncias coloridas foi separada Mistura de substâncias coloridas foi separada ((carotenocaroteno , , clorofilaclorofila e e xantofilaxantofila ))
CaCO3 (s)
(adsorvente)Tempo
Diferentes interaçõesDiferentes interaçõesAdsorvente / solvente
PrincípioInteração diferenciada dos componentes da amostra com umaInteração diferenciada dos componentes da amostra com uma
FASE ESTACIONÁRIA FASE ESTACIONÁRIA e uma e uma FASE MÓVEL FASE MÓVEL
sólidosólidoou
líquidolíquido
líquidolíquidoougásgás
CromCrom. líquida (CL). líquida (CL)
Crom. gasosa (CG)
SólidoSólido
líquido sobre líquido sobre um sólidoum sólido
FASEFASEESTACIONÁRIAESTACIONÁRIA
CONFIGURAÇÃOCONFIGURAÇÃOEXPERIMENTALEXPERIMENTAL
PLANARPLANAR
COLUNACOLUNA
Ex de interação analito - FE
Equilíbrio FE Equilíbrio FE –– FM (FM (partiçãopartição na na cromcrom. Líquido. Líquido--líquido)líquido)
�� Diferente para as substâncias diferentesDiferente para as substâncias diferentesPolaridade
Tamanho
Cromatografia planar
Suporte da FE: papel especial OU Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente divididosólido finamente dividido
FM (capilaridade) FM (capilaridade) �� separaçãoseparação
�� Fácil realizaçãoFácil realização�� Análises quali e Análises quali e quantitativasquantitativas
�� Baixo custoBaixo custo�� BaixasBaixas
-- Resolução Resolução ee-- RepetibilidadeRepetibilidade-- ReprodutibilidadeReprodutibilidade
Cromatografia em coluna
Convencional Convencional (Clássica)(Clássica)
SolventeSolvente
Fase estacionáriaFase estacionária
Líquida de alta eficiência Líquida de alta eficiência (CLAE)(CLAE)
Fase estacionáriaFase estacionária
Suporte inerteSuporte inerte
-- Colunas verticais (FM Colunas verticais (FM -- gravidade)gravidade)-- Análises quali e quantitativasAnálises quali e quantitativas-- Baixo custoBaixo custo-- Baixa Baixa frequênciafrequência-- Desempenho regularDesempenho regular
-- Colunas e FM Colunas e FM –– altas pressõesaltas pressões-- Análises quali e quantitativasAnálises quali e quantitativas-- Desempenho analítico satisfatórioDesempenho analítico satisfatório-- Rapidez analítica, automaçãoRapidez analítica, automação-- Custo elevado ...Custo elevado ...
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
-- Amplamente utilizadaAmplamente utilizada-- Dentre as modalidade mais importantesDentre as modalidade mais importantes-- Vem se desenvolvendo desde a década de 70Vem se desenvolvendo desde a década de 70
NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTANÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTANÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTANÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA
�� Necessidade de calibraçãoNecessidade de calibração
RESULTADO : Amostras RESULTADO : Amostras xx PadrõesPadrões((cromatogramacromatograma))
Subdivisões da CLAE
�� Tipo de FE (Tipo de FE (MECANISMOMECANISMO de separação)de separação)
Cromatografia líquidoCromatografia líquido--sólido: sólido: CLCLSS�������� FE é um FE é um sólidsólid o (adsorção)o (adsorção)
Cromatografia líquida de fase ligada: Cromatografia líquida de fase ligada: CLCLFLFL��FE é um FE é um líquido ligado quimicamentelíquido ligado quimicamente a um suporte sólidoa um suporte sólido
(partição)(partição)
Cromatografia líquidoCromatografia líquido--líquido: líquido: CLCLLL�������� FE é um FE é um líquidolíquido que recobre um sólido (partição) que recobre um sólido (partição)
Cromatografia por exclusão: Cromatografia por exclusão: CECE
�� FE é um gel que recobre um sólido com FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controladaporosidade controladaAplicação importante: análise de polímeros (GPC)
Cromatografia de troca iônica: Cromatografia de troca iônica: CTICTI
�� FE sólida contém grupos NRFE sólida contém grupos NR33++ (para (para
troca aniônica) ou grupos SOtroca aniônica) ou grupos SO33-- (para (para
troca catiônica)troca catiônica)Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)
Cromatografia por afinidade: Cromatografia por afinidade: CACA
�� FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivaFE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivacom com proteínaproteína s e s e anticorposanticorpos
Cromatografia quiral: Cromatografia quiral: CQCQ
�� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirFE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagir�� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirFE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirseletivamente com seletivamente com compostos quiraiscompostos quirais
PARA CASAPARA CASA :
Pesquisar Pesquisar duasduas substâncias que são determinadas por substâncias que são determinadas por CACA e e duasduas que o são por que o são por CQCQ
Separação e Sinal analítico
FMFM
FMFM
FMFM
FMFM
FMFM
FM + componente separadoFM + componente separadoFMFM FM + componente separadoFM + componente separado
CromatogramaCromatograma
Tempo de retençãoTempo de retenção
Sin
alS
inal
Entendendo o cromatograma
Diferentes espécies Diferentes espécies �� SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: trtr(tr= tempo de retenção � medida em função do tempo)medida em função do tempo)
aspartame
be
nza
ldeí
do
Resposta do detector
Resposta do detector
saca
rin
a
be
nza
ldeí
do
InformaçõesInformaçõesqualiquali eequantitativasquantitativas
Tempo de retençãoTempo de retenção
Resposta do detector
Resposta do detector
Muita interaçãoPouca interação
Análise quantitativa
Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picosQuantidades iguais de substâncias diferentes geram picoscromatográficos com áreas diferentescromatográficos com áreas diferentes
�������� Necessidade de calibração:Necessidade de calibração:
�Relaciona-se as áreas dos picos com as concentraçõe s
� Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES
Configuração instrumentalComponentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta
eficiência:
Reservatóriode FM
Colunacromatográfica
Detector
Registrador
�� CCada componente: função no processo analíticoada componente: função no processo analítico
Sistema de bombeamento
de FM
Válvula deamostragem
Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento
ReservatórioReservatóriode FMde FM
Válvula deVálvula deamostragemamostragem
ColunaColunacromatográficacromatográfica
DetectorDetector RegistradorRegistrador
frasco de frasco de plástico plástico
ououvidrovidro
FMFMÁguaÁgua
++Solvente(s) Solvente(s) orgânico(s)orgânico(s)
nn--hexanohexanoAcetonitrilaAcetonitrilaMetanolMetanolMetilMetil--tt--butilbutil--éteréterClorofórmioClorofórmioDiclorometanoDiclorometanoTetrahidrofuranoTetrahidrofuranoTetrahidrofuranoTetrahidrofurano22--propanolpropanol
eliminação deeliminação departículas maiorespartículas maiores
que 5 que 5 µmµm
retirada de gasesretirada de gasesDissolvidosDissolvidos
UltrasomUltrasomouou
BorbulhamentoBorbulhamento gases inertesgases inertes
USOUSO(preparação diária)(preparação diária)
CUIDADOSCUIDADOS
Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento
ReservatórioReservatóriode FMde FM
Válvula deVálvula deamostragemamostragem
ColunaColunacromatográficacromatográfica
DetectorDetector RegistradorRegistrador
�� Impulsionar a Impulsionar a FMFM para dentro da coluna com para dentro da coluna com vazão constante vazão constante e e reprodutívelreprodutível
� BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
Composição constanteComposição constante(eluição ISOCRÁTICA)(eluição ISOCRÁTICA)
Composição variávelComposição variável(eluição por GRADIENTE)(eluição por GRADIENTE)
Bomba de seringaBomba de seringa
Bomba pneumáticaBomba pneumática
Amostras complexasAmostras complexasCompostos de polaridade
muito diferente
Bomba recíprocaBomba recíproca
Proporção doProporção doSolvente mais polarSolvente mais polar
Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento
ReservatórioReservatóriode FMde FM
Válvula deVálvula deamostragemamostragem
ColunaColunacromatográficacromatográfica
DetectorDetector RegistradorRegistrador
ExEx : Bomba recíproca (: Bomba recíproca (uma das mais usadasuma das mais usadas))
Para coluna
DesvantagensDesvantagens ::
Vazão pulsada Vazão pulsada �� amortecedoramortecedorCavitação (bolhas) devido à compressãoCavitação (bolhas) devido à compressão
Vantagem:Vantagem:
Mudança da fase móvelMudança da fase móvel
Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento
ReservatórioReservatóriode FMde FM
Válvula deVálvula deamostragemamostragem
ColunaColunacromatográficacromatográfica
DetectorDetector RegistradorRegistrador
Dispositivo de aço Dispositivo de aço inoxidável com inoxidável com uma alça de amostragem uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na colunaque permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna
ALÇA ALÇA TROCÁVEL TROCÁVEL �������� Volumes de 2 a 1000 µL
Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento
ReservatórioReservatóriode FMde FM
Válvula deVálvula deamostragemamostragem
ColunaColunacromatográficacromatográfica
DetectorDetector RegistradorRegistrador
Coluna Coluna �������� tubo de aço inoxidável tubo de aço inoxidável �������� separaçãoseparação
Capacidade: Capacidade: dimensõesdimensões
ФФi= 1 i= 1 –– 20 mm20 mm
L= 3 L= 3 –– 25 cm25 cm
FEPartículas com Partículas com ФФ na faixa de na faixa de µmµmUso de partículas pequenasUso de partículas pequenas���� melhor separação (aumenta N)
+
FM
DUAS DUAS COMBINAÇÕESCOMBINAÇÕES
Fase reversa Fase reversa
Fase normalFase normal
FE apolar (baixa polaridade)FE apolar (baixa polaridade)FM polar FM polar
FE polarFE polarFM apolar (baixa polaridade) FM apolar (baixa polaridade)
EFICIÊNCIA DA COLUNA EFICIÊNCIA DA COLUNA �������� RESOLUÇÃO RESOLUÇÃO
�� REPRESENTAÇÃOREPRESENTAÇÃO: N: N“Número de pratos teóricos”
trtr2 2
Determinada pelo nDeterminada pelo noo de etapas de equilíbrio entre o soluto na de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FMFE e o soluto na FM
Sin
al d
o de
tect
orS
inal
do
dete
ctor
N = N = 16 16 trtr
WW
�� Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separaçãoQuanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação
�� Não implica em rapidez ! (Não implica em rapidez ! (Altura do prato (H): Altura do prato (H): H= L / NH= L / N))
Sin
al d
o de
tect
orS
inal
do
dete
ctor
Tempo de retenção Tempo de retenção
Detecção dos componentes conforme saem da colunaDetecção dos componentes conforme saem da coluna
�UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA
���� Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE)
Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento
ReservatórioReservatóriode FMde FM
Válvula deVálvula deamostragemamostragem
ColunaColunacromatográficacromatográfica
DetectorDetector RegistradorRegistrador
-- Que respondem à concentraçãoQue respondem à concentração�������� sinal proporcional à concentraçãosinal proporcional à concentraçãoEx: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluoresc ência
MAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEISMAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEIS
-- Que respondem à massa Que respondem à massa �������� sinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de temposinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de tempoEx: Detectores eletroquímicos e de condutividade el étrica
MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADI ENTEMAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADI ENTE
Considerações práticas
�� Várias configurações instrumentais podem ser empreg adasVárias configurações instrumentais podem ser empreg adas
determinação de vários tipos de substâncias(mesmo em amostras complexas )
sistema à alta pressão: sistema à alta pressão: checar vazamentoschecar vazamentos
As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamAs condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamno resultadono resultado
para minimizar os erros experimentais pode-se utiliza r padrõesinternos
(substância com características físico-químicas sem elhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida )
Questões
11-- DescrevaDescreva osos componentescomponentes básicosbásicos dede umum equipamentoequipamento parapara cromatografiacromatografia líquidalíquidadede altaalta eficiênciaeficiência (CLAE)(CLAE) ee explique,explique, brevemente,brevemente, aa funçãofunção dede cadacada umum delesdeles..
22-- OsOs cromatogramascromatogramas X,X, YY ee ZZ referemreferem--sese aa umauma misturamistura dede compostoscompostos presentespresentes ememanalgésicosanalgésicos ee foramforam obtidosobtidos emem umauma mesmamesma coluna,coluna, masmas utilizandoutilizando fasesfases móveismóveisdiferentesdiferentes ee emem modomodo isocráticoisocrático (X(X:: 7070%% MeOHMeOH// 3030%% HAcHAc;; YY:: 6060%% MeOHMeOH// 4040%% HAcHAc;;ZZ:: 4040%% MeOHMeOH// 6060%% HAcHAc)).. ConsiderandoConsiderando essasessas informações,informações, respondaresponda qualqual éé oocompostocomposto maismais polarpolar ee qualqual dasdas fasesfases móveismóveis vocêvocê utilizariautilizaria parapara fazerfazer essaessa mesmamesmaseparaçãoseparação..
X Y Z
Referências
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Collins,Collins, CC.. HH..,, Braga,Braga, GG.. LL..,, BonatoBonato,, PP.. SS..FundamentosFundamentos de de CromatografiaCromatografia11aa eded..,, EditoraEditora UNICAMPUNICAMP:: Campinas,Campinas, 20062006
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