Carlos@centrodegenomas.com.br Setembro/2004 Real Time PCR

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Real Time PCR

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O Que é?

• Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots.

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Tipos

• SYBR Green

• TaqMan/FRET

• Molecular Becons

• LUX

• Scorpions

• outros

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Vantagens

• Rápida ciclagem• Alto Throughput• Baixo risco de contaminação• Muito sensível• Larga faixa dinâmica• Reprodutibilidade• Quantificável• Não é mais caro que PCR convencional

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PCR

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Química da fluorescência

SYBR GreenSYBR GreenTaqManTaqMan

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TaqMan Atividade 5’-Nuclease

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Atividade da Taq

5’ nuclease5’ nucleaseSínteseSíntese

Nucleotídeo

Taq 5’ 3’

Direção da síntese

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A Atividade 5’-Nuclease não altera a PCR

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TaqMan utiliza FRET

Fluorescent Resonant Energy TransferFluorescent Resonant Energy Transfer

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TaqMan usa uma Probe Fluorescente

Reporter

Quencher

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Taq Extende do Primer Upstream

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A atividade 5’-Nuclease digere a Probe

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Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação

Número de ciclosNúmero de ciclos

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SYBR Green I

Corante Minor GrooveCorante Minor GrooveBinding.Binding.

Sem probe; Custo mais baixoSem probe; Custo mais baixoque TaqManque TaqMan

Não aceita multiplex.Não aceita multiplex.

Menos que 0.5Menos que 0.5g de DNAg de DNAna amostra.na amostra.

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Especificidade

TaqManTaqMan

Alta especificidade, inerenteAlta especificidade, inerente a química.a química.

SYBR GreenSYBR Green

Baixa especificidade. Espec. Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve”observada apenas no “Melt Curve”

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PCR quantitativo

Expressão gênicatransgênicosQuant. CâncerQt patógenos

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Fases da PCR

Log [DNA]Log [DNA]

# ciclos# ciclos

GeométricaGeométrica

PlateauPlateauLinearLinear

Gel EtBrGel EtBr

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0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1600000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBER

AMOUNT OF DNA

110

1001000

10000100000

100000010000000

1000000001000000000

10000000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBER

AMOUNT OF DNA

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000

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Fase geométrica

y = 2y = 2XX

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Problemas nas fases linear e plateau

Fase linearFase linear Efeito PlateauEfeito Plateau

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PCR Qt tradicionais

Uso de competidores Uso de competidores

Compartilha mesmos primers.Compartilha mesmos primers.

Compartilhar mesmas condições.Compartilhar mesmas condições.Competidor = tamanhos diferentes.Competidor = tamanhos diferentes.

Métodos radio / ELISA.Métodos radio / ELISA.

Gráfico conc.Gráfico conc.Limite de número de ciclos.Limite de número de ciclos. ..

.

..

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O Que faz o Real Time?

A tecnologia Real Time tem acesso a fase A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade.Geométrica maior qualidade.

São evitadas as fases linear e plateau.São evitadas as fases linear e plateau.

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Calibração externaDNA/RNA são amplificados como uma curva DNA/RNA são amplificados como uma curva separada para compensar a eficiência e fornecerseparada para compensar a eficiência e fornecerunidades de quantificaçãounidades de quantificação

# ciclos# ciclos

Detectionthreshold

target A

target B

Log [DNA]Log [DNA]

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Log [DNA]Log [DNA]

Cycle #Cycle #

PlateauPlateau

Y=X(1+e)n

GeometricGeometric Y=X2n

Real-Time PCRCaracterísticas do gráfico Real Time

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Número de ciclos PCR

Baseline

Threshold

C T

Controle sem Template

Amostra

Fluo

resc

ênci

a N

orm

aliz

adad

a ”r

epor

ter”

(Rn)

Fase geométrica

Alta CV baixa CVRn

CT é inversamente proporcinal a conc. de DNA

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Plot da Amplificação

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Curva Padrão

7 pg DNA

700 ng DNA

y= -3.6x + 39

R2= 0.999

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OBRIGADO