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Células-tronco e Regeneração
Conhecer a terminologia, conversar com pesquisadores, impressionar
amigos e familiares nas festas...
Objetivo desta aula…
Ler artigos e assistir reportagens e realmente entender a mensagem, ter
opinião própria e lúcida sobre o assunto
Saber um pouco da história da pesquisa em células-tronco, como
chegamos até aqui? Onde estamos? Para onde vamos? Questões existenciais...
Regeneração - Qual a necessidade?
Aplicação na vida real
Conceito de Regeneração
Animais com grande capacidade de regeneração
Reparo Regeneração
Solução imediata para um problema Resolução e desaparecimento do problema
Reparo Regeneração
Solução imediata para um problema Resolução e desaparecimento do problema
Cicatriz = propriedades materiais diferentes do tecido original (não tem
elasticidade, não apresenta crescimento de pelos)
Não é funcional
Formação de novo tecidos com funções fisiológicas e morfológicas
preservadas
Reparo Tecido Cicatricial = Resposta Inflamatória, remodelamento de matriz extracelular
Lesão de medulaA cicatriz pode impedir
a aproximação dos prolongamentos
neurais
DerrameA cicatriz glial diminui a
atividade neural na área lesada
Ataque cardíacoO tecido cicatricial não apresenta a habilidade
de batimento compassado (fibrose)
Nós perdemos milhões de células a cada segundo
Um bilhão de células por hora
Sem o mecanismo de reposição destas células, nós
perderíamos...
Intestino: 2 horas
Pele: 3 semanas
Hemácias: 4 meses
Ossos: 5 anos
Importância das células-tronco na regeneração
Implantes Biônicos
Implantes Biônicos
Tecidos naturais ainda são insubstituíveis
- Auto-manutenção constante- Adaptação- Interligação
Porém, são muito difíceis de se conseguir - Transplantes
- Rejeição- Medicação constante (imunossupressores)- Nem todos os órgãos podem ser transplantados
Auto-renovação;
Manter-se indiferenciada;
Diferenciação em tipos celulares diferentes
Quem são as Células-tronco?
Célula-tronco (características especiais)
Auto-renovação, Indiferenciação e Diferenciação
Potencial = Quantidade de possíveis destinos que a célula-tronco pode adquirir (totipotente, pluripotente, progenitores)
Determinação do destino (músculo, osso, pele, neurônios, etc)
Regeneração ≠ Reparo tecidual (células-tronco adultas)
Uso terapêutico (estabelecidos/pesquisas)
Gametogênese: Formação dos óvulos e espermatozóides , redução dos cromossomos
Fertilização: União de óvulo e espermatozóide
Embriogênese: Formação do embrião (zigoto)
De onde vem as células-tronco?
Zigoto
Resultado da união do óvulo ao espermatozóide. É o início de um
novo organismo.
Embriologia
Primeira Clivagem
Nos seres humanos, a primeira clivagem (ou divisão celular) acontece cerca de 30 horas após a fecundação
(dia 1).
(blastômeros)
Embriologia
Clivagem: estágio de 4 células
As células tornam-se menores a cada divisão mitótica.
Embriologia
Clivagem: estágio de 8 células
Ao chegar neste estágio, as células começam a mudar sua forma e se agrupar firmemente, tornando-se
compactas.Essa proximidade entre as células permite uma interação entre as células e troca de informações.
Embriologia
Mórula
Ao atingir 12 a 32 células, a estutura recebe o nome Mórula (amora).
~4 dias após a fecundação
Começa a formar-se a cavidade blastocística (infiltração de fluído
uterino)
Embriologia
Blástula ou Blastocisto
O fluído aumenta a cavidade interna(~6 dias após a fecundação)
Duas estruturas se formam: 1) Trofoblasto (células externas);2) Embrioblasto (células internas)
Embriologia
Trofoblasto (placenta)
Embrioblasto (embrião)
Embriologia
Embriologia
Pluripotentes
Progenitores
Totipotentes
Cels diferenciadas
zigotoAdultas
Medula Óssea
≠
Regeneração é o uso das células-tronco para gerar novo tecido/órgão funcional
Diferente entre as espécies
Que tipo de célula-tronco é melhor para a REGENERAÇÃO?
Gametogênese: Formação dos óvulos e espermatozóides , redução dos cromossomos
Fertilização: União de óvulo e espermatozóide
Embriogênese: Formação do embrião (zigoto)
Regeneração = Células-tronco adultas/ progenitoras/ quiescentes
Zigoto = Totipotente
Resultado da união do ovócito ao espermatozóide.
É o início de um novo organismo.
O Zigoto é uma boa célula para regeneração?
Trofoblasto (placenta)
Embrioblasto (embrião) Células da Massa Interna
Degeneração MacularParkinson
ELA (esclerose lateral amiotrófica
Cardiopatias, Anemia, Leucemia, Artrite,
Fratura óssea
DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica)
DiabetesCirrose
Infertilidade
Células-tronco Embrionárias (ES)
As células-tronco embrionárias são boas fontes celulares para
regeneração?
Pluripotentes
Progenitores
Totipotentes
Cels diferenciadas
zigotoAdultas
Medula Óssea
As células-tronco adultas ou progenitoras são boas células
para regeneração?
Células-tronco Adultas - Regeneração
Sangue
Pele
Epitélio Intestinal
Uso terapêutico de células-tronco (adultas)
Todas as células-tronco são capazes de regeneração, o que varia é o potencial e o controle
Célula-tronco embrionária
EctodermaProgenitores
NeuraisNeurônios
C-MycLin28SSEA3SSEA4
Smad2/3Oct3/4FoxD3NanogCriptoSox2
Sox17
Notch1NestinTP63
Β3-TubulinaNestinaMAP2ABCG2MashAtoh7
NestinaJagged
SinapsinaTau
GluR2GluR4
SinaptotosinaRodopsinaCalbindina
Pluripotente Progenitor DiferenciadaZigoto
Determinação do Destino = Diferenciação
Como a célula controla estes processos de divisão e diferenciação?
Oscar Hertwig (~1916)
Os cromossomos controlam a célula
Wilhelm His (~1892)
Os componentes do citoplasma controlam a célula
Edmund Wilson (~1928)
Todo mundo tem uma certa razão…
Vou mais além…EPIGENÉTICA e
MICROAMBIENTE meus senhores!
Conrad Waddington (~1942)
Era moderna de pesquisa com células-tronco
No laboratório…
Como identificá-las?
Como isolá-las?
Qual a participação dos genes?
Podem ser manipulados por experimentação?
Quais os fatores envolvidos?
Estas células podem fazer o que EU quero?
Fre et al., PLosOne 2011http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0025785
Identificação das células-tronco(utilização dos conceitos conhecidos)
Barker et al., Nature 2007 doi:10.1038/nature06196
Diferenciação - Quimeras
Era moderna de pesquisa com células-tronco
No laboratório…
Como identificá-las?
Como isolá-las?
Qual a participação dos genes?
Podem ser manipulados por experimentação?
Quais os fatores envolvidos?
Estas células podem fazer o que EU quero?
Isolamento das células-tronco
Isolamento das células-tronco
Após conhecimento de marcadores específicos
Célula-tronco embrionária
EctodermaProgenitores
NeuraisNeurônios
C-MycLin28SSEA3SSEA4
Smad2/3Oct3/4FoxD3NanogCriptoSox2
Sox17
Notch1NestinTP63
Β3-TubulinaNestinaMAP2ABCG2MashAtoh7
NestinaJagged
SinapsinaTau
GluR2GluR4
SinaptotosinaRodopsinaCalbindina
Pluripotente Progenitor DiferenciadaZigoto
Marcadores específicos
Era moderna de pesquisa com células-tronco
No laboratório…
Como identificá-las?
Como isolá-las?
Qual a participação dos genes? Clonagem e Cultivo
Podem ser manipulados por experimentação?
Quais os fatores envolvidos?
Estas células podem fazer o que EU quero?
1962 - Sir John Gurdon = Primeira reprogramação nuclear (clonagem de sapo)O potencial das células-tronco poderia ser reativado
- Sir John Bertrand Gurdon
- Nascido em 2 de outubro de 1933
- Durante seus estudos (1948-1949) , dos 250 alunos inscritos no curso de biologia, suas notas eram as mais baixas de todas, sendo o último no ranking dos estudantes
- Seus professores diziam que tentar uma carreira como cientista era “ridículo e uma perda de tempo para ele e aqueles que tivessem que ensiná-lo”
- Tentou trocar de curso se matriculando em disciplinas de História e Sociologia, mas foimatriculado erroneamente no curso de Zoologia
- DNA = material genético/ Michael Fischberg – Reprogramação Nuclear
- 1962 - Clonagem de sapo
- 2012 = Prêmio Nobel em Medicina pelo descobrimento da reprogramação celular
Relatório CientíficoNome: GurdonFoi um semestre desastroso. O trabalho dele está longe de ser satisfatório. Seuaprendizado foi mal sucedido e muitos dos seus ensaios foram rasgados; um dos seustrabalhos recebeu nota 2 de 50. Seu outro trabalho tem sido igualmente ruim, e pormuitas vezes ele apresentou dificuldades por não escutar, e insiste em fazer o trabalho dasua própria maneira. Acredito que ele tenha idéias de se tornar um cientista, o que éridículo, se ele não consegue aprender fatos biológicos simples, ele não tem chance derealizar um trabalho de especialista, e isso seria uma perda de tempo para ele e paraaqueles que terão que ensiná-lo.
Estabelecimento da primeira linhagem de células-tronco/pluripotentes de camundongos
Cultura de ES
+ bone morphogenetic protein (BMP) + leukemia inhibitory factor (LIF)+ mitogen-activated protein kinase (MEK) + glycogen synthase kinase 3 (GSK3)+ FGF+ ActivinFeeder Layer
Inibem a diferenciação celularAlgumas culturas de primatas
A espécie animal e as condições de cultivo influenciam no estado de pluripotência
Dolly 1996-2003
Clonagem e Cultivo
1 2
3
Era moderna de pesquisa com células-tronco
No laboratório…
Como identificá-las?
Como isolá-las?
Qual a participação dos genes?
Podem ser manipulados por experimentação?
Quais os fatores envolvidos?
Estas células podem fazer o que EU quero?
Célula-tronco embrionária
EctodermaProgenitores
NeuraisNeurônios
C-MycLin28SSEA3SSEA4
Smad2/3Oct3/4FoxD3NanogCriptoSox2
Sox17
Notch1NestinTP63
Β3-TubulinaNestinaMAP2ABCG2MashAtoh7
NestinaJagged
SinapsinaTau
GluR2GluR4
SinaptotosinaRodopsinaCalbindina
Multipotente/Pluripotente
Progenitor Diferenciada
Diferenciação
Desdiferenciação
2006 - Pluripotentes Induzidas
- Fatores conhecidos por manterem células-tronco embrionárias indiferenciadas em cultura;
- 24 genes envolvidos com estes fatores
Ecat1 Eras Sox15 Sall4 Utf1 B-catenin
Dppa5 Dnmt31 Dppa4 Oct3/4 Tcl1 C-Myc
Fbxo15 Ecat8 Dppa2 Sox2 Dppa3 Stat3
Nanog Gdf3 Fthl17 Rex1 Klf4 Grb2
Ecat1 Eras Sox15 Sall4 Utf1 B-catenin
Dppa5 Dnmt31 Dppa4 Oct3/4 Tcl1 C-Myc
Fbxo15 Ecat8 Dppa2 Sox2 Dppa3 Stat3
Nanog Gdf3 Fthl17 Rex1 Klf4 Grb2
Teste de pluripotencialidade – Formação de teratoma
C-Myc
Klf4
Sox2Oct3/4
GFP
Teste de pluripotencialidade – Formação de Quimeras
Não é que eleestava certo?
Não é que elesestavam errados?
Era moderna de pesquisa com células-tronco
No laboratório…
Como identificá-las?
Como isolá-las?
Qual a participação dos genes?
Podem ser manipulados por experimentação?
Quais os fatores envolvidos?
Estas células podem fazer o que EU quero?
Patologias cardíacas
Lesões Medulares
Insuficiências Hepáticas
Esperança
Nós possuímos a capacidade regenerativa em nosso corpo.Porque nossa regeneração não é tão eficiente?
Salamandra = Regeneração completa do membro em 60-90 dias
CartilagemMúsculosOssosSist Nervoso
Cicatrização(Blastema)
Blastema =Conjunto de Células-tronco derivadasdos ossosMúsculosTecidos adjacentes
Regeneração https://youtu.be/_rtF_coKT8U
Ao invés de apresentar uma célula pluripotente se diferenciando em diversos tipos celulares, esse Blastema é composto por diferentes tipos de células-progenitoras tecido específicas
1) Amputação/lesão (peixes, salamandras)2) Migração das células epiteliais para o local da lesão3) Formação de uma multicamada epitelial (epiderme)4) Mesenquima subjacente inicia proliferação = 5) Conjunto de células = blastema.6) Fatores que podem influenciar a proliferação das células do blastema: nervos, glândulas especializadas, vasculatura, diferentes vias de sinalização
Blastema
barbatana
Blastema só se inicia frente a lesão
Células adultas tecido-específicas (ósseo, vascular, epitelial, etc) passam por um processo de ativação
= proliferação e reprogramação (desdiferenciação)
Progenitores = diferenciação limitada
Totipotente Pluripotente Multipotente Progenitores Células Adultas
Diferenciação
Desdiferenciação (Reprogramação)
Ativação
Cauda de peixe
Epiderme
Ósseo
Stewart S, Stankunas KDev Biol 2012;365(2):339-49
Stewart S, et al., Cell Rep 2014, 6(3):482-98
LesãoReprogramação (proliferação e desdiferenciação)Diferenciação
Osteócitos secretando osteocalcinaLesãoReprogramaçãoDiminuição da expressão de osteocalcinaProdução de muitos osteoblastosDiferenciaçãoNovo tecido ósseo
Novo tecido ósseo: Reparo x Regeneração
Novo tecido ósseo: Reparo x Regeneração
Alguns animais apresentam grande capacidade regenerativa, inclusive em idade adulta
Tipos de Regeneração
Salamandra
Hidra
Rearranjo de células
pré-existentes
Abraham Trembley, 1744 – modelo de estudo por + de 270 anos
Hidra
Hidra – diploblasto (2 folhetos germinativos)3 fontes celulares = morfalaxia
Após decapitação, as células epiteliais são estimuladas e passam por reprogramação e diferenciação para substituir a cabeça =
transdiferenciação
Li Q, Yang H, Zhong TP. J Genet Genomics. 2015
A porção lesada induz apoptose celular . Estas células secretam temporariamente o ligante Wnt3 que induz proliferação nas células vizinhas = regeneração
Li Q, Yang H, Zhong TP. J Genet Genomics. 2015
Hidra - epimorfismo
XenopusZebrafish
Planária
279 tiny pieces
Peter Simon Pallas1778
Planária = triploblasto
Li Q, Yang H, Zhong TP. J Genet Genomics. 2015
Morfalaxia = mudanças em células pré-existentes;Epimorfismo = formação de blastema = neoblastos (pluripotentes)
Planária = Neoblastos
Li Q, Yang H, Zhong TP. J Genet Genomics. 2015
Planária = neoblastos
Wagner et al., Science, 332 (2011), pp. 811–816
Planária
Dugesia japonica Schmidtea mediterranea
Alta flexibilidade de regeneração
Phagocata kawakatsu Procotyla fluviatilis
Regeneração limitada (cabeça-rabo)
Regeneração Muscular
Crescimento Muscular: Hipertrofia X Hiperplasia
Regeneração Muscular
Células Satélite
Regeneração Muscular
Células Satélite
Aumento de Myf5 interrompe auto-
renovação
A expressão de MyoD indica
comprometimento celular com a
diferenciação muscular = mioblastos
A miogenina desencadeia a
diferenciação do precursor muscular
em músculo = miogênese
Pax7 = auto-renovação
Anfíbios da ordem caudata (família das salamandras)
Ambystoma mexicanum (axolotl)Notophthalmus viridescens
Sandoval-Guzman et al (2014) Cell Stem Cell
Diversidade de Mecanismos de Regeneração
Notophthalmus viridescens Ambystoma mexicanum (axolotl)
Sandoval-Guzman (2014). Cell Stem Cell 14, 174–187
Regeneração da Retina
Epitélio Pigmentado Retiniano
Células gliais de MüllerCélulas do Epitélio CiliarCélulas da ÍrisCélulas-tronco Residentes
Progenitores
Reprogramação
Epitélio Pigmentado Retiniano
Células gliais de MüllerCélulas do Epitélio CiliarCélulas da ÍrisCélulas-tronco Residentes
Reprogramação
Epitélio Pigmentado Retiniano
Células gliais de MüllerCélulas do Epitélio CiliarCélulas da ÍrisCélulas-tronco Residentes
Indução de Reprogramação
Células gliais de MüllerCélulas do Epitélio Ciliar
A B
Epitélio Não-Pigmentado (ENP)
Epitélio Pigmentado (EP)
A pars plana
B pars plicata
Del Debbio et al., IOVS, 2014
Células Epiteliais
Proliferação
neuroesferas
CC
3 dias 6 dias
1 2 3
neuroesferas
FGFEGF
0 dias
ProgenitoresRetinianos
Rhodopsin
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