Cromatografia cotel

CROMATOGRAFIA:Fundamentos e

aplicações

Eng. Bruno Cortez

Depto. de Engenharia Química Escola de Engenharia de Lorena – EEL/USP

DEFINIÇÃO

Conjunto de técnicas de separação cujo princípio depende da distribuição diferenciada dos componentes de uma mistura entre duas fases, uma considerada estacionária, e a outra, móvel.

KROMA + GRAPH (COR) (ESCREVER)

DEFINIÇÃO

Diferenças nas propriedades das fases móvel e estacionária possibilitam com que os componentes da amostra se desloquem através do material cromatográfico com velocidades desiguais, gerando a separação

ANÁLISE CROMATOGRÁFICA

AFINIDADE ⇒ SEPARAÇÃO

LÍQUIDA

CROMATOGRAFIA

PLANAR COLUNA

LÍQUIDA GÁS FLUÍDO SUPERCRÍTICO

Líquida (CP)

Sólida (CCD)

Ligada (CCD)

Ligada (CSFL)Sólido (CSS)

Líquida (CGL)

Sólida (CGS)

Ligada (CGFL) Líquida (CLL)

Sólida (CLS, CE)

Ligada (CFLF, CTI e CB)

TIPOS DE CROMATOGRAFIASIGLA NOME TIPO DE SEPARAÇÃO

CP Papel Partilha

CCD Camada Delgada Partilha

CCD-FL Camada Delgada com Fase Quimicamente Ligada Partilha e Adsorção

CGL Gás-Líquido Distribuição

CGS Gás-Sólido Adsorção

CGFL Gasosa com Fase Quimicamente Ligada Adsorção

CSS Sólida com Fase Móvel Super-crítica Adsorção

CSFL CSS com Fase Quimicamente Ligada Adsorção

CLL Líquido-Líquido Partilha

CLS Líquido-Sólido Adsorção

CE Exclusão Permeação

CLFL Líquida com Fase Quimicamente Ligada Partilha e Adsorção

CTI Troca Iônica Interações Polares

CB Bioafinidade Bioatividade

TIPOS DE SEPARAÇÃO Os princípios físico-químico básicos de separação são:

Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase estacionária através de interações químicas ou físicas.

Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve a superfície do suporte sólido.

Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo funcional) da fase estacionária.

Exclusão moléculas: As moléculas são separadas por tamanho, havendo retenção das maiores.

Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase estacionária.

Cromatografia Gasosa (CG)

Técnica de separação, em que substâncias capazes de se volatilizarem, percolam em uma corrente de gás através da fase estacionária.

Dependendo da natureza da fase estacionária, a cromatografia gasosa pode ser dividida em 2 grupos: Cromatografia gás-líquido (GLC) Cromatografia gás-sólido (GSC)

Cromatografia Gasosa (CG)

O QUE ANALISAR? Compostos voláteis de pontos de ebulição de

até 350 ºC e pesos moleculares menores que 500

Compostos que possam produzir derivados voláteis

Compostos termicamente estáveis na condições de trabalho

Cromatografia Gasosa (CG)

ALGUMAS APLICAÇÕES Indústria Petroquímica Alimentos e Bebidas Biocidas Medicamentos Meio ambiente

Cromatografia Gasosa (CG)

DESCRIÇÃO DE UM CROMATÓGRAFO: Cilíndro contendo gás carreador (hidrogênio,

hélio, argônio ou nitrogênio), com fluxo controlado e regulador de pressão

Sistema de injeção de amostra Coluna cromatográfica Detectores

Condutividade térmica Ionização de chama

Registrador

Cromatografia Gasosa (CG)

Cromatografia Gasosa (CG)

GÁS DE ARRASTE FASE MÓVEL EM CG: NÃO interage com a amostra –

apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como gás de arraste

INERTE: Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento

PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária

Cromatografia Gasosa (CG)

Impurezas típicas em gases e seus efeitos: H2O, O2 ⇒ oxida/hidrolisa

algumas FE, incompatíveis com DCE

Hidrocarbonetos ⇒ ruído no sinal de DIC

Cromatografia Gasosa (CG)GASES - FILTROS

Cromatografia Gasosa (CG)

CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros

Cromatografia Gasosa (CG)

COMPATÍVEL COM UM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste

específico para melhor funcionamento

Cromatografia Gasosa (CG)

Alimentação do gás de arraste

Cromatografia Gasosa (CG)

Dispositivos de Injeção de Amostra Os dispositivos para injeção (INJETORES ou

VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

Cromatografia Gasosa (CG)

SISTEMAS DE INJEÇÃO

Cromatografia Gasosa (CG)INJETOR “ON-COLUMN” CONVENCIONAL

Cromatografia Gasosa (CG)

Injeção “on-column” de líquidos

Cromatografia Gasosa (CG) INJETORES SPLIT/SPLITLESS

Cromatografia Gasosa (CG)

SPLIT Amostras concentradas onde a diluição com solvente

é impossível particularmente devido a co-eluição SPLITLESS

Amostras diluídas ou análise de traços Análise em ampla faixa de ponto de ebulição e

polaridade Adequado para análide de amostras complexas

(multicomponentes)

Cromatografia Gasosa (CG)

Parâmetros de Injeção TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser

suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição REGRA GERAL: Tinj=50 ºC acima da temperatura de

ebulição do componente menos volátil VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do

estado físico da amostra

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

Cromatografia Gasosa (CG)

MICROSSERINGAS PARA INJEÇÃO LÍQUIDOS: capacidades típicas ⇒ 1μL, 5 μL e 10 μL

Cromatografia Gasosa (CG)

COLUNAS CROMATOGRÁFICAS

Colunas empacotadas

Cromatografia Gasosa (CG)

Cromatografia Gasosa (CG)

COLUNAS CROMATOGRÁFICAS Coluna Empacotada

VANTAGENS Simples preparação e uso Tecnologia clássica Grande número de fases líquidas Capacidade alta e longa durabilidade Usada para análise de gases com DCT

DESVANTAGENS Número de pratos limitado Exige controle da vazão da fase móvel Análises relativamente demoradas Baixa resolução para amostras complexas

Cromatografia Gasosa (CG)

Temperatura da Coluna Além da interação da FE, o tempo que um

analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0)

Cromatografia Gasosa (CG)

Temperatura da Coluna

CONTROLE CONFIÁVEL

DA TEMPERATURA DA

COLUNA É ESSENCIAL

PARA OBTER BOA

SEPARAÇÃO EM CG

Cromatografia Gasosa (CG)

FORNO DA COLUNA Características desejáveis de um forno:

Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo menos de Tamb até 400 ºC. Sistemas criogênicos (T < Tamb) podem ser necessários em casos especiais

Temperatura independente dos demais módulos: Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector

Temperatura uniforme em seu interior: Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno

Cromatografia Gasosa (CG) FORNO DA COLUNA

Características desejáveis de um forno: Fácil acesso à coluna: A operação de troca de

coluna pode ser freqüente Aquecimento e resfriamento rápido: Importante

tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas

Temperatura estável e reprodutível: A temperatura deve ser mantida com precisão e exatidão de ± 0,1 ºC

EM CROMATÓGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980) O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO É

TOTALMENTE OPERADO POR MICROCOMPUTADORES

Cromatografia Gasosa (CG)

Programação Linear de Temperatura Misturas complexas (constituintes com

volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

Cromatografia Gasosa (CG)

Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada

linearmente durante a separação:

Cromatografia Gasosa (CG)

Programação Linear de Temperatura

POSSÍVEIS PROBLEMAS ASSOCIADOS À PLT

Cromatografia Gasosa (CG)

DETECTORES: Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste

Cromatografia Gasosa (CG) DETECTORES MAIS IMPORTANTES:

Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste

Detector por Ionização de Chama (DIC ou FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar

Detector por Captura de Elétrons (DCE ou ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS

Cromatografia Gasosa (CG)

Características de uma FE ideal SELETIVA: Deve interagir diferencialmente

com os componentes da amostra

REGRA GERAL: A FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático...)

Cromatografia Gasosa (CG)

Características de uma FE ideal AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO: Maior

flexibilidade na otimização da separação BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA: Maior

durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra

POUCA VISCOSIDADE: Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases)

DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA: Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS: ADSORÇÃO O fenômeno físico-químico responsável pela interação

do analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS: ADSORÇÃO

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS Características Gerais:

Sólidos finamente granulados (diâmetros de partículas típicos de 105 µm a 420 µm)

Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g)

Cromatografia Gasosa (CG)

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS: ABSORÇÃO O fenômeno físico-químico responsável pela interação

do analito + FE sólida é a ABSORÇÃO

A ABSORÇÃO OCORRE NO INTERIOR DO FILME DE FE LÍQUIDA (FENÔMENO INTRAFACIAL)

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS: ABSORÇÃO

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS QUIRAIS

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS QUIRAIS

Cromatografia Gasosa (CG)

FASES ESTACIONÁRIAS QUIRAIS

Cromatografia Gasosa (CG)

Cromatografia Gasosa (CG)

COLUNAS EMPACOTADAS Tubo de material inerte recheado com FE sólida

granulada ou FE líquida depositada sobre um suporte sólido

Cromatografia Gasosa (CG)

COLUNAS EMPACOTADAS FE Líquidas: SUPORTE

Cromatografia Gasosa (CG)

COLUNAS CAPILARES

Cromatografia Gasosa (CG)

COLUNAS CAPILARES DIÂMETRO INTERNO

Cromatografia Gasosa (CG) APLICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA GASOSA NA

CARACTERIZAÇÃO DE POLÍMEROS Os polímeros possuem peso molecular muito alto e, portanto,

pressão de vapor muito baixa. Eles não podem ser analisados diretamente pela CG

Determinação de pureza de monômeros, solventes e aditivos. Análise de componentes voláteis nos polímeros, tais como

monômero residual, plastificantes, antioxidantes e solventes residuais em adesivos e tintas.

Acompanhamento da cinética de reação de polimerização. Pirólise do polímero e caracterização de sua estrutura Análise do polímero como fase estacionária –

CROMATOGRAFIA GASOSA INVERSA

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Método popular para separação e análise de materiais poliméricos

Determinação simultânea Peso molecular numérico médio Peso molecular ponderal médio Distribuição do peso molecular

Conhecida popularmente por CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL (GPC)

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

MECANISMO DA SEPARAÇÃO

O recheio das colunas éconstituído de partículascontendo poros de diver-sos tamanhos.

O volume total da fase móvel corresponde ao volume de poros (Vp), mais o volume intersticial(Vo), também conhecidopor volume morto

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

MOLÉCULAS MAIORES: não sãoretidas pelos poros. Logo, são ELUÍDAS primeiro.

MOLÉCULAS MENORES: sãocapazes de permear totalmenteno recheio.Logo, são ELUÍDAS por último.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

VOLUME DE ELUIÇÃO: Ve = Vo + KVp

Onde: Ve é o volume de eluição; Vo é o volume intersticial; K é o coeficiente de distribuição do soluto; Vp é o volume dos poros.

O valor de K situa-se na faixa entre 0 e 1. K=0.....o soluto é totalmente excluído dos poros K=1.....o soluto é totalmente permeado nos poros 0<K<1 faixa de separação

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Exemplo: Coluna de separação para SEC, do tipo

ultrastyragel®, fabricada pela Waters Inc. contém aproximadamente 6 mL de solvente dentro dos poros (volume dos poros) e 6 mL de solvente nos interstícios entre as partículas que compõem o recheio.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Conclusão: Nenhuma molécula poderá eluir antes de 6 mL ou

depois de 12 mL. Moléculas de tamanho intermediário eluirão a um volume entre 6 e 12 mL.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIA PARA SEC O tamanho dos poros deve ser comparável ao tamano da

macromolécula a ser analisada. A distribuição de tamanho de poros deve ser de tal forma

que forneça uma dependência linear do volume de eluição com o logaritmo do tamanho molecular dos polímeros investigados.

A fase estacionária não deve exibir qualquer interação, do tipo adsorção, com a substância a ser analisada.

A fase estacionária deve possuir resistência mecânica e estabilidade térmica e química.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIA PARA SEC Polímero macroporoso

Possuem estrutura tri-dimensional, e são preparados por copolimeração ou reticulação de macromoléculas.

Podem ser semi-rígidos ou do tipo soft-gel

Silicato macroporoso São rígidos e não incham na presença de solventes. Tamanho dos poros não são influenciados pela

temperatura ou pelo solvente.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

SELEÇÃO DA COLUNA Colunas disponíveis com vários tamanhos de

poros A escolha depende do tamanho das

macromoléculas do soluto a serem analisadas Pode-se usar várias colunas dispostas em séries

e com tamanhos de poros variados, OU uma coluna com gradiente de porosidade ao longo de seu comprimento

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

CURVAS DE CALIBRAÇÃO Não é um método absoluto...REQUER a

construção de uma curva de calibração para converter os dados fornecidos pelo instrumento em valores de massa molar e sua distribuição.

A partir dos valores de Vr de amostras monodispersas de massa molar conhecida (PADRÕES), é possível determinar a massa molar de amostras desconhecidas

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Exemplo: Curva construída

usando-se padrões de poliestireno de massa molar conhecida e de distribuição estreita, praticamente monodispersos

A injeção de cada padrão fornece uma curva, cujo pico é considerado o volume de eluição, Vr

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Os valores de Vr, colocados em gráfico contra a massa molar dos padrões, fornecem a curva de calibração.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

A curva de calibração assim construída corresponde ao poliestireno analisado naquelas condições específicas de solvente e tamanho dos poros.

Poderá ser usada para outros polímeros??? Devido à especificidade dessas condições, a

aplicação direta da curva de calibração exemplificada, a polímeros de estrutura diferente poderá levar a resultados fictícios.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

CURVA DE CALIBRAÇÃO UNIVERSAL Baseada no volume hidrodinâmico

Na verdade os polímeros são eluídos em função de seu volume hidrodinâmico, e não de sua massa VOLUME HIDRODINÂMICO PODE SER EXPRESSO EM

TERMOS DO PRODUTO DA MASSA MOLECULAR [M] E A VISCOSIDADE INTRÍSECA [n] DA AMOSTRA DO POLÍMERO

Dois polímeros diferentes que aparecem no mesmo volume de eluição, no mesmo solvente, e nas mesmas condições instrumentais terão o mesmo volume hidrodinâmico e as mesmas características de [n]M

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

CURVA DE CALIBRAÇÃO UNIVERSAL

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) FASE MÓVEL

TOLUENO não absorve água e não degrada com facilidade. Não pode ser utilizado quando o sistema de detectores é constituído por

detectores UV. TETRAHIDROFURANO

Pode ser utilizado com detectores UV e de índice de refração. Absorve água com muita facilidade. Utilizar o solvente recém-destilado e adição de estabilizante para peróxidos.

CLOROFÓRMIO Não absorve água com tanta facilidade e pode ser usado com detector UV Com o tempo pode ocorrer decomposição, com liberação de ácido clorídrico,

extremamente prejudicial às colunas. ÁGUA

Análise de polímeros hidrossolúveis.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

APLICAÇÕES Caracterização de materiais poliméricos Determinação dos pesos moleculares numérico e

ponderal médios, e distribuição do peso molecular.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

EFEITO DA DISTRIBUIÇÃO DO PESO MOLECULAR NAS PROPRIEDADES MECÂNICAS

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

EFEITO DAS CONDIÇÕES DE PROCESSAMENTO NA DEGRADAÇÃO DE UM POLÍMERO

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

CONTROLE DE QUALIDADE(a) Cromatograma de uma amostra de PVC contendo plastificante.

(b) Cromatograma de uma mistura de plastificantes comuns

1 – ftalato de dioctila2 – ftalato de dibutila3 – ftalato de dietila4 – ftalato de dimetila

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC)

ACOMPANHAMENTO DE REAÇÃO