Dalila Zanette Alterações no perfil de expressão gênica e do imunofenótipo de CPHs CD34+...

Dalila Zanette

Alterações no perfil de expressão gênica e do imunofenótipo de CPHs CD34+ expandidas ex vivo

Panepucci RA, Molfeta GA, Araujo AG, Silva-Jr WA, Palma PBV, Menezes CCBO, Delgado MO, Covas DT

Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Zago

Transplante de células progenitoras hematopoéticas de SCU

Menos utilizadas do que medula óssea ou sangue periférico mobilizado

Baixo numero de células

Afeta diretamente o sucesso do transplante

Expansão in vitro: várias tentativas

Células expandidas apresentam menor enxertia

Perda da capacidade de repopulação in vivo ?????

Maior obstáculo da expansão

A PRÓPRIA PROLIFERAÇÃO ESTIMULAA PRÓPRIA PROLIFERAÇÃO ESTIMULA

A DIFERENCIAÇÃO E A PERDA GRADUALA DIFERENCIAÇÃO E A PERDA GRADUAL

DA CAPACIDADE DE REPOVOARDA CAPACIDADE DE REPOVOAR

TER PROLIFERAÇÃO

Preservar auto-renovação

Evitar a diferenciação

Na ausencia total de estroma: perda gradual da capacidade de repovoar

Quais os genes envolvidos nesta perda ?

Quais os genes afetados pela ausência do estroma ?

Melhores resultados até hoje: CPHs co-cultivadas com estroma humano

Maior obstáculo da expansão

Objetivos

Avaliar os efeitos da expansão sobre a expressão gênica de células CD34+

Avaliar os mecanismos genéticos envolvidos na adaptação ao meio ex vivo na ausência de estroma

Objetivos

Como estas mudanças alteram a capacidade de repovoar e a capacidadede diferenciação das células expandidas

Células recém-isoladas

T0

- CD 34 pureza- Imunofenótipo- Viabilidade- CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCRCD34+

3 dias de cultivo

MNC

Células expandidas por 3 dias

T3

- Imunofenótipo- Viabilidade- CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCR

Protocolo de expansão utilizado

Free Style Medium (Invitrogen)1% de human albumin

TPO

FLT3 lig

SCF

IL-6

3 dias

Sem estroma e sem soro bovino fetal

Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink

Cerca de 10.000 genes/transcritos

13 amostras

T0 T3

In vitro Expanded for 3 days

2 pools 2 pools

Freshly isolated

Reguladas POSITIVAMENTE pela expansão

Reguladas NEGATIVAMENTE pela expansão

Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink

Resultadose

Discussão

Viabilidade celular

t0 t3 t70

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

ViáveisApoptose precoceApoptose tardia e necrose

*p=0,038 *p=0,027

Tempo de Cultura

Po

rcen

tag

em d

e C

élu

las

Mais de 75% de viabilidadeNo dia 3

t0 : média 63% viáveist3 : média 75% viáveist7 : média 54% viáveis

Expressão gênica

In vitro:

Quais as diferenças na expressão gênica de células CD34+recém-isoladas e expandidas ex vivo ?

Microarrays : 40 genes mais expressos em T3

Gene Razão Gene Razão Gene Razão Gene Razão

UBTD1 126,3 TAS2R1 21,9 PACSIN3 15,8 AMBP 12,0

GSS 110,2 STAT2 21,7 PCK2 15,2 PLK1 11,8

ANGPTL3 66,6 PIH1D1 19,8 P2RX7 14,4 USP2 11,2

BBC3 60,2 AFG3L2 19,7 XPO7 14,2 IL9R 10,9

ADAM18 52,1 ITIH1 17,9 MRC1 13,9 CYLC1 10,8

CAMK4 48,7 WNT5B 17,9 PHLDA2 13,4 RBP4 10,5

PHLDA1 42,1 ADAMTS10

17,3 TDRD6 13,1 BUB1 10,4

TOM1L1 33,1 KIF1B 16,6 GAL 12,1 HSD3B7 10,1

KIF2C 25,2 GMIP 16,3 SMAD6 12,1 PGF 10,0

INMT 24,2 INMT 24,2 AMBP 12,0 FBLN1 10,0

DDX25 23,9 DDX25 23,9 PLK1 11,8 CD26 9,9

Genes validados e classes funcionais (Real Time qPCR)

Proliferation

IL9RSMAD6

Apoptosis

BIRC5 or survivin

Cell cycle

CDC25CCCND1

WNT pathway

WNT5BWIF1GSK3B

Self-renewal

HOXB4Bmi-1

Polarity, cell division

AKT1PTEN

Processos associados à expansão ex vivo e à auto-renovação

Via de sinalização WNT

Katoh M and Katoh M, 2007

Beta-catenin dependent Beta-catenin independent

CANONICAL NONCANONICAL

Canônica

Regula a escolha do destino das células progenitoras durante o desenvolvimento

embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos

Não-Canônica

- Regula indiretamente a escolha do destino das células progenitoras durante o

desenvolvimento embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos

através da inibição da via canônica

- Polaridade celular e migração celular

Via de sinalização WNT

Via de sinalização WNT

Via não-canônica

Não sinaliza através da beta-catenin;

Em alguns casos inibe a via canônica;

Também necessita de Fzd como receptor, mas não precisa de LRP5/6;

A via NC, divide-se em 3 outras sub-vias: duas delas liberam íons Cálcio no citoplasma, que são a via da adesão e da morfologia celular. A terceira é a via da polaridade celular;

Via de sinalização WNT

WNT1 (1,5)WNT2 (1,8)WNT2B (1,3)WNT3A (NA)WNT4 (-1,2)WNT5A (NA)WNT5B (10)WNT7A (-1,2)WNT10B (-1,2)WISP2 (1,2)WISP3 (1,0)FZD9 (7,5)GSK3B (-1,1)CTNNB1 (-1,5)AXIN 2 (1)WIF-1 (-5)DKK1 (4,8)

WNT5BInibe a via canônicaAtiva a via não-canônica ~WNT5A

FZD9Receptor

WIF1 Inibidor das duas vias, canônica e não-canônica

DKK1Inibidor específico da via canônica

Polarização de CPHs cultivadas in vitro:

evento comum na ausência de estroma

e na presença e citocinas

Divisões assimétricas

Perda da capacidade de repopulação

Giebel et al, 2004Giebel B and Bruns I, 2008

Via de sinalização WNT e polarização

Via não-canônica WNT

Divisões assimétricas

Polaridade

Auto-renovação

Outras vias regulama polarização:

PI3K-AKTSinalização do Cálcio

EGF

Via de sinalização WNT e polarização das CPH

Não-canônica e PI3K-AKT

Kawasaki et al, 2007

Wnt and PI3K-AKT estão relacionadas em gliomas

Pu et al, 2008

Via de sinalização WNT e outras vias

Dados divergentes sobre a via WNT e CPH

Wnt5a (não-canonica) : aumenta a atividade de repopulação das CPH

Wnt3a (canônica) : não aumenta a enxertia

Nemeth et al, 2007

Reya et al, 2003

A beta-catenina aumenta a auto-renovação in vitro

Jeannet et al, 2007

A hematopoese a longo-prazo independe de cateninas

A via não-canônica está mais ativa nas células cultivadas ?

Isso interfere na capacidade de repovoar destas células ?

Hipótese

Via de sinalização WNT e CPH

Silenciamento do Wnt5b

- siRNAs para o silenciamento do gene WNT5b

- faremos a cultura exatamente como antes, incluindo controles e também amostrasnas quais o WNT5B será silenciado

- Avaliaremos se houve transfecção através de um controle fluorescente

- avaliaremos se houve silenciamento do gene por real-time PCR para o WNT5B

- Avaliaremos se a proteína WNT5B é alterada, com Ac anti-WNT5b

Consequências

Na morfologia: verificar polarização

Na expressão de marcadores de superfície

Na expressão gênica de alvos abaixo de WNT e outros membros da via WNT (WNT5A, WNT8A, DKK1, GSK3B, beta-catenin, OCT3/4, NANOG, SOX2 e Axin 2)

Na capacidade de formar colônias eritróides e mielóides

Na proliferação das células

Silenciamento do Wnt5b

Genes mais expressos em CPHs cultivadas

Divisão celular

Mitose

Fuso Mitótico

Organização docitoesqueleto

Polaridade

Assimetria

Marcadores desuperfície

Quiescence abrogation

Genes mais expressos em CPHs cultivadas : mitose

KIF2C KIF1B

AURKB CPC complex

(+BIRC5, borealin, Incenp)

(p+)

centrômeros

KIF20APLK1

Fuso mitótico e centrossomos : interligam os eventos de :

Divisões assimétricas, polaridade e auto-renovação

Razões maiores do que 10

Genes mais expressos em CPHs cultivadas : fuso mitótico

Validação dos genes mais expressos: qPCR

BIRC5

T0 T30.25

0.5

1

2

4

8

2-d

dC

t

CDC25C

T0 T30.5

1

2

4

8

16

2-d

dC

t

IL9R

T0 T30.1250.250.5

1248

163264

128256

2-d

dC

t

SMAD6

T0 T30.25

0.5

1

2

4

82-

dd

Ct

GSK3B

T0 T30.0625

0.125

0.25

0.5

1

2

2-d

dC

t

WNT5B

T0 T30.125

0.25

0.5

1

2

4

8

16

32

64

2-d

dC

t

WIF1

T0 T32.0×10-03

3.9×10-03

7.8×10-03

0.0156250.031250.06250.1250.250.5

12

2-d

dC

t

Validação dos genes da via WNT: qPCR

Bmi-1

T0 T30.03125

0.0625

0.125

0.25

0.5

1

2

2-d

dC

t

HOXB4

T0 T30.25

0.5

1

2

2-d

dC

t

PTEN

T0 T30.25

0.5

1

2

2-d

dC

t

Validação de genes de auto-renovação : qPCR

Via não-canônica do WNT e expansão ex vivo

Silencing WNT5B

(siRNA)

Expressão de marcadoresee superfície

Ensaios clonogênicos

Proliferação

Ciclo celular

Polaridade

Expressão dos alvos e outros membros da vianão-canônica

To confirm:

Microarrays : 10 genes menos expressos em T3

AREG -431 ARHGAP20 -16

IFI44L -62 ELAVL4 -15

TPPP3 -57 VPREB3 -15

CRTAC1 -53 CLEC4E -14

RGS1 -49 S100A12 -14

CXCL10 -38 KLF2 -13

SNF1LK -37 CD69 -13

SERPINA1 -25 RAG2 -12

CD20 -20 HIST2H2BE -12

PDE4B -16 SKT17B -12

GENE GENE t0 / t3 t0 / t3

Amphiregulin ou AREG: 431 vezes menos expresso

Não há redundância funcionalcom outros ligantes de EGFR1Autócrina ou

parácrina

Fator auto-renovação células neurais adultas

Diferenças in vivo e in vitro ???

Epiregulin, Neuregulin, TGF-

AREG é expressa na placenta (gestação)

Membrana celular

Citoplasma

Células CD34+/CXCR4+ > homing

CXCR4 e homing

CXCR4+SDF-1+

NICHONICHOCPHCPH

migram SDF-1+

SDF-1+

SDF-1+

As CPHs de SCU < homing do que CPHs de MO

CXCR4 e homing

CXCR4

T0 T30.015625

0.03125

0.0625

0.125

0.25

0.5

1

2

4

2-d

dC

t

p<0,0001

t0 t3

Razão= – 9 (microarray)Razão = -24 (qPCR) Ausência de estroma (SDF-1)

HIF-1 – 4 vezes menos expresso em t3

CD26 – 10 vezes menos expresso em t3

Via CXCR4/SDF-1

Células CD34+/CXCR4+

t0 t30

250000

500000

750000

1000000

No a

bso

luto

de

célu

las

t0 t3

p = 0,8

T0 T30

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%

t0 t3

p = 0,05

%

Expressão dinâmica do receptor CXCR4 na membrana – demora na enxertia

Maior capacidade de homing

Genes reguladores de CPHs

Auto-renovação

Retenção na medula

Mobilização

Diferenciação

Proliferação

Funções críticas de CPHs

Fatores de transcrição

Reguladores extrínsecos

e

Reguladores intrínsecos

Genes reguladores de CPHs

Reguladores intrínsecos

Fatores de transcrição nível de expressão

Símbolo do Gene Razãomicroarray

Razão qPCR

HOXB4 1,3 - 1,9

SLAMF1 1,5 NA

BMI-1 1,5 -3,3

FLT3 - 4,3 NA

SCL 2,8

RUNX1 1,1 NA

BMP4 -1,1

ZFX -1,2 NA

TEK ou Tie2 1,2 NA

MLL4 1,8 NA

ABCB1 -3.7 NA

Não houve grande alteração

HOXB4 : homeobox B4

Super-expressão aumenta a expansão ex vivo e in vivo

Aumenta a capacidade de reconstituição

HOXB4

T0 T30.25

0.5

1

2

2-d

dC

t

Alvos não alteraram : FOXO3A, TNFRSF1B, BAMBI, SOCS2 e outros

Diferenciação expressão de HOXB4

t0 t3p=0,0002

Células cultivadas : razão = -2

NotchFGF

Sinalização de citocinas

Hedgehog

Proteínas GTNF-TGF-

Apoptose/stress

Ciclo celular

Wnt

HOXB4 : homeobox B4

Bmi-1 (polycomb group family member 4)

t0 t3

Bmi-1

T0 T30.03125

0.0625

0.125

0.25

0.5

1

2

2-d

dC

t

p= 0,0005

Razão microarray = 1,5

Razão qPCR = -3,3

Bmi-1

Divisões simétricas – auto-renovação intacta

Mantém células quiescentes, sem exaustão

Perda da expressão de Bmi-1 correlaciona-se com a perda da capacidade de reconstituição e com apoptose

Bmi-1

Bmi-1

Bmi-1 ocasiona descontrole da proliferação e apoptose

Repressão da transcriçãode alvos p16INK4a e p19ARF

Proliferação

Conclusões

Aumento do número total de células e do número de células CD34+

Aumento médio do número de células CD34+/CD38neg e CD34+/CD90+

Não houve indução da apoptose

Conservação da capacidade de diferenciação (ensaios clonogênicos)

Validação da expressão dos genes analisados no microarranjo por qPCR

A menor expressão de HOXB4 e Bmi-1, relacionados à perda gradativa da capacidade de auto-renovação e também associada à diferenciação

Conclusões

Menor expressão de CXCR4 indica menor capacidade de homing e enxertia

A maior expressão de genes relacionados ao ciclo celular e mitose refletea grande atividade proliferativa das células cultivadas in vitro

A maior expressão de genes relacionados à organização do fuso mitótico parece estar vinculada à alterações na polaridade celular que interferem na ocorrência de divisoes assimétricas in vitro

Melhor compreensão da perda gradativa da capacidade de

auto-renovação e reconstituição associada à expansão in vitro