Diagnóstico viral. Detecção direta 1. Detecção antígenos. imunofluorescência, ELISA etc. 2....

Diagnóstico viral

Detecção direta1. Detecção antígenos. imunofluorescência, ELISA etc.

2. Microscopía eletrônica morfologia de partículas viruais. Microscopía eletrónica

3. Microscopía de luz Apariênica histológica. Corpos de inclusâo.

4. Detecção do genoma viral. Hibridização com sondas específicas. PCR

(polymerase chain reaction)

Detecção Indireta1. Cultura de células Efeito citopático (CPE)

hema-absorção, imunofluorescência

2. Ovos pocks on CAM hemaaglutinação

corpos de inclusão

3. Animais Doença o morte

Isolamento de vírusPara o isolamento de vírus geralmente são usadas culturas de células. Existem três tipos de cultura de células:

1. Cultura primária – Rim de macaco2. Cultura semi-contínua. Fibroblastos embriõnicos humanos de pele ou rim. 3. Cultura contínua - HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK

As culturas primárias são conhecidas como os melhores sistemas ja que é possível crescer o maior número de tipos de vírus. São caras e são de difícil obtenção. As culturas contínuas são mais baratas, mais fáceis de obter mas o tipo de vírus que podem crescer é limitado.

Cultura de célulasO crescimento de vírus pode ocassionar:

1. Efeito citopático (CPE) – Deformação de células, formação de sincício, pode ser específico e não específico. 2. Haemadsorção – As células devem ter a habilidade para grudar em eritrõcitos de mamíferos.

A confirmação da identidade do vírus pode ser feita com neutralização, inibição de heamadsorção, ou testes de imunofluorescência..

Efeito citopático (1)

Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town)

Efeito citopático (2)Formação de sincicio em cultura de célula causado por RSV (top), e virus da caxumba (bottom). (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Vírus da raiva – corpos de NegriVírus do saramposincício

Monocamada não infectada Vírus herpes simplex –1sincício

não-infectadas

infectadas com vírus vaccinia24 horas

HEMADSORÇÃO

Mecanismo utilizado em exames laboratoriais, onde ocorre agregação de eritrócitos à superfície de células animais, em

meio de cultura, após infecção por vírus.

Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Problemas com cultura de células

Periodo longo (até 4 semanas) requerido para resultado. Muitas vezes a sensibilidade muito baixa, a sensibilidade

depende em grande medida, da condição do espécime Suscetíveis à contaminação bacteriana.

Sensíveis a substâncias tóxicas que podem estar presentes na amostra.

Muitos vírus não crescem em cultura de células por exemplo, A hepatite B, vírus diarreicas, parvovirose, papilomavírus. .

Virus Isolados por cultura de células

Viruses readily isolated by cell culture Less frequently isolated viruses

Herpes Simplex Varicella-Zoster

Cytomegalovirus Measles

Adenoviruses Rubella

Polioviruses Rhinoviruses

Coxsackie B viruses Coxsackie A viruses

Echoviruses

Influenza

Parainfluenza

Mumps

Respiratory Syncytial Virus

citomegalovírus O (CMV) é um importante patógeno em

neonatos e pacientes imunocomprometidos, causando efeitos gravesmorbidade e mortalidade. Pneumonite por CMV é a causa infecciosa mais comum de morte em pacientes com transplante de medula óssea. Mulheres mononucleose passa pro feto..

Técnicas de cultura rápidas são necessárias para o diagnóstico

Técnicas de cultura rápidas.

técnica de cultura rápida está disponíveis através da qual antígenos virais são detectados 2 a 4 dias após a inoculação. O DEAFF (detection of early antigen fluorescent foci ) para testar CMV é o melhor exemplo, segundo o qual a monocamada de células é cultivada em lamina de vidro que se coloca dentro de uma garrafa plástica.Após a inoculação de vírus, em seguida, a garrafa é centrifugada a uma velocidade baixa por uma hora (para acelerar a adsorção dos vírus) e, em seguida, incubadas por 2-4 dias.A lamínula é então retirado e examinada para a presença de antígenos virais por imunofluorescência

DEAFF test for CMV

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

Cultura em ovos

Métodos

Ovos embrionados

Pocks do vírus da varíola

Pocks do vírus cowpox Pocks do vírus vaccinia

Produção de vacinas

http://www.cbsnews.com/video/watch/?id=5450993n

Microscopía eletrônicaSão necessárias 106 partículas virais por ml para visualização. è usada uma magnificação de 50,000 - 60,000. Podem ser detectados virus das sigs. Amostras:Fecais Rotavirus, Adenovirus

Norwalk like virusesAstrovirus, Calicivirus

Fluidos vesículares HSVVZV

Raspagem cutánea papillomavirus, orfmolluscum contagiosum

Electronmicrographs

Adenovirus Rotavirus(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Métodos

Microscopia eletrônica de transmissão:

- contrastação negativa ou corte de células infectadas.

FilovírusAdenovírus

Picornavírus Rhabdovírus

Poxvírus

Poxvírus

Retrovírus

Microscopía eletrônica-imune

A sensibilidade e especificidade da microscopia eletrônica pode ser melhorada através de microscopia eletrônica imune. Existem duas variantes: - microscopia eletrônica Imune (IEM) clássica - a amostra é tratada com anti-soros específicos antes de serem colocados à EM. As partículas virais presentes serão aglutinadas e, portanto, ligam-se ao anticorpo. microscopia eletrônica imune fase sólida (SPIEM) - a grade é revestida com anti-soros específicos. Partículas de vírus presentes na amostra será absorvida na rede pelo anticorpo.

Immunofluorescense

Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

CMV pp65 antigenaemia test

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

Problemas com Microscopía eletrônica equipamentos caros

Manutenção caraExige observador experiente Sensibilidade frequentemente baixa

SerologiaDetecção do aumento no título de anticorpos entre a fase aguda e convalescente da infecção, ou detecção de IgM na infecção primária.

Classical Techniques Newer Techniques

1. Complement fixation tests (CFT) 1. Radioimmunoassay (RIA)2. Haemagglutination inhibition tests 2. Enzyme linked immunosorbent assay (EIA)3. Immunofluorescence techniques (IF) 3. Particle agglutination4. Neutralization tests 4. Western Blot (WB)5. Counter-immunoelectrophoresis 5. RIBA, Line immunoassay

Perfil Sorológico Típico após a infecção aguda

Notar que na reinfecção IgM pode estar ausente ou presente em níveis baixos transientemente.

SerologyCriterios para diagnóstico da infecção primáriaAumento de 4 vezes ou mais no título de IgG ou anticorpos totais entre soros agudos e convalescentesPresença de IgMSoroconversãoUm título elevado de anticorpos IgG (anticorpos ou total) - não muito confiávelCritérios para o diagnóstico de reinfecçãoaumento vezes ou mais no título de IgG ou anticorpos totais entre soros agudos e convalescentesAusência ou ligeiro aumento de IgM

Complement Fixation Test

Complement Fixation Test in Microtiter Plate. Rows 1 and 2 exhibit complement fixation obtained with acute and convalescent phase serum specimens, respectively. (2-fold serum dilutions were used) The observed 4-fold increase is significant and indicates recent infection.

ELVIS (Enzyme Linked Viral Induced System)

Elvis cells infected with HSV-1

PRNT (plaque reduction neutralization test), neutralização do vírus mediada

por anticorpos é definida como a interação do vírus comanticorpos, resultando em inativação do vírus de tal forma que já não é capaz de infectar ereplicar em culturas de células ou animais

Resultado do PRNT

há ou não presença de anticorpos neutralizantes no soro-teste

indivíduo já foi vacinado ou já teve contato com o vírus

Métodos

Testes sorológicos: PRNT (plaque reduction neutralization test), Cada vírus que inicia uma infecção produtiva produz uma área localizada de infecção ( chamada placa)que pode ser detectada em uma variedade de maneiras. As placas são contadas e comparadas e se determina a percentagem de redução pelo soro nainfectividade do vírus total. (utilizado por ex. Efeito da vacina da dengue)

PRNT

ELISA

ELISA

Variação: uso de anti-IgM

ELISA for HIV antibody

Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity

WESTERN BLOT

Western Blot

HIV-1 Western Blot Lane1: Positive Control Lane 2: Negative Control Sample A: Negative Sample B: Indeterminate Sample C: Positive

Utilidade dos resultados serológicos

Quão útil é um resultado sorológico depende do vírus individual.

Por exemplo, a existência de vírus, tais como rubéola e hepatite A, o aparecimento dos sintomas coincide com o desenvolvimento de anticorpos. A detecção de anticorpos IgM ou títulos crescentes de IgG no soro do paciente indica doença ativa.

No entanto, muitos vírus muitas vezes produzem doença clínica antes do aparecimento de anticorpos, como os vírus respiratórios e diarreicas. Portanto, neste caso, qualquer diagnóstico sorológico seria retrospectiva e, portanto, não será tão útil.

Existem também os vírus que produzem a doença clínica meses ou anos após a soroconversão por exemplo, HIV e anti-rábica. No caso desses vírus, a simples presença do anticorpo é suficiente para fazer um diagnóstico definitivo.

Specimens for Routine Tests

Clinical Category Blood Throatswab

Faeces CSF Other

1. Meningitis + + + +2. Encephalitis + + + + Brain biopsy3. Paralytic disease + + + +4. Respiratory illness + + Nasopharyngeal aspirate5. Hepatitis +6. Gastroenteritis +7. Congenital diseases + Urine, saliva8. Skin lesions + + Lesion sample e.g. vesicle

fluid, skin scrapping9. Eye lesions Eye swab10. Myocarditis + Pericardial fluid11. Myositis + +12. Glandular fever +13. Post Mortem + Autopsy

After use, swabs should be broken into a small bottle containing 2 ml of virus transport medium.Swabs should be sent to the laboratory as soon as possible without freezing. Faeces, CSF, biopsy orautopsy specimens should be put into a dry sterile container.

Métodos moleculares Métodos baseados na detecção do genoma viral

também são comumente conhecidos como métodos moleculares.

Costuma-se dizer que os métodos moleculares é a direção do futuro do diagnóstico viral.No entanto, na prática, embora o uso desses métodos tende a aumentar, o papel desempenhado por métodos moleculares, em um laboratório de rotina diagnóstica do vírus ainda é pequeno se comparado aos métodos convencionais.

É certo porém que o papel dos métodos moleculares vai aumentar rapidamente no futuro próximo.

Técnicas moleculares clássicas

Dot-blot, Southern blot, hydridization in-situ são exemplos de técnicas clássicas. Eles dependem da utilização de sondas específicas de DNA / RNA por hibridação.

A especificidade da reação depende das condições utilizadas para a hibridação. Entretanto, a sensibilidade dessas técnicas não é melhor do que as convencionais métodos de diagnóstico viral.

No entanto, uma vez que são geralmente mais tediosos e caros do que as técnicas convencionais, eles nunca tiveram uma aceitação generalizada.

Polymerase Chain Reaction (1)

A técnica de PCR permite a amplificação in vitro de seqüências específicas de DNA alvo por um fator de 106 e é, portanto, uma técnica extremamente sensível.

É baseado em uma reação enzimática que envolve o uso de oligonucleotídeos sintéticos de acompanhamento da seqüência alvo nucleico de interesse.

Estes oligonucleotídeos atuam como iniciadores para a Taq polimerase termoestável. Ciclos repetidos (geralmente 25 a 40) de desnaturação do DNA molde (em 94oC), anelamento dos primers a suas seqüências complementares (50oC) e extensão de primer (72oC) resultam na produção exponencial do fragmento-alvo específicos.

Mais sensibilidade e especificidade podem ser obtidas pelo nested PCR.Detecção e identificação do produto da PCR é geralmente realizada por eletroforese em gel de agarose, a hibridação com uma sonda de oligonucleotídeos, análise de enzimas de restrição, ou seqüenciamento de DNA.

Polymerase Chain Reaction (2)

Vantagens do PCR: Sensibilidade extremamente elevadas, podem detectar até um genoma viral por volume de

amostra Fácil de configurar tempo de resposta rápido Desvantagens da PCR Extremamente susceptíveis à contaminação Alto grau de habilidade do operador exigida Não é fácil de configurar uma análise quantitativa. Um resultado positivo pode ser difícil de interpretar, sobretudo com vírus latentes como o

CMV, onde qualquer pessoa soropositiva terá vírus presente no sangue, independentemente de terem a doença ou não.

Esses problemas estão sendo tratados com a chegada de sistemas comerciais fechados, tais como o Cobas Amplicor Roche, que exige o mínimo de manipulação. O uso de fibras sintéticas alvos internos competitivos nestes ensaios comercial facilitou a quantificação precisa dos resultados. No entanto, estes ensaios são muito caros.

Schematic of PCR

Each cycle doubles the copy number of the target