Dosagem(de(Citocinas( - GBCFLUXcitocinas . Detecção de proteínas Intracelular • Estudo...

Dosagem  de  Citocinas  

Karina  Carvalho  

Detecção de proteínas Intracelular

•  Estudo intracelular da atividade enzimática

•  Sinal de transdução

•  Resposta imunológica - Produção de citocinas

Detecção de proteínas Intracelular

•  Estudo intracelular da atividade enzimática

•  Sinal de transdução

•  Resposta imunológica - Produção de citocinas

Parâmetros Críticos  

•  Tipo celular

•  Protocolo de ativação

•  Tempo de incubação

•  Inibidor do transporte da proteína

•  Melhor anticorpo

Parâmetros Críticos  

•  Tipo celular

•  Protocolo de ativação

•  Tempo de incubação

•  Inibidor do transporte da proteína

•  Melhor anticorpo

CD3 CD28

PHA

Con A

PMA LPS

APC

T cell

Super Ag MHC

APC

Tipo celular

Parâmetros Críticos  

•  Tipo celular

•  Protocolo de ativação

•  Tempo de incubação

•  Inibidor do transporte da proteína

•  Melhor anticorpo

Protocolo de ativação  

•  Ativadores policlonais ou estímulos inespecíficos – Forbol esters – Concavalina A – Fitohemaglutinina – LPS – Acs monoclonais anti-CD3

•  Peptídeos e/ou estímulos específicos  

Protocolo de ativação  

•  Moléculas co-estimulatórias

– CD28 e CD49d

•  Peptídeos e/ou estímulos específicos  

CD3 CD28

PHA

Con A

PMA LPS

APC

T cell

Super Ag MHC

APC

Estímulos

•  Estímulos policlonais •  Específicos: estímulo monoclonal, peptídeo, vírus, bactéria

0   10  2   10  3   10  4   10  5  

0  10  2  

10  3  

10  4  

10  5  

0.98  

6B11  0   10  2   10  3   10  4   10  5  

0  10  2  

10  3  

10  4  

10  5  

0.98  

Vβ11  

v  

Vα

24  

0   10  2   10  3   10  4   10  5  

0  10  2  

10  3  

10  4  

10  5  

0.93  

Dimer+ αGalCer  

0   1000   2000   3000   4000  0  

1000  

2000  

3000  

4000  

21  

FSC  

v  SS

C  

0   10  2   10  3   10  4   10  5  0  

1000  

2000  

3000  

4000  

80  

CD3  

v  

SS

C  

Snyder-Cappione e cols., JID 2007  

Estratégia de Análise  

0 102 103 104 1050

50K

100K

150K

200K

250K

0 102 103 104 105

0

10 2

10 3

10 4

10 5

CD3 Vα24

4.57 60.1

9.725.6

5.65 0.87

0.4393

B Healthy HIV-Infected

IFNγ

Controle                                    HIV  infectado  

Snyder-Cappione e cols., AIDS 2009  

Parâmetros Críticos  

•  Tipo celular

•  Protocolo de ativação

•  Tempo de incubação

•  Inibidor do transporte da proteína

•  Melhor anticorpo

Tempo de incubação  

•  Depende – Citocinas

– Estímulo

– Tipo celular

•  Melhor opção – CINÉTICA

cd4+cd3+IL17_PMA 5.fcsEvent Count: 22234

0 102 103 104 105

<FITC-A>: IL17

0

102

103

104

105

<PE-

A>: I

L2

2.35

5.42

4.66

87.6

cd4+cd3+IL17_PMA 5.fcsEvent Count: 22234

0 102 103 104 105

<FITC-A>: IL17

0

102

103

104

105

<PE-

Cy7

-A>:

IFN

g

1.58

3.84

8.03

86.5

cd4+cd3+IL17_PMA 5.fcsEvent Count: 22234

0 102 103 104 105

<FITC-A>: IL17

0

102

103

104

105

<APC

-A>:

TN

Fa

1.03

4.39

11.1

83.5

cd4+cd3+IL17_PMA 16.fcsEvent Count: 14267

0 102 103 104 105

<FITC-A>: IL17

0

102

103

104

105

<PE-

A>: I

L2

4.92

11.4

3.57

80.1

cd4+cd3+IL17_PMA 16.fcsEvent Count: 14267

0 102 103 104 105

<FITC-A>: IL17

0

102

103

104

105

<PE-

Cy7

-A>:

IFN

g

1.98

11.5

3.86

82.7

cd4+cd3+IL17_PMA 16.fcsEvent Count: 14267

0 102 103 104 105

<FITC-A>: IL17

0

102

103

104

105

<APC

-A>:

TN

Fa

0.95

12.5

5.89

80.7

Parâmetros Críticos  

•  Tipo celular

•  Protocolo de ativação

•  Tempo de incubação

•  Inibidor do transporte da proteína

•  Melhor anticorpo

Inibidor do transporte da proteina  

•  Brefeldina A e Monoensima

•  Tempo e dose/dependente para atividade citotóxica

•  Cinética

CD3 CD28

PHA

Con A

Ionomycin LPS

APC

T cell

Super Ag MHC

APC

Estímulo

STOP Secreção de citocina

(Brefeldina A ou Monensina)

Acúmulo de citocina intracelular

Monensina Brefeldina A

Brefeldina:IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFNγ e MIP-1β Monoensina: CD107, CD154, IL-10 e TGFβ Brefeldina bloqueia CD69 e CD154

+

Superfície

+

Intracelular

CD3 CD28

PHA

Con A

Ionomycin LPS

APC

T cell

Super Ag MHC

APC

Estímulos

Superfície

Secreção stop (Brefeldina A ou Monensina)

Fixação/Permeabilização Marcação Intracelular

Comercial ou Caseiro

Parâmetros Críticos  

•  Tipo celular

•  Protocolo de ativação

•  Tempo de incubação

•  Inibidor do transporte da proteína

•  Melhor anticorpo

Melhor anticorpo  

•  Pergunta????????? – Expressão do Anticorpo

•  Fluorocromo

•  Clone

Control Co-infected

SS

C

0 10 2 10 3

10 4 10 5

0

1000

2000

3000

4000

0.42%

0 10 2 10 3

10 4 10 5

4.25%

IL-­‐4  

Obrigada!! kilc127@gmail.com