identificação bacteriana V

Deteco e Identificao de Bactrias de Importncia Mdica

Mdulo V

NDICEEstafilococos, estreptococos, enterococos e outros cocos gram positivos ........................................ 1 Introduo..............................................................................................................................................1 Identificao preliminar ............................................................................................................................1 Identificao de estafilococos ....................................................................................................................3 Identificao dos staphylococcus aureus.....................................................................................................4 Identificao dos estreptococos .................................................................................................................5 2. Neisserias......................................................................................................................................... 9 Introduo..............................................................................................................................................9 Isolamento ........................................................................................................................................... 10 Transporte e semeadura do material........................................................................................................ 11 Bacterioscopia e identificao.................................................................................................................. 11 3. Enterobactrias .............................................................................................................................. 14 introduo ............................................................................................................................................ 14 tipos de testes utilizados para identificao............................................................................................... 15 etapas da identificao de enterobactrias................................................................................................ 18 identificao das enterobactrias de importncia clnica ............................................................................. 19 identificao sorolgica .......................................................................................................................... 27 4. Bastonetes no fermentadores....................................................................................................... 31 Introduo............................................................................................................................................ 31 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao ................................................................... 31 Procedimentos para a identificao .......................................................................................................... 33 5. Bacilos curvos ou espiralados......................................................................................................... 41 Introduo............................................................................................................................................ 41 Campylobacter ...................................................................................................................................... 42 Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas........................................................................................................... 43 6. Bacilos gram positivos.................................................................................................................... 45 Introduo............................................................................................................................................ 45 Corineformes ........................................................................................................................................ 46 Bacilos gram positivo ............................................................................................................................. 50 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos............................................................................... 52 Actinomicetos ....................................................................................................................................... 54 7. Fastidiosos ..................................................................................................................................... 56 Introduo............................................................................................................................................ 56 Bartonella............................................................................................................................................. 58 Bordetella............................................................................................................................................. 59 Brucella................................................................................................................................................ 60 Francisella tularensis.............................................................................................................................. 61 Haemophylus ........................................................................................................................................ 62 Legionella ............................................................................................................................................. 64 Pasteurella ........................................................................................................................................... 65 Actinobacillus ........................................................................................................................................ 66 Capnocytophaga.................................................................................................................................... 68 Eikenella .............................................................................................................................................. 68 Kingella................................................................................................................................................ 68 Cardiobacterium hominis ........................................................................................................................ 69 Chromobacterium violaceum................................................................................................................... 69 Streptobacillus moniliformis .................................................................................................................... 70 8. Bactrias anaerbias estritas ......................................................................................................... 71 Introduo............................................................................................................................................ 71 Coleta de material ................................................................................................................................. 73 Transporte do material........................................................................................................................... 73 Processamento do material ..................................................................................................................... 73 Identificao bacteriana ......................................................................................................................... 74 Provas de sensibilidade a antimicrobianos................................................................................................. 77 9. Interpretao de Resultados e laudos ............................................................................................ 78 Introduo............................................................................................................................................ 78 Laudo para o trato respiratrio superior ................................................................................................... 79 Laudo para escarro ................................................................................................................................ 81 Laudo para secreo endotraqueal, lavado traqueal, e lavado brnquico ...................................................... 81 Laudo para lavado brocoalveolar ou escovado brnquico ............................................................................ 82 Laudo para pleural................................................................................................................................. 84 Laudo para abscesso pulmonar ............................................................................................................... 84 Laudo para ocular.................................................................................................................................. 84 Laudo para lquido cfalo raquidiano (LCR) ............................................................................................... 85 Laudo para fezes ................................................................................................................................... 85 Laudo para pele, abscessos e feridas ....................................................................................................... 86 Laudo para genital................................................................................................................................. 88 Laudo para urina ................................................................................................................................... 89 Laudo para sangue ................................................................................................................................ 92 10. Referncias Bibliogrficas .............................................................................................................. 93 1.

1. ESTAFILOCOCOS, ESTREPTOCOCOS, ENTEROCOCOS E OUTROS COCOS GRAM POSITIVOSINTRODUO Os Estafilococos so as bactrias no esporuladas que mais resistem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clnicas secas, so relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentrao aumentada de sal. No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condies sanitrias e das medidas de controle de infeco hospitalar, este microrganismo continua a ser um dos mais importantes patgenos para o homem. Indivduos sadios so colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentao, e podem albergar o microrganismo na nasofaringe, ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir destes stios, o S. aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infeces letais por conta dos fatores de virulncia ou atravs de resistncia aos antimicrobianos atualmente utilizados. J foram descritos no Brasil casos de infeces causadas por Staphylococcus aureus parcialmente resistentes aos antibiticos mais potentes como a Vancomicina, e relatos da capacidade que os Staphylococcus coagulase negativa tem de desenvolver resistncia. Assim h necessidade de uma identificao rpida e eficiente de todos os casos em que estes microrganismos se apresentam. Os estreptococos foram os maiores causadores de infeco hospitalar na era pr-antibitica, causando surtos de infeco e morte de purperas. Apesar de no serem atualmente uma importante causa de infeco hospitalar, provocam, no entanto, doenas muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes, sendo importante o rpido diagnstico deste agente. J os enterococos apresentam importncia crescente como causadores de infeco hospitalar, pelo aparecimento de resistncia quase total aos antibiticos tradicionalmente utilizados para tratamento destas infeces. Os Enterococos mais comumente isolados so: Enterococcus faecalis (90% dos casos) e Enterococcus faecium, com grande capacidade de colonizao de pacientes e de contaminarem superfcies ou equipamentos utilizados em hospitais. Possuem sensibilidade ou resistncia varivel aos antibiticos chamados glicopeptdios como a vancomicina e teicoplanina. Existem, atualmente, cepas comensais naturalmente resistentes a vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porm no sendo ainda capazes de causarem surtos, mas que devem ser corretamente identificadas. IDENTIFICAO PRELIMINAR A identificao dos estreptococos e estafilococos baseada na morfologia que apresentam em meios lquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados. A identificao presuntiva comea com a inoculao primria na placa de gar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tenso de CO (mtodo da vela ou estufa de CO2). As colnias de estafilococos so geralmente maiores, convexas, de colorao variando do branco-porcelana a amarelo podendo apresentar hemlise ou no. Note-se que o desenvolvimento da cor amarelada no S. aureus ocorre somente aps incubao prolongada (72 h), temperatura ambiente. As colnias de estreptococos tendem a serem menores (puntiformes), e com halos de hemlise total ou parcial (beta e alfa hemlise). A diferenciao entre os estreptococos e os estafilococos se d, seguramente, pela prova da catalase.

PROVA DA CATALASECom a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregao uma gota de gua oxigenada a 3% e observar a formao de bolhas. Para a famlia Microccocacea (estafilococos) a prova geralmente positiva, enquanto que para a famlia Streptococcacea (estreptococos) negativa.

Mod V - 1

Diviso dos cocos Gram positivo pela prova da catalaseCatalase positivos Staphylococcus spp. Micrococcus spp. Planococcus spp. Stomatococcus spp. Catalase negativos Enterococcus spp. Streptococcus spp. Aerococcus spp. Gemella spp., Leuconostoc spp. Lactococcus spp., Stomatococcus spp.

Ao coletar a colnia, no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode acarretar resultados falsopositivos porque o sangue do meio contm catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reao positiva (fazer Gram e ver disposio em cadeias curtas ou aos pares). Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnicaGnero Catalase Motilidade NaCl 5% Oxidase Aerbio estrito no + varivel no no no no Ttrade

Staphylococcus Planococcus Micrococcus Enterococcus Streptococcus Aerococcus Stomatococcus * * aderente ao meio

+ + + neg neg neg varivel

neg + neg varivel neg neg neg

+ + + + varivel + neg

neg neg + neg neg neg neg

varivel varivel varivel no no + varivel

Cocos Gram positivo, Catalase negativa, Motilidade NegativaGnero Enterococcus Streptococcus Aerococcus Leuconostoc Pediococcus Gemella Stomatococcus1 2 3

1

NaCl 6,5% + neg + varivel varivel neg neg

Vancomicina varivel sensvel sensvel resistente resistente sensvel sensvel

PYR + neg2

Bile Esculina + neg3

Ttrade no no varivel no varivel no varivel

varivel neg neg + +

varivel varivel + neg +

E. casseliflavus e E. gallinarum so positivos S. pyogenes positivo alguns S. viridans podem ser positivos

Mod V - 2

IDENTIFICAO DE ESTAFILOCOCOS O teste mais importante na identificao da famlia Micrococcaceae a prova da catalase, e esta famlia composta de quatro gneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus. O gnero Staphylococcus apresenta 32 espcies, 14 subnegespcies, sendo que somente 15 espcies so encontradas em amostras humanas, e de uma maneira prtica, os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase. Provas diferenciais dos generos Catalase positivosGnero Motilidade NaCl 5% Oxidase Aerbio estrito no + + no Ttrade

Staphylococcus Planococcus Micrococcus Stomatococcus

neg + neg neg

+ + + neg

neg neg + neg

varivel varivel + varivel

Identificao das espcies de Staphylococcus de maior importncia clnicaEspcie S. aureus S. epidermidis S. lugdunensis S. haemolyticus S. saprophyticus S. schleiferi S. intermedius S. hyicus DNAse + neg neg neg neg neg + + PYR neg neg + + neg + + neg Novob. sensvel sensvel sensvel sensvel resistente sensvel sensvel sensvel Uria varivel + varivel neg + neg + varivel Polimixina resistente resistente varivel sensvel sensvel sensvel sensvel resistente omitina + omitina neg isolado em urina Sacarose neg Outras pig. amarelo

Existem cerca de 31 espcies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais freqentes so: Staphylococcus epidermidis - causador de infeces de cateteres e prteses e o mais freqente microrganismo encontrado em hemoculturas. Staphylococcus saprophyticus - causador de infeco urinria em mulheres jovens. Staphylococcus haemolyticus - importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemlise na placa de gar sangue de carneiro.

TESTE DA RESISTNCIA A NOVOBIOCINAA cepa semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 g. As amostras resistentes mostram zonas de inibio de 6 a 12 mm, enquanto as susceptveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus so resistentes.

Mod V - 3

Testes da Trealose, Urease e NovobiocinaEspcies S. epidermidis S. haemolyticus S. saprophyticus Trealose Negativa Positiva Positiva Urease Positiva Negativa Positiva Novobiocina Sensvel Sensvel Resistente

IDENTIFICAO DOS STAPHYLOCOCCUS AUREUS A forma mais simples de identifica o Staphylococcus aureus a prova da coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lamina.

TESTE DA COAGULASE EM LMINAA maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) clumping factor na superfcie da parede celular, que reage com o fibrinognio do plasma causando a coagulao do mesmo. Colocar 2 gotas de salina em uma lmina; Emulsionar uma colnia isolada a ser testada; Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plstico ou madeira; Observar se h aglutinao em 10 segundos; No se pode executar este teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como gar manitol.

TESTE DA COAGULASE EM TUBOEste teste baseia-se na presena da coagulase livre que reage com um fator plasmtico formando um complexo que atua sobre o fibrinognio formando a fibrina. O teste melhor efetuado se: Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colnia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma; Incubar por 4 horas 35C em estufa ou banho maria; A formao do cogulo observada pela inclinao suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. Um mtodo alternativo a emulsificao desta mesma colnia suspeita em um 0,5 plasma e incubado da mesma forma. Qualquer cogulo indica uma prova positiva, porm no confundir com precipitados ou floculao. O melhor plasma a ser usado o de coelho com EDTA, no devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue.

TESTE DA DNASEEste teste consiste na inoculao de colnias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%; o meio adquire uma colorao azul intensa; Incubar a 35C por 24 horas; Uma colorao rsea caracterstica ao redor das colnias produtoras de DNAse indica a positividade da prova.

Mod V - 4

O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne placa original onde nem sempre as colnias esto bem isoladas.

TESTE DA ENDONUCLEASETeste da endonuclease termoestvel efetuado no mesmo meio de DNA. Fever o caldo de cultura com a bactria suspeita por 15 minutos; Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colnia suspeita; Fazer pequenos orifcios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante; A leitura do teste semelhante ao da DNAse. Note que este mtodo pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em que foi observado o crescimento de cocos Gram positivos agrupados.

OUTRAS PROVAS QUE DIFERENCIAM O STAPHYLOCOCCUS AUREUSAglutinao em ltex ou em hemcias de carneiro (sorologia). Estes testes geralmente detectam a coagulase livre e alguns apresentam tambm uma imunoglobulina antiprotena A presente da parede do Staphylococcus aureus. Como so disponveis comercialmente, deve-se seguir as instrues do fabricante.

TESTE DO CRESCIMENTO EM GAR MANITOLO Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de cloreto de sdio, denominado gar manitol salgado ou Meio de Chapman. O indicador de pH o vermelho de fenol, que indica uma reao positiva quando o meio ao redor das colnias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.

IDENTIFICAO DE OUTROS GNEROSA diferenciao entre Micrococcus sp e os Staphylococcus sp se d pela colorao de Gram, em que os Micrococcus aparecem em ttrades, ou pela pigmentao de suas colnias (amarelas, rseas ou alaranjadas). Alguns no apresentam pigmentos e podem ser diferenciados pela sensibilidade a Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificao de Streptococcus pyogenes, mas utilizandose a inoculao em gar Mueller Hinton. IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparncia na placa de gar sangue aps incubao a 35C em presena de 5% de CO2, podendo apresentar: hemlise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). A identificao de espcie de estreptococos beta hemolticos feita atravs de aglutinao com soros especficos contra os antgenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rpida, porm no acessvel a todos os laboratrios em virtude do elevado custo.

TESTE DA BACITRACINA importante notar que as identificaes devem ser feitas em gar sangue sem tenso de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de gar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma; Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; Incubar por uma noite a 35C sem CO2; Observar qualquer zona de inibio como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) assim rapidamente identificado.

Mod V - 5

TESTE DO SULFAMETOXAZOL TRIMETOPRIM (SXT)Adicionar na mesma placa de gar sangue o disco de SXT; Incubar por uma noite a 35C sem CO2. A sensibilidade a esta droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo no pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield. Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim esquerda. Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme desenho abaixo.

1 - Disco de bacitracina 2 - Disco de sulfametoxazol trimetoprim 3 - Camp Test

Linhas verticais cepas teste Linha horizontal estria com cepa beta hemoltica de Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

TESTE DE CAMP (NA MESMA PLACA)Inocular uma estria nica de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de gar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. (Esta linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque) Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ngulo reto com a linha de inoculao da amostra teste de estafilococo. As estrias no devem se tocar, ficando a 1 mm de distncia, e deste modo vrias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de gar sangue. A maneira de inocular fundamental para a observao do efeito esperado. Incubar a placa a 35-37C durante um perodo de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha caracterstica, na rea de interseco entre as duas estrias.

TESTE DO PYREste teste determina a atividade do PYR tambm chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e tambm pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colnias puras para o teste, pois podem surgir resultados errneos. Seguir as instrues do fabricante, uma vez que se encontra disponvel comercialmente. Esse teste tecnicamente, equivalente prova da hidrlise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificao clssica dos enterococos, e mais especfico que o teste da Bacitracina na caracterizao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, tendo a vantagem de ser mais rpido. Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos. Na impossibilidade da realizao de testes sorolgicos de confirmao, reforar o valor dos testes presuntivos clssicos de identificao do Streptococcus pyogenes.

TESTE DA BILE ESCULINA E DO NACL 6,5%Semear as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5%; Incubar da mesma forma; Teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve mostrar turvao para ser considerado positivo.

Mod V - 6

Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D no enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerncia ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos so positivos. Identificao de estreptococos beta hemolticosIdentificao Sensibilidade a Bacitracina CAMP /Hidrlise de hipurato Sensibilidade a SXT Bile Esculina e Tolerncia a NaCl 6,5% negativos

S. pyogenes

sensvel

negativo

negativo

S. agalactiae

resistente

positivo

negativo

negativos

Enterococcus sp Estreptococo No A, B ou D.

resistente resistente

negativo negativo

negativo positivo

positivos negativos

TESTE DA HIDRLISE DO HIPURATOOs Streptococcus agalactiae (grupo B) so tambm capazes de hidrolisar o hipurato em seus componentes: glicina e cido benzico. Identificao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, B e D.

IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS NO BETA HEMOLTICOSSomente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e D (Enterococcus spp. e Streptococcus bovis) podem no apresentar nenhuma hemlise, a denominada gama hemlise. Identificao de estreptococos gama hemolticos ou sem hemliseIdentificao CAMP /Hidrlise de hipurato positivo negativo negativo Bile Esculina Tolerncia a NaCl 6,5% negativo positivo negativo

Streptococcus agalactiae Enterococo S. bovis

negativo positivo positivo

IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS ALFA HEMOLTICOSA identificao deste grupo no deve ser feita por mtodos sorolgicos, pois a maioria no possui os antgenos de Lancefield. Identificao dos estreptococos alfa hemolticosIdentificao Optoquina e Bile solubilidade positivo negativo negativo negativo Bile esculina Tolerncia 6,5% a NaCl negativo positivo negativo negativo

Pneumococo Enterococos Grupo viridans Streptococcus bovis

negativo positivo negativo positivo

Mod V - 7

TESTE DA OPTOQUINASemear um quarto de uma placa de gar sangue com a cepa alfa hemoltica a ser testada; Aplicar um disco de optoquina; Incubar a 35oC em tenso aumentada de CO2 - mtodo da vela; Uma zona de inibio de 14 mm ou mais volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae.

TESTE DA BILE SOLUBILIDADEO teste da bile solubilidade tambm identifica o Streptococcus pneumoniae. Pode ser executado em placa ou em caldo. Placa: Tomar um caldo turvo aps 3 horas de incubao a 35C; Inocular uma suspenso de desoxicolato a 10%; Clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo prova.

Caldo: Inocular gotas de desoxicolato de Sdio a 2% sobre as colnias suspeitas; Incubar a 35C por 30 minutos; As colnias positivas iro desaparecer por lise bacteriana. Suspeitar da presena de variante nutricional de Streptococcus destes microrganismos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias que no crescem no subcultivo em gar sangue. Semear o repique em gar sangue; Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificao presuntiva de Haemophilus influenzae; Incubar a 35C em atmosfera com CO2. Identificao dos enterococos mais importantes clinicamenteEspcie Arabinos Sorbitol Crescimento Telurito 0,04% positivo negativo negativo negativo Motilidade Pigmento Vancomicina

E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum

negativo positivo positivo positivo

positivo varivel varivel negativo

negativa negativa positiva positiva

negativo negativo positivo negativo

varivel (s) varivel resistente resistente

Mod V - 8

2. NEISSERIASINTRODUO As espcies de Neisseria tem como caracterstica morfolgica serem diplococos Gram negativos mais achatadas nas laterais, dando a forma de rins ou dois gros de feijo unidos por uma ponte. Apenas a espcie N. elongata difere desta morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. Todas neisserias so oxidase positivas e catalase positivas, exceto Neisseria elongata e Kingella denitrificans. Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e no fermentativa, sendo baixa a acidez, de modo que podem acontecer reaes duvidosas com o meio CTA (Cistyne Tripticase Agar) com indicador vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina. As diferentes espcies de neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, so analisadas junto com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp., Acinetobacter spp., Kingella spp e Alcaligenes spp. pelas caractersticas morfolgicas de serem cocos ou cocides ao Gram e pela possibilidade de haver confuso na sua identificao. Quanto a sua importncia clnica, a maioria das neisserias comensal vivendo em mucosas de humanos e animais. Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gram negativoBactria Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria spp. Moraxella catharralis Kingella spp. Moraxella spp. Acinetobacter spp. Alcaligenes faecalis Morfol. diplococo diplococo diplococo/ bacilo diplococo cocobacilo cocobacilo cocobacilo Cocobacilo / bacilo OXI + + + + + + neg + CAT + + varivel + neg + + + OF Gli no cresce no cresce varivel (oxidativo) inerte fermentador inerte varivel (oxidativo) inerte CTA Gli + + varivel neg + neg varivel neg DNAse neg neg neg + neg neg neg neg AS + neg + + + + + + MOT neg neg neg neg varivel neg neg +

OXI = oxidase CAT=catalase OFGli=OF Glicose CTAGli= utilizao da glicose em base gar cistina tripticase AS = cescimento em gar Sangue MOT = motilidade

CARACTERSTICAS DE ALGUMAS ESPCIES DE IMPORTNCIA CLNICA sempre considerada patognica, de transmisso sexual ou pelo parto e indicativa de tratamento. No homem causa uretrite, sendo at 50% assintomtica e est relacionada a complicaes como epididimite, prostatite e estenose uretral. Na mulher causa corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, abscesso vestibular, salpingonegooforite e doena inflamatria plvica. Pode ser isolada tambm na mucosa oral e anal, e em rcem-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum. A doena sistmica disseminada pode ocorrer em 1 a 3% dos pacientes infectados, principalmente em assintomticos e caracterizada por febre, tremores, leses cutneas, artrite de extremidades. As leses cutneas so do tipo mculo-pustulares ou hemorrgicas, com centro de necrose. Raramente ocorre artrite sptica com 50% de positividade de isolamento. Pode ocorrer meningite e endocardite. Pode causar meningite, infeco sistmica grave com coagulao intravascular disseminada (CIVD) e elevada mortalidade, podendo causar em associao outras infeces (conjuntivite, artrite, sinusite e pneumonia). Em mucosas pode ser isolada em portadores sos em 5 a 15 % dos indivduos e por perodos de semanas a meses. A transmisso se faz por vias areas.

Neisseria gonorrhoeae

Neisseria meningitidis

Mod V - 9

Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Potencial patgeno de vias areas, principalmente em crianas e adultos jovens. Causa com maior freqencia otite, sinusite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite e meningite. Em idosos, aps o Haemophylus influenzae e o Pneumococo, constitui a terceira causa de pneumonia em pacientes com doena pulmonar obstrutiva crnica. Em adultos raramente isolada em pacientes assintomticos. Cerca de 80% das cepas so produtoras de beta-lactamase, e so detectadas atravs do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromognica). Outras espcies de Neisseria raramente so isoladas em casos de endocardite

ISOLAMENTO

NEISSERIA GONORRHOEAEMaterial clnico para isolamento (escolha depende dos sintomas): Uretral Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas) Retal (colher secreo mucosa e no fezes, utilizando meio seletivo tipo Thayer Martin) Orofaringe Conjuntiva Recomenda-se: Utilizar swab com algodo atxico ou swab de Rayon ou Dacron. Semear o mais rpido possvel nos meios slidos, e usar placas aquecidas prviamente em estufa. Urina pode ser utilizada, aps centrifugao rpida e semeadura do sedimento. Em meio seletivo, deve-se, no entanto, preferir outros materiais com maior chance de isolamento. Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS que inibidor para as N. Gonorrhoeae (Ex: Caldo BHI com 1% de gelatina). Em leses de pele preferir a bipsia que o swab. Incubar em jarra com umidade e vela. Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram. Glndula de Bartholin Trompas Endomtrio Lquido sinovial Leses de pele Sangue

NEISSERIA MENINGITIDISMateriais clnicos para isolamento, de acordo com aspectos clnicos: LCR Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anticoagulante) Aspirado de petquias Sufuses hemorrgicas ou bipsias Liqudo sinovial Swab de conjuntiva Aspirado traqueal, ou transtraqueal ou escarro Swab de nasofaringe (prefervel a swab de orofaringe)

MORAXELLA (BRANHAMELLA) CATARRHALISMaterial clnico adequado para isolamento de acordo com o quadro clnico: Otite mdia Timpanocentese (miringotomia) quando indicado. Secreo colhida com swab em geral revela flora contaminante, exceto se rompimento expontneo muito recente e sem uso prvio de antimicrobianos. Aspirado de seios da face comprometidos, quando indicado. Escarro, aspirado traqueal, transtraqueal podem ser teis ou BAL, quando indicado e comparados com bacterioscopia.

Sinusite Infeces do trato respiratrio inferior/pneumonia

Mod V - 10

TRANSPORTE E SEMEADURA DO MATERIAL O ideal semear imediatamente aps a coleta em meio slido, levar para a estufa 36oC em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade. O uso de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser considerada uma alternativa de risco. Para M. catarrhalis, os meios de transporte so adequados.

NEISSERIA GONORRHOEAE sensvel a variaes de temperatura acima de 37oC ou abaixo de 35oC, de modo que a amostra no pode ser refrigerada. Recomenda-se gar chocolate enriquecido com suplemento com l-cistena, NAD e vitaminas (Isovitalex ou similar), embora seja possvel obter crescimento de algumas cepas em gar sangue. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e gua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Secreo retal, swab de orofaringe, ou outros materiais com maior microbiota contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).

NEISSERIA MENINGITIDIS um pouco mais tolerante a variaes de temperatura, mas recomenda-se para transporte ambientes com CO2. Cresce bem em gar sangue, mas por precauo, deve-se semear tambm em gar chocolate. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e agua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Materiais com maior flora contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC). Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactrias, a maioria das outras espcies de Neisserias (7,5 g/ml de colistina), Gram positivos (Vancomicina 3 g/ml) e fungos (13,5 g/ml de nistatina); e contm suplementos para suportar crescimento das Neisserias meningitidis e N. gonorrhoeae.

MORAXELLA CATHARRALISTolera temperatura ambiente e cresce bem em gar sangue. Material estril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, bipsia, conjuntiva, nasofaringe). Pode usar meio no seletivo BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO A partir das amostras genitais, LCR, bipsia, etc., deve-se sempre reservar material para a bacterioscopia, fazendo o esfregao no momento da coleta, ou colhendo dois swabs, ou material suficiente para a semeadura e bacterioscopia. Quando o swab nico, no caso das Neisserias d-se preferncia semeadura imediata e posteriormente: Ressuspender o swab em 1 ml de salina; Agitar no Vortex; Centrifugar; Fazer um esfregao do sedimento.

Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presena ou ausncia de diplococos Gram negativos com caractersticas de neisserias em: raros (+) poucos (++) moderados (+++) muitos (++++)

Descrever se os microrganismos so extra-celulares ou intra-celulares e quantidade de neutrfilos e de clulas epiteliais. Mod V - 11

importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do paciente, como quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual fundamental o isolamento e identificao completa, considerando que neisserias saprfitas ou mesmo Acinetobacter spp. podem ser diagnosticados erroneamente como N. gonorrhoeae.

IDENTIFICAOAs N. gonorrhoeae crescem em gar chocolate formando colnias pequenas, sendo em geral menores que as de neisserias saprfitas. A cor pode variar de cinza a amarelo. A colnia da M. catarrhalis de cor cinza rseo-acinzentado, sendo comumente frivel, saindo inteira quando removida com a ala bacteriolgica. As colnias de N. meningitidis A e C capsuladas apresentam mucides. Testes imunolgicos no substituem a cultura e a bacterioscopia, e para o diagnstico da gonorria existem no comrcio recursos do tipo ELISA, sondas genticas de acido nuclico, PCR e suas variantes, de elevado custo e indicado em levantamentos epidemiolgicos, ou quando no se dispe dos recursos tradicionais. Para LCR e outros fludos estreis e mesmo urina, a caracterizao de Neisseria meningitidis pode ser feita pela tcnica de aglutinao com partculas de ltex que rpida, com boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. O teste pode ser positivo nos casos de cultura negativa por uso prvio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo elevado. Para o tipo B alguns produtos oferecem testes para afastar reao cruzada com E. coli. A reao negativa no exclui o diagnstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a cultura.

BACTERIOLOGIAA identificao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser feita em dois nveis: presuntivo e confirmatrio. Em servios de Sade Pblica (DST) onde a prevalncia da gonorria significativa, para fins prticos de tratamento pode-se fazer o diagnstico utilizando-se aspectos clnicos associados bacterioscopia positiva (Diplococos Gram negativos intra-celulares) em pacientes de risco. Deve-se, no entanto, sempre colher material para cultura, possibilitando a confirmao e monitoramento da resistncia destas bactrias. Na ocorrncia de surtos de meningite meningoccica, o diagnstico presuntivo para fins de tratamento, tambm pode basear-se na clnica e na bacterioscopia do LCR ou de leses (petquias e prpuras). As culturas devem sempre ser colhidas para confirmao, identificao de sorotipo e sensibilidade aos antimicrobianos atravs dos seguintes procedimentos: Fazer bacterioscopia das colonias isoladas para confirmar a presena de diplococos Gram negativos com forma de dois feijes. Fazer o teste de oxidase das colonias sugestivas. Deve-se procurar afastar outros gneros de bactrias como Acinetobacter spp., Kingella spp. e Moraxella spp. que so morfologicamente parecidos. Um recurso prtico para evitar erros de identificao de Acinetobacter spp. e Kingella spp. como Neisserias : Semear o agente suspeito em gar chocolate. Colocar um disco de penicilina de 10 ui. Aps 24h fazer um gram das colnias que crescerem prximas a zona de inibio. Se permanecerem cocides com aspecto de neisserias confirma-se o isolamento; caso tenham adquirido a forma de bacilos longos, o isolado no de Neisseria.

Outro passo importante verificar a capacidade de crescimento em meios pobres como o gar nutriente ou a necessidade de crescimento em meio rico (gar chocolate suplementado). A identificao das espcies de neisseria baseia-se na utilizao de acares: glicose, maltose, lactose, sacarose e frutose. Como as neisserias utilizam carboidratos por via oxidativa, a base gar Cistina Tripticase (CTA) adicionada de 1% de cada um dos aucares e com indicador vermelho de fenol tem sido utilizado. No entanto, reaes duvidosas podem ocorrer, por falha na deteco da acidez produzida pela bacteria, dificultando a identificao. Recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao Laboratrio de Referncia para confirmao.

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Provas de rotina para diferenciar Neisserias patognicasBactria AC 22oC A. Nut. 35oC neg v + + +o

DNAse

GLI

MAL

LAC

SAC

FRU

N. gonorrhoeae N. meningitidis Outras neisserias M. catharralis Kingella spp.

neg neg + + v

neg neg neg + neg

+ + varivel neg +

neg + varivel neg neg

neg neg varivel neg neg

neg neg varivel neg nego

neg neg varivel neg neg

AC = crescimento em gar chocolate a 22 C GLI = glicose MAL = maltose LAC = lactose

A. Nut. = crescimento em gar nutriente a 35 C SAC = sacarose FRU = frutose

Mod V - 13

3. ENTEROBACTRIASINTRODUO a maior e mais heterognea famlia de bactrias Gram negativas de importncia mdica. So considerados atualmente: 27 gneros / 102 espcies / 08 grupos indefinidos. Independente da complexidade, mais de 95% das amostras implicadas em caso clnicos so colocadas em 25 espcies, sendo possivel o isolamento de enterobactrias de qualquer amostra clnica.

CARACTERIZAO DA FAMLIA ENTEROBACTERIACEAESo bacilos Gram negativos, no esporulados, com motilidade varivel, oxidase negativos, e que crescem em meios bsicos (caldo peptona), meios ricos (gar sangue, gar chocolate e CLED), meios seletivos (Mac Conkey, EMB). So anaerbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem produo de gs, so catalase positivos, e reduzem nitrato a nitrito. So divididos atravs de diferentes provas em 11 principais gneros, tendo sido descritos nos ltimos anos outros 16 gneros e algumas espcies, mas ainda consideradas de pouca ou nenhuma importncia clnica.

IMPORTNCIA CLNICAA maioria das enterobactrias encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal, na gua, solo e vegetais. Alguns tambm so considerados enteropatgenos por causarem preferencialmente infeces gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras salmonellas, Shigella spp., Yersinia enterocolitica e vrios sorotipos de Escherichia coli, embora possam tambm causar infeco em outros locais. As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importncia clnica isolados na rotina microbiolgica So responsveis por de cerca de 70% das infeces urinrias e 50% das septicemias.

INFECES HOSPITALARES E NA COMUNIDADENas infeces hospitalares: As enterobactrias que atualmente predominam so: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. Principais gneros das enterobactrias (cerca de 99% dos isolamentos de enterobactrias de importncia clnica): Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp. As enterobactrias menos isoladas so: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp. Baseado em dados de prevalncia e importncia clnica, considera-se necessrio que os laboratrios de microbiologia utilizem metodologia que permita discriminar com 80% de acerto os gneros e espcies considerados abaixo: Escherichia coli Shigella spp. Salmonella typhi Salmonella spp. Citrobacter freundii Proteus mirabilis Citrobacter koseri Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Providencia spp. Serratia spp. Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Yersinia enterocolitica Morganella morganii

Nas infeces da comunidade: Destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.

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Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica 1. Fermentao da glicose 2. Fermentao da lactose 3. Motilidade 4. Utilizao de citrato 5. Descarboxilao da lisina 6. Produo de sulfeto de hidrognio (H2S) 7. 8. 9. Produo de gs (CO2) Oxidase Produo de indol

10. Produo de urease 11. Produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase 12. Produo de gelatinase ou opo DNAse

Provas complementares de Identificao Fermentao de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. Utilizao de aminocidos: arginina e ornitina Hidrlise da esculina, etc. ONPG Utilizao de acetato Provas teis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila, voges-proskauer, crescimento em KCN, tartarato de jordan e lipase. Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie, baseado em alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao, custo, rapidez para leitura, etc. TIPOS DE TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAO Podem ser utilizados testes preparados no laboratrio, desde que submetidos a controle de qualidade. Adquiridos no comrcio em testes isolados ou em kits acompanhados dos respectivos esquemas de identificao. Mtodos automatizados em geral utilizam estas mesmas provas e ampliam o nmero de testes podendo caracterizar com maior segurana e melhor poder de discriminao de gneros e espcies no comuns. Mtodos rpidos em geral utilizam substratos cromognicos para deteco de enzimas produzidas pelas bactrias e que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao. Na rotina bacteriolgica, existem vrias alternativas e, com base em conjuntos ou sistemas simplificados de provas bioqumicas, possvel realizar a triagem e identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico. Desse modo, das enterobactrias isoladas de amostras clnicas, cerca de 90%, podem ser perfeitamente identificadas atravs desses esquemas, podendo o resultado ser entregue dentro de um espao de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas.

MEIO IAL (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)Este meio foi elaborado para triagem de enterobactrias e consiste de 9 provas em apenas um tubo de ensaio, que consistem em: indol (tampa), fermentao da sacarose e glicose e produo de gs, fenilalanina, uria, H2S, Lisina, Motilidade. Baseado nestas provas possvel identificar as seguintes bactrias:E. coli Shigella (indol positiva) Shigella (indol negativa) Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp. (sacarose negativa) Enterobacter cloacae Providencia spp. (uria positiva) ou Morganella morganii Providencia spp. (uria negativa) Proteus mirabilis Proteus vulgaris Salmonella spp. Salmonella typhi Citrobacter freundii Serratia marcescens (provas complementares) Vibrio cholerae Vibrio spp. bactrias no fermentadoras

Mod V - 15

Vantagens e limitaes O meio IAL tem a vantagem de ser prtico para inoculao e de baixo custo. Sua desvantagem a dificuldade de interpretao de tantas provas, exigindo muita experincia prvia com o meio. Este meio identifica os principais gneros de enterobactrias, indicando a presena de bactrias no fermentadoras e Vibrios. Para caracterizar corretamente as espcies de Enterobacter, gnero Serratia, gnero e espcies de Pseudomonas h necessidade de realizar provas complementares. Pelas limitaes do poder discriminatrio de gneros e espcies de enterobactrias no se recomenda este meio, como nica opo, na identificao de bactrias envolvidas em infeces hospitalares. Uma alternativa seria utilizar os resultados obtidos do meio IAL como triagem e adicionar os testes complementares, como Citrato e a fermentao da lactose verificada no crescimento em gar Mac Conkey. Variantes do meio IAL Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentao da glicose, gs, H2S, uria MIO (Motilidade Indol Ornitina) lisina citrato rhamnose

CONJUNTO EPM / MILI / CITRATOTrata-se praticamente da mesma combinao de reaes do meio IAL ou Rugai & Arajo (modificado por Pessoa & Silva), separados em 2 tubos, passando a verificao do indol da tampa do IAL, para o meio MILi aps adio do reativo de Kovacs. - inocular picando at o fundo - semear na superfcie - incubar com a tampa frouxa 24hs/35oC Fermentao da glicose, produo de gs, H2S, uria, fenilalanina. - fazer picada central apenas - incubar 24hs/35oC - adicionar 3 gotas de reativo de Kovacs aps a leitura da lisina para o teste de indol Motilidade: as imveis crescem apenas na linha de picada. Descarboxilao da lisina: lisina positiva o meio torna-se roxo, na prova negativa o meio permanece amarelado nos 2/3 inferiores. Indol: a formao de um anel rosa na superfcie do meio indica positividade para o indol. - inocular a superfcie - incubar 24hs/35oC A prova positiva evidenciada pelo aparecimento de colorao azul na superfcie.

Tubo EPM

Tubo MILI

Citrato

Interpretao do Meio EPMProduo de gs Base Produo de H2S Hidrlise da Uria Superfcie Desaminao do Triptofano Formao de bolhas ou rachaduras no meio Presena de pigmento negro de qualquer intensidade Colorao azul esverdeada (fraca) na base indica prova positiva Reao positiva verde escuro ou acastanhado Reao negativa superfcie inalterada

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MEIO TRPLICE AUCAR FERRO (TSI)Considerado o mais clssico dos sistemas de identificao, necessita de provas adicionais, mas tem a vantagem de ser de mais fcil interpretao. Abaixo ser descrito em detalhes e ser a base da identificao de enterobactrias. Acurcia da identificao - qualquer sistema de testes existentes no comrcio, com leitura manual ou automatizada, tem limitaes no nmero de provas e de discriminao dos diferentes gneros e espcies de enterobactrias, de modo que a maioria dos esquemas trabalha com um mximo de 80% de acerto. Os esquemas de identificao de enterobactrias podem utilizar uma ampla gama de recursos, variando desde nove reaes como meio IAL ou Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva, at dez testes propostos neste manual, ou sistemas como API 32E que pode identificar enterobactrias e alguns no fermentadores, utilizando 32 testes. importante destacar que nenhum sistema oferece 100% de acerto para a caracterizao das espcies de enterobactrias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura. A fonte de informao mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1991) contando com 47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para 28 diferentes gneros e 121 espcies de enterobactrias. Os principais gneros e espcies de importncia clnica podem ser caracterizados com >95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espcies dos gneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminao, sendo a identificao feita pelo maior percentual de probabilidade. necessrio destacar que padres no usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar atento para analisar cepas que possam ter importncia clnica e epidemiolgica ou encaminh-las a Laboratrios de Referncia. Antes, no entanto, deve certificar-se que a anlise no esta sendo feita com cultura mista de bactrias. O meio de TSI inclinado em bico de flauta, de cor vermelho-cereja e deve ser inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC. Provas do Meio de TSI

a) Prpura/amarelo (pice prpuro e base amarela)b) Amarelo/amarelo (pice e base amarelos) c) Presena de gs (CO2) d) H2S positivo

==

fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativas)fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 acares) bolhas ou meio fragmentado presena de precipitado negro

= =

Interpretao do resultado das reaes encontradas no TSIpice Vermelho Vermelho Base Vermelho Vermelho H2S neg neg Gs neg neg Interpretao mais provvel Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Enterobactria Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter

Amarelo Vermelho

Vermelho Amarelo

neg neg

neg varivel

Amarelo Amarelo

Amarelo Amarelo

neg +

varivel varivel

Obs. A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente, pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio acido (Ex: Salmonella typhi)

Mod V - 17

ETAPAS DA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS

ANLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOSA identificao de uma enterobactria comea com a anlise do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secrees: gar sangue e Mac Conkey Lquidos nobres e bipsias: gar Chocolate e Mac Conkey Fezes: Mac Conkey e Salmonella-Shigella Urina: CLED ou gar sangue e Mac Conkey, etc. Devemos considerar que: A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (gar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: gar Mac Conkey e Salmonella-Shigella. Os Gram positivos como regra no crescem em gar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, exceto os enterococos que podem crescer. No gar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, alm das enterobactrias e dos enterococos, podem crescer bactrias no fermentadoras e Candida. Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela esta presente em todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros microrganismos no muito exigentes como no fermentadores, enterococos e Candida spp. Recomenda-se realizar: Gram da colnia isolada sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativoe e leveduras). Prova da oxidase indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que tambm so fermentadores. Prova do metabolismo fermentador triagem utilizando os meios de OF glicose (quando suspeitar de no fermentador), TSI (Trplice Aucar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactrias. Srie bioqumica complementar sempre necessria para caracterizar gnero e espcie. O nmero de provas vai permitir maior ou menor discriminao (vide a seguir o nvel de complexidade de provas). As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos Gram negativos, fermentadores da glicose, com ou sem produo de gs, oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e que crescem bem no meio de Mc Conkey ou EMB. Como modelo de triagem na identificao bacteriana tem sido utilizado o meio de TSI (Triplice Aucar Ferro), que permite avaliar a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao de lactose e/ou sacarose e produo de H2S. O TSI constitui o meio de identificao preliminar mais utilizado no mundo, sendo necessrio, no entanto, necessrio adicionar algumas provas, para completar a identificao e classificadas em dois nveis de complexidade:

Nvel de complexidade 1

motilidade, indol, lisina, uria, fenilalanina, DNAse e oxidase.

citrato,

lactose

(Mac

Conkey),

Nvel de complexidade 2

provas do nvel 1 e ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato, esculina e PYR.

Mod V - 18

DESCRIO DAS PRINCIPAIS PROVAS BIOQUMICAS- Semear por picada at o fundo, e incubar 24h/35oC - Aps 24h de incubao, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfcie do meio - Meios Motilidade/indol com resazurina (motilidade); SIM (motilidade, indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina) Motilidade, H2S e Indol crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva H2S positivo = meio enegrecido H2S negativo = cor inalterada do meio Indol cor prpura = indol positivo cor do reagente = indol negativo - Inocular apenas na superfcie e incubar 24h/35oC Uria de Christensen Urease positivo = cor vermelha (Proteus: reao mais intensa) Urease negativo = mantm cor amarelada do meio - Inocular na superfcie e incubar 24h/35oC Citrato de Simmons Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio Citrato negativo = cor verde (inalterado) - Inocular a superfcie do meio (inclinado) e incubar 24h/35oC - Aps crescimento pingar na superfcie 5 gotas do reagente cloreto frrico a 10% FA positivo = cor verde escuro na superfcie FA negativo = mantm a cor do meio inalterada

Fenilalanina

IDENTIFICAO DAS ENTEROBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA

CONSIDERAESValores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio; para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral. PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo; apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal #). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrncia)= 92%. PB baixo significa ter outro padro mais frequente. Os padres bioqumicos pouco freqentes tero menor probabilidade de isolamento. No aplicado quando se considera gnero, pois envolve vrias espcies com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp.). Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (neg) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas so lisina positiva. V = valores >20% e 90%) Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37oC por 5-7dias Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio Pesquisa no sangue, LCR e urina:microscopia em campo escuro (baixa sensibilidade) ou por imunofluorescncia direta Cultura: primeiros 10 dias de doena - LCR e sangue colhido com heparina em meio de Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena. Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos

Leptospira spp.

-

Treponema pallidum -

Linfa de leses observadas em campo escuro ou colorao pela prata (Fontana); presena de espiroquetas. Imunofluorescncia direta mais sensvel Sorologia: VDRL ou FTA-abs so muito teis para diagnstico * Recursos no citados: no teis ou no disponveis BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina.

CAMPYLOBACTER

MATERIALEm caso de gastroenterite colher fezes e enviar rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais, estas podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior freqncia infeces extraintestinais.

MICROSCOPIAA colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos, mas a ausncia no contra-indica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade. Principais espcies de Campylobacter e ArcobacterBactria Catalase H2S-TSI Cresc. 15oC neg Cresc. 25oC neg Cresc. 42oC + Mac Conkey + cido Nalidixico sensvel ou resistente sensvel sensvel ou resistente sensvel ou resistente sensvel Cefalotina

C. jejuni

+

neg

resistente

C. coli C. fetus

+ +

neg neg

neg neg

neg +

+ neg

+ +

resistente sensvel

Campylobacter spp. Arcobacter * C. lari = resistente

varivel

+

neg

neg

+

varivel

sensvel *

+

neg

+

+

varivel

varivel

varivel

ISOLAMENTOA maioria das espcies de Campilobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de CO2, 10% de CO2 e 85% de N2 (microaerofilia), obtidos com geradores especficos e no apenas com vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das fezes em filtro de acetato de celulose >0,45 m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos, sendo na atualidade os mais recomendados o gar carvo desoxicolato cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona , Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos). Mod V - 42

Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC (todos crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento. As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel a presena de qualquer tamanho de halo. VIBRIOS, AEROMONAS E PLESIOMONAS A suspeita da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas evidenciada pelo: Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva. Materiais clnicos que podem, eventualmente, ser associados com maior frequncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas. Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes quadros clnicos:Bactria Diarria Infeces partes moles pouco comum Sepse Outros

Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Plesiomonas shigeloides Aeromonas hydrophila Aeromaonas caviae Aeromonas veronii

freqente

raro

raro

freqente freqente freqente freqente

raro frequente raro raro

freqente * freqente freqente freqente

raro freqente freqente freqente

* associado meningite em recm-nascidos

VIBRIOAs espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos, anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gs, e oxidase positivas. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10 espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias. A clera, causada pelo V. cholerae produtor de toxina (dois biotipos: clssica e El Tor), responsvel por diarria secretria disseminada por via fecal-oral (gua e alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas falta de condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar de assintomtico a diarria aguda com morte em 5 horas por desidratao e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos. A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de transporte de Cary & Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico. Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. gar sangue e Mac Conkey permitem o crescimento da maioria das espcies, e neste ltimo meio as colnias so semelhantes a de bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas. So oxidase positivas, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl 6%.

Mod V - 43

AEROMONAS E PLESIOMONASVivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante s diferentes condies. Aeromonas tm sido isoladas em carnes, meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e pssaros. Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso ps-picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarria, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps-acidentes (corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose negativa. As principais caractersticas das Aeromonas so: lactose negativa, H2S negativo, fenilalanina negativa, indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos (Mac Conkey e Salmonella-Shigella). Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp., E.coli e Citrobacter spp.Bactrias E. coli Citrobacter spp. Aeromonas spp.1

Citrato neg + varivel

Uria neg varivel neg

Lisina + neg +

H2S neg varivel neg

Lactose + varivel neg1

Gs + + varivel

- Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva

Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e VibrioProvas V. cholerae Outros vibrios neg + + +2

Aeromonas spp.

Plesiomonas spp.

Cresce sem NaCl

1

+1

+ neg + +

+ neg + neg

Cresce com 6% NaCl Oxidase DNAse1 2

+ + +

- crescimento em caldo nutriente - exceto V. mimicus

Provas para diferenciar as principais espcies de Aeromonas e PlesiomonasBactrias A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. jandaei A. schubertii Plesiomonas shigelloides Indol + + + + + neg + LIS + neg + + + + + ARG + + + neg + + + ORN neg neg neg + neg neg + ARA + + neg neg neg neg neg LAC neg + neg neg neg neg neg LAC = lactose SAC + + + + neg neg neg ESC + + neg + neg neg neg HEM * + neg + + + Varivel neg

LIS = lisina ARG = arginina ORN = orninina ARA = arabinose ESC = esculina HEM * = hemlise / sangue carneiro

SAC = sacarose

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6. BACILOS GRAM POSITIVOSINTRODUO Este captulo aborda os aspectos prticos para identificao dos principais bacilos Gram positivos de importncia clnica. Bactrias consideradas: Corineformes Arcanobacterium spp., Corynebacterium spp., G. vaginalis, Oerskovia spp., Rhotia spp. Erisipelotrix spp., Listeria spp., Kurthia spp.

Bacilos Gram positivos regulares Esporulados Bacilos ramificados (Actinomycetos)

Bacillus spp. Nocardia spp., Rhodococcus spp., Streptomyces spp.

Bactrias Gram positivas que so citadas no texto para fins de diagnstico diferencial, mas que foram abordadas em outros captulos so: Outros anaerbios: Mobiluncus spp. Actinomyces spp. (anaerbios) Propionibacterium spp. Clostridium spp. (anaerbios) Eubacterium Lactobacillus spp. (anaerbios) Bifidobacterium spp. Mycobacterium spp. (micobactrias) Os Actinomyces spp. e alguns Propionibacterium spp. embora anaerbios, podem ser aerotolerantes, e crescer em aerobiose.ORIENTAO GERAL NA IDENTIFICAO DE BGPS

Para triagem inicial dos Bacilos/cocobacilos Gram positivos, algumas observaes e provas so fundamentais: Colher material com antissepsia rigorosa para evitar contaminao. Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso pede-se a coleta de no mnimo duas hemoculturas. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a hiptese de ser agente infeccioso. Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos. Procurar sempre ter bacterioscopia do material clnico onde foi isolado o Bacilo Gram Positivo (BGP) e verificar se h predomnio do agente em questo; relevante o achado dentro de macrfagos / neutrfilos. Valorizar materiais nobres (sangue, LCR, pericrdico, etc.), bipsias, aspirados de abscessos, LBA, etc., desde que a bacterioscopia e o quadro clnico sejam compatveis. Cuidado com contaminao por bactrias da flora de mucosas. Em caso de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento de >104 UFC/ml. Em urina sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem >105 UFC/ml. Observar caractersticas da colnia: cor, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise, etc. Testar em quais meios cresce o BGP e suas condies de incubao. Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a colnia envelhecer ou crescer em meios pobres.

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sempre interessante semear em meio slido e em caldo para observar variao morfolgica; observar ramificaes em diferentes condies e meios de cultivo. Fazer colorao de Ziehl ou de Kinyoum para pesquisa de lcool-cido resistente. Lembrar que este grupo de bactrias pode variar muito nas caractersticas morfolgicas quando observado no material clnico culturas jovens, culturas velhas, meios slido ou lquido, meio rico ou pobre, etc., sem que represente contaminao ou cultura mista. No entanto, algumas destas bactrias so habitantes de mucosas e podem causar infeco mista associada ou no com anaerbios estritos. CORINEFORMES So classificados como corineformes as seguintes bactrias: Corynebacterium spp. Arthrobacter spp. Brevibacterium spp. Curtobacterium spp. Exiguobacterium spp. Arcanobacterium spp. Microbacterium spp. Aureobacterium spp. Turicella spp. Dermabacter spp. Gardnerella spp. Rothia spp. Cellulomonas spp.

Entre os corineformes foram selecionados aqueles de maior importncia clnica, sendo recomendvel a caracterizao e provas diferenciais apenas dos gneros: Corynebacterium spp. Arcanobacterium spp. Gardnerella spp. Rothia spp.

PRINCIPAIS DOENAS ASSOCIADAS AOS BACILOS GRAM POSITIVOSBactria Actinomyces spp., A. israelii, A. naeslundii, A. viscosus, A. odontolyticus e outros Arcanobacterium spp., A. nhaemolyticum Bacillus sp, B. anthracis, B. cereus Quadro clnico Actinomicose, doena granulomatosa predominante cervico-facial faringite, infeco de partes moles, endocardite, etc Antraz, intoxio alimentar, sepse e pneumonia em imunossuprimidos e neutropnicos difteria endocardite, bacteremia Zoonose, linfadenite e abscessos celulite em veterinrios e zona rural vaginose, endometrite, ps-parto flora oro-intestinal e vaginal, rarssimo patgeno meningite, sepses, aborto abscesso cerebral, abscesso pulmonar, etc. em imunocomprometidos bacteremia, infeco associada a corpo estranho pneumonia, abscessos, etc. em imunocomprometidos endocardite, bacteremia, infeces respiratrias Oportunista, infeces de partes moles, etc.

C. diphtheriae, C. ulcerans C. jeikeium C. pseudotuberculosis Erysipelotrix sp Gardnerella spp. Lactobacillus spp. Listeria spp. Nocardia spp.

Oerskovia spp. Rhodococcus spp. Rothia spp., R. dentocariosa Streptomyces spp.

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Triagem inicial para Bacilos e Cocobacilos Gram positivosBactria Actinomyces spp. Arcanobacterium spp. Bacillus spp. Clostridium spp. Corinebacterium spp. Erisipelotrix rhustiopathie Gardnerella vaginalis Lactobacillus spp. Mobiluncus spp. Listeria spp. Mycobacterium spp. Nocardia spp. Oerskovia spp. Ppropionibacterium spp. Rhodococcus spp. Rhotia dentocariosa Streptomyces spp. Esporo neg neg + + neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Anaer. + neg neg + neg neg neg + + neg neg neg neg + neg neg neg AAR * neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg + + neg neg varivel neg neg Ramif. neg raro /curto neg neg neg neg neg neg neg neg varivel + varivel + varivel + + Hemlise neg beta varivel varivel neg alfa beta /coelho neg neg beta neg neg neg neg neg neg neg Catalase V neg + neg varivel neg neg varivel neg + + + + varivel + + + col. coral Pleomrfico raro, hifas mvel mvel cresc. lento col. laranja col. amarela paliada H2S + Gram lbil Pleomrfico Obs.

* AAR = alcool-cido resistente

importante destacar que os corineformes correspondem a um grupo no homogneo de bactrias com poucas caractersticas em comum sendo tambm morfologicamente muito distintos:

CORYNEBACTERIUM SPPO gnero Corynebacterium compreende cerca de 50 espcies, sendo cerca de 30 de algum interesse mdico. Estas espcies podem ser diferenciadas por provas como: OF glicose reduo de nitrato urease utilizao de diferentes carboidratos reao de CAMP Principais caractersticas: no se ramificam no so alcool-cido resistentes catalase positivas imveis esculina e gelatina negativas

MORFOLOGIAVariam muito na morfologia das diferentes espcies, e mesmo mesmas culturas em diferentes condies de cultivo. So bacilos Gram positivos, retos ou ligeiramente curvos, com extremidades em geral arredondadas, com a forma de clava, podendo apresentar arranjos caractersticos em paliada ou letras chinesas, podendo ou no apresentar grnulos metacromticos, que so melhores visualizados atravs da colorao de Albert-Laybourn, e que caracterizam as bactrias conhecidas como difterides. As corinebactrias de maior importncia clnica so catalase positivas, imveis podendo ser fermentadoras ou no. So muitas as corinebactrias que se pode isolar em material clnico, entretanto, de pouco interesse aprofundar na caracterizao destas espcies, exceto para fins de pesquisa ou epidemiolgicos.

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CORINEBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICAConsidera-se fundamental o laboratrio de microbiologia poder caracterizar ou afastar a possibilidade de isolamento das espcies de C. diphtheriae e C. ulcerans que podem pproduzir a toxina diftrica. Outra espcie de importncia em infeces hospitalares e frequentemente isolada em material clnico a C. jeikeium. Difteria Em virtude da vainao compulsria, a difteria na atualidade uma doena rara em pacientes imunizados, mas de importncia epidemiolgica quando detectada. A infeco caracteriza-se por processo infeccioso localizado no trato respiratrio e manifestaes txicas no corao e nervos perifricos.Quadro clnico Coleta de material Processamento do material Semear em meios no especficos como gar sangue e gar chocolate para pesquisa do Streptococcus pyogenes e outros patgenos eventuais, e encaminhar outro swab em meio de transporte para o laboratrio de referncia. Os meios especficos para a pesquisa de bacilo diftrico so os meios de enriquecimento de Loeffler e o meio seletivo e diferencial gar sanguecistina-telurito. Bacterioscopia

Ocorre dor de garganta, dificuldade de deglutio, presena de pseudomembrana purulenta, dor no corpo, cefalia, nuseas e febre. A morte pode ocorrer por obstruo respiratria ou por miocardite. Pode ocorrer difteria cutnea com leses necrticas e, eventualmente, presena de pseudomembrana.

O material de orofaringe ou nasofaringe deve ser colhido das bordas, abaixo da pseudomembrana purulenta.

A bacterioscopia do esfregado do material, bem como do crescimento no meio de Loeffler, aps colorao de Gram pode ser sugestiva caso sejam visualizados bacilos difterides, melhor caracterizados pela colorao de AlbertLaybourn. A identificao bioqumica das Corynebactrias potencialmente produtoras de toxina difcil em laboratrio no especializado. Recomenda-se, nestes casos, encaminhar o material ou contactar o Laboratrio de Referncia para orientao.

PROVAS DIFERENCIAIS PARA OS CORINEFORMESBactria Catalase O/F1

Motilidade

Uria

Esculina

CAMP Reverso + neg neg +

Hemlise

Arcanobacterium spp. C. diphteriae C. jeikeium C.ulcerans /Pseudotuberculosis Corinebacterium spp. Gardnerella vaginalis Oerskovia spp. Rhotia spp.1 2

neg + + +

F F O F

neg neg neg neg

neg neg neg +

neg neg neg neg

beta neg neg neg

+ neg + varivel

F F F F

varivel neg varivel neg

varivel neg neg neg

neg neg + +

neg neg neg neg

neg beta neg neg2

Base CTA (cystine tripticase gar) O = oxidativo e F = fermentador gar sangue de coelho

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C. PSEUDOTUBERCULOSISImportncia clnica Deve ser lembrado nos casos de veterinrios ou trabalhadores de zona rural com quadro de linfadenite, linfangite ulcerativa ou abscesso relacionado a manuseio de aborto de gado. Esta espcie pode ser produtora de toxina diftrica. As colnias so pequenas, branco-amareladas, urease positiva, CAMP reverso positivo (inibe a beta-hemlise do S. aureus em gar sangue com hemcias de carneiro).

Isolamento e Identificao

C. JEIKEIUMCaractersticas gerais Importncia clnica Colnia pequena cinza ou translcida, a bacterioscopia um pequeno coco-bacilo gram positivo, resistente a vrios antibiticos (beta-lactmicos, gentamicina, etc). Associada a septicemia, endocardite, infeces de pele e tecido subcutneo. Infeces mais severas podem ocorrer em imunossuprimidos, como meningite, pneumonia e peritonite ou associada a prteses e procedimentos invasivos. Cresce em BHI com 1% de Tween 80, sendo lipoflica e no em caldo BHI sem Tween 80. Apresenta metabolismo oxidativo na base CTA, enquanto a maioria das Corynebacterium spp. de importncia clnica so fermentadoras. Oxida a glicose, uria negativa, esculina negativa, PYR positiva.

Isolamento e Identificao

ROTHIA * DENTICARIOSACaractersticas gerais Importncia clnica Isolamento e Identificao So bacilos Gram positivo retos, sendo alguns ramificados.

Pertence microbiota da cavidade oral, e est raramente associada endocardite.

As colnias so brancas salientes e s vezes rugosas. So fermentadores da glicose e esculina positiva.

* Rhotia spp.: So pleomrficos podendo apresentar-se tanto na forma cocide como de bacilos. So catalase positiva, imvel e fermentador.

ARCANOBACTERIUM SPP.Caractersticas gerais Importncia clnica So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e ramificaes rudimentares. Arcanobacterium haemolyticum tem sido considerado juntamente com S. pyogenes como agentes patognicos em orofaringe, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est associado com infeces de partes moles, faringite em jovens e raros casos de septicemia, endocardite e osteomielite. Crescem em 24-48h como colnias pequenas e hemolticas. Colnias mais velhas tendem a adquirir a forma de coco-bacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos. So bacilos Gram positivos irregulares, catalase negativa, imveis e fermentadores. Espcies A. haemolyticum, A. pyogenes e A. bernardiae so hemolticas, tm a hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e crescem melhores em CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de CAMP reverso (inibio da hemlise).

Isolamento e Identificao

GARDNERELLA SPP.

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Caractersticas gerais

So pequenos bacilos ou coco-bacilos irregulares, que se coram irregularmente pela violeta. A principal espcie a Gardnerella vaginalis, que tem uma classificao taxonmica incerta, e portanto para fins didticos, estudada com os coryneformes. Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituio ao Lactobacillus de Doderlein. A vaginose bacteriana e a presena de Gardnerella esto associadas tambm ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Esta bactria comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e ps-aborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em adultos. Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta, mas sem hemlise no gar sangue de carneiro. So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou no Gram pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. pleomrfica, Gram varivel (ora Gram negativa ora parcialmente e fracamente Gram positiva), imvel, sem cpsula. um anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e oxidase negativas.

Importncia clnica

Isolamento e Identificao

OERSKOVIA SPP.Caractersticas gerais So microrganismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de miclios, apresentam ramificao, hifas vegetativas, sem hifas areas e penetrao no gar. Oerskovia turbata e O. xanthineolytica so bactrias do meio ambiente ou solo, com pouca importncia clinica, com raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses. Isolamento e Identificao Cresce bem em gar sangue de carneiro e no gar chocolate. Cresce mal no meio de Sabouraud dextrose. O crescimento, quando ocorre, visvel aps 24-48h em anaerobiose ou 5% CO2. Apresentam colnias amareladas, catalase positiva em aerobiose, oxidase negativa. Fermentador da glicose, sacarose e lactose, hidrolisa gelatina, amido e esculina; motilidade varivel.

BACILOS GRAM POSITIVO

LISTERIACaractersticas gerais So bacilos uniformes, no ramificados, apresentando-se s ou em pequenas cadeias. A nica espcie importante para o homem entre as sete espcies conhecidas a L. monocytogenes. Mvel a temperatura ambiente (25 a 28oC) e imvel a 37oC. Encontrada na natureza no solo, em matria orgnica em decomposio, gua, leite e derivados, carne, etc. Sendo encontrada como microbiota de diversos mamferos, aves, peixes, e insetos. Tem importncia clnica particularmente para idosos e imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Na grvida a infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Pode ocorrer em surtos, em geral relacionados a contaminao de alimentos. Crescem em gar sangue, gar Chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e gar Mueller Hinton, mas no em Mac Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30 a 37oC, e crescem tambm temperatura ambiente e a 4oC em trs a quatro dias. A partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos, gua, etc., semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas. Bacilo Gram positivo anaerbio facultativo, catalase positiva, oxidase negativa, que produz cido de glicose. Hemlise beta em gar sangue de carneiro, CAMP positivo, motilidade positiva temperatura ambiente, hidrlise da esculina positiva e NaCl 6,5% positiva. Alm disso, verificada prova da esculina rapidamente positiva, assim como uria, gelatina, indol e H2S negativas.

Importncia clnica

Isolamento e Identificao

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ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATHIAECaractersticas gerais Bacilo Gram positivo curto, de extremidades arredondadas, anaerbio facultativo, no esporulado, no alcool-cido resistente, ocorre s em cadeias curtas ou longas, sem ramificar. Existe na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais. Vive em animais, peixes e pssaros e causa erisipela em porcos. No homem causa uma zoonose (doena ocupacional de veterinrios e manuseadores de carne e animais) caracterizada por celulite que aparece no local da inoculao aps 2 a 7 dias. A leso costuma ser violcea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite podem ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave. Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou mses, com possibilidade de recada. Material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swab da leso em geral negativa, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida. Cresce em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a 35oC aerobiose ou 5% de CO2. Cresce entre 5 a 42oC e em caldo NaCL 6,5%. No gar sangue cresce em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer, bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram positivos, s vezes corando-se mal pelo Gram Catalase negativa, imvel, esculina negativa, fermenta lentamente a glicose sem produzir gs, uria e indol negativos, mas caracteriza-se por crescer no TSI produzindo H2S; lactose positiva e sacarose negativa.

Importncia clnica

Coleta do material Isolamento e Identificao

KURTHIACaractersticas gerais So bacilos Gram positivos grandes em cadeias ou em paralelo, ou filamentos no ramificados e em culturas velhas tendem a ficar cocides ou bacilos curtos. Vivem no meio ambiente, na gua, solo, animais, sua carne e seus derivados. Seu papel clnico questionado, pois no h relatos recentes de isolamento em casos significativos. Crescem em gar sangue como colnias de cor creme no hemolticas, podendo ser confundidas com Bacillus spp. So aerbios estritos, no esporulados, no lcool-cido resistentes; so mveis, catalase positiva e no fermentadores.

Importncia clnica Isolamento e Identificao

Principais diferenas entre bacilos e coco-bacilos Gram positivosBactria Listeria monocytogenes Enterococcus spp. Streptococcus beta hemolticos Lactobacillus spp. Kurthia spp.2

Gram bacilo curto ou coco-bacilo regular e largo cocos ou coco-bacilos em cadeias cocos em cadeias coco-bacilos e cadeias longas bacilo grande, cadeias, cocide em cultura velha bacilos e coco-bacilos pleomrficos coco-bacilo ou filamentos longos

Catalase + neg neg neg + + neg2

Motil. 25oC + neg neg neg + neg neg

Hemlise beta Alfa, beta gama beta no no varivel alfa3

CAMP test + neg neg1

NaCl 6,5% Esculina +/+ +/+ neg / neg neg / neg neg / neg varivel / neg neg / neg

neg neg neg neg

Corynebacterium spp. Erysipelotrix rhusiopathiae1 3

- S S. agalactiae (beta do grupo B) positiva

- No usa glicose

- H2S positivo

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Bacilos Gram positivos anaerbios que devem ser diferenciados: Lactobacillus spp. - flora da boca, intestino e flora vaginal (Bacilo de Doderlein). So anerbios estritos mas crescem em gar sangue e gar chocolate como colnias muito pequenas. So imveis e catalase negativa. Sem valor patognico. Mobilluncus - bacilos Gram positivos anaerbios estritos, curvos, mveis que vivem na trato genital humano e reto. Encontra-se aumentado nos casos de vaginose, juntamente com a Gardnerella. Propionibacterium spp., Eubacterium spp. e Bifidobacterium spp. anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios. BACILOS ESPORULADOS AERBIOS E ANAERBIOS FACULTATIVOS Gnero Bacillus compreende cerca de 50 espcies de bacilos anaerbios facultativos que podem exibir a forma esporulada, corando-se mal pela violeta, quando em colnia mais velhas. As formas vegetativas so retas largas, podendo ser grandes, isolados ou em cadeias. A forma e localizao dos endosporos so teis para sua classificao: podem ser cilndricos, ovais, redondos, e eventualmente com forma de feijo posio central, sub-terminal, terminal dilatando ou no a clula me Todos so mveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides e a maioria catalase positiva. Na presena de on bicarbonato (HCO3 -) e em anaerobiose ou CO2 os B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium apresentam cpsula polipeptdica. Habitat e importncia clnica - Os Bacillus spp. encontram-se basicamente no solo, gua, matria orgnica animal e vegetal nas condies mais variadas de temperatura, umidade, pH, etc. As duas espcies mais importantes e que devem ser reconhecidas pelo laboratrio de microbiologia so o B. antrhacis e B. cereus. Principais espcies de Bacillus relacionadas infecoEspcie de Bacillus Antrhacis Quadro clnico Frequncia de relatos

Antrhax cutneo Anthrax intestinal Anthrax pulmonar Necrose ou gangrena em partes moles Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Infeces pulmonares, endocardite, meningite, osteomielite e endoftalmite Infeces de partes moles, abscessos, bacteremia e sepse Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar

Bastante frequente Raro Raro Bastante frequente Frequente Muito frequente Frequente

Cereus

Circulans

Frequente

Licheniformis

Pouco frequente Frequente

Subtilis

Intoxicao alimentar Bacteremia, sepse, endocardite e infeces respiratrias

Muito frequente Raro

Bacillus cereus Pode apresentar dois tipos de intoxicao: Mod V - 52

Caracterizado por diarria, dor abdominal, que aparecem 8 a 16 h aps a ingesto do alimento contaminado (carnes, vegetais, leite, molhos, massas, doces, bolos). Caracterizado por nuseas e vmitos que aparecem 1 a 5 horas aps a ingesto do alimento contaminado, principalmente arroz, mas pode ser os mesmos alimentos acima. Bacillus anthracis

Caractersticas gerais

No passado era causa importante de mortalidade no gado, sendo os herbvoros altamente suscetveis, sendo reduzida pela vacinao e melhores condies de higiene. O homem pode adquirir a doena em contato com animais doentes (trabalhadores rea rural e veterinrios), no manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais e de forma eventual, sendo a forma cutnea quase a totalidade dos casos, com raros episdios intestinais pela