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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ- UNIVALI

CURSOs DE FARMÁCIA e BIOMEDICINA/CCS

NÚCLEO DE INVESTIGAÇÕES QUÍMICO-FARMACÊUTICAS – NIQFAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Métodos de separação e identificação de

princípios ativos naturais

Profs. Dr. Angela Malheiros e Rivaldo Niero

Ferramentas analíticas

Substancia de referênciapadronização

Plantas medicinais

fitocomplexo Isolamento de princípios

ativos

FitofármacosFitoterápicos

VIII Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais – Itajaí – Out/2016

PLANTA

TESTES

BIOLÓGICOS

EXTRATO

BRUTO

EXTRATOS

SEMIPUROS

TESTES

BIOLÓGICOS

PROCEDIMENTOS

CROMATOGRÁFICOS

ELUCIDAÇÃO

ESTRUTURAL

- FRAÇÕES

- COMPOSTOS PUROS

TESTES

BIOLÓGICOS

MODIFICAÇÃO

ESTRUTURAL

SÍNTESE DE

ANÁLOGOS

TESTES

BIOLÓGICOS

RELAÇÃO

ESTRUTURA - ATIVIDADE

TESTES

BIOLÓGICOS

ELUCIDAÇÃO

ESTRUTURAL

ELUCIDAÇÃO

ESTRUTURAL

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Ferramentas analíticas

MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE

NÃO DESTRUTIVOS DESTRITIVOS

ESP. MASSAS

CHN

ULTRAVIOLETA-VISÍVEL (UV-VIS)

INFRAVERMELHO (IV)

RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Tecnicas hifenadas

– CG, CLAE

MÉTODOS QUÍMICOS

REAÇÕES

RAIO X

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MÉTODOS QUÍMICOS

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ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA

EFEITOS ESPECÍFICOS

UVIVRMN

Transições

eletrônicas

Alterações

vibracionais

Inversão de

spin

• Ionização e fragmentação

• gráfico contendo as massas dos

fragmentos carregados positivamente

EM

MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE

AMOSTRA

Reações, UV, IV,

MS, RMN 1H, 13C

DEPT, HSQC,

HMQC, HETCOR

COSY TOCOSY

HOHAHA

HMBC

HETCORLR

Raio X

Conhecer antecedentes

número Insaturações,número anéis

Existência grupos funcionais

Esqueletos

Avaliação inequívoca C/H

Correlação entre os distintos

fragmentos mediante

conectividade homonucleares

Avaliação carbonos não

protonados, conectividade de

fragmentos moleculares através de

carbonos, Sequência C-C

Esterioquímica

absoluta

VIII Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais –

Itajaí – Out/2016

– Classificação botânica: Família, gênero, espécie

Investigação preliminar

AMOSTRA

Conhecer antecedentes

* Auxílio profissionais Botânica

– Levantamento bibliográfico

Drimys brasiliensis

* Bases de dados para estabelecer possíveis antecedentes

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-Levantamento bibliográfico:

* Principais classes de met. Secundários (Review dados espectroscópicos)

* Atividade biológica

Flavonoides

Antraquinonas

Saponinas

Alcalóides

Esteróides

Taninos

Terpenos

Hidrocarbonetos

Antocianidinas

Cumarinas

Base de dados: web of science, Science direct; pubmed, science finder; etc.

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Taninos hidrolisáveis

Alcalóides indólicos

e isoquinolínicos

Condensação

Polissacarídeos

Heterosídeos

Triptofano

Fenilalanina

Tirosina

Ác. gálicoCiclo do

Ác. cítrico

Via

Mevalonato

Ornitina

Lisina

Isoprenóides

Ác. cinâmico

Fenilpropanóides

Ácido chiquímico Acetil-CoA

Ligninas

Lignanas

CumarinasAlcalóides pirrolidínicos,

tropânicos e quizinolínicos

Terpenóides

Esteróis

Antraquinonas,

Flavonóides e

Taninos condensados

Protoalcalóides,

Alcalóides isoquinolínicos

e benzilisoquinolínicos

GLICOSE

Ác. graxo

- Rota biossintética

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- Polaridade solventes extração

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AU

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

Minutes

20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00 42,00 44,00 46,00 48,00 50,00

CCD CLAE

- Cromatografia

CCD – utilização de reveladores seletivos

CLAE – Detector UV – perfil absorção

AU

0,20

0,40

0,60

nm

200,00 250,00 300,00 350,00

204,4

256,1355,9

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Informações preliminares

• O composto DW-1 foi isolado da fração de clorofórmio

• Sólido branco, solúvel em CHCl3, CH2Cl2, Me2CO e EtOH,

com ponto de fusão 47-480C.

• Classificação botânica

Família: Winteraceae

Gênero: Drimys

Espécies: angustifolia

brasiliensis

• Levantamento bibiográfico Sesquiterpenos drimanos

flavonoides

FM: hexano:AcOEt 7:3

Anisaldeído sulfúrico

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VIII Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais – Itajaí – Out/2016

Extrato clorofórmico das cascas de Drimys brasiliensis

H-C=O

H aromáticos e

H olefínicos

H-C-O

H alifáticos

AMOSTRA

UV, IV, MS,

RMN 1H, 13C

DEPT, HETCOR

HSQC, HMQC

COSY

TOCOSY

HOHAHA

HETCORLR,

HMBC

INADEQUATE

Conhecer antecedentes

número Insaturações,número anéis

Existência grupos funcionais

Esqueletos

Avaliação inequívoca C/H

Correlação entre os

distintos fragmentos

mediante conectividade

homonucleares

Avaliação carbonos não

protonados, conectividade

de fragmentos moleculares

através de carbonos

Sequência C-C

ES

TA

BE

LE

CIM

EN

TO

ES

TR

UT

UR

A M

OL

EC

LA

R

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ETAPAS PARA ESTABELECIMENTO DA ESTRUTURA MOLECULAR

1 – FÓRMULA MOLECULAR

2 – CONSTITUIÇÃO MOLECULAR

3 – ESTEREOQUÍMICA MOLECULAR

O HO

H

O HO

H

H

C15H22O2

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

Análise elementar

EMAR

RMN

RMN

bidimensionais

RMN

Constantes de acoplamento (J)

NOESY, ROESY

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1 – FÓRMULA MOLECULAR

- Espectro de massas de alta resolução

- Espectro de massas de baixa resolução

-RMN13C / DEPT

- IV OH, CO, COOH

O HO

H

H

M+ = 234

3C + 5CH + 4CH2 + 3CH3 = C15H22 = 202

234 – 202 = 32 2 O C15H22O2

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M+ = 234

2 – CONSTITUIÇÃO MOLECULAR

- Esqueleto + localização das funções

-ESQUELETO CARBONADO

DIRETAMENTE: INADEQUATE, 2D-INADEQUATE

Experimentos de RMN que permitem estabelecer diretamente as conectiviade carbono-carbono

INDIRETAMENTE: Correlações bidimensionais heteronucleares H-C (uma ligação ou várias ligações) ou Correlações homonucleares H-H

Espectros que permitem estabelecer, respectivamente, conectividades de carbonos com hidrogênios e outros carbonos próximos.

LOCALIZAÇÃO DAS FUNÇÕES

IV, RMN, UV, etc

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3 – ESTEREOQUÍMICA MOLECULAR

-ESTEREOQUÍMICA RELATIVA

DETERMIAÇÃO DE EFEITOS NOE HOMO E HETERONUCLEARES

Localização de átomos espacialmente próximos

ANÁLISES DE ACOPLAMENTO A TRÊS LIGAÇÕES

Dterminação de ângulos diedro H/H e ou H/C

ESTEREOQUÍMICA ABSOLUTA

Correlação química com substâncias conhecidas

Aplicação de métodos espectro-ópticos (DC)

Difração de raio X

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ETAPAS DE DESIGNAÇÃO INEQUÍVOCA

(INTERPRETAÇÃO) DE ESPECTROS DE RMN

Numerar os sinais do espectro de carbono-13 diferenciando claramente os que correspondem metilas, metilenos, metinos e carbonos quaternários.

Analisar a correlação direta H-C numerar correspondentemente todos os sinais de H, associando cada átomo de carbono com os seus hidrogênios.

Designar diretamente os sinais dos espectros monodimensionais de hidrogênio e de carbono que se considerem inequívocas, relacionando as correlações bidimensionais diretas de H-C

Analisar o espectro e correlação homonuclear H/H COSY tentando localizar sucessões de H interconectados vicinais. Designar os sinais correspondentes e transladar a informação obtida no espectro de carbono

Analisar a correlação indireta H/C (a duas ou mais ligações), determinando todas as conectividades observáveis para cada carbono e cada hidrogênio.

Efetuar a proposta de designação completa dos sinais (constituição molecular) e revisar até que todas as informações concordem.

CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

9--drim-7-en-11,12-dial (poligodial).

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Espectro no IV (pastilha de KBr) de DW-1

2928 cm-1 metila.

2850 e 2726 cm-1 C-H aldeído

(ressonância de Fermi).

1722 e 1680 cm-1 C=O, 1642cm-1

C...C 1462 cm-1 C-O. O H

O

H

H

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O espectro de massas de baixa resolução

picos em m/z 234 [M+], 219 [M+ - CH3],

206 [M+ - CO], 191 [206 – Me],

121 [C9H13 terpenos]

e pico base em m/z 109,

Espectro de massas (70 eV) do DW-1 C

C

H OH

O

C

C

H O

O

H

+

m/z 234

- CO

H

CO H

m/z 206

+.

H

CO H

H

CO H

+

CH3.

m/z 191

CHO

+

C

HO

m/z 122

- H

CO

+

m/z 121

-

m/z 136

CO H

m/z 110

+

- H

C O +

m/z 109

O HO

H

H

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Espectro de RMN 1H (200 MHz, CDCl3/TMS) do DW-1

O HO

H

H

3C + 5CH + 4CH2 + 3CH3 = C15H22 = 202

234 – 202 = 32 2 O

Espectro de RMN 13C (50 MHz, CDCl3/TMS) do DW-1

Poligodial ?

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CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

Espectro de NOESY (200 MHz, CDCl3) do DW-1

11 9

H

H

OH

O

15

1413

12

11

10

98

7

6

5

4

3

2

1

H

O

O

H

H15

1413

12

11

10

98

7

6

5

4

3

2

1

15

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CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

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Análise Raio X – Informação estrutural completa -

Estereoquímica absoluta

Rotação ótica e Dicroísmo circular – Quando aplicável fornecem

estereoquímica absoluta

Correlação química – A partir de um composto com a

estereoquímica absoluta conhecida, pode ser revelado a

estereoquímica de outra molécula.

Síntese – Suporte definitivo para a estrutura e estreoquímica

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DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL

Informação UV IV RMN RX EM

F. Molecular * ***

G. Funcional * *** *** *

Conectividade * * *** *** *

Geometria * * *** *** *

Estereoquímica * * *** ***

*** Excelente * Moderado

MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE

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BASES DE DADOS

http://www.acdlabs.com/products/com_iden/elucidation/

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Naproc-13

http://c13.usal.es/c13/usuario/views/inicio.jsp?lang=es&country=ES

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http://webbook.nist.gov/chemistry/

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http://sdbs.db.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi

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http://www.colby.edu/chemistry/cmp/cmp.html

VIII Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais – Itajaí – Out/2016

http://www.univali.br/ensino/pos-graduacao/mestrado/programa-de-pos-graduacao-em-ciencias-farmaceuticas

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Reservas: 47-33417645

E-mail: editora@univali.br

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niero@univali.br angela@univali.br

Agradecimentos: UNIVALI – CYTED - CNPq

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