PCR in situ PCR Hotstart - UFPel · Vantagens: Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR,...

PCR in situ

PCR Hotstart

Disciplina de Biologia Molecular

Profª. Fabiana Seixas

Graduação em Biotecnologia - UFPel

Bruno Matos e Júlia Cougo

PCR in situ

- É a técnica de PCR usada diretamente numa lâmina de tecido ou células isoladas. Para essa técnica, é adicionada a Taq Polimerase diretamente na lâmina e realizada uma ciclização diferente, em termocicladores adaptados.

- A PCR in situ combina a sensibilidade da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com a especificidade e versatilidade do imunoensaio.

São usadas técnicas de detecção do produto da PCR para análise das amplificações. Um exemplo é a PCR in situ servir para detecção da presença de cargas de DNA em tecidos ou células que se acredite estarem infectadas.

Ex: detecção de vírus por PCR in situ (amplificando o DNA do vírus) e posterior identificação do vírus. Para tanto, o DNA procurado já deve ser conhecido.

Vantagens:

- Possibilidade de identificação de patógenos desconhecidos:

Muitas doenças têm desenvolvimento de seus patógenos lento, mas apresentam sintomas. Portanto a PCR in situ é uma saída para a amplificação e identificação de DNA estranho em tecidos e células e conhecimento de que tipo de doença está ocorrendo.

- A PCR permite a correlação direta dos resultados com as características histológicas e citológicas da amostra.

- A identificação de quantidades ínfimas de DNA, bem como de células que possuam genes específicos.

Desvantagens:

- O tempo é maior que o da PCR convencional (1 ciclo leva 15 minutos, enquanto o da PCR comum leva 1 minuto).

- Não permite a análise molecular do produto da PCR, pois poderia ocorrer degradação do DNA amplificado no momento da extração das células da lâmina (por conta da fixação).

- O tempo de espera para o DNA alongar-se é maior, pois há a barreira da própria célula retendo o DNA no meio intracelular.

Etapas:

1) Preparação das lâminas

Os procedimentos de preparação do tecido ou das

células a serem submetidas à PCR in situ diferem de

acordo com a origem do tecido e seu estado após a

manipulação, mas em geral, tecidos animais passam

pelos processos normais de preparação de lâminas (em

micrótomo) e tecidos vegetais passam por processos de

secagem para irem às lâminas.

Protocolo de preparação de folhas de cana de açúcar:

- Corte as folhas em pedaços pequenos (mm máx 5x2).

- Fixação em FAA, a 4 ° C durante 24 h.

- Desidratação do tecido duas vezes, durante 30 min em 70% EtOH, seguida de 30 min de EtOH a 100%.

- Transferência para Estisol puro duas vezes durante 30 min.

- Incorporação dos tecidos em parafina ou paraplast.

- Corte de secções de 8-10 μm.

- Secagem mínima de 24 h a 40 ° C.

- Retirada da parafina em xileno (ou Histoclear) durante 5 minutos seguido por 5 min em EtOH a 100%.

- Secagem à temperatura ambiente.

2) Fixação

Substâncias que aumentam a aderência do material à lâmina.

- Fixadores:

- FAA

- Paraformaldeído

3) Degradação celular

- Pectinase (plantas)

- Pepsina (animais)

4) Adição dos componentes e da Taq Polimerase:

- Para cada lâmina, preparar 25 μl de solução:

- 2.5 μl de PCR buffer

- 4.5 μl de MgCl2 (25 mM de solução estoque)

- 4.0 μl de solução dNTP (200 mM concentração final de cada nucleotídeo)

- 1.0 μl de albumina de sorobovino 2% (BSA)

- 0.4 μl de solução dUTP digoxigenina (1 mM solução estoque)

- 1 μl de cada um dos primers: primer 1 and primer 2 (20 μM)

- 11 μl de água

- 0.5 μl de Taq polimerase

5) Termociclização e PCR em si

6) Detecção

A detecção da amplificação pode ocorrer de duas maneiras diferentes:

- Direta: marcadores (ex: Biotina) são incorporados pelo produto da PCR e na seqüência detectados por Imunohistoquímica.

- Indireta: hibridização in situ de uma sonda de DNA (radiomarcada ou não) no produto da PCR, também seguida de Imunohistoquímica.

Artigos:

PCR Hot Start

Hot Start PCR é uma forma modificada da Reação em

Cadeia da Polimerase (PCR), que evita a amplificação

não específica de DNA por inativar a Taq polimerase a

baixas temperaturas, ou por utilizar uma polimerase

especifica que necessita de um meio de ativação.

Vantagens:

Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94°C.

Outro exemplo é o da AmpliTaq Gold, que é uma enzima que atinge sua forma ativa apenas se permanecer 10 minutos em temperatura de 94ºC.

Ao mesmo tempo em que as enzimas estão sendo ativadas, o DNA está sofrendo desnaturação, portanto a enzima irá trabalhar em temperatura ideal e no momento correto (aumento da especificidade).

Desvantagens:

- Como se trata de um processo manual, há risco de

contaminação mais alto.

- No caso da compra de enzimas especiais prontas,

sejam as conjugadas ou especiais, o processo

encarece.

Formas de ativação das polimerases:

1 – Cápsula de cera: quando degradada permite a ativação enzimática.

2 – Degradação do anticorpo conjugado à enzima.

3 – Adicionar a enzima em temperatura ideal (risco de contaminação e erro)

A ativação da enzima e a desnaturação do DNA ocorrem na mesma fase, levando a polimerase a trabalhar em temperatura ótima na fase seguinte.

Referências:

http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/23819/aplicacao-tecnica-rt-pcr-situ/

http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/

http://www.bi.ku.dk/staff/BoJ/insitupcr.htm

http://www.pcrlinks.com/variants/insitu_pcr.htm

http://www.pcrlinks.com/variants/hotstart.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Hot_Start_PCR

http://www.uniscience.com/polimerases/item/1478-biotium-polimerases---pcr-hot-start

Gratos pela atenção!

PCR In Situ

e Hot Start

PCR Camila Caldeira Simões

Priscila Silveira dos Santos

Pelotas, 30 de janeiro de 2013.

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologia

Disciplina: Biologia Molecular

Profª.: Fabiana Seixas

PCR

PCR In Situ

Reação da cadeia polimerase que ocorre

dentro da célula, além de poder ser

realizado na superfície da lâmina.

Variações

PCR In Situ

RT In Situ PCR

PCR Hibridização In Situ

RT- PCR In

Situ

É a combinação entre a PCR In Situ e a

transcrição reversa.

Ela difere da PCR In Situ normal em dois

passos: na digestão com DNase e na

etapa de transcrição reversa.

PCR- Hibridização In Situ

PCR In Situ –15 ciclos a 94ºC em 1 min.

PCR Hibridização In Situ –Sondas e 35

ciclos a 94ºC em 1 min.

Aplicações

Identificação de marcadores celulares;

Localização de sequências de células específicas dentro das populações de células;

Detectar RNAs que ocorrem em um número de cópias relativamente elevado;

É mais indicada para diagnóstico viral.

Protocolo

Preparação de cortes de tecidos e

amostras de células

Digestão protease

DNase Digestão (para RT-PCR In Situ)

RT

PCR

Detecção

Vantagens

Permite a localização do sinal amplificado dentro da estrutura do tecido

Detectar DNA viral, proviral, rearranjos do DNA e translocações.

Pode detectar quantidades pequenas de DNA

Desvantagens

A barreira física de uma célula fixada

aumenta o tempo de alongamento do

DNA.

Artigo Objetivo: detecção molecular de uma pandemia de gripe A (H1N1) 2009 cepas

é possível no material de arquivo, como parafinizado pulmonares.

Métodos: RT-PCR in situ.

Resultados: Detectamos 100% de transcritos de neuraminidase das amostras

diagnosticados A (H1N1)-positivas. Nenhuma expressão foi detectada em dois

paciente (H1N1)-negativas. In situ os níveis de transcrição estão relacionados

com os resultados obtidos in vitro realizados com RT-PCR. . Análise da

sequência mostrou similaridade de 98% com o vírus da gripe relatados

anteriormente em outros lugares.

Conclusões: Foi amplificado com sucesso as sequências especificas da gripe

A e Neuraminidase, usando o material das amostras. Os resultados sugerem

que esta estratégia poderia ser útil quando as amostras clínicas de RNA são

em quantidade limitada, ou quando é de má qualidade. Porque é um método

muito sensível, que detecta o RNA viral neuraminidase em amostras de

pulmão de pacientes que morreram de pneumonia causada pelo surto de

Influenza A (H1N1) na Cidade do México.

Hot-Start

PCR

Variação do PCR, onde a reação de

amplificação é iniciada à temperaturas

elevadas.

Protocolo

Aplicações

Testes genéticos;

Diagnóstico clínico;

Exames de sangue;

Forense;

Biodefesa.

Vantagens

Aumenta a especificidade, a sensibilidade

e a rentabilidade do produto;

Ideal para ensaios Quantitativos

Ensaios Multiplex

Sem Hot-start Com Hot-start

Vantagens

Desvantagens

Maior risco de contaminação

Trabalho intensivo

Artigo Objetivo: detectar a Babesia bigemina e Babesia bovis em bovinos de

Moçambique, utilizando dois métodos distintos de PCR.

Métodos: Para este estudo, amostras de sangue foram coletadas em uma fazenda. As amostras de DNA foram analisadas usando o PCR nested e o hot start PCR. Os primers foram selecionados para o hot start PCR baseado no suposto gene de uma protease aspártica, a babesipsin, presente em ambos Babesia bovis e Babesia bigemina.

Resultados: A combinação da hot start e primers longos (29-31 pb) foram determinantes neste estudo para o sucesso da amplificação e detecção, além de que sensibilidade foi aumentada. O babesipsin no hot start PCR foi mais sensível do que a PCR nested. Um total de 117 amostras de campo foram testadas, 104 foram positivas para Babesia bigemina (90%), 97 foram positivas para Babesia bovis (82%), 86 foram infecções mistas (52%) e apenas 2 foram negativas para ambas as espécies de Babesia (1,7%).

Conclusão: Os resultados confirmam que esta doença deve ser considerada como uma ameaça para o gado importado.

Bibliografia http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/

http://www.cabdirect.org/abstracts/19950101840.html

http://182.48.17.65/img/pcr/pcr_guide_gbl.pdf#page=12

http://omega.rc.unesp.br/mauricio/curso/bibliografia/8/220/PCR.pdf

http://sci.odu.edu/impa/files/hotstartPCR.pdf

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-83822007000300004&lang=pt

http://www.molecularstation.com/wiki/PCR

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20301005

http://www.uniscience.com.br/polimerases/phusion-hot-start-flex-dna-polymerase

http://pt.scribd.com/doc/72789166/PCR-apresentacao-e-PCR-em-tempo-real-aula

http://www.uniscience.com.br/polimerases/phusion-hot-start-flex-dna-polymerase

http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/pcr/pcr_protocol.htm

http://www.pcrstation.com/hot-start-pcr/

http://www.science-protocols.com/2007/10/in-situ-pcr_17.html

http://genome.cshlp.org/content/4/4/S151.full.pdf

http://www.readcube.com/articles/10.1186/1477-3155-1-3

Obrigada!!!