Técnicas Moleculares: PCR, Sequenciamento e Southern Blot ... 4... · ANÁLISE DA PCR Calegario et...

Profa. Renata Faier Calegario

Técnicas Moleculares:

PCR, Sequenciamento e Southern Blot

Técnicas Sorológicas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 073- Biotecnologia Vegetal

ANÁLISE DA PCR

Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007

Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco

Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A, compreendendo as

extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum

RepCP

1200pb

- Apresenta alguns falsos positivos

- Importante controles +/-

- Sensível (fentograma: 10-18)

- Rápido

- Grande n° amostras

Vantagens:

Desvantagens:

PCR

Controle positivo = amostra conhecidamente positiva

Branco = sem DNA

Controle negativo = planta sadia

PCR

- Detecção de genes em DNA genômico

- Clonagem de DNA

- Sequenciamento

- Evolução molecular

- Análise de estrutura genômica

- Identificação de mutações

- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas

- Análise de plantas transgênicas

APLICAÇÕES

.....

VIDEO SEQUENCIAMENTO

HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização

Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex

Teste de complementaridade

DNA

Southern Blot Northern Blot

RNA

Sonda: sequência complementar ao DNA alvo

SOUTHERN BLOT

Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico

COMO?

Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA

Sondas Radioativas = nt 32P

Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica

ou quimioluminescente)

SONDA: sequência complemetar ao DNA

Sequência de interesse DNA genômico

Sequência de complementarao DNA genômico

TTCCAGAA* *******

Sonda com nucleotídeos marcados

SOUTHERN BLOT

DNA genômico

DNA genômico cortado

SOUTHERN BLOT

1° Passo: Digerir DNA genômico

2° Passo: Gel Agarose do DNA genômico cortado

SOUTHERN BLOT

3° Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose

SOUTHERN BLOT

Gel Agarose comDNA genômico

Membrana Nitrocelulose

SOUTHERN BLOT

3° Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose

Gel Agarose comDNA genômico

SOUTHERN BLOT

TRANSFERÊNCIA

SOUTHERN BLOT

4° Passo: Hibridização da Sonda

Sonda

DNA (-) imobilizadoSonda

Nucleotídeos marcados P32

Membrana (+)

O QUE ACONTECE NA MEMBRANA

Revelação Raio X

5° Passo: Revelação

SOUTHERN BLOT

Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos

SOUTERN BLOT

VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja

Gel - 3hs

Hibridização

18hs

α32P: d-CTP3 3

4

1 11

4 4 6 66 6

4

Cópias do transgene

DNA total Hind III

Separou o gene

PCR

Souther

Blot

SOUTERN BLOT

Plantas Transgênicas de Batata

DNA total digerido Eco RI

1 e 5: Marcador Peso Molecular2 e 4: DNA total batata transgênicadigerido co Eco RI3: DNA total batata Não-transgênicadigerido co Eco RI

Southern Blot do gel

Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perda

das mesmas ou ao silenciamento

Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da

planta, pelo efeito posicional das inserções

Alto número de inserções do transgene:

SOUTERN BLOT

Importante para a expressão estável

Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da

real interação entre as moléculas

Poucas cópias:

Sensibilidade (fentograma)

Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma

Envio de membranas para outro laboratório

Demorado

Caro

Perigoso (sondas radioativas)

SOUTHERN BLOT

Vantagens:

Desvantagens:

- Importante experimentos de Transformação => Prova

molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal

- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de

alterações no material genético

- Detecta fragmento específico em meio a milhões de

fragmentos

- Usado para distinguir estirpes de um organismo

SOUTHERN BLOT

APLICAÇÕES

Baseado na reação antígeno – anticorpo de animais de sangue quente

Anticorpos: são proteínas produzidas pelos glóbulos brancos

(linfócitos B)

Vírus: atua como antígeno quando inoculado num animal

Substância formada em reação ao vírus: anticorpo

Antígeno: substâncias estranhas ao organismo

4. MÉTODOS SOROLÓGICOS

Propriedade proteica

Anticorpo reconhece a CP

Portanto:

O antígeno é a proteína viral = Capa Proteica

Separação dos glóbulos vermelhos

4. MÉTODOS SOROLÓGICOS

Glóbulos Brancos - soro

- IgG

Região

Invariável

Sítio de reconhecimento da proteína viral

Região variável

Anticorpo

Sítio de reconhecimento da proteína viral

Epitopo Epitopo

ELISA

Western Blot

Tissue Blot

4. MÉTODOS SOROLÓGICOS

Detecta Proteína Antissoro

Y-E

O anticorpo 2° ligado

a enzima reconhece Ac 1°

O substrato é adicionadoY

Anticorpo 1°

imobilizado pelo vírus

Vírus adsorvido

Y

Y

Y-E

IndiretoAdaptado de Zerbini, 2002

Reação

Colorimétrica

4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay

Extrato Vegetal

infectado

Resultado

+

-

Absorbância Concentração viral

Leitor de Elisa: Mede absorbância (405nm)

Cor Amarela

4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay

ELISA: CiLV-C / AS = CP

Sensível (1 ng/ml)

Rápido

Baixo custo

Seguro

Várias amostras

Quantitativo

Útil para testes de rotina

Vantagens

Desvantagens

Não mede infectividade e reação inespecífica

4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay

Eletrophoretic protein separation

4.2 WESTERN BLOT

Extrato vegetal

infectado

- Enzima: fosfatase alcalina

- Quimioluminescente: CSPD ou CDP-star

- Colorimétrico: NBT/BCIP

4.2 WESTERN BLOT

Vírus

Calegario et al., 2013

4.2 WESTERN BLOT

1- Proteína Pura2- Lesões novas3 e 4 - Lesões mais velhas5 - Planta Sadia

Western Blot: antissoro contra a CP do CLV-C (1:1000)

Não mede a infectividade do vírus

Apresenta alguns falsos positivos

Membranas podem ser transportadas

Pode ser iniciada em campo pelo agricultor

Custo moderado

Várias amostras analisadas concomitantemente

WESTERN BLOT

Vantagens

Desvantagens