View
225
Download
1
Category
Preview:
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA UFBA
INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SADE
CAMPUS ANSIO TEIXEIRA
PROGRAMA MULTICNTRICO DE PS-GRADUAO
EM CINCIAS FISIOLGICAS - SBFIS
RAIMUNDO NONATO FARIA
AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
EXTRATO ETANLICO DA FOLHA DE Phanera flexuosa
(MORIC.) L. P. QUEIROZ (CAESALPINIOIDEAE) E DA
INIBIO DE FATORES DE VIRULNCIA DE Staphylococcus
aureus RESISTENTES A ANTIBITICOS.
Vitria da Conquista - BA
2012
RAIMUNDO NONATO FARIA
AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
EXTRATO ETANLICO DA FOLHA DE Phanera flexuosa
(MORIC.) L. P. QUEIROZ (CAESALPINIOIDEAE) E DA
INIBIO DOS FATORES DE VIRULNCIA DE
Staphylococcus aureus RESISTENTES A ANTIBITICOS.
Dissertao apresentada ao Programa Multicntrico de
Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas/Sociedade
Brasileira de Fisiologia para a obteno do ttulo de
Mestre em Cincias Fisiolgicas.
Orientadora: Profa. Dra. Regiane Yatsuda
Co-Orientador: Prof. Dr. Lucas Miranda Marques
Vitria da Conquista - BA
2012
Biblioteca Universitria Campus Ansio Teixeira - UFBA
Faria, Raimundo Nonato
Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa (Moric.) L. P. Queiroz (Caesalpinioideae) e da inibio de fatores de virulncia
de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos / Raimundo Nonato Faria - 2012.
129 f. : il.
Orientadora: Profa. Dr
a Regiane Yatsuda; Co-orientador: Prof. Dr. Lucas Miranda
Marques.
Dissertao (mestrado) Universidade Federal da Bahia, Programa Multicntrico de
Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas, 2012.
1. Plantas Medicinais Phanera flexuosa (Moric.). 2. Farmacorresistncia Bacteriana - Staphylococcus aureus - MRSA. I. Universidade Federal da Bahia. Programa Multicntrico de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas. II. Ttulo.
CDU 633.88
Dedico este trabalho aos meus pais, Pedro Paulo de Farias e Margarida Maria de Farias,
que sempre me proporcionaram as melhores condies possveis para o aprendizado, o
desenvolvimento do carter e da honestidade e permitir uma vida de tantas alegrias.
A Deliene Martins de Carvalho, por ser minha companheira amada, meu porto seguro e a
fora que me aconselha e sustenta nos momentos difceis, mo anam cara.
Ao meu filho Joo Pedro de Carvalho Faria, a luz que ilumina meu horizonte e me faz
querer voltar pra casa a cada dia, te amo.
Aos meus sogros Newton Rodrigues Carvalho e Hermelina Martins de Carvalho, pois sei
o quanto torceram por mim e o quanto regojizam-se com esta conquista.
Sonaly Martins de Carvalho Arajo, Ana Clara Carvalho Arajo e Newton Cleber
Martins de Carvalho por existirem e serem uma continuidade da minha famlia.
Aos professores Regiane Yatsuda e Lucas M. Marques por suas presenas, amizade e
orientaes constantes.
AGRADECIMENTOS
A Deus, Jhav, Alah, que tem sempre colocado nos caminhos trilhados por mim, pessoas
maravilhosas que me acolheram, orientaram e tornaram-se blsamo nos momentos de
dificuldade.
Agradeo s Instituies financiadoras, Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico
e Tecnolgico (CNPq UNIVERSAL 014/2008; 13389/2010-0), Fundao de Amparo
Pesquisa e Inovao Tecnolgica do Estado da Bahia (FAPESB/PPSUS 0008/2009).
O ingresso no mestrado me abriu um grande horizonte de conhecimentos, de oportunidades e,
sem dvida alguma, um imenso prazer. Hoje tenho a certeza que ningum caminha sozinho,
sempre existe algum em quem se apoiar nos momentos de fraqueza, ou compartilhar os
momentos de alegria. para elas que apresento meus mais sinceros agradecimentos e carinho.
A Universidade Federal da Bahia Instituto Multidisciplinar em Sade Campus
Ansio Teixeira (UFBA- IMS/CAT), por trazer aos rinces do estado baiano a oportunidade
e oferta de cursos de graduao e ps-graduao primando pela excelncia e qualidade.
Em especial, a minha professora orientadora, Dra. Regiane Yatsuda, pela imensa pacincia,
dedicao, amizade e pela confiana em me aceitar em seu laboratrio, pelos valiosos
ensinamentos, e por seu exemplo nico de pesquisadora.
A meu co-orientador de corao, o professor Dr. Lucas Miranda Marques, que sempre se
mostrou solcito no auxlio em momentos de dificuldade e que abriu as portas da sua famlia
para proporcionar vivncias enriquecedoras pessoais e acadmicas.
s heroicas professoras Dra. Amlia Cristina Mendes de Magalhes, Dra. Telma de Jesus
Soares e Dra. Najara de Oliveira Belo, por todo empenho, zelo e perseverana para fazer
com que o Programa Multicntrico em Cincias Fisiolgicas da UFBA, continue como um
projeto para a gerao de profissionais qualificados e comprometidos com a qualidade
acadmica.
A todos os docentes do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFMG, em especial
queles que participaram mais diretamente da minha formao acadmica e cientfica: Prof.
Dr. Andr Klein, Prof. Dr. Steyner Cortes, Profa. Dra. Miriam T. P. Lopes, Profa. Dra.
Janetti N. Francischi, Prof. Dr. Fabrcio Moreira, Profa. Dra. Daniele Aguiar, Prof. Dr.
Jorge Pesquero e Prof. Dr. Igor Dimitri Gama Duarte.
Ao Prof. Dr. Jorge Timenetsky, Aricelma Pinheiro Franca, Denise Jaqueto, Carlos
Augusto Scachetti Almeida, Profa. Dra. Glucia Maria Machado Santelli, Beatriz A.
Cortez, Roberto Cabado M. Junior, Profa. Dra. Dolores rsula Mehnet, Telma Alves
Monezi, Angelita M. O. Gusmo dos Santos e demais amigos e professores do ICB-USP
que nos receberam carinhosamente e permitiram a realizao dos experimentos necessrios ao
sucesso dessa dissertao.
Aos colegas discentes do programa de ps-graduao em Fisiologia e Farmacologia do
ICB/UFMG, por proporcionarem um ambiente acadmico acolhedor, compartilhando
convvio edificante e descontrado que minimizaram as saudades e a distncia dos entes
familiares na minha estadia em Belo Horizonte-MG: Pedro Henrique Gobira Nunes, Ana
Flvia Santos Almeida, Thrcia Guedes Viana, Giovane Galdino de Souza, Raphael
Gomes Ferreira, Viviane Saito, Lindisley Ferreira Gomides, Danielle Bernardes,
Alessandra de Castro Montandon, Amilton Cerqueira de Andrade, Rogrio Pereira
Bilheiro, Paulo Marcelo de Andrade Lima, Lukas Miranda Cangussu Gomes Oliveira,
Rosria Dias Aires, Cynthia Dela Cruz, e tantos outros que pude conviver neste perodo.
Aos pesquisadores Dr. Marcelo H. Napimoga, Dra. Juliana T. Clemente-Napimonga, Dr.
Humberto M. Spindola, Dra. Mary Ann Folgio, Dr. Pedro Luiz Rosalen e Msc. Avaldo
de Oliveira S. Filho pelo amparo, auxlio, suporte tcnico e disponibilidade para a pesquisa.
rika Pereira de Souza e Joseline Cezrio Duarte, por sua amizade, conversas,
ensinamentos, convivncia e por serem meus guias nos primeiros passos no convvio no
grupo de pesquisa e na rotina do laboratrio.
Ao esquadro dourado, que com tanto afinco e dedicao ajudou-me na rotina exaustiva dos
experimentos realizados, em especial a Gladistone Correia Messias e Geysa Silva Santos,
assim como a Mrcio Augusto Meira Santana, Mssio Piraj Mattos e Tiara Oliveira
Castro.
Aos amigos e companheiros do laboratrio de Farmacologia: Andressa Arajo Oliveira,
Camila Brito Cardoso, Cassya Maviony Fiuza Andrade, Daniel Dias Sampaio,
Emanuella Gomes Maia, Keila Silva de Jesus, Maiana Ferraz Andrade, Mahala Correia
Cludio, Monique Dutra Fonseca, Naira Kelle Barbosa Ribeiro, Priscila Silva
Cunegundes, Rafael Santos Dantas Miranda Drea, Roberta Alves Mota, e Vincius
Saboia Meireles por toda amizade e ajuda do transcorrer desta conquista. Nem tenho palavras
para agradecer a todos vocs pelo carinho e pelo cuidado que tiveram comigo. Mostrando que
realmente temos uma equipe, que sabemos trabalhar em grupo e isso uma lio que
levaremos para toda a nossa vida, um grande ensinamento, alm de muitos outros, que se
insere neste grande universo que a nossa pesquisa. Saibam que eu fui apenas porta-voz de
um trabalho desenvolvido com muito empenho de todos, e que se hoje tenho um ttulo eu
ofereo todo o reconhecimento a vocs.
Aos amigos e companheiros de laboratrio do Programa de Educao Tutorial (PET):
Aparecido Almeida Conceio, Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa, Aracely Vieira
de Melo, Deivid Alan Luz Santos, Iaquine Santos Da Silva, Jeisa Zielle de Souza
Rodrigues, Manoel Neres Santos Junior, Marcelly Machado Santos, Nayara Silva de
Macedo, Pedro Aldo Silva Cunegundes, Qeren Hapuk Rodrigues Ferreira e Saulo
Rocha Sales, que apesar de estarem no projeto mais recentemente, puderam contribuir de
forma relevante para a consecuo de nosso trabalho at o presente instante, e que com
certeza iro fazer mais ainda no futuro. Os mritos tambm so de vocs.
Aos amigos e companheiros do laboratrio de Microbiologia: Danilo Cordeiro Cariri da
Silva, Guilherme Barreto Campos, Simone Gomes de Souza, Daniel Santos Sousa,
Verena Macedo e Aline Amorim, que propiciaram os alicerces sobre o qual nosso projeto se
desenvolveu e que sempre se mostraram receptivos, cuidadosos e atenciosos em todos os
momentos em que foram solicitados. Que nossa amizade e companheirismo estendam-se alm
dos limites do tempo e do espao. Obrigado!
Aos meus colegas de jornada Anna Carolina Sade Dantas, Daniela de Oliveira Gusmo,
Everaldo Nery de Andrade, Gleisy Kelly Neves Gonalves, Jacqueline Pereira da Silva,
Leda Maria de Castro Coimbra, Liliany Souza de Brito Amaral, Samira Itana de Souza
e Thiago Henrique Caldeira de Oliveira. Tambm aos novos colegas: Erika Pereira de
Souza, Luciano E. dos Santos, Jussara A. Silva, Grazielle P. L. dos Santos e Clarissa L.
S. e Souza que enfretaro as lutas e batalhas por que passamos, mas que apesar de difceis,
so extremamente engrandecedoras e gratificantes. Fora sempre!
A Ndia Mariza Ledo Costa e Juliana Ledo Costa por abrirem seu lar e me acolherem na
minha estadia em Belo Horizonte-MG; permitindo um ambiente de conforto e descontrao
durante os momentos difceis do afastamento do lar.
A Alexandre Pereira Flores, colega e amigo especial que me acolheu inicialmente em
Vitria da Conquista, e sua companheira Janana Santos Albuquerque que permitiram
minha adaptao a esta maravilhosa cidade, que apesar de fria em clima exulta calor no
corao.
Aos meus ex-alunos e amigos da Faculdade Guanambi, que sempre foram e sero a razo
precpua do meu ingresso na vida acadmica e na busca da qualificao contnua neste
objetivo; e que mesma na ausncia nunca deixaram de manifestar apreo, carinho e desejo de
compartilharmos outras vivncias.
"Educar crescer. E crescer viver. Educao , assim, vida no sentido mais autntico da
palavra."
Ansio Spnola Teixeira.
(1900-1971)
FARIA, Raimundo Nonato. Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato etanlico
da folha de Phanera Flexuosa (Moric.) L. P. Queiroz (CAESALPINIOIDEAE) e da
inibio dos fatores de virulncia de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos. Dissertao (Mestrado) Instituto Multidisciplinar em Sade, Universidade Federal da Bahia,
Vitria da Conquista, 2012.
RESUMO
O Staphylococcus aureus um patgeno envolvido em infeces noscomiais e comunitrias.
O objetivo deste estudo foi analisar in vitro a atividade antimicrobiana do extrato etanlico da
folha de Phanera flexuosa (Moric) L.P.Queiroz (EFPF), conhecida como escada de macaco,
coletada na Floresta Nacional Contendas do Sincor (BA), sobre o crescimento bacteriano e
sobre alguns fatores de virulncia de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos
(MRSA), isolados de ambientes hospitalares de Vitria da Conquista (BA). O EFPF foi
testado nas concentraes entre 4000 a 125 g/mL na determinao de concentrao inibitria
mnima (CIM) e concentrao bactericida mnima (CBM). Foram estudados Staphylococcus
aureus ATCC 43300 e 31 isolados resistentes a oxacilina em antibiograma e que
apresentaram o gene mecA em reao de PCR. Na CIM, as placas foram incubadas a 37C,
24h, sendo interpretadas de acordo com o crescimento bacteriano e confirmado com o corante
ressazurina. Como controle dos experimentos, foi utilizado o veculo, etanol (10%, v/v).
Verificou-se a inibio de formao do biofilme de MRSA em 3, 5, 7 e 24 h, aps a exposio
ao EFPF, avaliou-se a formao de biomassa total com cristal de violeta, viabilidade celular
com MTT e morfologia do biofilme usando microscopia confocal aps 24 h (isolados clnicos
16A e 92). Foi realizada curva de crescimento de MRSA avaliando a absorbncia e
viabilidade da cultura bacteriana suplementada com 1% glicose, e tratada com o veculo ou
EFPF em concentrao subinibitria (CIM50). Nos tempos de 5 e 24 h de exposio ao EFPF,
da curva foi analisada a expresso gnica de -hla, PVL, sea, seb, spa, icaA, icaB, icaC,
icaD, icaR dos isolados 16A e 112. Foram realizadas 03 triplicatas para cada experimento e
anlise estatstica. Todos os isolados testados e a cepa ATCC apresentaram CIM ente 125 e
4000 g/mL, sendo resultados relevantes de CIM (125 g/mL) foram obtidos para a cepa
ATCC 43300 e para os isolados 27A, 27B, 28, 29, 33A, 43.1, 47.1, 52, 76, 85.1, 85.2, 92 e
113. Quanto ao CBM, ocorreu para os isolados 47.1 e 92 (4000 g/mL), isolado 12D (1000
g/mL), e isolado 29 (500 g/mL). Na inibio de formao de biofilme, os resultados em
reduo de clulas viveis e formao da biomassa total ocorreram nos tempos de 7 e 24h,
sendo que na concentrao 5000 g/mL foi efetiva no biofilme de 24 h. Quanto curva de
crescimento, a atividade antimicrobiana de EFPF ocorreu na fase final exponencial e
estacionria inicial avaliada pela reduo de absorbncia, e tambm a reduo da viabilidade
celular do EFPF em relao ao veculo nas cepas testadas. Houve diminuio da expresso de
PVL do isolado 16A tratado com EFPF (p
FARIA, Raimundo Nonato. Evaluation of the antimicrobial activity of ethanolic leaf
extract of Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz (CAESALPINIOIDEAE) and
inhibition of the virulence factors of Staphylococcus aureus resistant to antibiotics Thesis
(MsC) - Multidisciplinary Health Institute, Federal University of Bahia, Vitria da Conquista,
2012.
ABSTRACT
Staphylococcus aureus is a pathogen involved in nosocomial and community infections. The
aim of this study was to analyze in vitro antimicrobial activity of ethanol extract of leaf
Phanera flexuosa (Moric) L.P. Queiroz (EFPF), known as monkey ladder, collected in the
National Forest Contendas Sincor (BA) on bacterial growth and on some virulence factors of
antibiotic-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), isolated from hospital environments of
Vitoria da Conquista (BA). The EFPF was tested at concentrations between 4000 to 125
g/mL in the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum
bactericidal concentration (MBC). We studied Staphylococcus aureus ATCC 43300 and 31
isolates resistant to oxacillin in sensitivity and that had the mecA gene in PCR. In the MIC,
the plates were incubated at 37C, 24 are interpreted according to the bacterial growth and
confirmed with the dye ressazurin. As control experiments, we used the vehicle, ethanol (10%
v/v). There was inhibition of biofilm formation of MRSA 3, 5, 7 and 24 h after exposure to
EFPF evaluated to complete the formation of biomass with crystal violet, with MTT cell
viability and morphology of the biofilm using microscopy confocal after 24 h (16A and 92
clinical isolates). Growth curve was performed by evaluating the absorbance of MRSA and
viability of bacterial cultures supplemented with 1% glucose, and treated with vehicle or in
EFPF subinihibtory concentration (MIC50). In times of 5 and 24 h of exposure to EFPF, the
curve was analyzed the gene expression of hla-, PVL, sea, seb, spa, icaA, icaB, icaC, icaD icaR in isolates 16A and 112. 03 triplicates were performed for each experiment and statistical
analysis. All isolates and ATCC strains showed MIC being 125 and 4000 g/mL, with
relevant results from CIM (125 g/mL) were obtained for strain ATCC 43300 and isolates
27A, 27B, 28, 29, 33A, 43.1 , 47.1, 52, 76, 85.1, 85.2, 92 and 113. As to the CBM was
isolated for the 47.1 and 92 (4000 g/ml) isolated 12D (1000 g/mL), 29 and isolated (500
g/mL). Inhibition of biofilm formation, results in reduced formation of viable cells and total
biomass of the 7 and 24 times, and the concentration 5000 g/mL was effective in the biofilm
24 h. The growth curve, the antimicrobial activity of EFPF occurred at the end of exponential
and stationary initial absorbance measured by the reduction, and also the reduction of cell
viability versus vehicle EFPF the strains tested. There was decreased expression of PVL
treated with isolate 16A EFPF (p
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz. Folhas e caule em seu habitat na
Floresta Nacional (FLONA) de Contendas do Sincor- BA............................
40
Figura 2A Inibio da formao do biofilme de S. aureus ATCC 43300 resistente a
antibiticos pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.)
L.P. Queiroz EFPF........................................................................................
53
Figura 2B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus ATCC 43300 resistente a
antibiticos MRSA pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
53
Figura 3A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 16A) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
54
Figura 3B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 16A) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
54
Figura 4A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 29) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
55
Figura 4B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 29) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
55
Figura 5A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 92) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
56
Figura 5B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 92) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
57
Figura 6A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 112) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
58
Figura 6B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos
MRSA (isolado 112) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................
58
Figura 7 Micrografia dos biofilmes do isolado S. aureus 16A tratados com veculo
ou o extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz
(EFPF) pela microscopia confocal a laser.......................................................
60
Figura 8 Micrografia dos biofilmes do isolado S. aureus 92 tratados com veculo ou
o extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz
(EFPF) pela microscopia confocal a laser........................................................
61
Figura 9 Determinao da liberao da interleucina IL-1por macrfagos J774
estimulados com endotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou veculo
(Etanol 10%, v/v).............................................................................................
62
Figura 10 Determinao da liberao da interleucina IL-6por macrfagos J774
estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou veculo
(Etanol 10%, v/v).............................................................................................
63
Figura 11 Determinao da liberao da interleucina IL-10por macrfagos J774
estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou veculo
(Etanol 10%, v/v).............................................................................................
64
Figura 12 Determinao da liberao da interleucina TNF-por macrfagos J774
estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou veculo
(Etanol 10%, v/v).............................................................................................
65
Figura 13 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico de S. aureus ATCC
43300.
66
Figura 14 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico do isolado S. aureus
112...
67
Figura 15 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico do isolado S. aureus
16A...
68
Figura 16 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera flexuosa (EFPF)
sobre a expresso do gene sea na formao do biofilme de 24 h de S. aureus
ATCC 43300....................................................................................................
69
Figura 17 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera flexuosa (EFPF)
sobre a expresso dos genes -hla, PVL, sea, seb e spa na formao do
biofilme de 24 h do isolado de S. aureus 112..................................................
70
Figura 18 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera flexuosa (EFPF)
sobre a expresso do gene -hla, PVL e spa na formao do biofilme de 24
h do isolado de S. aureus 16A........................................................................
71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Sequncia dos primers utilizados na amplificao das regies promotoras dos
genes .................................................................................................................
49
Tabela 2 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz - EFPF na determinao da concentrao inibitria
mnima (CIM) e na concentrao bactericida mnima (CBM) de S. aureus
resistentes a antibiticos (MRSA).....................................................................
51
Tabela 3 Avaliao da presena dos genes de virulncia dos S. aureus (MRSA) pelo
mtodo de PCR.....................................................................................................
68
Tabela 4 caractersticas dos isolados selecionados para avaliao dos fatores de
virulncia............................................................................................................
88
Tabela 5 Protocolos de ciclos das reaes de PCR........................................................... 89
Tabela 6 Protocolo das quantidades de reagentes por tipo de PCR (x1).......................... 90
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
agr Acessory gene regulator
AIP Autoinducing peptide
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
ANOVA Anlise de varincia
BHI Brain Heart Infusion
CA-MRSA Community-Acquired Methicilin resistant S. aureus
CBM Concentrao Bactericida Mnima
CDC Center for Disease Control and Prevention
cDNA cido desoxirribonuclico complementar
ClfA/B Clumping factor A/B
CIM Concentrao Inibitria Mnima
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
Dr. Doutor
Dra. Doutora
D.P. Desvio padro
EDTA cido etileno diamino tetra actico
EFPF Extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ensaio imuno-enzimtico em
fase slida
FAPESB Fundao de Amparo Pesquisa e Inovao Tecnolgica do
Estado da Bahia
FDA Food and Drug Administration
fnb Fibronectinas estafiloccicas
FLONA Floresta nacional Contendas do Sincor
CAPES Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior
EPI Efllux Pump inihibtors
g Gramas
h Horas
HA-MRSA Hospital-Acquired Methicilin resistant S. aureus
ica Intercelular adhesin lcus
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renovveis
IH Infeco Hospitalar
IL-1 Interleucina-1
IL-10 Interleucina-10
IL-1 Interleucina-1
IL-2 Interleucina-2
IL-6 Interleucina-6
LTA cido lipoteicico
M Molar
Min Minutos
MHC II Molcula do complexo principal de histocompatibilidade do tipo II
mL Mililitros
MRSA Methicilin resistant Staphylococcus aureus
MS Ministrio da Sade
MSCRAMM Microbial surface components recognizing adhesive matrix
molecules
NaCl Cloreto de sdio
NCBI National Center for Biotechnology Information
NO xido Ntrico
OD Densidade ptica
OMS Organizao Mundial da Sade
PBP Penicilin Binding Protein
PBS Salina tamponada com fosfatos
PCR Polymerase Chain Reaction
PEG Peptdeoglicano
PNSG Polissacardeo Poli-N-succinil--1,6-glicosamina
pH Potencial hidrogeninico
PIA Polyssacaridic intercelular adhesin
PVL Leucocidina de Panton-Valentine
RNA cido ribonuclico
SarA Staphylococcal acessory regulator
SCCmec Staphylococcal cassete chromosome mec
Sea Enterotoxina estafiloccica tipo A
Seb Enterotoxina estafiloccica tipo B
Sec Enterotoxina estafiloccica tipo C
Sed Enterotoxina estafiloccica tipo D
Spa Protena A estafiloccica
TAE Tampo TRIS-cido actico EDTA
TLR2 Tooll Like Receptor tipo 2
TNF-
TSB
Fator de necrose tumoral-alfa
Triptone soy broth
TSST-1 Toxina da Sndrome do choque txico 1
UFBA Universidade Federal da Bahia
UESB Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
UFC Unidade Formadora de Colnia
UTI Unidade de Terapia Intensiva
UNESCO Organizao das Naes Unidas para Educao, Cincia e Cultura
VRE Vancomycin resistant Enterococcus faecium
v/v Relao entre volume e volume
M Micromol
L Microlitros
g Microgramas
VISA Vancomycin intermediate resistant Staphylococcus aureus
VRSA Vancomycin resistant Staphylococcus aureus
WHO World Health Organization
SUMRIO
1 INTRODUO.................................................................................................... 17
2 FUNDAMENTOS TERICOS.......................................................................... 19
2.1 AVALIAO DA ATIVIDADE BIOLGICA DE PLANTAS MEDICINAIS.......................................................................................................
.
F
19
2.1.1 Antibioticoterapia................................................................................................. 20
2.2 RESISTNCIA MICROBIANA E INFECES HOSPITALARES............ 24
2.2.1 Resistncia Microbiana.......................................................................................... 24
2.2.2 Infeces Hospitalares............................................................................................ 25
2.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS......................................................................... 28
2.3.1 Staphylococcus aureus............................................................................................ 28
2.3.2 Fatores de virulncia de S. aureus........................................................................ 32
2.4 BIODIVERSIDADE BRASILEIRA.................................................................. 37
2.5 Phanera flexuosa (MORIC.) L. P. Queiroz........................................................ 39
2.5.1 Caractersticas Botnicas e de localizao da Phanera flexuosa..................... 39
2.5.2 Composio qumica e usos medicinais.............................................................. 40
3 OBJETIVOS......................................................................................................... 42
3.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................... 42
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................................. 42
4 MATERIAL E MTODOS................................................................................. 43
4.1 COLETA E IDENTIFICAO DA ESPCIE VEGETAL............................ 43
4.2 PREPARO DOS EXTRATOS............................................................................ 43
4.3 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EFPF................ 43
4.3.1 Microrganismos.................................................................................................... 44
4.3.2 Teste de Concentrao Inibitria Mnima (CIM) e Concentrao
Bactericida Mnima (CBM) do extrato etanlico da folha de P. flexuosa
(EFPF) contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)........
57
57
44
4.4 AVALIAO DA ATIVIDADE DO EFPF SOBRE OS FATORES DE
VIRULNCIA DE S. AUREUS.....................................................................................
47
45
4.4.1 Inibio da formao do biofilme......................................................................... 45
4.4.2 Avaliao da morfologia do biofilme tratado com EFPF.................................. 46
4.4.3 Ensaio de liberao de fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucinas
(IL-1, IL-6 e IL-10) por macrfagos J774 estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF.............................................................................................
60
56
47
4.4.4 Avaliao da expresso gnica dos fatores de virulncia do S. aureus............. 48
4.5 ANLISE ESTATSITCA................................................................................... 50
5 RESULTADOS..................................................................................................... 51
5.1 TESTE DA CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) E DA
CONCENTRAO BACTERICIDA MNIMA (CBM) DO EFPF CONTRA S.
aureus................................................................................................................................
63
53
51
5.2 INIBIO DA FORMAO DE BIOFILME POR EFPF............................. 52
5.3 AVALIAO DA MORFOLOGIA DO BIOFILME TRATADO COM
EFPF.................................................................................................................................
61
59
5.4 ENSAIO DE LIBERAO DE FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA
(TNF-) E INTERLEUCINAS (IL-1, IL-6 E IL-10) POR MACRFAGOS J774 ESTIMULADOS COM EXOTOXINAS DE S. aureus TRATADOS COM EFPF...
63
63
61
5.5 AVALIAO DA EXPRESSO GNICA DOS FATORES DE
VIRULNCIA...................................................................................................... 65
6 DISCUSSO......................................................................................................... 72
7 CONCLUSO....................................................................................................... 87
8 ANEXOS............................................................................................................... 88
REFERNCIAS................................................................................................... 91
17
1 INTRODUO
A Organizao Mundial da Sade (OMS), denomina como plantas medicinais todas as
espcies silvestres ou cultivadas, quando utilizadas como recurso para prevenir, aliviar, curar,
modificar um processo fisiolgico normal ou patolgico ou quando estas so fontes de
frmacos ou de seus precursores (ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD, 2000). Em
1978, a OMS reconheceu os medicamentos de origem vegetal como recurso teraputico
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001) e recomendou aos pases que executassem
levantamentos regionais e identificao botnica de espcies vegetais usadas na medicina
popular tradicional; estimulassem e indicasse o uso das plantas medicinais com eficcia e
segurana comprovadas e contraindicassem o emprego das prticas medicinais populares
consideradas inteis ou prejudiciais (CAVALCANTE, 2010).
A busca de alternativas teraputicas complementares farmacoterapia tradicional
converteu-se recentemente numa diretriz importante no contexto da sade pblica.
Atualmente, a pesquisa de plantas medicinais eixo fundamental nas polticas de sade
implementadas pelas esferas governamentais como parte da Poltica Nacional de Prticas
Integrativas e Complementares do Sistema nico de Sade (BRASIL, 2006).
As plantas medicinais participam de forma fundamental no aumento do mercado de
medicamentos, particularmente no desenvolvimento de fitoterpicos e na identificao de
novas molculas ou prottipos bsicos para gerao de novos medicamentos sintticos
(YATSUDA, 2004), visto que muitos constituintes de plantas e/ou seus derivados
semissintticos constituem uma parcela aprecivel dos frmacos de ponta recm-introduzidos
no mercado. Trata-se de um mercado poderoso, por isso, h a necessidade de buscar novas
molculas para assegurar a competitividade na produo de novos medicamentos patenteados.
Alm disto, tambm representam a oportunidade de elaborar os medicamentos denominados
fitoterpicos, que so extratos vegetais padronizados e validados do ponto de vista da sua
eficcia, segurana e qualidade (BHATTARAM; GRAEF; KOHLERT, 2002).
O uso de fitoterpicos no Brasil constitui um mercado de US$ 400 milhes, e ainda
so recomendadas pela Organizao das Naes Unidas, que reconheceu o uso de plantas
medicinais por 2/3 da populao da Terra (BARATA, 2010). Estima-se que o Brasil possui
aproximadamente 55 mil espcies vegetais catalogadas, das quais apenas 8% foram estudadas
para identificao de molculas bioativas e, quatro mil so reconhecidas como plantas
medicinais (BRASIL, 2004).
18
A populao brasileira utiliza as plantas medicinais como antimicrobianos, uma forma
alternativa para tratamento de diversas infeces. As doenas infecciosas so a segunda causa
de morte no mundo e terceira causa de morte em pases em desenvolvimento (FAUCI, 2001).
Atualmente, a presso de seleo de microrganismos resistentes pelos antimicrobianos
consequente no s do uso indiscriminado dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente
hospitalar, ao uso teraputico ou profiltico destas drogas em medicina e odontologia
humanas, como tambm de seu emprego em medicina veterinria, na conservao de
alimentos, no combate a elementos biolgicos daninhos aos seres humanos e na engorda de
animais destinados alimentao. Atualmente, os microrganismos multirresistentes so uma
preocupao global, acarretando prejuzos financeiros e sociais estimados em 25.000 mortes e
gasto com custos hospitalares por volta de 1,5 bilho de euros na Europa e 35 bilhes de
dlares nos Estados Unidos ao ano, gerando um significativo aumento dos custos totais para o
sistema de sade (LEUNG et al., 2011).
Devido ao rpido aumento mundial da resistncia microbiana aos antibiticos
disponveis no mercado, necessria a pesquisa por novos antimicrobianos contra essas cepas
resistentes. Paradoxalmente, a busca por novos agentes antimicrobianos tem declinado nos
ltimos anos, sendo que as grandes companhias farmacuticas tm extinguido ou diminudo
seus programas de pesquisa (SPELLBERG et al., 2004).
Assim, importante estudar plantas da caatinga como a Phanera flexuosa, conhecida
popularmente como escada de macaco, uma planta ainda pouco estudada apesar do seu uso
pela populao do semirido. Tambm importante avaliar a atividade antimicrobiana da
Phanera flexuosa, principalmente frente os microrganismos multirresistentes, no intuito de
descobrir novos antimicrobianos, assim como, avaliar a influncia desse extrato sobre os
fatores de virulncia de Staphylococcus aureus, um dos principais patgenos resistentes
envolvidos nas infeces hospitalares.
A descoberta de novos produtos de origem natural ou compostos qumicos isolados
com atividade biolgica de grande interesse cientfico, ambiental, tecnolgico e econmico
para o Brasil, principalmente considerando o possvel desenvolvimento de novos fitoterpicos
e fitofrmacos, alm da gerao de patentes. Deste modo, o presente trabalho tem como
objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (Moric.) L.P.Queiroz (Caesalpinioideae) contra Staphylococcus aureus resistentes a
antibiticos, e sua influncia sobre os fatores de virulncia desses isolados de ambientes
hospitalares de Vitria da Conquista BA.
19
2 FUNDAMENTOS TERICOS
2.1 AVALIAO DA ATIVIDADE BIOLGICA DE PLANTAS MEDICINAIS
As plantas medicinais tm formado a base dos cuidados em sade em todo o mundo,
desde os primrdios da humanidade at os dias atuais, sendo que so de grande importncia
no comrcio internacional. O reconhecimento de seu valor clnico, farmacutico e econmico
continua a crescer, embora isso varie muito entre os pases. As plantas so importantes fontes
para a investigao farmacolgica e desenvolvimento de medicamentos, no s quando
fitocompostos bioativos so usados diretamente como agentes teraputicos, mas tambm
como matrias-primas para a sntese de drogas ou como modelos para os compostos
farmacologicamente ativos (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).
O valor dos produtos naturais claramente reconhecido na descoberta de novos
compostos bioativos, sendo que, das novas drogas aprovadas pelo FDA desde 1983 at 1994,
28% procedem inteiramente de produtos naturais, 39% so derivados de produtos naturais e
33% so drogas de origem sinttica (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).
As espcies vegetais apresentam a capacidade de produzir, transformar e acumular
inmeras substncias que no esto necessariamente relacionadas de forma direta com a
manuteno da vida da planta, mas garantem vantagens para a sua sobrevivncia e para a
perpetuao da espcie, sendo chamados de metablitos secundrios. A sua produo
determinada por necessidades ecolgicas e possibilidades biossintticas. Assim, os
metablitos secundrios, por serem fatores de interao entre organismos, frequentemente
apresentam atividades farmacolgicas importantes (SANTOS, 2007).
Os fitofrmacos, molculas com aes teraputicas de origem vegetal representam
uma alternativa tecnolgica e econmica em relao ao elevadssimo custo de
desenvolvimento de um novo medicamento realizado atravs da anlise combinatria e
sntese de molculas a partir de moldes biolgicos que apresentam diversos efeitos
indesejveis, tais como a prpria dificuldade de adaptao ao receptor biolgico (LASTRES
et al., 2001).
Alm disso, as preparaes vegetais tm uma caracterstica muito especial que as
distinguem de drogas qumicas: uma nica planta pode conter um grande nmero de
fitocompostos bioativos e ainda mais em uma combinao de plantas. Essa complexidade
um dos desafios mais importantes para a tentativa de identificar um nico composto bioativo
no universo enorme que inclui um nico extrato bruto (MENDONA-FILHO, 2006).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Newman+DJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Cragg+GM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Snader+KM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Newman+DJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Cragg+GM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Snader+KM%22%5BAuthor%5D
20
A avaliao do potencial teraputico de plantas medicinais e seus metablitos
secundrios, tais como alcalides, esterides, triterpenos, taninos, saponinas, flavonides,
lignanas (ARRUDA, 2008), tm sido objeto de constante estudo que inclui a investigao da
atividade farmacolgica e toxicolgica de substncias isoladas, fraes e extratos totais da
droga vegetal (ZANETTI, 2002).
2.1.1 Antibioticoterapia
Desde os primrdios da existncia humana, o homem vem sendo acometido por
doenas de origem microbiana (CLEVELAND et al., 2001; RILEY; WERTZ, 2002). Embora
na histria da humanidade, a luta contra infeces causadas por microrganismos existe h
mais de 50.000 anos, s recentemente foi descoberta a natureza infecciosa de algumas
doenas. No incio, utilizando-se de conhecimentos empricos, buscava-se na natureza a cura
para todos os tipos de doenas, onde inclusive, se usava extratos vegetais e venenos de
animais (WHITE, 2002; PAGES, 2004).
Em 1910, Paul Ehrlich, um mdico alemo, aps testar centenas de substncias
encontrou um agente quimioterpico efetivo no combate da sfilis, chamado salvarsan, um
derivado de arsnico (MCDERMOTT et al., 2003). Em 1929, o primeiro antibitico, a
penicilina G, foi descoberta por Fleming, seguido pelo surgimento de derivados
sulfonamdicos na dcada de 30 e novas classes de antibiticos nos anos seguintes (CHOPRA
et al., 2002; BUYNAK et al., 2004).
A penicilina liga-se s protenas de ligao de penicilina (PBP penicilin binding
protein) e possui 04 isoformas (PBP1, 2, 3 e 4), distintamente expressas pelo microrganismo.
Ao ser internalizado pelo microrganismo, o frmaco atua ao inibir a atividade de
transpeptidase realizada por estas PBPs, responsvel pela ligao cruzada entre a N-acetil-
glucosamina e o cido N-acetil-murmico, que formam o arcabouo da rede do
peptideoglicano, principal constituinte da parede celular bacteriana. O evento final a
inativao do agente inibidor de enzimas autolticas da parede celular bacteriana, levando a
clula lise (TIPPER, 1985; RANG et al., 2007)
A introduo da benzilpenicilina teve um efeito marcante nas taxas de mortalidade
provocada por S. aureus. Desde ento, inmeros pacientes foram curados de infeces
potencialmente fatais usando-se um ou mais esquemas teraputicos com antibiticos. Porm,
o uso indiscriminado de tais drogas resultou no aparecimento de patgenos resistentes, o que
tornou necessrio o emprego cada vez maior de novos frmacos (FALCO et al., 2002).
21
A evoluo das cepas de bactrias resistentes e multirresistentes atravs da histria
tem sido rpida e preocupante. Em 1944, foram descritas as primeiras cepas produtoras de
penicilinase em ambiente hospitalar, at ento raramente encontradas (ERSON, 2005;
ROLAIN; RAULT, 2005). O aumento da prevalncia de S. aureus resistentes a
benzilpenicilina foi inicialmente superado pela introduo das penicilinas semissintticas, e
dcadas mais tarde, pelas penicilinas sintticas (CHAMBERS, 2001).
Em 1959, a meticilina foi introduzida para o tratamento das infeces causadas por S.
aureus resistentes a penicilinas. No entanto, em 1961, no Reino Unido, ocorreram os
primeiros relatos de cepas isoladas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA methicilin
resistant S. aureus), que rapidamente apareceram em outros pases europeus, com surtos
hospitalares provocados por estes organismos. Rapidamente, houve relatos de MRSA isolados
no Japo, Austrlia, Estados Unidos e na Amrica Latina (POWERS, 2004). A resistncia
meticilina e oxacilina se deve a alterao na expresso das protenas de ligao a penicilina
(PBPs), onde uma variante mutante, a PBP2a tem menor afinidade pelos antibiticos -
lactmicos, mantendo suas funes na fisiolgica do microrganismo, garantindo sua
multiplicao (MALOUIN; BRYAN, 1986).
Uma vez que a grande maioria dos clones de MRSA, internacionalmente disseminados
nos hospitais, apresentava frequentemente multirresistncia a drogas, a vancomicina tornou-se
o antibitico de escolha para o tratamento das infeces causadas por esses microrganismos.
A vancomicina um glicopeptdio conhecido desde 1956, mas no foi utilizado anteriormente
devido o sucesso da meticilina, da oxacilina e de outras isoxazolilpenicilinas (MAINARDI et
al.,1995). Os glicopeptdeos, como vancomicina e teicoplanina, ainda constituem a
teraputica de escolha nas infeces por MRSA. Contudo, h relatos de cepas de S. aureus
apresentando susceptibilidade reduzida aos glicopeptdeos, isolados com resistncia
intermediria vancomicina (VISA) e os resistentes vancomicina (VRSA) no Japo e nos
Estados Unidos (CENTERS FOR DISEASE CONTROL PREVENTION, 2002;
HIRAMATSU et al., 1997).
A resistncia a drogas de patgenos humanos e animais um dos casos mais bem
documentados de evoluo biolgica e um srio problema, tanto em pases desenvolvidos
como em desenvolvimento. Baquero e Blzquez (1997) relataram o perigo do retorno a uma
era pr-antibitico, particularmente considerando que nenhuma nova classe de antibitico foi
descoberta nos ltimos anos, apesar das intensas pesquisas das indstrias farmacuticas. Em
vista do presente cenrio, a busca por novas substncias antimicrobianas a partir de fontes
22
naturais, como as plantas, tem ganhado importncia nas companhias farmacuticas
(DUARTE, 2006).
Entre os anos 1980-2000, as principais ferramentas utilizadas para a busca de novos
antibiticos foram a genmica e as triagens de colees de compostos, em detrimento s
triagens de produtos naturais microbianos. Porm, houve uma reduo dramtica na
identificao de novos prottipos antibiticos, ao mesmo tempo em que ocorreu um aumento
na incidncia de resistncia bacteriana (GUIMARES et al., 2010). Dentre as razes que
justificam a necessidade urgente do surgimento de novos agentes antibiticos podemos
destacar: as doenas infecciosas que so a segunda maior causa de mortalidade do mundo; as
altas taxas de resistncia microbiana em ambientes hospitalares; o decrscimo constante
observado no nmero total de novos agentes antimicrobianos aprovados pelo FDA; e a
necessidade de agentes que atuem por mecanismos de ao diferentes aos atuais frmacos em
uso, com maior seletividade e menor toxicidade (GUIMARES et al., 2010).
As plantas podem contribuir na descoberta de novos antibiticos na medida em que
possvel que metablitos secundrios com atividade antimicrobiana sejam biossintetizados
para prevenir e/ou combater o ataque de microrganismos patognicos s plantas. Gibbons
(2004) cita vrios exemplos de metablitos isolados de plantas frente Staphylococcus sp. As
plantas so possuidoras de vrias vias metablicas que do origem a compostos, tais como,
fenis, terpenos, alcalides, lecitinas, polipeptdios e poliacetilenos. Alm dessas classes,
outras substncias de origem vegetal mostram certa atividade antimicrobiana, como:
poliaminas, isotiocianatos, tiossulfinatos e glicosdeos (NOGUEIRA, 2000). Os vegetais ricos
em taninos, flavonides, leos essenciais e poli fenis esto entre os extratos mais avaliados
para esta atividade (COUTINHO et al., 2008). Deste modo, a diversidade de molculas
encontradas nas plantas faz das mesmas promissoras fontes de novos agentes antimicrobianos
(COUTINHO et al., 2008).
Os trabalhos relacionados atividade atimicrobiana de plantas tiveram incio na
dcada de 1940. Em 1943, Osborn pesquisando a atividade de 2300 plantas superiores contra
S. aureus e Escherichia coli, verificou que as plantas pertencentes a 63 gneros continham
substncias que inibiam o crescimento de um ou de ambos os microrganimos (PEDERSON;
FISHER, 1984). No Brasil, as pesquisas sobre substncias antimicrobianas de origem vegetal
iniciaram-se com Cardoso e Santos (1948) que avaliaram extratos de 100 diferentes plantas
indicadas em teraputica popular como anti-inflamatrios ou cicatrizantes/antimicrobianos.
Destas plantas, cinco extratos apresentaram atividade contra S. aureus, Escherichia coli e
Proteus X-19 (SANDERS; WEATHERWAX; MCCLUNG, 1945).
23
O estudo cientfico de plantas medicinais usados na medicina tradicional essencial
para diminuir os riscos de efeitos adversos para a populao, comprovar a atividade biolgica
das plantas e perpetuar o conhecimento tradicional sobre essas plantas medicinais. Tambm
importante que sejam realizados estudos para garantir que estes frmacos naturais sejam
seguros, estveis, padronizados e mais seletivos quanto a sua atividade biolgica.
Os produtos naturais so responsveis diretamente ou indiretamente por cerca de 40%
de todos os frmacos disponveis na teraputica moderna e, se considerarmos os usados como
antibiticos e antitumorais, esta porcentagem pode chegar a aproximadamente 70%
(PHILLIPSON, 2001; YUNES; CALIXTO, 2001). Os compostos isolados de plantas so
substncias com estruturas qumicas bem diferenciadas dos antimicrobianos obtidos a partir
de bactrias, leveduras e fungos. Tais produtos podem atuar no metabolismo intermedirio
ativando enzimas no nvel nuclear ou ribossomal, provocando alteraes nas membranas ou
interferindo no metabolismo (ESTEVAM, 2006).
No Brasil, a investigao sobre produtos naturais com atividade antimicrobiana contra
MRSA tambm aumentou significativamente nos ltimos anos. Machado et al. (2003)
estudando 14 extratos de plantas usadas tradicionalmente no Brasil para tratamento de
doenas infecciosas, verificaram que Punica granatum (rom) inibiu linhagens de S. aureus
sensveis e resistentes (MRSA) a meticilina, concluindo que esta substncia apresenta
potencial como agente no tratamento de infeces causadas por MRSA. Silva et al. (2007)
avaliaram a ao antimicrobiana do extrato hidroalcolico da casca do caule de Anacardium
occidentale (cajueiro) sobre MRSA e obtiveram Concentrao Inibitria Mnima (CIM) de
6,25 mg/mL do extrato, para 4 amostras MRSA. A atividade antimicrobiana positiva do
extrato do cajueiro frente a amostras de S. aureus, pode ser devido presena de compostos
como taninos (compostos polifenlicos) e alcalides previamente encontrados na planta, uma
vez que estes compostos tm comprovada ao antimicrobiana, e que compostos fenlicos
possuem uma ao inespecfica sobre o microrganismo, rompendo a parede celular bacteriana
e inibindo os sistemas enzimticos para a formao da mesma (HASLAM, 1996; JORGE et
al., 1996; AKINPELU, 2001).
Agente modificador de resistncia ou da atividade antibitica um termo usado para
substncias que modulam ou mesmo revertem resistncia bacteriana a certos antibiticos, ou
seja, potencializam a atividade de um antibitico contra uma cepa resistente (DE MARCO;
CUSHING; FREMPONG-MANSO, 2007; GIBBONS, 2004). Dentre esses modificadores,
destacamos vrios produtos naturais de origem vegetal (extratos e fitoconstituintes) que
alteram a susceptibilidade microbiana aos antibiticos por inibio de bombas de efluxo
24
(GIBBONS, 2004). A reserpina um composto isolado da planta Rawolfia serpentina
conhecida como inibidora de bomba de efluxo (EPI - efllux pump inhibitors), em vrios
microrganismos multirresistentes, incluindo S. aureus (GIBBONS; OLUWATUYI; KAATZ,
2003; STAVRI et al., 2007; OLUWATUYI; KAATZ; GIBBONS, 2004). Entretanto, a
toxicidade da reserpina e seus efeitos adversos em seres humanos, mesmo em baixas
concentraes (MASHOUR; LIN; FRISHMAN, 1998), limitou o seu uso, justificando-se
assim a busca de EPIs alternativas. Mohtar et al. (2009) avaliou o potencial de 13 alcalides
como inibidores e/ou agentes modificadores da resistncia atravs da inibio da bomba de
efluxo contra S. aureus sensvel meticilina (MSSA) e em cinco outros MRSA isolados,
apresentando diferentes nveis de susceptibilidade vancomicina. A notvel atividade
inibitria de efluxo foi detectada pelo quinino, piperina e harmalina, usando a reserpina como
controle positivo. Os resultados deste estudo sustentam a opinio de que um grande nmero
de fitocompostos possui potencial farmacolgico e ainda no foram descobertas.
2.2 RESISTNCIA MICROBIANA E INFECES HOSPITALARES
2.2.1 Resistncia microbiana
O uso indiscriminado dos antimicrobianos na comunidade e tambm no ambiente
hospitalar um fator de risco importante para aparecimento e disseminao da resistncia
microbiana (ANVISA, 2005). A presso de seleo de microrganismos resistentes pelos
antimicrobianos consequente no s ao uso teraputico ou profiltico destas drogas em
medicina e odontologia humanas, como tambm de seu emprego em medicina veterinria, na
conservao de alimentos, no combate a elementos biolgicos daninhos aos seres humanos e
na engorda de animais destinados alimentao. Em geral, bactrias tm a habilidade
gentica de transmitir e adquirir resistncia a drogas usadas como agentes teraputicos
(NASCIMENTO et al., 2000), pois so frequentes os relatos sobre isolamentos de bactrias
que eram reconhecidamente sensveis as drogas de uso na rotina, mas que se tornam
resistentes a todos, ou a quase todos, frmacos disponveis no mercado (SAKAGAMI;
KAJAMURA, 2002).
25
As bactrias podem desenvolver resistncia aos antibiticos por meio de alguns
mecanismos bioqumicos j bem difundidos na literatura (JACOBY, 2005; HOOPER, 2005;
BOMONO; SZABO, 2006; MIN et al., 2007). Esses mecanismos incluem:
a) modificao qumica do antibitico, atravs de enzimas especficas;
b) alterao do stio de ligao do antibitico;
c) substituio do stio de ligao da droga;
d) diminuio da permeabilidade ao antibitico;
e) aumento da sntese de substrato com o qual a droga compete;
f) efluxo do antibitico, por intermdio de transporte ativo (ROUVEIX, 2007)
g) sntese de protenas protetoras dos ribossomos.
Esses mecanismos podem coexistir em uma mesma cepa bacteriana que, ainda pode
desenvolver resistncia cruzada contra distintos antibiticos (NEU, 1992; GOLD;
MOELLERING, 1996; RUSSEL, 2002; CHOPRA et al., 2002). A resistncia pode ser
consequncia da ao de outros fatores, como o stio de infeco onde se encontra a cepa
bacteriana e a concentrao do antibitico.
A colonizao por S. aureus, especialmente envolvendo amostras multirresistentes, em
pacientes hospitalizados e profissionais de sade, representa um srio problema para a sade
pblica (SCOTT; BLOOMFIELD, 1990). O Ministrio da Sade (MS), na portaria n 2.616
de 12/05/1998, define infeco hospitalar (IH) como a infeco adquirida aps a admisso do
paciente na unidade hospitalar e que se manifesta durante a internao ou aps a alta, quando
puder ser relacionada com a internao ou procedimentos hospitalares. So tambm infeces
hospitalares aquelas manifestadas aps 72 horas da internao, quando associadas a
procedimentos diagnsticos e/ou teraputicos, realizados durante este perodo (BRASIL,
1998).
2.2.2 Infeces hospitalares (IH)
As infeces hospitalares constituem atualmente um problema de sade pblica.
Inferncias epidemiolgicas as colocam como uma das principais causas de
morbimortalidade, alm de constiturem significativa carga social, emocional e econmica
para os pacientes e para todo o sistema de sade. No Brasil, mesmo com a legislao vigente
no pas, os ndices de IH permanecem altos, em torno de 15,5%, o que corresponde a 1,18
episdios de infeco por paciente internado nos hospitais brasileiros. Alm disso, considera-
se mais um agravante, o fato das instituies pblicas de sade possurem a maior taxa de
26
prevalncia de IH no pas, com 18,4% (PRADE, 1995). Uma infeco hospitalar acresce, em
mdia, 5 a 10 dias ao perodo de internao. Alm disso, os gastos relacionados a
procedimentos diagnsticos e teraputicos da infeco hospitalar fazem com que o custo do
tratamento dos clientes com IH seja trs vezes maior que o custo dos clientes sem infeco.
Dados da literatura internacional demonstram, por exemplo, que as unidades de terapia
intensiva so propcias ao aparecimento e disseminao da resistncia microbiana. Os
pacientes mais vulnerveis para adquirirem bactrias multirresistentes so os internados em
setores crticos do Hospital, como Unidades de Terapia Intensiva, Berrio de neonatos, Setor
de Dilise e Transplantados, ou que necessitem de observao mais rigorosa e utilizao de
procedimentos teraputicos invasivos (RICHARDS et al., 1999; 2000). Os pacientes desses
ambientes esto em estado mais grave e so submetidos aos vrios procedimentos invasivos
que regionalmente utilizam antibiticos de amplo espectro de ao. Alguns locais e materiais
reutilizados nos hospitais so descritos na literatura como fatores de risco para a aquisio de
microrganismos antibitico-resistentes, para o surgimento de infeces nosocomiais e a
disseminao destes como algumas cepas de estafilococos e bacilos Gram-negativos.
Outra caracterstica, que contribui para a sua persistncia em hospitais, a capacidade
dessas cepas de sobreviver por longos perodos de tempo fora do corpo humano (KRAMER;
SCHWEBKE; KAMPF, 2006). Estudos sobre as caractersticas do biofilme formado pelos S.
aureus revelaram que essas cepas so capazes de persistir por at 7 meses sobre superfcies
inanimadas secas (SCOTT; BLOOMFIELD, 1990; WAGENVOORT; PENDERS, 1997;
NEELY; MALEY, 2000), principalmente se essas superfcies forem plsticas (KRAMER;
SCHWEBKE; KAMPF, 2006). As superfcies inanimadas e os equipamentos so possveis
fontes de bactrias, principalmente as resistentes (DREES et al., 2008; KAYABAS et al.,
2008). No raramente apontada a contaminao de equipamentos, superfcies e solues de
limpeza por microrganismos de importncia epidemiolgica. Estes dados se tornam
extremamente relevantes em hospitais, onde as superfcies esto frequentemente
contaminadas com patgenos nosocomiais e em contato com as mos, representam
importantes vetores de transmisso cruzada.
Alguns locais e materiais reutilizados nos hospitais so descritos na literatura como
fatores de risco para a aquisio de microrganismos antibitico-resistentes, para o surgimento
de infeces nosocomiais e a disseminao destes como algumas cepas de estafilococos e
bacilos Gram-negativos. Amrutkar et al. (2006) citam que existem vrios outros fatores de
risco que podem colocar os pacientes em risco de candidemia e bacteremia, como o uso de
materiais termossensveis que so desinfetados e reutilizveis, incluindo-se cateteres
27
intravenosos, instrumentos para nutrio parenteral, ventilao mecnica, entre outros
materiais como mscara de nebulizadores (CATHERINE et al., 2007; KIKUCHI et al., 2007).
Os profissionais da sade tambm tm sido apontados, por meio de suas mos, como
importantes fatores de disseminao do MRSA no ambiente hospitalar. Estes profissionais
adquirem transitoriamente o microrganismo atravs do contato com o paciente infectado, ou
mesmo, colonizado, ou ainda pelo contato indireto, atravs do ambiente, via reservatrios
inanimados (BOYCE; POTTER-BYNOE; CHENEVERT, 1997).
No Brasil, a frequncia de isolamento de S. aureus MRSA e sua relao com infeces
hospitalares atingem valores elevados. Em muitos hospitais brasileiros, a prevalncia de
isolamento de cepas de MRSA varia de 40 a 80% (OLIVEIRA et al., 2001; TRINDADE et
al., 2005). Um estudo realizado no Hospital Espanhol em Salvador (BA) demonstrou que em
9 anos a prevalncia dessas bactrias resistentes meticilina/oxacilina foi de 28%, sendo que
os lugares com maior deteco dessas bactrias foram a UTI (59%), a unidade de hemodilise
(43%), unidade de doenas infectocontagiosas (34%), unidade neonatal (18,5%) quando
comparados com os outros locais do hospital (BRITES et al., 2006). Foram relatados por
Souza e Figueiredo (2008), 68 casos de infeces atribudas ao S. aureus resistente oxacilina
entre fevereiro de 2003 a janeiro de 2006 no Hospital Universitrio Regional de Maring. A
avaliao de diferentes materiais clnicos detectou maior prevalncia de isolamento em pontas
de catter (39,2%) e em secrees orotraqueais (34,2%).
Cepas de S. aureus resistentes meticilina, enterococos resistentes vancomicina e
bastonetes Gram negativos multirresistentes esto tornando prevalentes tambm em hospitais
infantis (BIZARRO; GALLAGHER, 2007). A vancomicina era o nico antibitico efetivo
contra os MRSA, mas, em 1997, foram descritos S. aureus com resistncia vancomicina e
teicoplanina. Estafilococos com resistncia aos glicopeptdeos foram recentemente
encontrados no Brasil. Registrou-se o isolamento de S. aureus com resistncia intermediria
vancomicina no Rio de Janeiro, em So Paulo e Porto Alegre e de estafilococos coagulase
negativos resistentes vancomicina e teicoplanina em So Paulo (OTLIA; 1999;
MAMIZUKA; OLIVEIRA, 2000).
Assim, a aquisio de MRSA pode levar a consequncias adversas graves para os
pacientes, alm de ampliar o tempo de hospitalizao e aumentar os custos relacionados com
a assistncia mdico-hospitalar (HUANG; PLATT, 2003). Deste modo, nos ltimos anos, as
indstrias farmacuticas tm sido motivadas para o desenvolvimento de novas drogas
antimicrobianas, especialmente em funo da ocorrncia de resistncia microbiana a tais
medicamentos.
28
2.3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
2.3.1 Staphylococcus aureus
Os microrganismos do gnero Staphylococcus pertencem famlia Micrococcaceae e
apresentam forma de coco, tendendo a formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva.
So gram positivos, possuindo dimetro variando entre 0,5 e 1,5 m, imveis e no formam
esporos. Possuem metabolismo fermentativo e respiratrio, neste ltimo, vindo a produzir
catalase (VARNAN; EVANS, 1991; KLOOS; BANNERMAN, 1999). Crescem em meios
comuns, pH 7, temperatura de 37C. O gar manitol-sal um meio seletivo para essa
espcie, devido capacidade desse microrganismo fermentar o manitol com produo de
cido ltico. As colnias formadas, aps 18-24 horas de incubao, so arredondadas, lisas e
brilhantes. A cor da colnia varia do acinzentado ao amarelo-ouro. Na cultura em gar sangue
caracterstica a formao de um halo de beta hemlise ao redor das colnias (KONEMAN et
al., 2001).
Staphylococcus spp. possui uma distribuio ubiquitria, sendo seu reservatrio
primrio a pele e membranas mucosas, especialmente a regio nasofarngea de mamferos e
aves (ATANASSOVA; MEINDL; RING, 2001). Atualmente, o gnero composto por 38
espcies e 24 subespcies (EUZBY, 2005), sendo que algumas so frequentemente
associadas a uma ampla variedade de infeces de carter oportunista, tanto em seres
humanos como em animais (TRABULSI; TEIXEIRA; BUERIS, 2004). Dentre estas espcies,
destaca-se S. aureus como a mais envolvida em doenas em seres humanos (KONEMAN et
al., 2001).
Os S. aureus so normalmente encontrados colonizando a pele e membranas mucosas
de humanos. Elevadas concentraes desse microrganismo podem estar colonizando as axilas,
poro anterior das narinas e o perneo. Porm, essas bactrias tambm podem estar
distribudas em outros nichos, como orofaringe, boca, vagina, trato intestinal e glndulas
mamrias (WERTHEIM et al., 2005). A capacidade de um patgeno de superar as defesas do
organismo humano, conseguir coloniz-lo e manifestar a sua patogenicidade so os fatores
responsveis pela variao no quadro de sinais e sintomas que caracterizam as patologias
(CARDOSO et al., 2007; ROUVEIX, 2007). A patogenicidade das bactrias determinada
29
pelo desenvolvimento de mecanismos que contribuem para o aumento de sua capacidade de
infeco e que ajudam a burlar o sistema imunolgico do hospedeiro (CHOPRA et al., 2002).
O S. aureus tambm o principal patgeno envolvido em uma grande variedade de
manifestaes clnicas, tais como infeces de feridas, pneumonia, septicemia e endocardite
tanto em pases desenvolvidos como os Estados Unidos, e tambm aqueles em
desenvolvimento. um microrganismo nico quando comparado a outros clinicamente
relevantes, pois apresenta trs caractersticas fundamentais: apresenta uma srie de fatores de
virulncia, apresenta capacidade crescente de desenvolver resistncia a antibiticos, e
responsvel por infeces nosocomiais e comunitrias (JACOBSSON, 2009). Agentes
antimicrobianos -lactmicos, como a penicilina, so os frmacos de escolha para o
tratamento das infeces graves por S. aureus. Contudo, a partir da introduo dos mesmos a
partir da dcada de 1940, rapidamente surgiram cepas resistentes, por meio da produo de -
lactamases (penicilinases), enzimas que inativam tais frmacos. A seguir, foram introduzidas
novas drogas resistentes ao das -lactamases, tais como a meticilina no uso clnico,
surgindo posteriormente o S. aureus resistente meticilina.
O S. aureus resistente meticilina (MRSA) surgiu a partir de 1960, como importante
patgeno hospitalar em todo o mundo (CHAMBERS, 2009; DIEKEMA et al., 2001;
HIRAMATSU et al., 2002). Inicialmente, restritas ao ambiente hospitalar (hospital-acquired
methicillin resistant S. aureus, HA-MRSA), as cepas resistentes tomaram um novo perfil a
partir da dcada de 1990, com infeces comunitrias (community-acquired methicillin
resistant S. aureus, CA-MRSA) relevantes em indivduos saudveis e no sujeitos aos fatores
de risco do ambiente hospitalar, tais como cirurgias, imunossupresso e outros
(KOBAYASHI; DeLEO, 2009). O aumento da prevalncia de MRSA tornou-se uma grande
ameaa para o setor da sade em todo o mundo, devido principalmente sua virulncia,
opes teraputicas limitadas e sua distribuio em ambos os ambientes, hospitalar e
comunidade (HULETSKY et al., 2004).
A resistncia dos S. aureus a meticilina causada principalmente pela aquisio
exgena do gene mecA, que codifica uma protena de ligao penicilina (PBP penicilin
binding protein) com baixa afinidade de ligao ao antibitico, denominada por PBP2a ou
PBP2 (HIRAMATSU et al., 2001).
O gene mecA, confere a expresso da resistncia meticilina/oxacilina em S. aureus.
O gene mecA carreado por um elemento gentico mvel de 26 a 67 kilobases, denominado
cassete cromossmico estafiloccico (staphylococcal cassette chromosome mec - SCCmec)
30
(KURODA et al., 2001), responsveis por codificar a protena de ligao alterada, resultando
no quadro de multirresistncia. O sequenciamento de vrias linhagens de MRSA tem revelado
oito diferentes altipos de SCCmec, tipos I-V, todos carreando dois componentes genticos
essenciais combinados, conhecidos como complexo gnico mec e o complexo gnico cassete
cromossmico recombinase (ccr). Os isolados de MRSA associados ou adquiridos na
comunidade (CA-MRSA) apresentam caractersticas fenotpicas e genticas distintas, quando
comparadas s cepas tpicas isoladas nos hospitais (HA-MRSA). O SCCmec tipo I (34 kb) foi
detectado na cepa NCTC 10442, o primeiro MRSA isolado em 1961, no Reino Unido. O tipo
II (52 kb) foi identificado em uma cepa de MRSA, isolada no Japo em 1982, denominada
N315, e o tipo III (66 kb) foi identificado em uma cepa de MRSA, isolada em 1985 na Nova
Zelndia e foi denominada 82/2082.
Posteriormente, foi identificado em duas cepas associadas a infeces comunitrias, o
menor elemento mec, o tipo IV (20 a 24 kb), que confere aos MRSA um perfil de
sensibilidade diferente dos outros trs tipos, sendo sensvel s outras classes de
antimicrobianos, que no os -lactmicos. (DUARTE; LENCASTRE, 2002; OKUMA et al.,
2002). O mec tipo V (28kb) foi descrito a partir do cromossomo de uma cepa de MRSA, de
origem comunitria, isolada na Austrlia, denominada WIS (WBG8318). Este elemento foi
estruturalmente similar ao SCCmec tipo IV. (ITO et al., 2004). No final de 2006, outro tipo
SCCmec foi proposto - o tipo VI. Cepas caractersticas deste tipo possuem o complexo mecB,
o ccrAB altipo 4 e uma regio especfica J1. Quinze cepas de MRSA contendo SCCmec
tipoVI foram inicialmente descritas no hospital Dona Estefnia (Lisboa) e outras quatro cepas
foram encontradas em outros trs hospitais, sendo dois tambm situados em Lisboa e outro em
Coimbra (OLIVEIRA; MILHEIRIO; DE LENCASTRE, 2006).
Em 2008, Higuchi et al.(2008) demonstrou a presena do SCCmec tipo VII, em cepas
CA-MRSA pertencendo ao tipo de sequncia multilocus (ST) 59 de Taiwan, tinha 41.347
pares de base em tamanho e flanqueado por 19 pares de bases de sequncias attL e attR. A
regio central de 21.245 pares de bases contm o complexo mec (C2b) e outro ccrC gene
(ccrC2), e era altamente homlogo ao SCCmecV, mas com substituies, inseres e
rearranjos. A poro final do lado 3 apresentou uma sequncia nica de 10.191 pares de
bases.
Os SCCmec tipos I, II e III esto associados a cepas de origem hospitalar que tm
como caracterstica a resistncia a mltiplos antimicrobianos alm dos -lactmicos como os
macroldeos, aminoglicosdeos, tetraciclinas, rifampicina, cotrimoxazol e quinolonas
31
(HIRAMATSU et al., 1997). Muitos isolados de MRSA que apresentam mltipla resistncia
so susceptveis apenas aos glicopeptdeos como a vancomicina. Os SCCmec tipo IV e V no
possuem nenhum outro determinante de resistncia a antimicrobianos alm do gene mecA, o
que explica uma das principais caractersticas dos isolados comunitrios de MRSA, a
sensibilidade a diversos antimicrobianos no -lactmicos. (DUARTE; LENCASTRE, 2002;
ENRIGHT et al., 2002; OKUMA et al., 2002; ITO et al., 2004).
O complexo gene mec corresponde s regies do gene mecA e dos reguladores para a
expresso do mecA (mecR1 e mecI), e ainda o complexo gene ccr, correspondendo regio
onde se encontram os genes para as recombinases, as quais so responsveis pela mobilidade
do SCCmec. O gene mecA um segmento de DNA exgeno, ou seja, que no nativo do S.
aureus, de 2,1 Kb, e controlado pelos genes mecR1 e mecI. O produto do gene mecI reprime
a expresso do mecA ao se ligar ao operador, sendo esta represso revertida pela presena
de meticilina ou qualquer outro -lactmico no meio (mecanismo de induo). J a protena
mecR1, um produto do gene mecR1, uma protena de membrana envolvida em um sistema
de transduo de sinal, a qual reconhece a presena de -lactmicos atravs de seu domnio
extracelular ligador penicilina. Seu domnio citoplasmtico apresenta atividade de protease e
degrada o mecI, permitindo assim a transcrio do gene mecA. (McKINNEY et al., 2001).
Alm desses genes, outros elementos genticos tambm podem estar presentes, dentre
eles os elementos de insero IS431 e IS257, os plasmdeos pUB110 e pT181 e o transposon
Tn554, que carreia genes de resistncia eritromicina e espectinomicina. Em adio, a
presena de mais de uma cpia do IS256 parece servir como hot spot (regies de elevada
frequncia de recombinaes) para a insero de outros genes de resistncia s drogas. Assim,
torna-se claro o porqu dos MRSA apresentarem, frequentemente, mltipla resistncia aos
antimicrobianos associado presena do gene mecA (KATAYAMA; ITO; HIRAMATSU,
2000).
O gene mecA regulado pelos genes mecI e mecR1, similarmente regulao do blaZ
pelos genes blaI e blaR1 frente exposio penicilina. Na verdade, mecI e mecR1 so
homlogos ao blaI e blaR1. A expresso dessa resistncia pode ser homognea ou
heterognea. Na expresso homognea todas as colnias expressam resistncia oxacilina e
na heterognea expressa apenas por parte das colnias apesar da presena do gene mecA,
dificultando a interpretao do teste (ROSSI; ANDREZZI, 2006).
Alguns genes, denominados genes auxiliares ou fatores essenciais, o gene fem (factor
essential for methicilin resistance), auxiliam o gene mecA a expressar um alto nvel de
resistncia aos beta-lactmicos. Foram identificados muitos desses genes fem, denominados
32
femA, femB, femC, femD, femE e femF (VANNUFFEL et al., 1995). O gene femA essencial
para a expresso da resistncia dos MRSA e parece ser uma caracterstica peculiar de S.
aureus, no sendo encontrado em outras espcies de estafilococos. Outro importante
mecanismo de resistncia o efluxo em MRSA, sendo este identificado como um dos
principais contribuintes para a resistncia de vrios antibiticos estruturalmente
independentes. As bombas de efluxo so protenas integrantes da membrana plasmtica
bacteriana e que tm sido responsabilizadas por diversos casos de resistncia a drogas, as
quais so expelidas para fora da clula (PIDDOCK, 2006).
2.3.2 Fatores de virulncia de S. aureus
A capacidade de colonizao e patogenicidade de S. aureus so provenientes de seus
fatores de virulncia. Tais fatores permitem sua aderncia s clulas do hospedeiro ou
matriz extracelular, invadem as defesas imunolgicas e proporcionam a invaso celular,
penetrao tecidual ou adeso a superfcies de catteres e prteses. Esses diferentes
mecanismos de sobrevivncia, que partem dos constituintes de parede celular e da produo
de enzimas e toxinas oferecem proteo ao microrganismo e permitem sua disseminao
(VELZQUEZ-MEZA, 2005). As leses superficiais decorrentes de S. aureus incluem
infeces cutneas como impetigo, foliculite, terol, furnculo, carbnculo e mastite
(LEVINSON; JAWETZ, 2005). Em carter sistmico pode ocasionar pneumonia, artrite,
endocardite e bacteremia (STAPLETON; TAYLOR, 2002). S. aureus tambm esto
relacionados osteomielites. A expresso de adesinas que permitem a fixao aos
componentes da matriz ssea, o fato de sobreviver intracelularmente em osteoblastos e a
capacidade de formar biofilmes na superfcie de materiais estranhos ao organismo como as
prteses, armam em conjunto, proteo contra o sistema imunolgico do hospedeiro e tornam
essas cepas tolerantes ao dos antimicrobianos (DAVIS, 2005).
A formao do biofilme bacteriano tem sido descrita desde que Van Leeuwenhoek
descreveu as placas bacterianas de seus prprios dentes no sculo XVII. Entretanto, demorou
at 1978 para que houvesse o entendimento da importncia dessas estruturas nos
ecossistemas, e seu significado mdico, por meio dos conhecimentos obtidos para explicar sua
estrutura e relevncia. (DONLAN; COSTERTON, 2002).
Biofilmes so complexas comunidades microbianas fixadas em uma superfcie e
embebidas em uma matriz extracelular. Estas comunidades podem se fixar em uma grande
33
variedade de superfcies com composies qumicas diversas. Esforos tm sido realizados
para compreender como se d o processo de adeso, desenvolvimento e maturao dos
biofilmes, assim como a sua capacidade de desagregamento e disperso, disseminando-se para
outras superfcies (BOLES; HORSWILL, 2011).
Do ponto de vista mdico, a formao de biofilmes representa um importante
mecanismo de virulncia microbiano, pois ao aderir a superfcies e produzir uma matriz
polissacardica, o microrganismo garante a continuidade do processo infeccioso, assim como
maior resistncia aos mecanismos imunolgicos do hospedeiro e tambm maior resistncia
aos antimicrobianos que as clulas planctnicas do mesmo agente patognico (RODRGUEZ-
MARTNEZ; PASCUAL, 2008; BRYERS, 2008).
H uma clara percepo de que as clulas bacterianas em crescimento nos biofilmes se
comportam distintamente das clulas com crescimento planctnico, com alterao no padro e
na taxa de expresso gnica de molculas essenciais para seu metabolismo, assim como de
fatores de virulncia (MACK et al., 2004). Nestas situaes, assume papel preponderante um
sistema de intercomunicao celular conhecido como quorum sensing, que constitudo por
pequenas molculas secretadas pelas clulas bacterianas (AIP- autoinducing peptide)
moduladas pelo complexo gnico agr (acessory gene regulator) e tambm pelos complexos
SarA e RNAIII, dentre outros (YARWOOD et al., 2004). Foi demonstrado que nas populaes
bacterianas em biofilme existem variantes que expressam distintamente fatores de
virulncia relacionados ao processo de adeso e crescimento bacteriano dos prprios
biofilmes, como as adesinas, fibronectinas entre outros, e que so geralmente modulados pelo
complexo agr (YARWOOD et al., 2007).
A formao do biofilme um processo dividido em etapas que depende da aderncia
do microrganismo superfcie a ser colonizada, seguida da secreo das molculas de adeso
intercelulares, secreo da matriz polissacardica, consolidao da estrutura e em seguida o
destacamento de fraes ou pedaos que facilitam a disperso e persistncia da infeco. O
fundamental neste processo a produo da adesina polissacardica intercelular (PIA
polyssacaridic intercelular adhesin) que codificada pelo operon ica (intercelular adeshin
locus) (FLUCKIGER et al., 2005) nos S. aureus.
Tal operon contm os genes icaA, icaB, icaC, icaD que produzem enzimas
responsveis pela sntese do principal componente da PIA, o polissacardeo poli-N-succinil--
1,6-glicosamina (PNSG), que apresenta resposta imunognica e tem sido testado como
potencial alvo de vacinas; alm do gene icaR um modulador negativo do sistema de expresso
(WILSON et al., 2011). O gene icaA responsvel pela produo de protena transmembrana
34
com funo de N-acetil-glucosamina transferase, e que para a sua tima atividade, requer a
co-expresso do produto do gene icaD. O polissacardeo produzido alcana um tamanho
mximo de cerca de 20 resduos, sendo necessria a co-expresso do produto do gene icaC
para obteno de estruturas de maior extenso. O produto do gene icaC tambm est
envolvido na translocao do produto de sntese polissacardica para a superfcie celular,
enquanto o produto do icaB responsvel pela desacetilao do carboidrato que relevante
para os mecanismos de adeso intercelular e com as superfcies que so substrato para a
instalao do biofilme (OGARA, 2007). O papel dos genes icaA e icaD para formao de
biofilmes, tanto em S. aureus quanto S. epidermidis foi demonstrado a partir do isolamento de
microrganismos de catteres urinrios de pacientes, apresentando uma importante correlao
entre os isolados fortemente produtores de biofilme e a presena de tais genes nas espcies
estudadas (GAD et al., 2009).
O produto do gene icaR membro da famlia TetR de protenas regulatrias, e
localiza-se no mesmo locus, sendo divergentemente transcrito em relao ao icaADBC. Ele
responsvel pela regulao negativa, ligando-se ao promotor 5 do cdon de inicializao do
gene icaA. A transcrio de icaADBC tambm regulada positivamente pelo regulador
global SarA e pelo fator SigB em condies de stress e por algumas cepas (CUE et al., 2009)
Alm disso, estudos recentes tm demonstrado mecanismos independentes do operon
ica e da presena de PIA para formao de biofilmes, pois isolados que no possuem esses
genes, isolados defectivos, tm mantido esta propriedade patognica. O papel dos reguladores
globais agr e SarA tm sido elucidado, atuando de formas divergentes, enquanto o sistema
SarA est envolvido no ataque e adeso s superfcies, o sistema agr parece estar envolvido
nos mecanismos de disperso (LAUDERDALE et al., 2009)
Anlise de isolados clnicos de S. aureus das infeces de prteses articulares,
bacteremia, ou infeces relacionadas a cateteres demonstraram a presena do locus ica na
maioria dos isolados, mas porcentagens variantes dessas cepas apresentaram falta de produo
de PIA in vitro (ARCIOLA; BALDASSARRI; MONTANARO, 2001; CRAMTON, 1999,
2001; FOWLER, 2001; KNOBLOCH et al., 2002; MARTN-LPEZ et al., 2002;
PEACOCK, 2002; ROHDE et al., 2001). Recentes publicaes demonstram que outros
fatores influenciam a produo de PIA ou de biofilme, como glicose e outros acares, alta
osmolaridade e anaerobiose (CRAMTON, 2001; GERKE et al., 1998; KNOBLOCH et al.,
2001, 2002; MACK; SIEMSSEN; LAUFS, 1992; RACHID et al., 2000 ).
As fibronectinas estafiloccicas (fnbA e fnbB) tm sido amplamente investigadas pelo
seu papel de adeso as estruturas de clulas eucariticas in vitro e in vivo, sendo que tais
35
adesinas exercem participao relevante no processo de fixao aos tecidos colonizados e
internalizao por clulas fagocticas, e assim, contribuindo para o desenvolvimento do curso
letal da infeco (SHINJI et al., 2011). De fato, as fibronectinas estafiloccicas atuam como
MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules), ou
seja, so molculas capazes de reconhecer protenas presentes no plasma e na matriz
extracelular (fibronectina, fibrinognio e elastina) e expressam variao genotpica e
fenotpica, funcionando como mecanismo de evaso as aes do sistema imune (BURKE et
al., 2010).
Alm das fibronectinas, outros fatores de virulncia apresentam importncia para a
adeso tecidual e invaso celular, destacando-se a Protena A (Spa), o clumping factor A e B
(CflA e CflB), atuando tambm como mecanismos de evaso as respostas imunolgicas do
hospedeiro, tanto humano quanto animal (STUTZ; STEPHAN; TASARA, 2011). A protena
A (Spa), presente na maioria das cepas de S. aureus, capaz de interagir com diversos tipos
de receptores em clulas eucariticas, superfcies e plaquetas (HENRY-STANLEY et al.,
2011; NGUYEN; GHEBREHIWET; PEERSCHKE, 2000; MERINO et al., 2009) se liga a
poro Fc da molcula de IgG, alterando a ligao da imunoglobulina com receptores de
macrfagos e outras clulas fagocticas, alm de componentes sricos importantes pra defesa
imune, gerando efeitos anticomplementares, quimiotticos e antifagocitrios, funcionado
como mecanismo de evaso resposta do hospedeiro (STUTZ; STEPHAN; TASARA, 2011).
A capacidade de ligao da Spa com diversas estruturas contribui para a aderncia de
S. aureus as variadas superfcies levando sua persistncia nas infeces e a complicaes
dos quadros como endocardite (NGUYEN; GHEBREHIWET; PEERSCHKE, 2000),
formao de biofilmes em cateteres (HENRY-STANLEY et al., 2011) at mesmo em
ausncia de PIA (MERINO et al., 2009). Pode ainda desencadear a cascata pr-inflamatria
nas vias areas por ativao do receptor 1 de TNF- (DAVID; DAUM, 2010).
Os clumping factors A e B (CflA e CflB) so componentes da famlia das
MSCRAMMs capazes de se ligar ao fibrinognio no plasma humano e causar coagulao
intravascular. Ele tambm capaz de se ligar ao fator I, que estimula a clivagem do fragmento
C3b na superfcie de clulas de S. aureus, para sua forma inativa C3bi, que perde sua funo
de opsonina, com isso funcionando como um mecanismo de evaso da resposta imune para o
microrganismo (WILSON et al., 2011). A capacidade de se ligar a estruturas proteicas como
fibrinognio e outras protenas da matriz extracelular, alm de sua imunogenicidade, tem
levado a realizao de estudos que visam definir o papel dos CflA e CflB em patologias,
36
como a septicemia (COLQUE-NAVARRO et al., 2000) e a artrite sptica (JOSEFSSON et
al., 2001).
O S. aureus apresenta em sua parede celular, polissacardeos, protenas antignicas e
molculas como o cido teicico, o glicanopeptdio, a protena A, alm de cpsula e adesinas
que so capazes de induzir resposta imunolgica no hospedeiro (OLIVEIRA et al., 2001). O
cido teicico capaz de ativar a via alternativa do complemento e estimular a produo de
citocinas. O glicanopeptdio atua como agente quimiottico e induz a produo de interleucina
1 (IL-1) e opsoninas, facilitando a fagocitose. A cpsula protege o microrganismo da
fagocitose, tornando-o mais virulento e com maior capacidade de invaso tecidual. A cpsula
uma estrutura polissacardica que envolve a parede celular da maioria das cepas de S.
aureus, protegendo a bactria da fagocitose mediada pelo complemento (C3b) por parte dos
neutrfilos polimorfonucleares, aumentando a virulncia e a capacidade de invaso nos
tecidos e na corrente sangunea. As adesinas pertencem estrutura gelatinosa do glicoclix e
promovem a aderncia s clulas do hospedeiro atravs da interao com receptores qumicos
(VELZQUEZ-MEZA, 2005).
Alm disso, o S. aureus produz numerosas enzimas que favorecem a invaso e
destruio tecidual do hospedeiro, assim como a disseminao para demais stios anatmicos
(GORDON; LOWY, 2008). A mais conhecida a coagulase, caracterstica do prprio S.
aureus, que coagula o plasma, ocasionando um emparedamento do stio infectado, com o
objetivo de retardar a migrao de neutrfilos e dificultar a fagocitose celular (LEVINSON;
JAWETZ, 2005). Outras enzimas incluem a catalase, desoxirribonuclease (DNase),
hialu
Recommended