Contributo à diferenciação de leveduras de interesse

enológico por perfis isoenzimáticos

Nuno Pedro Herculano Pimentel

Objectivos do trabalhoObjectivos do trabalho

Focou-se a aplicabilidade da análise isoenzimática na identificação de

espécies de levedura relevantes ao processo de vinificação. Para tal:

• Visou-se dar continuidade a estudos anteriores, complementando a

base de dados de perfis isoenzimáticos de leveduras existente na EVN.

Estirpes em estudoEstirpes em estudo

Efectuou-se uma pesquisa bibliográfica de espécies de leveduras encontradas em ambientes vínicos, e assim:

• Fez-se a selecção de espécies de leveduras relevantes ao processo de vinificação, não presentes na base de perfis isoenzimáticos de leveduras da EVN.

Os diversos ambientes vínicos presentes nas diferentes etapas de fabrico do vinho podem ser (Sponholz, 1993):

Vinha

Adega:

processos pré-fermentativos

fermentação alcoólica

processos pós-fermentativos

Vinha•Dispersão entomófila

Em microbiotas associados com abelhas (género Apis) foram identificadas as espécies de leveduras:

– géneros Metschnikowia e Wickerhamiella;

– Wickerhamiella domercqiae.

•UvasEm microbiotas associados com uvas foram identificadas as espécies de leveduras:– Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);

– Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata;

– Hanseniaspora osmophila;

– Kloeckera apis (Hanseniaspora guilliermondii);

– Saccharomyces veronae (Pichia mexicana);

– Lodderomyces elongisporus.

•Uvas infectadas por Botrytis cinereaEspecialmente em más condições de vindimas, vindimas com pluviosidade.

– Torulopsis bacillaris (Candida stellata);

– Candida vini (Pichia fluxuum);

– Pichia carsonii.

Adega • Fase pré-fermentativa

As espécies Metschnikowia pulcherrima e Kloeckera apiculata (anamorfo de Hanseniaspora uvarum) tratam-se das espécies mais encontradas no microbiota proveniente das uvas, nas fases pré-fermentativas e de início de fermentação (Rosini et al.,1982).

– Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);– Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata;– Kluyveromyces thermotolerans;– Torulopsis bacillaris (Candida stellata);– Candida vini (Pichia fluxuum).

• Fase fermentativa

– Torulopsis bacillaris (Candida stellata) - no início / durante a primeira fase fermentativa);

– C. mycoderma (Pichia fluxuum);

– C. pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);

– Debaryomyces hansenii;

– Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata;

– Kloeckera apis (Hanseniaspora guilliermondii);

– Kluyveromyces thermotolerans;

– Lodderomyces elongisporus;

– Saccharomyces veronae (Pichia mexicana);

– S. exiguus;

– Saccharomycodes ludwigii.

Em vinificações especiais como é o caso do vinho Xerez, foi identificada a espécie:

– Saccharomyces exiguus.

Em linhas de engarrafamento ou em vinhos

engarrafados foram isoladas as espécies:

Adega• Fase pós-fermentativa

Em vinhos armazenados foram detectadas as espécies:

– géneros Dekkera / Brettanomyces;• Kloeckera apiculata (anamorfo de Hanseniaspora uvarum);• Torulopsis bacillaris / Torulopsis stellata (Candida stellata);• Torulopsis domercqii (Wickerhamiella domercqiae); • Candida mycoderma (Pichia fluxuum);• Saccharomycodes ludwigii.

― Torulopsis stellata (Candida stellata);― Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);― Candida mycoderma / C. vini (Pichia fluxuum);― Lodderomyces elongisporus;― Saccharomyces baillii var. baillii (Zygosaccharomyces baillii ).

Métodos de identificação de levedurasMétodos de identificação de leveduras

Análise de perfis electroforéticos:

Proteína total

Isoenzimas

Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S

Em leveduras a sequenciação do rDNA 26S (D1/D2) tem sido usada: No estudo dos relacionamentos filogenéticos entre as espécies de leveduras;

Na identificação de leveduras ao nível da espécie;

Em leveduras a análise isoenzimática tem sido aplicada:

Em estudos taxonómicos:

• na delimitação de espécies

• na descrição formal da espécie

• no esclarecimento de relações anamorfo/ teleomorfo

No estudo de populações

Em estudos epidemiológicos

Candida cantarellii (2); Candida stellata (2); Candida vanderwaltii (1); Pichia mexicana (1); Pichia fluxuum (2); Kluyveromyces thermotolerans (3); Metschnikowia pulcherrima (3); Pichia carsonii (3); Saccharomyces exiguus (3); Wickerhamiella domercqiae (2); Lodderomyces elongisporus (1); Debaryomyces hansenii var. fabryii (1); Dekkera naardenensis (1); Hanseniaspora guilliermondii (1); Hanseniaspora occidentalis (1); Hanseniaspora osmophila (1); Hanseniaspora uvarum (2); Saccharomycodes ludwigii (1); Schizosaccharomyces pombe (1).

Material e métodos Material e métodos

Espécies de leveduras analisadas

Total:Total: 32 estirpes; 19 espécies e 12 géneros

Material e métodos Material e métodos

Análise isoenzimática

Crescimento das células

Crescimento das células

Electroforese (PAGE-nativa)Electroforese (PAGE-nativa)Extracto proteícoExtracto proteícoRebentamento

das célulasRebentamento

das células

Solução de revelação de actividade enzimática

(EST, LDH, ADH, ACP e G6PD)

•Mobilidade electroforética relativa (Rm)

a b RRm m = a / b= a / b

a – distância da migração da banda de actividade enzimática

b – distância da migração do corante de referência

(37ºC, ao abrigo da luz)

NotaNota

Foram efectuados duplicados

de crescimento em 10 %

das estirpes analisadas,

que foram submetidos à

análise isoenzimática

juntamente com as estirpes

em estudo.

Material e métodos Material e métodos

•Análise numérica dos resultadosAnálise numérica dos resultados

Matriz dos resultados Matriz de semelhanças - coeficiente de DICEoeficiente de DICE

Dendrograma

Método de aglomeração com Método de aglomeração com médias não-ponderadas (UPGMA)médias não-ponderadas (UPGMA)

...

…E0.48E0.42E0.40E0.32E0.28E0.21

Rm

Estirpes

0

0

0

0

1

0

10000EVN 370

00000EVN 369

00000EVN 368

00000EVN 367

00000EVN 366

10000EVN 365

… ………………

…

…

…

…

…

…EVN 369

EVN 368

EVN 367

EVN 366

EVN 365

…

…EVN 369

…………EVN 368

…SkkSkjSkiEVN 367

…SjkSjjSjiEVN 366

…SikSijSiiEVN 365

...

…

Material e métodosMaterial e métodos

Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S

Extracção do DNA

Extracção do DNA

Amplificação DNA por PCR primers ITS5 e LR6

Amplificação DNA por PCR primers ITS5 e LR6

Purificação do produto PCR

Purificação do produto PCR

Reacção de sequenciação,

primers: NL1 NL4

Reacção de sequenciação,

primers: NL1 NL4

Observação do DNA extraído

Observação do prod. PCR

Observação do prod. PCR purificado

Sequenciação no sequenciador

automático CEQ 8000

Sequenciação no sequenciador

automático CEQ 8000

5S NTS2 ETS 17 – 18 S ITS1 5.8S ITS2 NTS1 5S25 – 28 S

D1 / D2

NL1 NL4ITS5 LR6

Esquema dos genes do rRNA com indicação da localização dos primers utilizados e da região sequenciada.

Resultados obtidosResultados obtidos

Análise isoenzimática – perfis isoenzimáticos obtidos

ESTEST 384T 392 385 395T

365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T

368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366

384T 392 385 395T

365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T

368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366

G6PDG6PDLDHLDH

384T 392 385 395T

365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T

368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366

384T 392 385 395T

365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T

368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366

ADHADH 384T 392 385 395T

365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T

368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366

ACPACP

Candida stellata

Wickerhamiella domercqiae

Resultados obtidosResultados obtidos

Análise isoenzimática – análise numérica (EST+LDH+ADH+ACP+LDH)

r = 0.88

365T

375T

395T

396T

389T 390 371 370NT 387T 373 368T

385 386T 392 384T 391 383 382 381a 381NT 377 376

379 379a

378T 378a 380

394T 393 367 388T

372T 374

369T 366

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00Índice de semelhança

Candida cantarellii

Pichia mexicana

Kluyveromyces thermotolerans

Kluyveromyces thermotolerans

Candida stellataDebaryomyces hansenii var. fabryii

Hanseniaspora uvarum

Pichia carsonii

Metschnikowia pulcherrima

Saccharomyces exiguus

Hanseniaspora occidentalis

Pichia fluxuum

Wickerhamiella domercqiaeLodderomyces elongisporusHanseniaspora osmophila

Saccharomycodes ludwigiiCandida vanderwaltii

Hanseniaspora guilliermondiiDekkera naardenensisSchizosaccharomyces pombe

Resultados obtidosResultados obtidos

Análise isoenzimática – análise numérica (EST+LDH+ADH+ACP+LDH)

r = 0.88

Candida cantarelii 365T

375T

395T

396T

389T 390 371 370NT 387T 373 368T

385 386T 392 384T 391 383 382 381a 381NT 377 376

379 379a

378T 378a 380

394T 393 367 388T

372T 374

369T 366

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00Índice de semelhança

Kluyveromyces thermotolerans

Kluyveromyces thermotolerans

Candida stellata

Wickerhamiella domercqiae

Candida stellata

Resultados obtidosResultados obtidos

Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S

EVN 372TEVN 373

0,2 % dissemelhança

EVN 384TEVN 385

0,4 % dissemelhança

EVN 365TEVN 366

1,1 % dissemelhança

EVN 387TEVN 367

9,0 % dissemelhança

EJ1EVN 367 10-372

0,0 % dissemelhança

EJ1 – Candida

10-372 – Candida cf. stellata

A variabilidade intraespecífica ≤ 1% de substituições nucleotídicas (Kurtzman e Robnett, 1998)

r = 0.88

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

260 253 255 256 251 167 262 166 267 237 263 258 261 264 257 265 266 268 254 252NT

259 216 230 382 383 381NT 329T

222 284T 285 299 302 292 293 298 301 290 291 303 287 269 271T

270 272 273 274 276 277 275NT 278 235 355 242T 243 244 245 248 246 247 249 390 279NT 280 281 283 282 370NT 371 378T 380 379 212 223 217 219213 215 218 224 229 227 220 221 225 228 226T 312NT 310 311 340 341 342 384T

392T

391T

345 346NT

231T

368T

373 387T

354T

348 349 395T 339 394T

393 367NT

305 308 307 388T

168 350 351 396T

294 288 289 300 295 336 337 338T 326NT

327 372T

374 232 234 233 241NT

238 239 333T 334 335 330T 331 332 385 236 375T 376 377 343 344 386T 389T

296 369T

304 306 297 286 309 365T 366 325

Índice de semelhança

IV

V

VI

VIII

I

II

III

VII

Agrupamento I

Agrupamento II

Agrupamento III

Agrupamento IV

Agrupamento V

Agrupamento VI

Agrupamento VII

Agrupamento VIII

• Saccharomycodes ludwigii

• Hanseniaspora uvarum

• Schizosaccharomyces pombe

• Lodderomyces elongisporus

É necessário efectuar uma comparação de mobilidades electroforéticas (Rm) similares no mesmo gel.

ConclusõesConclusões

A análise dos perfis isoenzimáticos obtidos na generalidade conseguiu efectuar a distinção das 19 espécies de leveduras em estudo.

• Verificou-se que 4 das 32 estirpes analisadas, não agruparam com as estirpes tipo da sua espécie

Com os resultados da sequenciação do rDNA 26 S (D1/D2), verificou-se que:• Para 2 das 4 estirpes analisadas a sequenciação do rDNA confirmou uma incorrecta identificação na

espécie (EVN 366- Candida cantarellii e 367- C. stellata); • Para as restantes 2 estirpes confirmou a sua classificação (EVN 373 - Kluyveromyces thermotolerans

e 385 - Wickerhamiella domercqiae). Assim: É necessário o estudo de sistemas enzimáticos adicionais para permitir a identificação e

discriminação das espécies Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae).

A inclusão dos resultados obtidos, na análise isoenzimática, na BD de perfis isoenzimáticos de leveduras existente na EVN, permitiu a diferenciação da generalidade das 50 espécies de leveduras associadas com a indústria de vinificação.

• Para algumas espécies é necessário focar outros sistemas enzimáticos adicionais para permitir a sua diferenciação mediante a análise electroforética.

Referências bibliográficasReferências bibliográficasBarnett, J., A.; M., A., Delaney; E., Jones; A., B., Magson; B., Winch.1972. The number of yeasts associated with wine grapes of Bordeaux. Arch. Microbiol., 83,

52-55. Bréchot, P.; J., Chauvet; H., Girard.1962. Identification des levures d'un moût de Beaujolais au cours de sa fermentation. Ann. Technol. Agric., 11, 235-244.Castelli, T.; S. Georgantas.1970. Gli agenti della fermentazione vinaria nel nord della Grecia. Vini d'Italia,12, 185-191.Davenport, R., R.1974. Microecology of yeasts and yeast-like organisms associated with an English vineyard. Vitis, 13, 123-130.Duarte, F., L.2000. Perfis electroforéticos de isoenzimas na diferenciação de leveduras de interesse enológico. Tese Doutoramento, Universidade do Minho,

Braga.Fleet, G., H.; S., Lafon-Lafourcade; P., Ribéreau-Gayon.1984. Evolution of yeasts and lactic acid bacteria during fermentation and storage of Bourdeaux wines.

Appl. Environ. Microbiol., 48, 1034-1038.Gandini, A.1969. Microbiological investigations of Moscato d'Asti. Infection occurring during bottling and the effect of using an iodine-containing compound. Vini

d'Italia, 11, 455-527 (abstract).Goto, S.; H., Oguri; M., Yamazaki.1984. Yeast population in botrytized grapes. J. Inst. Enol. Vitic. Yamanashi Univ., 19, 1-5 (abstract).Hidalgo, P.; M., Flores.1994. Occurrence of the killer character in yeasts associated with Spanish wine production. Food Microbiol., 11, 161-167 (abstract).Kurtzman, C., P.; C., J., Robnett.1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial

sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73, 331-371.Kyselakova, M.1994. Observation of yeast occurrence in wine cellars. Acta Universitatis Agriculturae Facultas Horticulture, Bro., 9, 11-15 (abstract). Kyselakova, M.1995. Investigation no the occurrence of Candida sp. in cellars and cellar equipment. Vinohrad, Bratislava., 33, 13-14 (abstract).Lachance, M., A.; W., T., Starmer; C., A., Rosa; J., M., Bowles; J., Stuart; F., Barker; D., H., Janzen.2001.Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers and

their insects. FEMS Yeast Res. I, 1-8.Longo, E.; J., Cansado; D., Agrelo; T.,G., Villa.1991. Effect of climatic conditions on yeast diversity in grape musts from northwest Spain. Am. J. Enol. Vitic., 42,

141-144.Malfeito-Ferreira, M.1996. Perfis de ácidos gordos e toxicidade de ácidos fracos em leveduras de contaminação de alimentos. Tese Doutoramento, Instituto

Superior de Agronomia, U.T.L., Lisboa.Maiquez, E., G.1995. Los microorganismos del Jerez. Microbiología Sem., 11, 51-58.Minarik, E.1971. Etude de la flore levurienne des régions viticoles périphériques en Tchécoslovaquie. Conn. Vigne Vin., 5, 185-197.Minarik, E.1982. Levures de contamination des vins embouteillés. Bulletin OIV, 628, 414-419.Nadal, D.; B., Colomer; B., Piña.1996. Molecular polymorphism distribution in phenotypically distinct populations of wine yeast strains. Appl. Environ. Microbiol.,

62, 1944-1950.Pardo, I.; M., J., García; M., Zúñiga; F., Urubu.1989. Dynamics of microbial populations during fermentation of wines from Utiel-Requena region of Spain. Appl.

Environ. Microbiol., 55, 539-541.Parish, A., E.; D., E., Carrol.1985. Indigenous yeasts associated with muscadine (Vitis rotundifolia) grapes and musts. Am. J. Enol. Vitic., 36, 165-169.Peynaud, E.; S., Domerq.1959. A review of microbiological problems in wine-making in France. Am. J. Enol. Vitic., 10, 69-77.Rosini, G.; F., Federici; A., Martini.1982. Yeast flora of grape berries during ripening. Microb. Ecol., 8, 3-89.Sneath, P., H., A.; R., R., Sokal.1973. Numerical taxonomy, the principles and practice of numerical classification. W. W. Freeman and Company, São Francisco.Stollarova, V.1992. Populations of yeasts on grapes, Vitis vinifera L., in the vinicity of the nuclear power station at Mochovce. Biologia Bratislava., 47, 697-701

(abstract).Sponholz, W., R.1993. Wine spoilage by microorganisms, In: Wine microbiology and biotechnology, (G., H., Fleet ed.), 395-420. Harwood academic publishers,

Chur.Van der Walt e van Kerken (1958; cit. in Duarte, 2000)Van Zyl e Du Plessis (1961; cit. in Davenport, 1974).

Sites consultados

http://www.cosval.com

http://dgl.microsoft.com/

http://www.esa-santarem.pt/

http://www.revistadevinhos.iol.pt/

http://www.cortesdecima.pt/

http://www.gallo.com/UKE/

http://www.tokaji.hu/en.html

http://www.wines.com/tokaj/tokaj.html

http://www.bpdr.com/

http://www.carmen.com/ing/home.asp

http://www.roche.com/pages/rgg/science-gengen-cdrom[2]+jpg_page4.html

http://www.gl.iit.edu/frame/genbank.htm

Referências bibliográficasReferências bibliográficas