Contributo à Diferenciação de Leveduras com interesse Enológico por Perfis Isoenzimáticos

INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM

ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA DE SANTARÉM

LICENCIATURA BIETÁPICA DE ENGENHARIA AGRO-ALIMENTAR,

RAMO DA QUALIDADE ALIMENTAR

CONTRIBUTO À DIFERENCIAÇÃO DE LEVEDURAS DE

INTERESSE ENOLÓGICO POR PERFIS ISOENZIMÁTICOS

Nuno Pedro Herculano Pimentel

SANTARÉM

2003

INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM

ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA DE SANTARÉM

LICENCIATURA BIETÁPICA EM ENGENHARIA AGRO-ALIMENTAR,

RAMO DA QUALIDADE ALIMENTAR

CONTRIBUTO À DIFERENCIAÇÃO DE LEVEDURAS DE

INTERESSE ENOLÓGICO POR PERFIS ISOENZIMÁTICOS

TRABALHO FIM DE CURSO

para obtenção do grau de Licenciado

Nuno Pedro Herculano Pimentel, N.º 796

Orientador: Doutora Filomena Cristina

Coelho da Luz Duarte (EVN-

INIAP)

Supervisor: Doutora Marília Oliveira

Inácio Henriques

SANTARÉM

2003

Este trabalho foi realizado na Estação Vitivinícola Nacional em Dois Portos (INIAP-

Instituto Nacional de Investigação Agrária e das Pescas) na secção de Microbiologia do

Departamento de Enologia, sob a orientação da Investigadora Auxiliar Filomena Cristina

Coelho da Luz Duarte.

AGRADECIMENTOS

Na realização do presente trabalho contei com diversos apoios, os quais me ajudaram e

incentivaram. Um muito obrigado a todos os que me apoiaram de uma forma directa ou

indirecta. Gostaria de agradecer em especial:

Ao Director e Subdirector da Estação Vitivinícola Nacional, na pessoa do Investigador

principal Eng. António Sérgio Curvelo-Garcia e do Eng. Vasco Justino, por terem

possibilitado a realização do estágio, bem como o acesso aos meios disponibilizados pela

EVN.

À Doutora Filomena Duarte, por ter aceite ser orientadora deste trabalho, pela partilha

de conhecimentos sem os quais não teria sido possível a sua realização, pela forma como

orientou e colaborou na análise dos resultados e resolução dos problemas que foram surgindo

no trabalho experimental. Pelas numerosas críticas e sugestões que me proporcionou com

vista à melhoria do trabalho.

À Doutora Marília Henriques por ter aceite ser supervisora deste trabalho, pelo apoio,

suporte e boa disposição, bem como pela constante disponibilidade oferecida na edificação do

presente trabalho.

À Filomena Alemão, pelo constante interesse e predisposição a ajudar demonstrados

ao longo de todo o trabalho, pela sua amizade, bem como pela partilha de conhecimentos,

paixão pela microbiologia e um sentido humano muito inspiradores não só no decorrer deste

trabalho como para as lições da vida futura.

À Doutora Eva, à Eng.ª Ilda, ao professor Virgílio e ao Eng. Paulo Cameira dos

Santos, pelas importantes sugestões e discussões, ao longo de toda a realização do estágio,

mas acima de tudo pela amizade.

A todos os colegas estagiários e bolseiros, à Ana, à Ana Quintino, à Ana Mateus, à

Adelaide, à Adelina, à Carla, à Carla Fortunato, à Nilza, à Tânia, ao Cristiano, ao António, ao

Francisco, ao João, ao Jorge, ao Mário e ao Ricardo, pela sua amizade e pelo encorajamento

nos momentos mais críticos deste trabalho.

A toda a equipa da EVN, por todo o apoio recebido, por me ter acolhido e me ter feito

sentir em casa.

À tipografia Sogratol, na pessoa do meu amigo Bruno Henriques, o meu apreço e

agradecimento pela edição do grafismo da capa e encadernação do presente trabalho.

Aos meus pais, sem os quais nunca teria possibilidades de estar aqui, pelo seu total

apoio, bem como pela atenção e preocupação demonstradas na realização do estágio.

Aos meus familiares e amigos, com quem pude contar, pelo apoio e força nas alturas

mais críticas da realização deste trabalho.

À Susana pelo encorajamento, pelo apoio, e carinho demonstrados, os quais me

incutiram um fôlego extra na fase final da elaboração do presente trabalho.

Resumo

RESUMO

Na indústria alimentar existe uma emergente necessidade de implementar uma

metodologia fiável na identificação de leveduras, entre outros microrganismos, presentes nos

alimentos, nas diferentes fases do seu processamento. Com o desenvolvimento da biologia

molecular, novas metodologias de identificação de leveduras, entre as quais a análise

isoenzimática, foram disponibilizadas para responder a esta necessidade. O presente trabalho

focou a aplicabilidade da análise isoenzimática na identificação de algumas espécies de

leveduras associadas a ambientes vínicos. Visou-se, com este trabalho, dar continuidade aos

estudos anteriores e complementar a base de padrões isoenzimáticos da Estação Vitivinícola

Nacional (EVN).

No presente trabalho foram analisados os perfis electroforéticos de cinco sistemas

enzimáticos: esterase (EST), lactato desidrogenase (LDH), álcool desidrogenase (ADH),

fosfatase ácida (ACP) e glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), em leveduras associadas à

indústria dos vinhos, mais em concreto, ligadas ao processo de vinificação. Foram analisados

os perfis electroforéticos de 32 estirpes pertencentes a 19 espécies de 12 géneros, os quais

foram adicionados aos da base de dados de perfis electroforéticos de isoenzimas existente na

EVN (Duarte, 2000), perfazendo na sua totalidade 160 estirpes de cerca de 50 espécies de

leveduras.

Foram obtidos 32 perfis electroforéticos distintos de EST, ACP, LDH, G6PD e ADH,

para as 32 estirpes estudadas. Da aplicação de métodos de análise numérica aos dados

electroforéticos resultou uma representação gráfica na forma de dendrograma, na qual as

estirpes se posicionaram isoladas ou em grupos, correspondentes às respectivas espécies.

Contudo, algumas estirpes não agruparam com as estirpes tipo da sua espécie, foram elas as

estirpes EVN 366, 367, 373 e 385 respectivamente das espécies Candida cantarellii, C.

stellata, Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae. Foi utilizada a

sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S, método muito utilizado na identificação de

espécies de leveduras, no estudo das referidas estirpes. Ocorreu um paralelismo entre os

resultados da sequenciação e os resultados da análise isoenzimática, para duas das estirpes –

EVN 366 e 367, os quais apontam muito provavelmente para uma incorrecta classificação das

vii

Resumo

mesmas. No entanto, para as estirpes EVN 373 e 385 não foi verificado aquele paralelismo

entre as duas metodologias de identificação, devendo ser testados outros complexos

enzimáticos para a sua identificação.

A inclusão dos resultados do presente trabalho na base de dados electroforéticos de

isoenzimas existentes na EVN, permitiu verificar, no geral, uma boa diferenciação entre as

cinquenta espécies estudadas. No entanto, os valores de Rm iguais, ou muito próximos, aos

existentes na base de dados terão que ser confirmados por comparação num mesmo gel.

A análise isoenzimática revelou uma elevada resolução genética, e um grande

potencial na diferenciação das espécies de leveduras estudadas. Contudo são necessários mais

estudos com outros complexos enzimáticos para optimizar o processo de identificação na

espécie, efectuada com base na análise electroforética de perfis isoenzimáticos. Esta, aliada à

sua economia e rapidez, a qual pode ser ainda aumentada por automatização na análise

electroforética, assim como por software de análise dos perfis de bandas, parece ser indicada

no rastreio de leveduras presentes ao longo de todo o processo de vinificação, por parte da

indústria.

viii

Resumo

ix

Abstract

ABSTRACT

In the food industry there is an emerging need in implementing a reliable methodology

for the identification of the yeast species present in the different food processing stages. The

aim of this work was to verify suitability of isoenzyme electrophoretic profiles to identify

several wine related yeast species, and to the construction of a isoenzyme database already

initiated at Estação Vitivinícola Nacional (EVN).

Five isoenzyme systems, namely, esterase (EST), lactate dehydrogenase (LDH),

alcohol dehydrogenase (ADH), acid phosphatase (ACP) and glucose-6-phosphate

dehydrogenase (G6PD), of wine yeast strains, belonging to nineteen species and twelve

genera, were analysed in the present work. The obtained results were added to the above

mentioned isoenzyme patterns database, making up a sum of one hundred and sixty strains

approachably belonging to fifty yeast species.

Thirty-two distinct electrophoretic isoenzyme patterns were obtained for the thirty-two

studied strains. The application of numerical analysis methods to the isoenzymes profiles

originated a dendrograma, where the strains were positioned isolated or in clusters,

corresponding to their belonging species. Some of the studied strains haven’t clustered with

the respective species type strain, namely EVN 366, 367, 373, 385, respectively belonging to

the species Candida cantarellii, C. stellata, Kluyveromyces thermotolerans and

Wickerhamiella domercqiae. Another approach was used in their identification – 26S rDNA

sequence analysis, a methodology frequently used in the yeast species identification. For

strains EVN 366 and 367 a parallelism has occurred, between the 26S rDNA sequence results

and the electrophoretic isoenzyme results, which points to a misidentification at the species

level, however for the strains EVN 373 and 385 there was no agreement between the

methodologies tested, and additional enzymes are needed for their identification by the

isoenzyme analysis.

The results of the present work were added to EVN isoenzyme patterns database, and

with only five isoenzyme systems it was possible to differentiate the great majority of the fifty

x

Abstract

yeast species. However Rm values similar to those present at the existing database need to be

confirmed by running the strains at the same gel.

It seems that the electrophoretic isoenzyme patterns analysis has revealed a high

genetic resolution, and its large potential for distinguishing the yeast species has been

confirmed although different enzymes should be assayed for optimizing the identification

process, by using this methodology. Its economy allied with its fastness, which can be

improved with the automation of electrophoresis process and the use of a analysis software,

points out the isoenzyme analysis as a powerful methodology to trace spoilage yeasts,

particularly in the wine industry.

xi

Abstract

xii

Índices

ÍNDICE GERAL

RESUMO vii

ABSTRACT ix

ÍNDICE GERAL xi

ÍNDICE DE FIGURAS xiii

ÍNDICE DE TABELAS xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

xv

1. INTRODUÇÃO 01

1.1 Leveduras presentes nas diferentes etapas de vinificação 02

1.1.1 Fase pré-fermentativa 03

1.1.2 Fermentação alcoólica 05

1.1.3 Fase posterior à fermentação 08

2. CLASSIFICAÇÃO DE LEVEDURAS

10

2.1 Testes clássicos, simplificados e miniturizados 13

2.2 Métodos de análise de constituintes celulares 14

2.2.1 Espectroscopia por infravermelho 14

2.2.2 Perfis de ácidos gordos 15

2.2.3 Técnicas baseadas nos ácidos nucleicos 15

2.2.4 Análise de proteínas 20

2.2.4.1 Análise isoenzimática 21

2.2.4.1.1 Isoenzimas 21

2.2.4.1.2 Técnica de electroforese 22

2.2.4.1.3 Vantagens da análise isoenzimática 26

2.2.4.1.4 Desvantagens da análise isoenzimática 27

2.2.4.1.5 Sistemas enzimáticos em estudo 28

3. MATERIAL E MÉTODOS 31

3.1 Estirpes de leveduras em estudo 31

3.1.1 Manutenção das leveduras 32

3.2 Análise isoenzimática 33

xiii

Índices

3.2.1 Preparação do extracto proteíco 33

3.2.1.1 Cultura e recolha das células de leveduras em meio YEPD 34

3.2.1.2 Obtenção do extracto proteíco 34

3.2.2 Análise electroforética das isoenzimas 35

3.2.2.1 Sistema de electroforese 35

3.2.2.2 Preparação do gel suporte de poliacrilamida 36

3.2.2.3 Preparação das amostras para electroforese 37

3.2.2.4 Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE-nativa) 37

3.2.2.5 Obtenção de perfis isoenzimáticos 38

3.2.2.5.1 Esterase (EST- EC 3.1.1.1) 38

3.2.2.5.2 Fosfatase ácida (ACP- EC 3.1.3.2) 39

3.2.2.5.3 Lactato desidrogenase (LDH- EC 1.1.1.27) 40

3.2.2.5.4 Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD- EC 1.1.1.49) 40

3.2.2.5.5 Álcool desidrogenase (ADH- EC 1.1.1.1) 41

3.2.2.6 Digitalização dos geis obtidos 42

3.2.2.7 Determinação de mobilidade electroforética relativa (Rm) 42

3.2.2.8 Secagem dos geis obtidos 43

3.2.2.9 Análise numérica dos resultados 43

3.2.2.10 Análise de reprodutibilidade do método 44

3.3 Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S 45

3.3.1 Estirpes de leveduras analisadas 45

3.3.2 Condições de cultura 45

3.3.3 Extracção do DNA 46

3.3.4 Amplificação de DNA (PCR) 47

3.3.5 Sequenciação de rDNA (D1/D2) 48

3.3.6 Comparação dos nucleótidos sequenciados 50

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 51

4.1 Perfis isoenzimáticos 51

4.2 Análise numérica dos perfis isoenzimáticos obtidos 55

4.3 Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S 60

4.4 Comparação com os perfis isoenzimáticos das estirpes da base de dados da EVN 65

5. CONCLUSÕES 69

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

xiv

Índices

ANEXOS

ÍNDICE DE FIGURAS

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 2.1 – Reacção de coloração por procedimentos histoquímicos para a maioria das 28

desidrogenases.

3- MATERIAL E MÉTODOS

Figura 3.1 – Representação esquemática da preparação do extracto proteico. 33

Figura 3.2 – Sistema descontínuo de uma dimensão. 35

Figura 3.3 – Representação da distribuição das amostras pelos poços do gel de poliacrilamida. 37

Figura 3.4 – Revelação das bandas de actividade enzimática no gel de poliacrilamida, após 38

separação electroforética.

Figura 3.5 – Esquema dos genes do rRNA com indicação da localização dos primers utilizados 45

e da região sequenciada.

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO

Figura 4.1 – Imagens digitalizadas de perfis electroforéticos dos cinco complexos enzimáticos 51

nas 32 estirpes analisadas.

Figura 4.2 – Dendrograma representando a semelhança entre a totalidade de estirpes de 57

leveduras analisadas neste trabalho, com base em perfis electroforéticos dos cinco complexos

isoenzimáticos.

Figura 4.3 – Perfis de bandas do DNA extraído das estirpes em estudo 60

Figura 4.4 – Perfis de bandas do produto PCR amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6 61

Figura 4.5 – Perfis de bandas do produto PCR purificado, amplificado com os primers externos 61

ITS 5 e LR6.

Figura 4.6 – Alinhamento das sequências parciais do rDNA das estirpes EVN 366 e CBS 4878. 62

Figura 4.7 – Alinhamento das sequências parciais do rDNA da estirpe EVN 367 com as estirpes 63

CBS 157, 10-372, e EJ1.

Figura 4.8 – Alinhamento das sequências parciais do rDNA das estirpes EVN 373 e CBS 6340 64

xv

Índices

Figura 4.9 – Alinhamento das sequências parciais do rDNA das estirpes EVN 385 e CBS 4351 65

Figura 4.10 – Dendrograma representando as relações da totalidade de estirpes estudadas 66

(160 estirpes), com base nos perfis electroforéticos de EST, ACP, G6PD, LDH e ADH.

ÍNDICE DE TABELAS

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Tabela 2.1 – Sistemas enzimáticos em estudo. 29

3- MATERIAL E MÉTODOS

Tabela 3.1 – Estirpes de leveduras em estudo no presente trabalho. 31

Tabela 3.2 – Preparação do gel suporte de poliacrilamida, condições PAGE-nativa. 36

ANEXO III

Tabela A.1 – Matriz dos resultados obtidos de todas as estirpes estudas, para tratamento por análise numérica.

xvi

Lista de abreviaturas

LISTA DE ABREVIATURAS

’ Minutos

Bisacrilamida N,N’-metiletilenobisacrilmida

Brometo de etídeo Brometo de (3,8’-diamino-5-etil-6-fenil) fenantridinium

DNA Ácido desoxirribonucleico

D.O. Densidade óptica

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

Fast Blue RR Cloreto de 4-benziolamino-2,5-dimetoxibenzenodiazónio

Fast Garnet GBC C14 H4 N4 O4 S

g Aceleração da gravidade

Kb Kilobases

NAD+ Dinucleótido de nicotinamida e adenina (forma oxidada)

NADH Dinucleótido de nicotinamida e adenina (forma reduzida)

NBT Nitro Blue Tetrazolium [Cloreto de 2,2’-di-p-nitrofenil-5,5’-difenil-

3,3’- (3,3’-dimetoxi-4,4’-difenileno) tetrazólio]

pb Pares de bases

p/p Peso/Peso

p/v Peso/Volume

PAGE Electroforese em gel de poliacrilamida

PMS Metosulfato de fenazina

rDNA DNA ribossómico

RNA Ácido ribonucleico

Rm Mobilidade electroforética relativa

r.p.m. Rotações por minuto

SDS Dodecilsulfato de sódio

TEMED N,N,N’,N’-Tetrametiletilenodiamina

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

v/v Volume/Volume

xvii

Revisão Bibliográfica

1. INTRODUÇÃO

As leveduras são usadas em muitos processamentos industriais, tendo a produção de

bebidas alcoólicas e de alimentos como o pão, um dos grandes destaques. A utilização de

leveduras advém desde os primórdios da civilização, por exemplo na Suméria por volta do

ano 7000 A.C., era produzida cerveja, na Assíria fabricava-se vinho no ano 3500 A.C. e na

Roma antiga, existiam, no ano 100 A.C., mais de 250 indústrias de panificação que

fabricavam pão a partir de massa levedada (Demain et al., 1998). Contudo, são igualmente

responsáveis por elevadas perdas económicas devido ao desenvolvimento de leveduras de

contaminação em alimentos e bebidas, nos quais resultam a formação de películas, turvação e

aromas indesejáveis. Este facto tem preocupado a indústria alimentar, uma vez que tende-se

para um decréscimo no uso de conservantes eficientes contra leveduras (por exemplo o

dióxido de enxofre e ácido benzóico), tendo vindo a ser efectuadas numerosas investigações a

nível da Europa para entender este fenómeno (Malfeito Ferreira, 1996; Demain et al., 1998).

Tal é reforçado por Thomas (1993), no que respeita à incidência de contaminações de bebidas

estar muito frequentemente associada a leveduras. Dada a sua grande distribuição na natureza

e particular associação com frutos e vegetais. Colónias de leveduras são comuns em bebidas,

assumindo grande destaque em condições de baixo aw, baixo pH, bem como na presença de

conservantes como o dióxido de enxofre e o ácido sórbico, em concentrações elevadas de

açúcar e/ou álcool.

A contaminação de vinhos por leveduras continua a constituir um problema para os

produtores, por um lado devido a exigências comerciais e, por outro, à maior exigência de

qualidade por parte dos consumidores. Devido às restrições cada vez maiores à aplicação de

conservantes no vinho, surge uma necessidade de conhecer os fenómenos e eliminar as causas

da degradação do vinho, tantas vezes conducente a elevados prejuízos.

Em leveduras associadas ao processo de vinificação bem como à sua contaminação,

têm sido empregues diversas metodologias na sua identificação e diferenciação, entre as quais

a análise de perfis electroforéticos de isoenzimas, a qual tem sido muito aplicada para estes

fins, com o intuito de ser uma metodologia de identificação rápida, fiável, de fácil manuseio e

baixo custo (Subden et al., 1982; Yamazaki et al., 1983; Poncet et al., 1992). O presente

trabalho visou dar continuidade aos estudos de Duarte (2000) complementando a base de

dados existente, constituída pelos padrões isoenzimáticos de 28 espécies de leveduras.

Pretendeu-se determinar os padrões isoenzimáticos de espécies adicionais, relevantes ao

1


processo de vinificação, que, conjuntamente com os dados anteriores poderão ser

implementados nos sistemas de controlo de qualidade na produção de vinho.

Foi efectuada uma pesquisa bibliográfica com vista à selecção de leveduras

encontradas em ambientes vínicos, ou seja, presentes ao longo do processo de fabrico do

vinho, nomeadamente na vinha, no mosto, em vinho e nos ambientes vínicos, baseando-se

esta recolha de informação em Barnett et al., (1990); Lodder (1970); Kurtzman e Fell (1998).

As estirpes de leveduras, as quais se encontram descritas em 3.1, são oriundas da Colecção

Portuguesa de Culturas de Leveduras (PYCC), e do Centraalbureau voor Schimmelcultures

(CBS), sendo na sua maioria estirpes tipo da respectiva espécie, de modo a garantir uma

maior fiabilidade dos resultados.

1.1 Leveduras presentes nas diferentes etapas de vinificação

Segue-se uma breve revisão dos estudos efectuados sobre este tema, relacionados com

as espécies de leveduras estudadas no presente trabalho.

O mosto de uva trata-se de um meio eminentemente fermentescível. Nele as leveduras

encontram os constituintes necessários para assegurarem as suas funções vitais. Os hidratos de

carbono, glucose e frutose, compostos azotados sob diversas formas como amoníaco,

aminoácidos, polipéptidos e proteínas, os sais minerais (fosfato, sulfato, cloreto, potássio,

cálcio e magnésio), um pH conveniente devido à presença de ácidos orgânicos como os ácidos

tartárico e málico. O mosto de uva contém igualmente substâncias que desempenham um

papel de factor de crescimento (vitaminas) e outros factores importantes para a sua

sobrevivência. Outros compostos da uva, como os compostos fenólicos e compostos com

aroma são importantes para as características dos vinhos, mas não desempenham um papel

essencial nos fenómenos fermentativos (Ribéreau-Gayon et al., 1998).

Os fenómenos que ocorrem durante a fermentação alcoólica foram objecto de

investigação em muitos trabalhos, e verificou-se que durante as fermentações de mostos,

ocorre um desenvolvimento sequencial de várias espécies de leveduras, associadas com as

superfícies das uvas, solo das vinhas e superfícies de equipamento vinícola nas adegas.

Verificou-se que tanto as estirpes como a sucessão de espécies de leveduras, possuíam uma

influência determinante na qualidade do produto final, uma vez que as leveduras durante os

processos fermentativos produzem para além de álcool etílico uma enorme variedade de

2


metabolitos que contribuem ou afectam a complexidade do aroma e a qualidade do vinho

(Fleet e Heard, 1993; Sipiczki et al., 2001).

1.1.1 Fase pré-fermentativa

Existem três etapas no fabrico do vinho em que podem ocorrer contaminações

microbianas, susceptíveis de diminuir a aceitação e a qualidade do produto final (Sponholz,

1993). A primeira etapa remete para a vinha, para o estado sanitário das uvas, uma vez que

podem estar contaminadas com fungos, leveduras, bactérias acéticas e bactérias lácticas. A

disseminação de leveduras é veiculada através de insectos, nomeadamente abelhas e vespas,

as quais são vectores muito eficientes de leveduras, podendo ser responsáveis pela sua

introdução dentro da adega ou zonas de distribuição (Thomas, 1993; Lema et al., 1996;

Martíni et al., 1996).

De facto em 1925 Sergent e Rougebief demonstraram que os insectos eram o principal

vector de transporte de leveduras, excluindo a hipótese de ser o ar o seu agente de propagação

(Ribéreau-Gayon e Peynaud, 1960). Em 1999 Mortimer e Polsinelli propuseram que os

insectos inoculariam microrganismos para o interior de bagos danificados, e que

provavelmente proliferariam no interior do fruto. Os insectos vectores incluem vespas

(Vespa), abelhas (Apis), Drosophila, outras moscas, aranhas e borboletas (Lepidoptera).

Contudo, os autores não têm a certeza se todos estes insectos possuem a espécie

Saccharomyces cerevisiae, mas constataram que grande percentagem de abelhas a possuía nos

seus corpos durante os meses de Inverno, contudo ainda não conhecem os mecanismos de

distribuição das leveduras nos bagos de uvas. Lachance et al. (2001) estudaram comunidades

específicas de leveduras disseminadas por insectos em regiões da Austrália. Em abelhas e em

moscas isolaram leveduras pertencentes aos géneros Metschnikowia e Wickerhamiella, e mais

especificamente Wickerhamiella domercqiae entre outras espécies pertencentes ao último

género (isolada em abelhas). De salientar que a estirpe tipo pertencente à última espécie

referida, foi isolada de uma cuba de vinho de uma adega situada na África do Sul, no ano de

1960 por van der Walt e van Kerken (van Uden e Vidal-Leiria, 1970).

Metschnikowia pulcherrima é uma espécie de leveduras muito associada a flores e

frutos (Lodder, 1970), tendo sido isolada de inflorescências de cultivares de Vitis vinifera por

van Zyl e Du Plessis (1961; cit. in Davenport, 1974). Em 1972, Barnett et al., isolaram entre

3


outros géneros da microbiota associada a uvas provenientes da região de Bordéus, o género

Rhodotorula e a espécie Kloeckera apiculata. Rosini et al. (1982) associaram as espécies

Metschnikowia pulcherrima e Kloeckera apiculata com a microbiota proveniente das uvas

que mais relevância tinham nas fases pré-fermentativas e de início de fermentação.

Populações de leveduras das espécies Candida albicans, C. edax, C. humicola, C.

sake, Hanseniaspora osmophila, Lodderomyces elongisporus, Pichia membranifaciens,

Rhodotorula glutinis, R. minuta e Saccharomyces cerevisiae, foram isoladas da superfície de

uvas por Parish e Carrol (1985), e verificaram que estas populações apresentavam uma

distribuição regular em castas de Vitis muscadinea (Vitis rotundifolia).

Já em mostos de uva em fases pré-fermentativas, Castelli e Georgantas (1970)

isolaram, em 15 amostras provenientes das regiões Thessaloniki e Florina (norte da Grécia),

estirpes de leveduras das espécies Candida pulcherrima e Torulopsis bacillaris, sendo

Saccharomyces rosei e Kloeckera apiculata as espécies de leveduras mais predominantes.

Noutro país mediterrâneo, Pardo et al. (1989) verificou que no processo de vinificação de

mostos nas fases pré-fermentativas, provenientes de uma região vitivinícola de Espanha, as

espécies mais frequentemente isoladas foram Candida pulcherrima, C. stellata, Kloeckera

apis, K. Japonica, Pichia fermentans, P. kluyveri, Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora

delbrueckii.

Num estudo extensivo a 4 anos de vindimas sucessivas (1986-1990) na Eslováquia,

Stollarova (1992) identificou 1126 estirpes de leveduras isoladas de mosto de uva, e verificou

que as espécies mais abundantes foram Metschnikowia pulcherrima e Hanseniaspora uvarum,

as quais faziam parte, em conjunto com Saccharomyces cerevisiae, S. rosei e Candida vini,

das populações de leveduras permanentemente encontradas nas uvas.

Peynaud e Domerq (1959) isolaram 2023 estirpes de leveduras, em uvas e mostos

provenientes de vinhas da região de Gironde. Encontraram frequentemente associadas a uvas

brancas Torulopsis bacillaris e Saccharomyces oviformis, as quais representavam 90 % das

espécies de leveduras isoladas em mostos, e verificaram que Torulopsis bacillaris encontrava-

se especialmente em regiões com uma elevada incidência de Botrytis cinerea (“podridão

nobre”). Também isolaram entre outras espécies, estirpes de levedura Candida pulcherrima,

Saccharomyces veronae, Pichia membranifaciens, Pichia fermentans, Saccharomyces

fructuum e Debaryomyces hansenii.

4


Em más condições de vindima, como o caso das vindimas com precipitação, foi

constatado por Longo et al. (1991), que as espécies Candida lusitanae, C. rugosa, C. stellata,

C. vini, Dekkera intermedia e Pichia carsonii sofriam um incremento muito significativo, e

não se encontravam presentes nos mostos de vindimas efectuadas em condições climatéricas

mais secas.

Vindimas em condições difíceis, geralmente proporcionam infecções nas uvas por

Botrytis cinerea. A proliferação de B. cinerea induz, no bago, um aumento das concentrações

de açúcares redutores por exsudação, uma degradação das fontes de azoto, juntamente com a

produção de um ácido exógeno à uva (ácido galacturónico), tal repercute-se na microbiota

existente na película do bago (Donèche, 1993). Goto et al. (1984) visaram esse efeito, num

estudo comparativo de populações de leveduras provenientes de uvas infectadas por Botrytis

cinerea e de uvas sãs. Isolaram Zygosaccharomyces baillii e leveduras pertencentes ao género

Candida as quais predominavam em relação às leveduras apiculadas, nomeadamente

Hanseniaspora uvarum e outras espécies pertencentes ao género Kloeckera. Verificaram que

as leveduras não fermentativas Pichia carsonii e Candida valida tinham a menor expressão

das populações de leveduras, quer em uvas sãs quer em uvas infectadas. Em bagos

danificados as espécies de leveduras referidas por Guerzoni e Marchetti (1987), mais

frequentemente associadas a bagos com doenças, foram Hanseniaspora uvarum, Torulopsis

stellata, Metschnikowia pulcherrima e Saccharomycopsis vini, constataram, quando

comparados com os bagos sãos, que nos bagos que sofriam doenças eram onde as populações

de leveduras se multiplicavam mais activamente. Os autores avançaram a hipótese da

dispersão das leveduras ser efectuada de um modo entomófilo, veiculada por insectos

pertencentes ao género Drosophila.

1.1.2 Fermentação alcoólica

Desde cedo ocorreu o estudo dos fenómenos fermentativos por parte dos

investigadores. Em 1959, Peynaud e Domerq estudaram a sucessão de leveduras em

fermentações de mostos de uva branca provenientes da região de Gironde e denotaram a

presença de Torulopsis bacillaris no início e durante a primeira fase fermentativa. Com menor

frequência isolaram Saccharomyces veronae, S. fructuum, S. elegans, S. steineri e S. uvarum.

5


Noutra região de França (Saône-et-loire), Bréchot et al. (1962) num estudo de dois

anos sucessivos (1958-1960), isolaram, num mosto de Beaujolais em final de fermentação,

estirpes de leveduras Torulopsis bacillaris, T. stellata, Candida mycoderma, C. melinii,

Saccharomyces exiguus e S. veronae.

Num estudo ecológico da microbiota presente no decurso da fermentação de mostos

provenientes de regiões periféricas da Checoslováquia (Skalica-Záhorie, Bohême e Saale-

Unstrut), Minarik no ano de 1971, isolou estirpes das espécies Candida pulcherrima, C.

melinii, C. mycoderma, Kloeckera apiculata e leveduras formadoras de esporos

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, S. oviformis, S. bayanus, S. veronae, S. uvarum,

S. carlsbergensis, S. chevalieri, S. steineri, Torulopsis rosei, Pichia membranifaciens e

Hansenula anomala, em regiões periféricas. Após o final do processo fermentativo, foram

isoladas estirpes, pertencentes ao género Saccharomyces, das espécies S. cerevisiae var.

ellipsoideus, S. oviformis e S. willianus, assim como denotada a presença de estirpes de Pichia

membranifaciens e de Candida mycoderma, as quais foram frisadas como agentes potenciais

de formação de véu à superfície nos vinhos produzidos a partir de castas de uma das regiões

estudadas (Skalica-Záhorie).

De referir que uma das espécies detectadas no trabalho mencionado anteriormente,

Metschnikowia pulcherrima, é apontada designadamente por Park e Bertrand (1974), como a

responsável pelo surgimento do defeito ester taint no vinho, esta levedura caracteriza-se pela

formação elevada de acetato de etilo (60-140 mg/L). De um modo geral segundo os autores as

leveduras pertencentes aos géneros Candida e Metschnikowia têm uma produção baixa de

álcoois superiores e de ésteres.

No decorrer da fermentação, as leveduras apiculadas como Hanseniaspora uvarum, e a

sua forma imperfeita Kloeckera apiculata, são conhecidas por produzirem quantidades

limitadas de álcool etílico (4-6 %, v/v) (Gao e Fleet, 1988) acompanhadas de quantidades

importantes de compostos secundários como ácido acético, ésteres e glicerol (Romano et al.,

1992). Existe, contudo, alguma controvérsia segundo diversos autores em torno do seu

contributo real no produto final. Para Lafon-Lafourcade (1983; cit. in Venturin et al., 1994)

representam um factor indesejável devida à formação excessiva de acetato de etilo, e outros

ésteres causadores de sabores desagradáveis, enquanto que Mateo et al. (1991) atribuem-lhes

a produção de aromas frutados particulares.

6


A espécie Candida stellata, tem sido detectada em inúmeros trabalhos, alguns

referidos anteriormente, e Fleet et al. (1984) verificaram, ao examinarem os níveis de

leveduras presentes naturalmente durante a vinificação de dois vinhos tintos e dois vinhos

brancos da região de Bordéus, que as populações de T. stellata eram somente suplantadas em

número pelas populações de Saccharomyces cerevisiae. Monitorizaram esta levedura no

decurso da fermentação dos mostos e constataram um crescimento significativo, e a sua

presença até à fase final da fermentação alcoólica, o que sugere que se trata de uma levedura

que possui uma contribuição mais elevada na fermentação, do que anteriormente se pensava.

Esta levedura consegue tolerar 10 a 12 % (v/v) de álcool etílico. A sua presença prolongada

nos mostos em fermentação e a sua capacidade de produzir elevadas quantidades de ácido

acético, lactato de etilo e metil-2-propanol, pode influenciar a qualidade organoléptica do

vinho.

Para além das espécies acima referidas outros estudos revelaram a presença de uma

grande diversidade de espécies de leveduras, Parish e Carrol (1985) detectaram a presença de

populações de Lodderomyces elongisporus, Candida sake e Pichia besseii, em mostos em

fermentação, estando L. elongisporus presente em baixas incidências, sendo detectada até ao

segundo dia de fermentação.

Na região espanhola Utiel-Requena, Pardo et al. (1989) monitorizaram, em mostos

não sulfitados, o crescimento de populações de microrganismos. Nas fases iniciais da

fermentação, isolaram Candida stellata, C. pulcherrima, Kloeckera apis, e Kluyveromyces

thermotolerans, e verificaram a presença de leveduras de contaminação como Kloeckera

japonica, Pichia guilliermondii e Saccharomycodes ludwigii. Num estudo fermentativo de

Kluyveromyces thermotolerans, em mostos provenientes da ilha de Maiorca (levedura

bastante frequente na região), Mora et al. (1990), verificaram que os níveis de pH eram mais

baixos nos vinhos com esta levedura, assim como uma acidez volátil semelhante à dos

restantes vinhos, inoculados com Saccharomyces cerevisiae. De referir que leveduras

pertencentes ao género Kluyveromyces foram também isoladas em mostos de uva, num estudo

da microbiota proveniente da região de El Penedès, efectuado por Nadal et al. (1996). Noutros

estudos, na ilha de Maiorca, foram isoladas em mostos em fermentação estirpes de Candida

stellata, Kloeckera apiculata, C. pulcherrima, C. stealolytica e Saccharomyces cerevisiae,

assim como estirpes pertencentes a Hansenula anomala e Pichia membranifaciens, por Mora

e Mullet (1991).

7


No mesmo país, uma grande variedade de espécies de leveduras foi isolada por Longo

et al. (1991), em mostos de uva em fermentação, provenientes de duas regiões vitivinícolas –

Albariño e Valdeorras, nomeadamente Pichia farinosa, Debaryomyces hansenii, Rhodotorula

mucilaginosa, Candida pulcherrima, C. guilermondii, C. glabrata, C. lusitaneae e C. rugosa,

comuns às duas regiões. Na Zona de Albariño isolaram Cryptococcus albidus, Candida

stellata, Hansenula anomala e Hansenula silvicola, e na região Valdeorras isolaram C. vini,

Dekkera intermediae e Sporobolomyces roseus.

No decurso de uma fermentação espontânea, foram isoladas cerca de 270 estirpes de

leveduras por Hidalgo e Flores (1994), em mostos de uva provenientes de Espanha.

Verificaram que as espécies Saccharomyces exiguus, Hansenula anomala, Kluyveromyces

thermotolerans e Torulaspora delbrueckii, apresentavam baixas incidências de toxinas killer.

Incidindo-se na vinificação do vinho fortificado Xerez, Maiquez (1995) ao efectuar

um estudo da microbiota existente no mosto, proveniente de uvas da sua região de produção

(Jerez de la Frontera), detectou a variação de algumas estirpes durante a fermentação, com

destaque para as estirpes de Saccharomyces fermentati e Saccharomyces exiguus, que foram

isoladas em praticamente todo o processo fermentativo. As estirpes do género Saccharomyces

formadoras de véu à superfície apresentaram uma selecção manifesta com o álcool etílico, e

estavam presentes em todos os isolamentos efectuados no final da fermentação, variando as

percentagens de três espécies consoante os véus em estudo (Saccharomyces cheresiensis, S.

rouxii e S. beticus).

1.1.3 Fase posterior à fermentação

Nas superfícies de adegas e de equipamentos vinícolas, Peynaud e Domercq (1959)

isolaram 132 estirpes de leveduras de contaminação, pertencentes às espécies Saccharomyces

oviformis, S. ellipsoideus, S. elegans, S. chevalieri, Candida mycoderma, Brettanomyces vini,

B. schanderlii e leveduras pertencentes ao género Pichia, denotando que C. mycoderma se

encontrava muito difundida pelas superfícies da adega, mas que estava presente em maior

número em barricas de envelhecimento de vinhos, linhas de engarrafamento, e no solo de

caves de envelhecimento. Em vinhos que sofreram uma refermentação foram isoladas, pelos

8


mesmos autores, leveduras pertencentes às espécies Saccharomyces ellipsoideus, S. oviformis,

S. chevalieri, S. carlsbergensis, S. heterogenicus, S. acidifaciens, S. elegans,

Saccharomycodes ludwigii e Brettanomyces shanderlii.

Foi verificada em 1969, por Gandini, a predominância de leveduras de contaminação

Candida mycoderma e Pichia membranifaciens, e em menores proporções Trichosporon

pullulans e Hansenula anomala, na microbiota isolada em vinhos Asti engarrafados que

apresentavam turbidez. O autor associou a origem de contaminação com as superfícies da

adega, depósitos e equipamentos vinícolas, especialmente em linhas de enchimento e

engarrafamento. Também numa linha de enchimento, incidiu um estudo efectuado por

Minarik (1982), tendo este isolado das superfícies da respectiva linha, predominantemente

estirpes das espécies Torulopsis stellata, e de Candida vini, e ainda estirpes de C.

pulcherrima, Saccharomyces baillii var. baillii e de S. cerevisiae. Efectuou igualmente

estudos em mostos concentrados pela acção do calor, nos quais recuperou estirpes de T.

stellata e de T. domercqii. Ainda associadas com linhas de engarrafamento de vinhos,

Malfeito-Ferreira (1996), refere a detecção de estirpes de Lodderomyces elongisporus, assim

como detectadas em mostos de uva concentrados, tendo alcançado a sua identificação através

de perfis de ácidos gordos.

Na região de Moravia, em diversas caves de envelhecimento, Kyselakova (1994,

1995), observou a ocorrência de leveduras, e recuperou estirpes de leveduras Saccharomyces

cerevisiae, S. oviformis, S. carslbergensis e S. willianus. Das leveduras não pertencentes ao

género Saccharomyces, isolou Metschnikowia pulcherrima, Candida krusei, C. zeylanoides,

C. mycoderma, Kloeckera apiculata, Torulopsis stellata e T. bacillaris. Verificou que o

género Candida representava 42,3 %, Saccharomyces 34,6 %, Kloeckera 15,4 % e Torulopsis

7,7 % da microbiota total isolada nas caves de envelhecimento.

9


2. CLASSIFICAÇÃO DE LEVEDURAS

As leveduras constituem um grupo de fungos unicelulares taxonomicamente

heterogéneo e de elevada complexidade (Ribéreau-Gayon et al., 1998). O domínio das

leveduras compreende representantes de Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycetes

(Fungi Imperfeti). Foi demonstrado que as leveduras imperfeitas (deuteromicetas) podem

estar relacionadas tanto com as leveduras ascomicetas, como com as leveduras

basidiomicetas. A classificação atribuída por Hansen no século XIX, distinguiu os isolados de

leveduras provenientes da indústria cervejeira com base na morfologia das células e

ascósporos, características de crescimento em meios de cultura líquidos, temperaturas óptimas

de crescimento e a sua capacidade de fermentar diferentes tipos de açúcares. Com as

descobertas de leveduras com novas características, os taxonomistas foram alargando a lista

de caracteres fenotípicos descritas por Hansen, como a forma e dimensão das células, a

estrutura da parede celular e septos, o modo de reprodução vegetativa, a presença ou ausência

de estádios sexuais, as propriedades dos ascos e basídios, a morfologia dos ascósporos e

basidiósporos, o padrão das gerações alternadas, ploidia das fases vegetativas, formação de

pigmentos, a oxidação de cerca de 40 fontes de carbono, a utilização de azoto e formas

azotadas, crescimento a diversas temperaturas, liquefacção de gelatina, tolerância a elevadas

concentrações de glucose, resistência à ciclohexamida e a estrutura da coenzima Q envolvida

no transporte de electrões (van der Walt, 1987). Em leveduras a taxonomia tem suscitado

numerosos estudos, cujos resultados foram reagrupados em obras sucessivas, edificando

progressivamente a classificação que conhecemos hoje em dia (van der Walt, 1987; Ribéreau-

Gayon et al., 1998). Assim, características morfológicas, fisiológicas, bem como algumas

características moleculares, as quais são determinadas sob condições padronizadas,

constituem a principal base de classificação de leveduras apresentada nos mais recentes

tratados de taxonomia (Kurtzman e Fell, 1998; Barnett et al., 2000)

A taxonomia de leveduras, como dos restantes microrganismos, compreende a sua

classificação e identificação. A classificação permite agrupar os organismos em taxa, em

função das suas similaridades e/ou das suas relações com um ancestral comum. O taxon base

trata-se da espécie, a qual pode ser definida, como uma população de estirpes que apresentam

em comum um certo número de características morfológicas, fisiológicas, genéticas e

ecológicas, as quais constituem a descrição estandardizada da espécie. A identificação

10


consiste em efectuar uma comparação de um organismo desconhecido com outros já

classificados e denominados que apresentem características semelhantes (Ribéreau-Gayon et

al., 1998).

Uma vez definidas, as espécies individuais podem ser arranjadas em géneros e

famílias, com base nas semelhanças totais, de modo a formar um sistema hierárquico.

Contudo, embora a identificação das espécies seja o principal objectivo de todos os esquemas

de classificação microbiológica, a separação e reconhecimento exacto das subespécies

ocorrentes numa espécie, tem assumido uma grande importância em todos os ramos da

microbiologia, como por exemplo na microbiologia enológica e microbiologia clínica

(Towner e Cockayne, 1993).

A fragilidade da identificação pelos métodos microbiológicos convencionais foi posta

em evidência pelos métodos de análise de genoma. Segundo Poncet et al. (1992) a

classificação de leveduras baseada nos caracteres fenotípicos, como as características

morfológicas e fisiológicas ou as reacções bioquímicas, nem sempre revelaram ser

satisfatórias, especialmente na delimitação de organismos relacionados com um parentesco

próximo. Devido à grande variabilidade da assimilação e fermentação de fontes de carbono

por parte das estirpes, as espécies do grupo Saccharomyces sensu stricto proporcionam um

bom exemplo desta problemática. Acrescente-se que na taxonomia tradicional de leveduras,

nem sempre é satisfatória a diferenciação de espécies, com base nos critérios atrás referidos,

em parte devido a muitas separações se basearem na presença ou ausência de uma

determinada característica, a qual é muitas vezes controlada por um único gene susceptível de

mutação (Lewicka et al., 1995; Kümmerle et al., 1998).

Os primeiros estudos de comparação de DNA e RNA de estirpes do género

Saccharomyces, efectuados por Bicknell e Douglas (1970), permitiram a diferenciação de três

géneros, Zygosaccharomyces, Torulaspora e Kluyveromyces. Yarrow e Meyer (1978)

combinaram o género Candida com o Torulopsis, separados originalmente pela presença ou

ausência de pseudomicélio, ao descobrir respectivamente, que a formação de pseudomicélio

poderia variar entre as estirpes pertencentes às mesmas espécies. De um modo semelhante

Kurtzman (1984) propôs a união dos géneros Pichia e Hansenula, separados pela capacidade

de assimilar nitratos, quando estudos de reassociação DNA-DNA efectuados a três estirpes

pertencentes a espécies que apresentavam similaridades fenotípicas (H. minuta, H.

nonfermentans, P. lindneri), revelaram 75 % de semelhança entre P. lindneri e H. minuta, e

50 % de semelhança da espécie H. nonfermentans com H. minuta e P. lindneri.

11


Para uma classificação ser fiável, necessita ser suportada por semelhanças

filogenéticas e considerar as semelhanças e dissemelhanças a nível do genoma. A utilização

de técnicas oriundas dos progressos a nível da biologia molecular, como a comparação de

perfis de isoenzimas, proteína total, ou nas técnicas de análise de ácidos nucleicos (perfis de

restrição de DNA mitocondrial, análise de cariótipo por electroforese em campo pulsado,

técnicas baseadas na Reacção em Cadeia de Polimerase, PCR- Polymerase Chain Reaction,

ou sequenciação de DNA ribossómico), tornou então possível a obtenção de mais informação

e maior precisão, acerca dos relacionamentos descritos entre as espécies. E o que se iniciou

como uma matéria subjectiva e intuitiva, modificou-se radicalmente com a aplicação das

técnicas moleculares, que levaram à revisão de alguns esquemas de classificação aceites,

obtendo-se igualmente um enorme impacto na sistemática, com o reconhecimento de novos

relacionamentos entre os microrganismos e alterando radicalmente a delimitação de espécies e

géneros (Kreger-van Rij, 1984; Deak e Beuchat, 1986; Poncet et al., 1992; Towner e

Cockayne, 1993).

Em indústrias alimentares, existe a necessidade emergente de implementar métodos

fiáveis de identificação de microrganismos de degradação dos alimentos, nomeadamente na

implementação de uma metodologia que efectue uma monitorização das diversas etapas de

processamento, para controlar o nível de higienização das superfícies e equipamentos, bem

como no rastreio de possíveis fontes de contaminação em todo o processo (Baleiras-Couto et

al., 1996b). Nesse sentido a indústria alimentar necessita da utilização de um método de

identificação rápido, fiável, simples e de baixo custo, o qual consiga a identificação e

diferenciação dos microrganismos de contaminação (Baleiras-Couto et al., 1995; Kümmerle

et al., 1998).

Na indústria alimentar as técnicas rápidas de identificação e caracterização da

microbiota de alimentos e bebidas teve um desenvolvimento muito direccionado na indústria

de vinhos e à semelhança do que acontece com bactérias de foro clínico, as tecnologias de

biologia molecular parecem vir a ocupar um lugar primordial na identificação da microbiota

existente. Estas técnicas incluem diversas metodologias moleculares (RFLP, DNA-

fingerprinting e técnicas baseadas no PCR), análise de ácidos gordos de cadeia longa, e de

isoenzimas (Thomas, 1993; Malfeito-Ferreira, 1996; Loureiro, 2000).

12


2.1 Testes clássicos, simplificados e miniturizados

As metodologias convencionais para identificação de leveduras tratam-se de um

processo complexo, laborioso e um enorme dispêndio de tempo, as quais podem levar a

resultados ambíguos como foi referido anteriormente. Devido a este facto, as metodologias

clássicas têm vindo a perder espaço de manobra na indústria, tendo mesmo vindo a perder

importância como padrão.

Uma linha de desenvolvimento de técnicas de identificação de leveduras levou para

uma miniturização de testes de identificação, na tentativa de desenvolver técnicas mais

rápidas e simples. Deste modo desenvolveram-se vários testes de identificação baseados em

reacções metabólicas, como API 20C e ATRB 22C (API bio Merieux) (Thomas, 1993;

Heelan et al., 1998; Smith et al., 1999). O sistema de galerias API 20C baseia-se em 19 testes

de assimilação, e foi concebido para a identificação de espécies de leveduras do foro clínico.

Subden et al. (1980) aplicaram este método no estudo de leveduras presentes no vinho,

utilizando para tal 72 estirpes de leveduras. Nos resultados obtidos, não conseguiram

assegurar 100 % de eficácia na identificação, e denotaram a necessidade da criação prévia de

uma base de dados adequada, com base nas capacidades de assimilação e fermentação das

leveduras em estudo. Malfeito-Ferreira (1996), refere que na criação da base de dados, o

conjunto de leveduras que servem de base à interpretação dos resultados, condiciona em

grande medida a utilidade dos métodos miniturizados e simplificados. Outra limitação destes

testes, apontada por Thomas (1993), trata-se dos tempos de resposta obtidos serem muito

lentos para possibilitar uma intervenção, e remediar uma contaminação eminente no processo

de fabrico.

Para fins de monitorização das tecnologias de processamento da indústria alimentar,

Deak (1986; cit. in Deak e Beuchat, 1996) propôs uma chave de identificação simplificada,

com base em considerações ecológicas, direccionada para espécies de leveduras associadas

com os alimentos. Foram elaboradas actualizações posteriores desta chave, com a

denominação de SIM (Simplified Identification Method – Método Simplificado de

Identificação). Este método consiste em utilizar uma chave dicotómica, que direcciona para o

tipo de testes bioquímicos utilizados. Na última revisão do SIM, proposta por Deak e Beuchat

(1996), são utilizados ao todo 30 testes bioquímicos, na sua maioria testes convencionais de

assimilação de fontes de carbono e azoto.

13


2.2 Métodos de análise de constituintes celulares

2.2.1 Espectroscopia por infravermelho

Kümmerle et al. (1998), propõem um método de identificação de leveduras por

espectroscopia de infravermelho FT-IR (Fourier-transformed infrared), esta técnica envolve a

observação das vibrações de moléculas excitadas por um feixe de infravermelhos, do qual

resulta um espectro de infravermelhos, que representa um fingerprinting característico.

Naumann (1985) propôs a utilização da espectroscopia de infravermelho na identificação de

microrganismos, uma vez que os espectros observados eram altamente específicos (Naumann

et al., 1991; Kirschner et al., 2001), pois eram compostos pelos acontecimentos vibráteis de

diversos componentes celulares, tais como por exemplo, DNA, RNA, proteínas, e

componentes da membrana e parede celular (Timmins et al., 1998).

Para efectuar a implementação desta metodologia analítica, é necessário a criação de

uma biblioteca de espectros de referência com base em estirpes e espécies bem caracterizadas.

A esta biblioteca de espectros de referência é comparado o espectro da estirpe em estudo,

obtendo-se a identificação da estirpe, caso o espectro revele semelhanças com o espectro de

referência, é portanto de uma extrema importância a representatividade e robustez dos

espectros referência de forma a fornecerem respostas credíveis, garantindo a fiabilidade do

método. Esta metodologia analítica é bastante rápida por necessitar de poucas quantidade de

biomassa dos organismos em análise, o que reduz de um modo significativo o tempo de

crescimento celular, assim a sua velocidade aliada a uma resolução elevada, de ser uma

metodologia de fácil aplicação, não necessitar de muitas manipulações de amostras assim

como da utilização de muitos reagentes, e a capacidade de analisar muitas centenas de

amostras por dia, tornam esta metodologia muito propensa para a indústria alimentar, e com

um enorme potencial na rápida diferenciação, classificação e identificação, no rastreio rápido

de microrganismos, nomeadamente leveduras de contaminação de alimentos (Naumann et al.,

1991; Timmins et al., 1998; Kirschner et al., 2001).

Kümmerle et al., 1998 efectuaram um estudo abrangendo 332 estirpes de leveduras

provenientes das colecções de culturas internacionais, dos géneros Issatchenkia, Pichia,

Candida, Hanseniaspora, Dekkera, Saccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces,

Debaryomyces, Zygosaccharomyces, Wickerhamiella, Schizosaccharomyces entre outros,

14


com as quais foi construída a base dos espectros de referência. Após a sua construção foram

analisados 722 isolados, sendo que 97 isolados foram correctamente identificados por FT-IR.

Os resultados obtidos através da utilização desta metodologia analítica, apontam para

as limitações do FT-IR, para fins taxonómicos (Kümmerle et al., 1998; Oberreuter et al.,

2002), contudo segundo Kümmerle et al. (1998), este facto não inviabiliza a sua eficácia

como sistema de identificação.

2.2.2 Perfis de ácidos gordos

A análise de perfis de ácidos gordos de cadeia longa consiste numa extracção dos

ácidos gordos com a utilização de uma reacção de saponificação, e sua determinação,

mediante a utilização de técnicas como a cromatografia em fase gasosa, espectometria de

massa e cromatografia gás-líquido, GLC – Gas Liquid Chromatography (Tredoux et al.,

1987; Guarro et al., 1999; Peltroche-Llacsahuanga et al., 2000). Tredoux et al. (1987)

utilizaram a GLC na determinação da composição em ácidos gordos de cadeia longa, em 104

estirpes de leveduras pertencentes a 39 espécies. Os autores conseguiram efectuar a sua

separação em três grandes grupos, consoante as composições de ácido oleico, linoleico,

linolénico, palmítico e palmitoleico. Contudo, estes agrupamentos não exprimiram os

relacionamentos filogenéticos entre as estirpes.

A análise de perfis de ácidos gordos de cadeia longa, tem contudo vindo a provar ser

um método que pode ser aplicado no rastreio de contaminações nas indústrias alimentares,

com curtos tempos de resposta (cerca de 3 dias). Malfeito-Ferreira (1996) efectuou um estudo

exaustivo das potencialidades deste método, e conseguiu avaliar os tipos de leveduras de

contaminação mais frequentes, e separá-las consoante a sua perigosidade e estabelecer

indicadores zimológicos relevantes.

2.2.3 Técnicas baseadas nos ácidos nucleicos

Até ao final dos anos 60, a principal maneira de identificar e classificar as espécies, era

com base nos métodos fenotípicos. Contudo características fenotípicas como a assimilação e

fermentação de muitos compostos são controladas por um ou muito poucos genes (Lindegren

e Lindegren, 1949; Winge e Roberts, 1949; cit. in Kurzman, 1998). Com o desenvolvimento

15


dos métodos de análise dos ácidos nucleicos surgiu a oportunidade de definir as espécies com

base nas semelhanças da totalidade do genoma (Kurtzman, 1998). Assim, têm sido

desenvolvidas modernas metodologias, baseadas em técnicas de biologia molecular, de modo

a simplificar a identificação, mais especificamente metodologias de análise de DNA, as quais

possuem a vantagem de serem independentes da expressão do genoma (Ness, 1993; cit. in

Baleiras-Couto et al., 1995; Kurtzman, 1998). Mais concretamente para leveduras enológicas,

métodos baseados na análise de ácidos nucleicos, como a análise de enzimas de restrição de

DNA genómico e DNA mitocondrial em campo pulsado, bem como métodos baseados na

reacção de PCR, forneceram melhorias na velocidade e resolução das suas determinações

taxonómicas (Yamamoto et al., 1991; Masneuf e Dubourdieu, 1994; Quesada e Cenis, 1995;

Baleiras-Couto et al., 1995, 1996a, 1996b; Constantí et al., 1997; Esteve-Zarzoso et al., 1999,

2001).

Uma das técnicas usadas na diferenciação de organismos é designada por RFLP,

(Restricton Fragment Length Polymorphism), e que, segundo Ferreira e Grattapaglia (1995), é

o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da cadeia dupla de DNA.

Após a extracção de DNA dos indivíduos, este é tratado com enzimas de restrição, que

efectuam cortes num elevado número de locais (sítios de restrição), resultando uma enorme

quantidade de fragmentos de DNA. Em seguida estes fragmentos de tamanhos distintos são

separados por electroforese. Devido a um arrastamento contínuo promovido pelos fragmentos

no gel, não é possível visualizar diferenças, pelo que se efectua uma transferência, para uma

membrana colocada sobre o gel (Ferreira e Grattapaglia, 1995), e adiciona-se uma sonda

marcada de 0,5 a 2,0 kb que hibrida com os fragmentos homólogos existentes na membrana

(Southern, 1975; cit. in Neto, 1994). De seguida submete-se a membrana a um filme de raios

X (autoradiografia), ou outro tipo de revelação dependendo do marcador, o que permite

revelar as bandas constituintes dos marcadores RFLP. Assim, posições diferentes devem-se a

fragmentos de distintos tamanhos, o que permite a distinção de indivíduos (Ferreira e

Grattapaglia, 1995). Referindo diversos autores, Baleiras-Couto (1995) aponta para as grandes

desvantagens desta técnica, que são devido a ser bastante laboriosa, dispendiosa de tempo, e

assim como necessitar de elevadas quantidades de DNA ou RNA relativamente purificado, o

que faz desta técnica, pouco apropriada na rotina de identificação.

16


A técnica de Reacção em Cadeia de Polimerase, PCR – Polymerase Chain Reaction,

trata-se de uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de

cópias de um segmento específico de DNA na presença de DNA polimerase. A reacção de

PCR baseia-se no emparelhamento e extensão enzimática de um par de oligonucleótidos

utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a sequência da cadeia dupla de DNA

alvo da amplificação. Os primers são sintetizados artificialmente com o objectivo de serem

complementares com sequências específicas que flanqueiam a região alvo.

Um ciclo de PCR envolve três etapas – desnaturação, emparelhamento e extensão. Na

primeira etapa, a cadeia dupla de DNA alvo é desnaturada por aumento de temperatura,

seguindo-se a etapa de emparelhamento, na qual, mediante uma redução drástica de

temperatura, promove-se uma hibridação de DNA-DNA de cada primer com as sequências

complementares que rodeiam a região alvo. Segue-se a fase de extensão, na qual promove-se

um novo aumento de temperatura, para possibilitar que a enzima DNA polimerase realize a

extensão a partir de cada terminal 3’ dos primers. Por último, aumenta-se a temperatura e o

ciclo repete-se por algumas dezenas de vezes (Ferreira e Grattapaglia, 1995). O PCR e as

técnicas baseadas na amplificação de DNA são muito utilizadas, não somente por

necessitarem de pequenas quantidades de DNA, como por serem bastante rápidas e de fácil

execução (Baleiras-Couto, 1995).

A técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) consiste na criação de

padrões mediante a amplificação, por reacção PCR, de segmentos casuais de DNA com

primers únicos, ou sequências aleatórias de nucleótidos, sendo depois separados por

electroforese (Baleiras-Couto, 1995). Segundo diversos autores os primers possuem

sequências arbitrárias, contudo a sua amplificação tecnicamente não ocorre de forma

aleatória, mas sim em locais específicos do genoma. Desta forma, mediante a utilização desta

técnica, criam-se impressões digitais dos genótipos, simples e reprodutíveis, as quais

permitem a sua identificação (Ferreira e Grattapaglia, 1995). Em ensaios experimentais a

leveduras de contaminação, efectuados por Baleiras-Couto et al. (1995), as técnicas RAPD e

análise de perfis de restrição de rDNA provaram ser ferramentas poderosas na identificação

de leveduras, ao nível da espécie. Contudo os dados obtidos através de RAPD são algo

complexos, pelo que os autores aconselharam o seu tratamento através do método de análise

de componentes principais. Um dos problemas da análise de RAPD, é a amplificação, a qual

tem de ser efectuada sob condições muito restritas, pois é extremamente sensível a alterações

na temperatura de emparelhamento, que pode induzir uma variabilidade dos perfis de bandas

17


obtidos, e por conseguinte levar a se tratar de uma metodologia de muito difícil

reprodutibilidade (Quesada e Cenis, 1995; van der Vossen e Hofstra, 1996; Olive e Bean,

1999).

O MSP-PCR ou PCR fingerprinting, baseia-se também no PCR, e trata-se da mais

recente inovação das técnicas de análise de DNA. Consiste na amplificação de fragmentos

usando como primers oligonucleótidos com sequências de DNA repetitivas, também

designados por primers microsatélite. O PCR fingerprinting permite efectuar uma

discriminação ao nível da espécie e da estirpe, possui a vantagem de ser mais reprodutível que

o RAPD, devido ao facto da temperatura a que se efectua o emparelhamento das bases, ser

superior (van der Vossen e Hofstra, 1996). Esta técnica tem sido utilizada em diversas

investigações do genoma, Baleiras-Couto et al. (1996a) ao estudarem estirpes de

Saccharomyces cerevisiae, não conseguiram efectuar a discriminação ao nível da estirpe

mediante a utilização de uma só das técnicas usadas (RAPD, o PCR fingerprinting, e análise

de enzimas de restrição em rDNA amplificado: regiões ITS e NTS). Os autores referem por

isso, a necessidade de combinar os resultados de identificação obtidas por mais de uma

técnica analítica dos ácidos nucleicos. Uma vez que o RAPD e o PCR fingerprinting são

técnicas de identificação rápidas e de relativo fácil maneio, podem ser efectuados múltiplos

testes, que possibilitem a identificação ao nível da estirpe.

A comparação de RNA ribossómico (rRNA) e do seu DNA ribossómico (rDNA)

correspondente, tem sido aplicada a um nível extensivo nos últimos anos para estimar os

relacionamentos entre diversos organismos. O seu interesse provém de duas propriedades: 1)

dos ribossomas se encontrarem presentes em todos os organismos, e parecerem partilhar uma

origem de linha evolutiva comum; 2) e de ser consensual de que algumas sequências de

rRNA / rDNA se encontrarem suficientemente conservadas, e de serem homólogas entre

todos os organismos, servindo de ponto de referência para o alinhamento das regiões menos

conservadas, permitindo a avaliação de evolução (Kurtzman, 1994). Assim, é aceite como o

melhor foco de estudo para inferir as relações filogenéticas dos organismos, uma vez que a

variabilidade nele contida reflecte a divergência evolutiva da espécie (Vandamme et al.,

1996). Em seres eucariontes, o rRNA ocorre em diversas classes de tamanho: a grande

subunidade (25S-28S), a subunidade pequena (18S) e a subunidade 5,8S; para cada uma das

classes de tamanho de DNA ribossómico foi examinada a um nível filogenético a extensão da

informação presente (Kurtzman, 1994). O autor refere que para fungos bem como outros

18


organismos, foram fornecidos por White et al. (1990) e Kaltenboeck et al. (1992), protocolos

para a sequenciação de rDNA mediante a utilização de primers oligonucleótidos específicos e

sua amplificação através da reacção de PCR. A metodologia da sequenciação tem por base a

cópia de DNA in vitro pela DNA polimerase, e a inserção das quatro bases (dNTPs- A, G, T,

C). Acontece que juntamente com essas bases são adicionadas bases homólogas

didesoxiribonucleotidos trifosfato (ddNTP), as quais se ligam no local da base

correspondente. Os ddNTP actuam como terminais de transcrição, dado que não possuem o

local de ligação da base seguinte, e originam-se desta forma fragmentos de oligonucleótidos

com os mais diferentes tamanhos, em que a base terminal é a ddNTP, a qual pode estar

marcada com um fluoróforo específico e assim ser detectada e identificada por um

sequenciador automático de DNA, e a construção do mapa genético vai sendo transcrita

(Towner e Cockayne, 1993).

Fell (1993; cit. in Kurtzman, 1994) utilizou 3 primers numa técnica baseada no PCR,

para identificar leveduras. A mistura da reacção incluiu DNA genómico, dois primers

externos para a região D1/D2 da subunidade grande de rDNA, e um primer interno o qual

revelou ser específico para a espécie. Os primers externos permitiram a amplificação de uma

cadeia nucleotídica com 600 pb da região D1/D2, mas na presença do terceiro primer, o

produto da reacção resultou uma cadeia com um comprimento menor e facilmente detectável

numa corrida electroforética em gel de agarose. Constatou-se que em seres eucariontes esta

região apresentava uma elevada variação de espécie para espécie, tendo sido muito utilizada

para estudos taxonómicos de espécies de leveduras (Kurtzman, 1994; Kurtzman e Blanz,

1998; Stender et al., 2001).

Em 1997 Kurtzman e Robnett efectuaram um estudo filogenético exaustivo, com base

na análise de sequências parciais da região D1/D2 de rDNA da subunidade grande (26S), em

204 espécies de leveduras ascomicetas com bastante significado do ponto de vista clínico, das

quais 21 espécies revelaram ser sinónimas, nomeadamente as espécies Pichia mexicana e

Candida veronae revelaram possuir a mesma sequência nucleotídica. Em 1998, Kurtzman e

Robnett, empregando a mesma metodologia publicaram um estudo de aproximadamente 500

espécies de leveduras ascomicetas. Os autores compararam os resultados das classificações

filogenéticas atribuídas por James et al. (1997), baseados na análise de sequências de rRNA

18S efectuadas ao grupo de leveduras com afinidade ao género Saccharomyces. O estudo

incluiu todas as espécies conhecidas de leveduras ascomicetas, e a análise dos resultados

permitiu uma avaliação dos relacionamentos filogenéticos entre as espécies, com base nesta

metodologia foi possível diferenciar a generalidade das espécies em estudo.

19


Fell et al. (2000) efectuaram um estudo em leveduras basidiomicetas, no qual

empregaram análise da sequência nucleotídica de fragmentos amplificados da região D1/D2

da subunidade 26S, e regiões ITS1 e ITS2, foram focadas 337 estirpes representantes de 230

espécies pertencentes a 18 géneros anamórficos e 24 géneros telemórficos. Este estudo

revelou que a maioria das espécies podia ser identificada com base na análise de fragmentos

nucleotídicos da região D1/D2, embora fosse requerida a análise com base nas regiões ITS1 e

ITS2, para efectuar a distinção de espécies com um relacionamento muito próximo.

2.2.4 Análise de proteínas

A análise de perfis electroforéticos de proteínas é uma metodologia importante no

estudo da variabilidade genética. O princípio subjacente a esta metodologia é o de que a

função e estrutura das proteínas são determinadas pela sequência de aminoácidos (a qual

constitui a estrutura primária), os quais são codificados pelo DNA. Alterações na estrutura

primária vão influenciar a estrutura secundária e terciária da proteína, contribuindo para

diferenças nas suas propriedades físico-químicas, como a forma, a carga eléctrica, a

hidrofobicidade e ponto isoeléctrico, entre outras (Hames, 1990). Inserindo o conceito

introduzido por Phaff (1984; cit. in Duarte, 2000), o de que a diversificação genética é função

do tempo, ou seja que organismos que apresentem uma similitude elevada ao nível do

genoma, e por conseguinte uma elevada similitude ao nível macromolecular, partilham uma

linha evolutiva comum divergente há menor tempo. Acontecendo o oposto para organismos

que se tenham separado do mesmo tronco evolutivo à mais tempo, ou seja, que exibem

maiores diferenças ao nível do genótipo e do fenótipo, nomeadamente de proteínas. Ao

estudarem-se as sequências de aminoácidos de proteínas provenientes de diferentes

organismos pode-se verificar o número de semelhanças e dissemelhanças entre estes, e deste

modo inferir os seus relacionamentos filogenéticos.

Van Vuuren e van der Meer (1987) analisaram os perfis electroforéticos de proteínas

solúveis totais, de 29 estirpes de leveduras enológicas pertencentes ao género Saccharomyces,

identificadas por testes convencionais como S. cerevisiae, S. bayanus, S. uvarum e S.

carlsbergensis. Os autores constataram a proximidade de parentesco entre as estirpes e

verificaram uma incorrecta classificação para S. carlsbergensis e S. uvarum, uma vez que,

com base na análise de proteínas totais ambas as espécies apresentaram perfis idênticos aos de

20


S. cerevisiae. A análise de proteínas totais provou ser uma metodologia útil na caracterização

de espécies próximas filogeneticamente.

Vancanneyt et al. (1991) analisaram os perfis electroforéticos de proteína total em 112

estirpes de leveduras pertencentes a 20 géneros. No sentido de obterem perfis de bandas

reprodutíveis os autores efectuaram a extracção de proteína total sob condições

estandardizadas, durante a fase exponencial de crescimento das estirpes. A combinação desta

técnica com a análise numérica permitiu deduzir relacionamentos taxonómicos a nível

interespecífico das espécies estudadas.

Uma metodologia de análise de proteínas bastante utilizada como técnica de

delimitação de espécies de leveduras, é a determinação de perfis electroforéticos de

isoenzimas (Towner e Cockayne, 1993), e que será abordada de seguida.

2.2.4.1 Análise Isoenzimática

2.2.4.1.1 Isoenzimas

O termo isoenzima define um grupo de múltiplas formas moleculares da mesma

enzima. Estas formas possuem as mesmas funções catalíticas, mas sequências de aminoácidos

diferentes, podendo diferir também na sua estrutura secundária, terciária e quaternária. Os

mecanismos que induzem alterações na sequência de aminoácidos e assim da estrutura

primária da enzima são designados por genéticos, e ocorrem com a transcrição e tradução do

ADN codificante da enzima. Os mecanismos que introduzem alterações pós transcrição e

tradução da enzima são designados por epigenéticos. Nos mecanismos genéticos as

isoenzimas podem ser derivadas de: diferentes alelos de um mesmo locus; de genes

diferentes, os quais codificam proteínas independentes, as quais podem actuar em diferentes

compartimentos celulares; podem ser poliméricas com subunidades idênticas, codificadas por

um único locus; ou poliméricas com subunidades codificadas por mais do que um locus,

formando homopolímeros e/ou heteropolímeros ( (Acquaah, 1992).. Outra situação de

polimorfismo advém de erros no processo de transcrição, ao nível do RNA-transferência, ou

na tradução, RNA-síntese, (Eiras-Dias, 1994). Nos mecanismos epigenéticos pode-se induzir

igualmente o polimorfismo enzimático, mediante alterações da cadeia polipeptídica por

reacções de fosforilação, agregação, desaminação, acilação e deleções parciais de

21


oligopéptidos, os quais alteram assim a estrutura primária e deste modo as restantes estruturas

da enzima. Outro mecanismo epigenético trata-se da alteração da configuração estrutural das

proteínas no que respeita à sua estrutura secundária e terciária, resultando em isoenzimas

conformacionais (Selander et al., 1986; Acquaah, 1992; Bonde et al., 1993; Morris et al.,

1993).

2.2.4.1.2 Técnica de electroforese

O nome electroforese tem origem do Grego, e designa o transporte através da

electricidade. As primeiras electroforeses com proteínas solúveis foram efectuadas nos anos

que precederam a segunda Guerra Mundial (Pasteur et al., 1987). Nos últimos 20-30 anos o

desenvolvimento de técnicas baseadas na electroforese de proteínas, como é o caso das

isoenzimas, vieram a constituir uma metodologia muito importante na análise da variabilidade

genética, visto que, situam-se entre os métodos fenotípicos que maior expressão pode inferir

do genoma (Sampaio, 1998)

As isoenzimas, sob a acção de um campo eléctrico, migram a uma velocidade

dependente do seu tamanho, forma e carga da proteína. Nesta conjectura pode ser introduzido

o conceito de densidade de carga eléctrica que corresponde à carga eléctrica por unidade de

massa ou tamanho. No caso das isoenzimas de diferentes cargas e tamanhos, se estas forem

sujeitas a electroforese num meio suporte com propriedades de crivagem, as que possuírem

maior densidade de carga eléctrica, possuem velocidades de migração superiores às de menor

densidade de carga (Hames, 1990; Acquaah, 1992; Towner e Cockayne, 1993). São as

mobilidades relativas de cada complexo isoenzimático que são utilizadas na caracterização de

organismos, obtendo-se perfis electroforéticos de isoenzimas (Selander et al., 1986).

O dispositivo de electroforese é constituído por um suporte de electroforese, no qual

são colocadas as amostras, e nas duas extremidades opostas do gel são colocadas soluções de

tampão de electroforese, as quais banham os eléctrodos (Pasteur et al., 1987).

Na escolha dos suportes empregues na electroforese o investigador tem que ter em

linha de conta factores como os custos, a duração da electroforese, a facilidade de maneio, e

para o caso do gel de amido, a possibilidade de ser cortado em fatias e permitir a revelação de

múltiplos complexos isoenzimáticos, com uma economia de mão-de-obra (Pasteur et al.,

1987; Acquaah, 1992).

22


A matriz do gel de poliacrilamida consiste numa mistura de acrilamida e de bis-

acrilamida, a qual cria uma malha tridimensional. A solução de acrilamida é polimerizada

mediante a adição de um catalisador, e as propriedades do gel de resolução são determinadas

pela concentração total de acrilamida e da quantidade relativa de bis-acrilamida (Towner e

Cockayne, 1993). Com concentrações superiores de acrilamida, obtêm-se menores

porosidades no gel, e as proteínas de cadeia longa irão sofrer um efeito de “crivo molecular”,

o que permite intervir no processo de electroforese, em relação à migração das proteínas e ao

tamanho dos poros (Pasteur et al., 1987). As vantagens da utilização da acrilamida, consiste

em ser quimicamente inerte, e estável a uma gama elevada de pH, temperaturas, e forças

iónicas, não ser adsorvente, ser transparente e finalmente adequar-se melhor ao

fraccionamento de tamanhos de proteínas, uma vez que os geis de poliacrilamida possuem

uma elevada gama de porosidades, o que não sucede com os de amido (Hames, 1990;

Acquaah, 1992).

Segundo Selander et al. (1986), têm sido realizados diversos estudos, que

demonstraram a sensibilidade da electroforese, a qual permite a detecção de uma grande

proporção de substituições de aminoácidos nas cadeias proteícas (80 a 90 %). Contudo, nem

todas estas substituições alteram a carga eléctrica global da isoenzima, as quais devido a isso

não conseguem ser diferenciadas por electroforese (Bonde et al., 1993).

Neste trabalho foi utilizada para a separação das proteínas a electroforese de gel de

poliacrilamida em condições nativas (PAGE-nativa), a qual permite a separação de proteínas

em função simultaneamente do seu peso molecular e da sua carga, ou seja, que a sua

separação é efectuada mediante a densidade de carga eléctrica. (Hames, 1990).

A análise de perfis electroforéticos de isoenzimas, tem por base a detecção de

diferenças entre as sequências de aminoácidos encontradas em enzimas de diferentes

organismos, as quais se tratam de um reflexo da sua divergência genética. As substituições de

aminoácidos podem ser detectadas através das extensões das suas migrações electroforéticas,

visualizadas por diferentes perfis de bandas, também designados zimogramas (Yamazaki et

al., 1998). Esta metodologia tem sido aplicada no estudo dos fluxos génicos e na

determinação da variabilidade genética de populações nos seus habitats naturais, no

esclarecimento de relações taxonómicas de leveduras bem como noutros grupos de

organismos (Kreger-van Rij, 1984; Acquaah, 1992; Ferreira e Grattapaglia, 1995). Essa

técnica tem permitido a delimitação de espécies de leveduras, fazendo mesmo parte da

descrição formal de algumas delas, o estudo de populações, designadamente em problemas

23


epidemiológicos e ainda o estabelecimento de relações anamorfo/ teleomorfo, em géneros tão

diversos como Saccharomyces, Pichia, Dekkera, Kluyveromyces e Candida (Yamazaki e

Komagata, 1982; Yamazaki et al., 1983; Sidenberg e Lachance, 1983; Holzschu et al., 1985;

Smith et al., 1990; Arnaviellhe et al., 1996; Naumov et al., 1997; Duarte et al., 1999; Duarte,

2000; Sampaio et al., 2001).

Subden et al. (1982) analisaram a variabilidade genética de 18 estirpes de leveduras

usadas em vinificação, por perfis electroforéticos de cinco complexos enzimáticos. Obtiveram

padrões distintos para os cinco complexos enzimáticos estudados, e que permitiram a sua

diferenciação.

Yamazaki et al. (1983), analisaram os perfis electroforéticos de 10 complexos

enzimáticos em 36 estirpes do género Saccharomyces, das quais 13 estirpes de S. cerevisiae, 3

estirpes de S. bayanus, 3 estirpes de S. uvarum, 2 estirpes de S. fermentati, 2 estirpes de S.

baillii, 2 estirpes de S. rouxii, e uma estirpe de cada uma das espécies – S. chevalieri, S.

delbrueckii, S. diastaticus, S. exiguus, S. florentinus, S. italicus, S. rosei, S. saitoanus, S.

telluris, S. bisporus e S. unisporus. A análise numérica dos perfis obtidos de todos os

complexos enzimáticos estudados revelou algum polimorfismo isoenzimático para as estirpes

do grupo Saccharomyces sensu stricto (van der Walt), as quais se tratavam das estirpes das

espécies S. cerevisiae, S. diastaticus, S. italicus, S. chevalieri, S. bayanus e duas das estirpes

S. uvarum. A análise comprovou contudo que as espécies referidas eram sinónimos,

comprovando que o grupo Saccharomyces sensu stricto era constituído por populações ou

variantes fisiológicas da mesma espécie (Barnett et al., 1979; cit. in Yamazaki et al., 1983).

Tal sucedeu de igual modo para as estirpes das espécies S. delbrueckii, S. fermentati, S. rosei

e S. saitoanus, as quais foram, posteriormente, classificadas como Torulaspora delbrueckii.

Os autores obtiveram a diferenciação das restantes estirpes do género Saccharomyces (S.

exiguus, S. telluris e S. unisporus), bem como das estirpes das espécies S. baillii, S. bisporus,

S. florentinus e S. rouxii, que foram colocadas no género Zygosaccharomyces. Obteve-se uma

divergência para uma estirpe de S. uvarum, a qual não revelou possuir relacionamentos com

nenhuma das estirpes estudadas.

Poncet et al. (1992) estudaram perfis electroforéticos de onze sistemas enzimáticos em

12 estirpes de Saccharomyces cerevisiae usadas em vinificação. Os autores verificaram a

existência de um polimorfismo evidente para a maioria dos sistemas enzimáticos estudados,

contudo obtiveram perfis isoenzimáticos distintos correspondentes a cada estirpe. A análise

numérica dos resultados permitiu concluir que todas as estirpes estudadas tratavam-se de

24


variantes fisiológicas de um mesmo taxon. Foi verificada uma heterogeneidade de um igual

modo, por Lewicka et al. (1995), no grupo Saccharomyces sensu strico, ao investigarem com

base nos perfis electroforéticos, em gel de amido, de sete sistemas enzimáticos, os

relacionamentos entre 52 estirpes pertencentes ao género Saccharomyces, das quais 50

pertencentes ao grupo Saccharomyces sensu strico, nomeadamente as espécies S. cerevisiae,

S. pastorianus, S. bayanus e S. paradoxus. A análise dos resultados permitiu inferir que o

grupo Saccharomyces sensu stricto era distinto das espécies S. kluyveri e S. servazii. Duarte et

al. (1999) obtiveram alguma heterogeneidade ao analisarem os perfis electroforéticos de

quatro complexos enzimáticos (EST, LDH, G6PD e ACP) de 35 estirpes (S. cerevisiae, S.

bayanus, S. pastorianus e S. paradoxus). Apesar de algum polimorfismo foi verificada a

formação de grupos correspondentes às quatro espécies, os quais se apresentavam claramente

separados, e verificou uma divergência superior entre o agrupamento de S. paradoxus e S.

cerevisiae, contrariamente a outros estudos neste grupo com metodologias genéticas, como a

sequenciação de rDNA. Assim confirmou-se a importância da análise de perfis

electroforéticos de isoenzimas na classificação, identificação, bem como na clarificação dos

relacionamentos taxonómicos entre as leveduras, nomeadamente para o género

Saccharomyces e o grupo Saccharomyces sensu stricto. Esta revelou também possuir uma

correlação próxima com a reassociação DNA-DNA (Yamazaki et al., 1983, 1998; Poncet et

al., 1992).

Num estudo taxonómico em populações do género Kluyveromyces (K. lactis, K.

marxianus, K. thermotolerans, K. waltii), Sidenberg e Lachance (1986), aplicaram a análise

de perfis isoenzimáticos para discriminar os diversos graus de variabilidade intraspecífica, e

determinar os seus relacionamentos, com base em cinco sistemas isoenzimáticos. Em geral,

exceptuando algumas estirpes discrepantes, que se verificou serem identificações incorrectas,

os resultados conduziram à formação de agrupamentos correspondentes às diferentes espécies

em estudo.

Smith et al. (1990) estudaram a variabilidade entre os géneros Dekkera,

Brettanomyces e Eeniella. Para tal, analisaram os perfis isoenzimáticos de cinco enzimas, de

39 estirpes das espécies Dekkera anomala, D. bruxellensis, D. abstinens, e dos seus estados

anamorfos Brettanomyces anomalus, B. bruxellensis e B. intermedia, assim como B.

claussenii, B. custersianus, B. custersii, B. intermedius, B. lambicus, B. naardenensis e

Eeniella nana. A análise numérica dos perfis isoenzimáticos obtidos, conjuntamente com

25


reassociações de DNA, permitiu a revisão da delimitação das espécies e o estabelecimento das

relações entre estados anamorfo/ telemorfo e entre os 3 géneros.

Muitos autores referem que o polimorfismo enzimático induzido por mecanismos

epigenéticos, se trata de uma fonte de erro na análise da variabilidade genética com a análise

de perfis electroforéticos de isoenzimas (Selander, 1986). Para evitar fontes de erro adicionais

deve existir uma preocupação em estandardizar as condições de crescimento dos organismos

em estudo (Towner e Cockayne, 1993). Santos et al. (1999), efectuaram o estudo da

estabilidade dos perfis isoenzimáticos, tendo para tal analisado os perfis electroforéticos de

cinco sistemas enzimáticos, em estirpes de diferentes espécies: Saccharomyces cerevisiae,

Torulaspora delbrueckii, Pichia anomala, Schizosaccharomyces pombe e Rhodotorula

mucilaginosa, foram também consideradas diferentes fases de crescimento celular (fase

exponencial e estacionária), em meio sintético rico e mosto de uva corrigido. Verificaram que

as condições de crescimento influenciaram de modo diferente os perfis electroforéticos de

estirpes diferentes, tendo sido a estirpe de Schizosaccharomyces pombe a mais influenciada.

A análise da globalidade dos resultados revelou que os sistemas enzimáticos também eram

afectados de modo desigual (ADH, foi mais estável e LDH mais influenciada), e que dentro

das mesmas condições de crescimento os perfis mostraram-se reprodutíveis. A análise

numérica dos resultados mostrou uma elevada semelhança entre os perfis obtidos para cada

estirpe nas diferentes condições de crescimentos celular. Os autores frisam a necessidade de

durante a análise dos perfis de bandas obtidos, de se considerar somente as bandas principais

(as quais estão constantemente presentes), e não considerar as bandas secundárias para a

diferenciação das estirpes.

2.2.4.1.3 Vantagens da análise isoenzimática

Uma das vantagens da utilização desta metodologia é que a extensão da resolução

genética fornecida, tem tido um grande paralelismo com identificações efectuadas por

métodos de análise de referência, como a reassociação de DNA-DNA; conseguindo mesmo a

distinção de espécies com relacionamentos muito próximos em termos da sua filogenia. Por

isso, mesmo nos nossos dias, com métodos de análise de ácidos nucleicos que envolvam PCR

e primers específicos de espécies de DNA, a análise isoenzimática continua a ser muito

empregue na identificação (Ferreira e Grattapaglia, 1995). Esta trata-se de uma metodologia

26


com um poder de resolução semelhante ao obtido por outras metodologias, mas a qual é muito

menos dispendiosa, pois envolve equipamentos de baixo custo, reagentes baratos quando

comparados com os kits de reagentes e primers usados na reacção PCR, e é fácil tecnicamente

(Bonde et al., 1993; Ferreira e Grattapaglia, 1995; Yamazaki et al., 1998). Esta metodologia

pode ainda ser automatizada na análise electroforética bem como por software de análise dos

perfis de bandas, e constituição de bases de dados, o que possibilita um incremento na rapidez

de identificação

2.2.4.1.4 Desvantagens da análise isoenzimática

A análise isoenzimática trata-se de um método fenotípico, o qual infere o genoma

mediante o polimorfismo isoenzimático, revelado pelas diferentes mobilidades

electroforéticas das bandas de actividade enzimática, as quais formam perfis de bandas

isoenzimáticas designados por zimogramas. Como tal, esta metodologia estima a

variabilidade genética de apenas a fracção do DNA codificante da enzima, a qual trata-se de

uma pequena parte, incorrendo assim uma subestima das divergências genéticas ocorrentes

entre os organismos focados no estudo com esta metodologia. Uma das fontes de erro,

relaciona-se com os mecanismos responsáveis pela ocorrência de isoenzimas após a sua

transcrição e tradução, designados por mecanismos epigenéticos, que podem alterar as

estruturas secundárias e terciárias, não correspondendo assim a alterações de estrutura

primária, a qual é codificada pelo genoma. Outro cuidado especial que deve advir na

utilização desta técnica, deve ser as condições de crescimento dos organismos em estudo, as

quais devem ser optimizadas e bem controladas, pois afectam a actividade e quantidade das

enzimas detectadas (Towner e Cockayne, 1993). Outra limitação apontada para esta

metodologia quando comparada com técnicas imunológicas ou metodologias de análise de

ácidos nucleicos baseadas em reacções de PCR, trata-se de necessitar uma grande quantidade

de biomassa (Doebbeling et al., 1993; Bonde et al., 1993), bem como de um número elevado

de soluções que têm de ser preparadas diariamente (Pasteur et al., 1987; Acquaah, 1992).

27


2.2.4.1.5 Sistemas enzimáticos em estudo

Após o final da electroforese, para que as proteínas possam ser visualizadas, é

necessário recorrerem-se a procedimentos de coloração histoquímica específica para detectar

a presença das enzimas, e assim obter os perfis das bandas de actividade enzimática. Através

destes procedimentos, as enzimas catalisam reacções específicas que originam compostos

corados que permitem a sua visualização no gel.

Quando os compostos da solução de revelação de actividade enzimática (substrato,

coenzimas, iões, e outros) entram em contacto com as isoenzimas estas catalisam uma reacção

que origina um produto corado que precipita no local em que se posiciona a isoenzima,

impedindo assim a difusão da banda no gel (Pasteur et al., 1987). Para a revelação de enzimas

como as fosfatases e a maioria das esterases são utilizados derivados de -naftilo; como

resultado da actividade hidrolítica liberta-se o -naftol, o qual combina-se com compostos

diazo (Fast Garnet GBC, Fast Blue RR), e formando deste modo precipitados corados. A

maioria das desidrogenases catalisa a transferência de um átomo de hidrogénio do seu

substrato para uma coenzima (NAD+ ou NADP+), este átomo, conforme se pode visualizar no

esquema presente na figura 2.1, pode ser transferido por uma reacção em cadeia, mediada

pelo PMS, na qual o receptor final trata-se de um sal de tetrazólio, como o Nitro Blue

Tetrazolium (NBT), o qual dá assim origem a um precipitado de cor azul – o formazano

(Pasteur et al., 1987).

Substrato Produto

NAD+ ou NADP+ NADH ou NADPH

PMSH PMS

NBT NBTH= Formazano

Figura 2.1 – Reacção de coloração por procedimentos histoquímicos para a maioria das desidrogenases

(adaptado Pasteur et al., 1987)

Os complexos isoenzimáticos em estudo neste trabalho foram esterase (EST), lactato

desidrogenase (LDH), álcool desidrogenase (ADH), fosfatase ácida (ACP) e glucose-6-fosfato

desidrogenase (G6PD), e encontram-se abaixo indicados na tabela.2.1.

28


Tabela 2.1 – Sistemas enzimáticos em estudo (adaptado de Pasteur et al., 1987; Acquaah, 1992).

Enzimas Abreviatura Número E.C.1) Classe

Esterase EST E.C. 3.1.1.1 hidrolases

Lactato desidrogenase LDH E.C. 1.1.1.27 oxidoreductases

Álcool desidrogenase ADH E.C. 1.1.1.1 oxidoreductases

Fosfatase ácida ACP E.C. 3.1.3.2 hidrolases

Glucose-6-fosfato desidrogenase G6PD E.C. 1.1.1.49 oxidoreductases

1) Número da Comissão Internacional de Enzimas

As esterases pertencem à classe das hidrolases, e catalisam a hidrólise de ésteres

carboxílicos levando à formação de alcoóis e ácidos gordos respectivos (Pasteur et al., 1987;

Acquaah, 1992).

A lactato desidrogenase pertence à classe das oxidoredutases, subclasse das

desidrogenases, e está envolvida na via glicolítica, catalisa a oxidação do lactato em piruvato,

com redução de NAD+ a NADH (Acquaah, 1992).

A álcool desidrogenase pertence à classe das oxidoreductases, subclasse das

desidrogenases, e catalisa a oxidação de etanol a acetaldeído na presença de NAD+, o qual se

reduz a NADH (Pasteur et al., 1987). Em Saccharomyces cerevisiae a ADH possui quatro

isoenzimas, ADH I, II, III e IV (Lutsdorf e Megnet, 1968; Ciriacy, 1975; Paquin e

Williamson, 1986; Walton et al., 1986; cit. in Bisson, 1993). ADH I, é citoplasmática e está

envolvida na produção de etanol mediante a fermentação anaeróbica da glucose. ADH II

encontra-se igualmente no citoplasma, é reprimida por elevadas concentrações de glucose e

está envolvida no consumo do etanol, contudo acredita-se que em certas circunstâncias, pode

substituir a ADH I e desempenhar um papel fermentativo. ADH III trata-se de uma enzima

mitocondrial, a qual é igualmente reprimida pela glucose e possui actividade durante o

crescimento em etanol (Gancedo e Serrano, 1989; Bisson, 1993). A sobreexpressão de ADH

III não compensa as perdas de ADH I e II, para o crescimento fermentativo (Blumberg et al.,

1987; cit. in Bisson, 1993). Mais recentemente foi descoberta uma nova álcool desidrogenase,

ADH IV, a qual, quando sobreexprimida, confere resistência à antimicina A, suprimindo a

perda de ADH I em condições fermentativas (Paquin e Williamson, 1986; Walton et al., 1986,

cit. in Bisson, 1993).

29


Segundo Gancedo e Serrano (1989) uma taxa deficitária de actividade da ADH

promove uma sobreprodução de glicerol, os autores verificaram esse facto numa estirpe de

Torulopsis magnoliae, a qual convertia 40% dos açúcares em glicerol. Llaguno et al. (1970)

num estudo às leveduras formadoras de véu à superfície do vinho xerez, constataram que a

actividade de ADH aumentava com o aumento da concentração de etanol.

As fosfatases ácidas pertencem à classe das hidrolases, englobam um grupo não

específico de fosfo-hidrolases que têm actividade a baixo pH (Jaaska, 1983; cit. in Acquaah,

1992), promovem a hidrólise de monoésteres ortofosfóricos, com a produção do álcool

respectivo e do ácido fosfórico (Pasteur, et al., 1987).

A glucose-6-fosfato desidrogenase pertence à classe das oxidoreductases, subclasse

das desidrogenases. Trata-se da primeira enzima interveniente na etapa oxidativa do ciclo das

pentoses-fosfato, e catalisa a oxidação de D-glucose-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona, com

formação de NADPH (Gancedo e Serrano, 1989; Acquaah, 1992).

30


3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Estirpes de leveduras em estudo

As estirpes de leveduras utilizadas neste estudo são provenientes da Colecção

Portuguesa de Culturas de Leveduras, Universidade Nova de Lisboa e do Centraalbureau voor

Schimmelcultures, Delft, Holanda.

Foram estudadas 32 estirpes de leveduras pertencentes a 19 espécies de 12 géneros. Na

tabela seguinte (tabela 3.1) apresentam-se as estirpes, a sua classificação original, o número

de diversas colecções de culturas e a sua proveniência.

Tabela 3.1 – Estirpes de leveduras em estudo no presente trabalho

EspécieEpíteto original

Designação das estirpesOrigem do isolamento

Nº EVN Nº PYCC Nº CBS

Candida cantarellii Torulopsis cantarellii T 365 T 1) 3073 T 4878 T Mosto de uva

Torulopsis vinacea 3661) 3863 5383 Mosto de uvaCandida stellata

Saccharomyces stellatus T 387 T 2) 157 T Uvas Saccharomyces bacillaris NT 3671) 3044 843 Uvas

Candida vanderwaltiiTorulopsis vanderwaltii T 368 T 1) 3671 T 5524 T Equipamento de adega

Pichia mexicanaCandida veronae T 369 T 1) 3664 T 5815 T Mosto de uva

Pichia fluxuum Mycoderma vini NT 370 NT 1) 2597 NT 639 NT Vinho com azedia

Saccharomyces mycoderma 3711) 3339 633 -----Kluyveromyces thermotoleransZygosaccharomyces thermotolerans T 372 T 1) 4135 T 6340 T Conserva de ameixa var. mirabelle

Saccharomyces veronae 3731) 2908 2917 Drosophila Kluyveromyces thermotolerans 3741) 4675 Solo

Metschnikowia pulcherrimaMetschnikowia pulcherrima T 375 T 1) 4830 T 5833 T Uvas de Vitis labrusca

Asporomyces uvae 3761) 2726 2245 UvasCandida pulcherrima 3771) 3018 Superfície de uma alga (M. pyrifera)

Pichia carsoniiPichia carsonii T 378 T 1) 2757 T 2285 T Seiva de Carvalho preto

Debaryomyces vini T 3791) 3799 810 Sedimento de vinho engarrafado

Pichia vini T 3801) 3800 5254 Água de azeitonasSaccharomyces exiguus

Saccharomyces exiguus NT 381 NT 1) 2543 NT 379 NT -----

Torula holmii NT 3821) 2544 135 ManteigaTorulopsis holmii 3831) 3179 2671 Saliva humana

31


Tabela 3.1 (continuação)

EspécieEpíteto original

Designação das estirpesOrigem do isolamento

Nº EVN Nº PYCC Nº CBS

Wickerhamiella domercqiae Torulopsis domercqiae T 384 T 1) 3067 T 4351 T Depósito de vinho

Torulopsis saccharum T 3851) 3203 4733 Água de lavagem de cana de açúcarLodderomyces elongisporus

Saccharomyces elongisporus T 386 T 1) 4136 T 2605 T Sumo de laranja concentradoDebaryomyces hansenii var. fabryii

Debaryomyces fabryii T 388 T 2) 789 T Micose interdigitalDekkera naardenensis

Dekkera naardenensis T 389 T 2) 6042 T LimonadaHanseniaspora guilliermondii

Kloeckera apis 3902) 2591 Filo-traqueia de abelhaHanseniaspora occidentalis

Pseudosaccharomyces javanicus T 3912) 282 SoloHanseniaspora osmophila

Pseudosaccharomyces corticis T 3922) 106 Casca de árvoreHanseniaspora uvarum

Kloeckeraspora uvarum T 394 T 2) 314 T Uva muscatel

Pseudosaccharomyces apiculatus T 3932) 104 -----Saccharomycodes ludwigii

Saccharomycodes ludwigii T 395 T 2) 821 T -----Schizosaccharomyces pombe

Schizosaccharomyces pombe T 396 T 2) 356 T -----T – estirpe tipoNT – estirpe neotipoEVN, Colecção de Microrganismos da Estação Vitivinícola Nacional, Dois Portos, Portugal.PYCC, Portuguese Yeast Culture Collection, Univ. Nova de Lisboa, Mte. Caparica, Portugal.CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Delft, Holanda.1) Proveniente da PYCC2) Proveniente da CBS

3.1.1 Manutenção das leveduras

As estirpes de leveduras foram mantidas à temperatura ambiente, em tubos com meio

sólido inclinado YEPD [extracto de levedura 0,5 % (p/v); peptona 1,0 % (p/v); glucose 2,0 %

(p/v); adicionado de 2,0 % (p/v), de agar].

32


3.2 Análise Isoenzimática

3.2.1 Preparação do extracto proteíco

A preparação do extracto proteíco, está representada no esquema seguinte presente na

figura 3.1, encontrando-se mais pormenorizadamente descrita nos pontos 3.2.1.1 e 3.2.1.2.

Figura 3.1 – Representação esquemática da preparação do extracto proteico.

33

Centrifugação (4ºC; 7000g; 5') Lavagem (2 x) (Tris-HCl, pH=7; 4ºC)

Cultura(YEPD, 25ºC, 170 r.p.m.)

Cultura(YEPD, 25ºC, 170 r.p.m.)

CélulasCélulas

Armazenamento Congelação (-80ºC)

Armazenamento Congelação (-80ºC)

Congelação (-20ºC)

Centrifugação (4ºC; 14000 g; 30')

Extracto proteíco(Sobrenadante)

Extracto proteíco(Sobrenadante)

Rebentamento (Tris-HCl, pH 6,8; 4ºC;

Esferas de vidro 0,5 mm ;Bead-Beater 5/ 7 min.)

Rebentamento (Tris-HCl, pH 6,8; 4ºC;

Esferas de vidro 0,5 mm ;Bead-Beater 5/ 7 min.)


3.2.1.1 Cultura e recolha das células de leveduras em meio

YEPD

As células de leveduras foram cultivadas em balões Erlenmeyer de 250 ml, com

aproximadamente 100 ml de meio líquido YEPD, a uma temperatura de 25 ºC (estufa Aralab

4500 Fitoclima) e uma agitação orbital a 170 r.p.m. (Aralab B 300 E), até atingirem uma

densidade óptica (D.O.) de 10, a um comprimento de onda de 640 nm. Atingida a D.O.

pretendida, efectuava-se uma primeira centrifugação para recolher as células, em copos de

250 ml, durante 5 min. a 7000 g, a 4ºC (centrífuga Sorvall RC-5B). Seguiu-se a operação de

lavagem das células, na qual eram adicionados 20 ml de solução Tris-HCl (3,2 mM; pH 7,0),

e nova centrifugação a 7000g, durante 5 min., a 4ºC. A operação de lavagem foi efectuada

duas vezes, e o depósito de células dividido por dois eppendorfs após o qual sofreu uma

centrifugação final (7000 g; 5'), foi-lhes retirado o sobrenadante, e as células foram

conservadas a –20º C até sua posterior utilização (Duarte, 2000).

3.2.1.2 Obtenção do extracto proteíco

As amostras que se encontravam conservadas a –20º C, foram retiradas e colocadas no

gelo para descongelação. Prosseguiu-se com a adição de esferas de vidro (1,2 g; 0,5 mm ∅), e

de tampão de extracção (1 ml de Tris-HCl 0,06 M; pH 6,8). Mediante a utilização de um

homogeneizador celular (Mini Beadbeater- Biospel Products), promoveu-se a lise das células.

O Mini Beadbeater foi programado para uma agitação de 30 segundos a 5000 r.p.m.,

espaçados por 4 minutos, nos quais as amostras permaneceram no gelo, de forma a baixar a

temperatura que se eleva durante a agitação. Repetiu-se este procedimento durante dois

minutos, seguido de uma observação ao microscópio óptico. Após ter sido determinado, por

intermédio de uma visualização ao microscópio óptico, que aproximadamente cerca de 70 %

das células rebentaram, terminou-se este procedimento, assim como no caso em que findados

os 7 minutos de agitação no homogeneizador celular, não foi atingida a percentagem

designada.

A suspensão anterior foi centrifugada (14 000 g, 10'), a 4 ºC, para se efectuar uma

separação das células inteiras, e outros componentes não solúveis. Foi transferido o líquido

sobrenadante para novo tubo eppendorf, sofreu uma centrifugação final (14 000 g, 20'), a 4ºC,

34


na qual foi obtido o extracto utilizado na análise isoenzimática. Dividiu-se o sobrenadante do

extracto proteíco em alíquotas de 75 l, as quais foram conservadas a -80 ºC para posterior

análise isoenzimática (Duarte, 2000).

3.2.2 Análise electroforética das isoenzimas

3.2.2.1 Sistema de electroforese

Para a análise isoenzimática foi utilizada a electroforese em suporte vertical (sistema

Mighty Small II, SE250, da Hoefer/ Pharmacia), acoplado a um sistema de refrigeração

(Hoefer RCB 300), com geis de poliacrilamida homogéneos (87 cm; 0,75 cm de espessura)

em condições PAGE nativa, no qual se efectuou uma separação das proteínas em função do

seu tamanho e da sua carga, deste modo as moléculas de proteína apresentam diferentes

mobilidades mediante a sua relação peso molecular/ carga eléctrica, sendo deste modo

diferenciadas.

Segundo Hames (1990), os geis de poliacrilamida são adequados à análise de

proteínas, por possuírem porosidades na mesma ordem de grandeza das moléculas de

proteínas. Outra das vantagens na sua utilização trata-se de ser um polímero sintético, que

pode ser preparado a partir de reagentes de elevada pureza química. Estes geis são inertes,

possuem um elevado campo de actividade de temperaturas e pH.

Utilizou-se um sistema descontínuo de tampões, descritos no Anexo I, e composto por

gel de separação e gel de concentração (ver figura 3.2).

- Depósito do tampão superior

- Gel de concentração

- Gel de separação

- Depósito do tampão inferior

Figura 3.2 – Sistema descontínuo de uma dimensão (Hames, 1990)

35


3.2.2.2 Preparação do gel suporte de poliacrilamida

A preparação do suporte gel poliacrilamida iniciou-se com a preparação do gel de

separação, sendo a última solução a adicionar o TEMED, o qual segundo Hames (1990),

catalisa a libertação de radicais livres do persulfato de amónio, os quais iniciam a reacção de

polimerização da acrilamida e bisacrilamida.

O sistema era composto por um molde no qual se verteu o gel de separação,

adicionou-se água ultrapura, de modo a cobrir todo o gel, para impedir deste modo o contacto

do gel com o oxigénio do ar, e permaneceu a polimerizar durante uma hora. Após a reacção

de polimerização estar concluída, iniciou-se a preparação do gel concentrador, o qual foi

vertido no molde, fixando-se em seguida o pente (para formação dos poços, nos quais foram

introduzidas as amostras). Esperou-se a conclusão da reacção de polimerização (o tempo de

polimerização é idêntico ao do gel de separação) e retira-se o pente (com cuidado para não

deformar os poços).

Tabela 3.2 – Preparação do gel suporte de poliacrilamida, condições PAGE-nativa (Hames,

1990)

Gel concentrador Gel separador

Solução “stock “ 2,5 % 8,0 % 7,5 %

Acrilamida 30% (p/v)-bisacrilamida 0,8% (p/v) 0,5 ml 3,2 ml 3 ml

Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 1,0 ml --- ---

Tris-HCl 3,0 M (pH 8,8) --- 1,5 ml 1,5 ml

Água ultrapura 2,3 ml 6,7 ml 6,9 ml

TEMED 6 μl 8 μl 8 μl

Persulfato de amónio 1,5 % (p/v) 1 0,2 ml 0,6 ml 0,6 ml

1 A solução, devido a ser muito instável, tem que ser preparada imediatamente antes da sua utilização.

A concentração de 8% do gel separador utiliza-se somente para a análise da esterase e é usada a

concentração de 7,5 % para os restantes sistemas enzimáticos.

A água ultrapura adicionada, assim como todas as restantes soluções adicionadas, têm que estar à

temperatura de 4º C.

36

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15


3.2.2.3 Preparação das amostras para electroforese

As amostras dos extractos proteícos foram retiradas da arca congeladora, a –80ºC, e

colocadas no gelo com alguma antecedência. A cada tubo eppendorf (75 μl de extracto

proteíco), foram adicionados 15 μl de uma solução tampão de aplicação [Glicerol 50 % (v/v);

azul de bromofenol 0,05 % (p/v)], a qual foi misturada por agitação num agitador tipo vortex.

A introdução das amostras dos extractos proteícos obedeceu à disposição apresentada

na figura 3.3, tendo cada gel capacidade para 15 amostras, sendo 12 amostras extractos

proteícos das estirpes em estudo e 3 amostras de extractos proteícos da estirpe utilizada como

padrão.

Figura 3.3 – Representação da distribuição das amostras pelos poços do gel de poliacrilamida

Poços 1-2; 4-7; 9-12;14-15: Amostras extracto proteíco, das estirpes em estudo

Poços 3; 8; 13: Amostras extracto proteíco, da estirpe padrão (PYCC 4072)

Inicialmente efectuou-se a adição da solução tampão de electroforese do eléctrodo

superior (Tris-Glicina-citrato, pH 8,2; excepto para as fosfatases ácidas em que a solução

tampão utilizada foi Tris-Glicina-HCl, pH 8,2). De seguida foram aplicados 7,5 μl de extracto

proteíco com tampão de aplicação (5 μl para G6PD) em cada poço do gel (seringa de 25 μl,

Gastigh 1072, Hamilton). E por último adicionou-se a solução tampão do eléctrodo inferior

(Tris-Glicina-HCl, pH 8,3).

3.2.2.4 Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE-nativa)

Ligou-se o banho termostatizado cerca de 30 min. antes de se dar início à electroforese

para estabilização da temperatura e de modo a que a electroforese decorresse à temperatura

controlada de 4º C. Seguidamente iniciou-se a electroforese a 100 V (fonte de alimentação

EPS 301 Amersham, Pharmacia Biotech) durante os primeiros 25 minutos, seguido de 125 V

durante 5 min., e de 150 V até final da electroforese.

37


3.2.2.5 Obtenção de perfis isoenzimáticos

Após a separação electroforética foi detectada a actividade enzimática dos cinco

sistemas em estudo: esterases, fosfatases ácidas, lactato desidrogenases, glucose-6-fosfato

desidrogenases e álcool desidrogenases, através da utilização da metodologia experimental

optimizada por Duarte (2000).

No final da separação electroforética retiraram-se os géis de poliacrilamida e efectuou-

se um corte em cada um dos geis no canto inferior direito, de modo a possibilitar a localização

das amostras. Seguidamente efectuou-se uma incubação ao abrigo da luz, dos geis com a

solução de revelação numa estufa regulada a 37 ºC, até ao surgimento de bandas indicadoras

de actividade enzimática. Terminaram-se as reacções por meio de uma lavagem com água

destilada e por submersão na solução de fixação [metanol 30 % (p/v), ácido acético 10 %

(p/v)] durante 15 minutos, tendo igualmente a solução de fixação a função de impedir a

difusão das bandas de actividade enzimática no gel. Os geis foram armazenados em água

ultrapura à temperatura de 4ºC.

Figura 3.4 – Revelação das bandas de actividade enzimática no gel de poliacrilamida, após separação

electroforética.

3.2.2.5.1 Esterase (EST- EC 3.1.1.1)

O substrato utilizado para a detecção de actividade enzimática foi o acetato de -

naftilo, o qual por acção das esterases é hidrolisado e origina os compostos acetato e -naftol.

Este último leva à formação de derivados corados ao combinar-se com os sais de diazónio

(Fast Blue RR), como pode ser visualizado na equação de reacção descrita abaixo (Pasteur et

al., 1987).

38

Solução de

revelação de

actividade

enzimática


Acetato de -naftilo EST -naftol + acetato

-naftol + Fast Blue RR Precipitado corado

(Pasteur et al., 1987)

Na preparação da solução de detecção de actividade enzimática foi adicionado Fast

blue RR (6 mg/l) à solução tampão fosfato (NaH2PO4.H2O 48mM; Na2HPO4.2H2O 52 mM), e

foi agitado durante cinco minutos (ao abrigo da luz). Depois foi adicionado acetato de -

naftilo (8 mg/l) dissolvido previamente em acetona (25 ml/g acetato de -naftilo), e

novamente agitado por mais cinco minutos (ao abrigo da luz). A preparação da solução de

revelação encontrava-se concluída imediatamente antes do final da separação electroforética,

sendo que eram retirados os geis de poliacrilamida e submetidos ao procedimento

experimental indicado anteriormente em 3.2.2.5.

3.2.2.5.2 Fosfatase ácida (ACP- EC 3.1.3.2)

O substrato utilizado para a detecção de actividade enzimática foi o fosfato de -

naftilo, o qual por acção das fosfatases é hidrolisado e origina os compostos fosfato e -

naftol. Este último leva à formação de derivados corados ao combinar-se com os sais de

diazónio (Fast Garnet GBC). Os princípios de reacção aplicados na revelação das fosfatases

ácidas são idênticos aos aplicados na revelação das esterases, e podem ser visualizados na

equação de reacção descrita abaixo (Pasteur et al., 1987).

Fosfato de -naftilo ACP -naftol + fosfato

-naftol + Fast Garnet GBC Precipitado castanho


Na preparação da solução de detecção de actividade enzimática foi adicionado fosfato

ácido de -naftilo [0,1 % (p/v)], Fast Garnet GBC [0,1 % (p/v)] e MgCl2 [0,1 % (p/v)] à

solução tampão de acetato [ácido acético 0,2 M; acetato de sódio 0,2 M; acerto de pH a 4,5

com solução HCl 30 % (v/v)], e foi agitado durante dez minutos (ao abrigo da luz). A

preparação da solução de revelação encontrava-se concluída imediatamente antes do final da

39


separação electroforética, sendo que eram retirados os geis de poliacrilamida, lavados com a

solução tampão de acetato, acima referida, e submetidos ao procedimento experimental

indicado em 3.2.2.5.

3.2.2.5.3 Lactato desidrogenase (LDH- EC 1.1.1.27)

O substrato utilizado para a detecção de actividade enzimática foi o lactato, o qual,

como resultado da actividade da lactato desidrogenase sofreu as seguintes transformações

(Pasteur et al., 1987):

Lactato + NAD+ LDH Piruvato + NADH

NADH + NBT + PMS Formazano (precipitado azul)


Na preparação da solução de detecção de actividade enzimática foi preparada em

primeiro lugar a solução de substrato (ácido láctico 9,0 % (p/v); Na2CO3 0,56 M; e acerto a

pH 7 com solução Na2CO3 2M). Adicionou-se 10% (v/v) da solução substrato à solução

tampão Tris-HCl (tris 83 mM, e acerto a pH 7,1 com HCl). A esta mistura foi adicionado

NAD+ 0,05 % (p/v), NBT (0,03 % (p/v) e PMS 0,002 % (p/v), e foi agitado durante dez

minutos (ao abrigo da luz). A preparação da solução de revelação encontrava-se concluída

imediatamente antes do final da separação electroforética, sendo que os geis de poliacrilamida

eram retirados e submetidos ao procedimento experimental indicado anteriormente em

3.2.2.5.

3.2.2.5.4 Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD- EC 1.1.1.49)

O substrato utilizado para a detecção de actividade enzimática foi a D-glucose-6-

fosfato, a qual, como resultado da actividade da glucose-6-fosfato desidrogenase sofreu as

seguintes transformações (Pasteur et al., 1987):

D-Glucose-6-fosfato + NADP+ G6PD 6-fosfogluconolactona + NADPH

NADPH + NBT + PMS Formazano (precipitado azul)

40



Na preparação da solução de detecção de actividade enzimática foi adicionado

glucose-6-fosfato 0,2 % (p/v), MgCl2 0,08% (p/v), NADP+ 0,04 % (p/v), NBT 0,02 % (p/v),

PMS 0,002 % (p/v), à solução tampão Tris-HCl (tris 0,2 M; e acerto a pH 8 com HCl), e foi

agitado durante dez minutos (ao abrigo da luz). A preparação da solução de revelação

encontrava-se concluída imediatamente antes do final da separação electroforética, sendo que

eram retirados os geis de poliacrilamida e submetidos ao procedimento experimental indicado

em 3.2.2.5.

3.2.2.5.5 Álcool desidrogenase (ADH-EC 1.1.1.1)

O substrato utilizado para a detecção de actividade enzimática tratou-se do etanol, o

qual, como resultado da actividade da álcool desidrogenase sofreu as seguintes

transformações (Pasteur et al., 1987):

Etanol + NAD+ ADH Acetaldeído + NADH

NADH + NBT + PMS Formazano (precipitado azul)


Na preparação da solução de detecção de actividade enzimática foi adicionado etanol

7,0 % (v/v), MgCl2 0,046 % (p/v), NAD+ 0,046 % (p/v), NBT 0,023 % (p/v), PMS 0,0023 %

(p/v), à solução tampão Tris-HCl (tris 0,2 M; e acerto a pH 8 com HCl), e foi agitado durante

dez minutos (ao abrigo da luz). A preparação da solução de revelação encontrava-se concluída

imediatamente antes do final da separação electroforética, sendo que eram retirados os geis de

poliacrilamida e submetidos ao procedimento experimental indicado em 3.2.2.5.

41


3.2.2.6 Digitalização dos geis obtidos

Decorridos os quinze minutos em que o gel entra em contacto com a solução de

fixação, este foi lavado em água destilada e fotografado por meio de uma câmara digital

(modelo Kodak 290C), recorrendo ao sistema de software (Kodak 1D - Image Analysis

Limited Edition, versão 3.5). A fotografia dos geis obtidos na separação electroforética das

isoenzimas, foi analisada por intermédio do software GelCompar II versão 2.0, tendo sido

elaborada uma base de dados em que a cada estirpe foi associado um perfil de cada um dos

sistemas enzimáticos.

3.2.2.7 Determinação do valor de mobilidade electroforética

relativa (Rm)

Após a fotografia do gel, procedeu-se igualmente à medição das distâncias de

migração das bandas de actividade enzimática (mobilidade absoluta), e da distância de

migração do corante de referência (azul de bromofenol). A relação destes dois parâmetros

permitiu a determinação das mobilidades electroforéticas relativas de acordo com a seguinte

equação:

Rm= Distância de migração da proteína

Distância de migração do corante referência

A cada valor de Rm calculado, foi efectuada uma correcção proporcional à correcção

efectuada aos valores de migração obtidos para a estirpe de Saccharomyces cerevisiae PYCC

4072, presente no mesmo gel, e utilizada como padrão de modo a corrigir eventuais

deformações ou outras alterações do gel. Os valores estipulados por Santos et al. (1999),

Duarte et al. (1999) e Duarte (2000) para a estirpe PYCC 4072 eram: Rm (EST) = 0.70; Rm

(LDH) = 0.38 e Rm (LDH) = 0.54; Rm (ADH) =0.44; Rm (ACP) = 0.54; Rm (G6PD) = 0.52.

42


3.2.2.8 Secagem dos geis obtidos

Os geis foram colocados entre duas folhas de papel celofane previamente humedecidas

em água destilada, e colocados no secador de gel (modelo 583 – BioRad). O método de

secagem do gel tratou-se de um sistema combinado de vácuo (bomba de vácuo e pressão

Millipore), ligado ao secador de gel, e temperatura em que os níveis de vácuo variavam entre

600 e 640 mm de Hg, à temperatura de 80 ºC durante 80 minutos (condições para a secagem

de seis géis).

3.2.2.9 Análise numérica dos resultados

Os resultados foram analisados por métodos de análise numérica, recorrendo ao

software NTSYS-pc versão 2.1. (Applied Biostatistics Inc.). As matrizes originais foram

construídas com base na presença (1), ou ausência (0) de banda de actividade enzimática com

determinado valor de Rm para cada uma das estirpes em estudo.

Foram calculadas as afinidades entre as diferentes estirpes em estudo, mediante a

utilização de um coeficiente de associação, mais especificamente o coeficiente de

Dice: SD= 2A / (2A+B+C), A define o nº de bandas comuns entre duas estirpes, B o nº de

bandas presentes numa estirpe x e ausentes noutra y e C refere-se ao nº de bandas presente em

y e ausentes em x, dando assim origem à matriz de semelhanças (Sneath e Sokal, 1973).

A aplicação do método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using arithmetic

Averages) à matriz de semelhanças permitiu a representação dos resultados obtidos, sob a

forma de um dendrograma, isto é, sob a forma de uma estrutura ramificada, onde os vários

níveis a que se unem os diferentes ramos estão relacionados com os valores das medidas de

semelhança em que se baseou o método de agregação utilizado. Para ajuizar o grau de

distorção introduzido pelo método de agrupamento das estirpes (UPGMA), foi calculado o

coeficiente de correlação cofenética (r) entre a matriz de valores cofenéticos (implícita no

dendrograma) e a matriz de semelhança. O coeficiente de correlação cofenética exprime o

grau de concordância entre as duas matrizes.

43


3.2.2.10 Análise da reprodutibilidade do método

No sentido de se garantir a reprodutibilidade dos resultados, foram inclusas nas

corridas de electroforese, para todos os complexos enzimáticos, repetições de cerca de 10%

das estirpes em estudo, as quais deram entrada de uma forma independente (Tenreiro, 2001).

Estes duplicados foram provenientes de culturas de algumas estirpes, e subsequentes

rebentamentos das células e extracção da proteína. Os seus resultados foram analisados e

deram entrada na matriz de semelhanças como três estirpes independentes. As três estirpes

repetidas foram designadas como: EVN 378a, 379a e 381a, duplicados das estirpes EVN 378,

379 e 381.

44


3.3 Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S

A região D1/D2 possui cerca de 600 pares de bases nucleotídicas (pb), a qual tem sido

muito utilizada na identificação de espécies de leveduras (Kurtzman e Robnett, 1998). Para a

sequenciação de rDNA (região D1/D2), foi efectuada uma extracção do DNA, foi efectuada

uma primeira reacção de amplificação do DNA por PCR na qual foram usados os primers

externos ITS5 e LR6, seguida de uma reacção de sequenciação, na qual foram utilizados os

primers internos (NL1 e NL4) que delimitam a região D1/D2.

Figura 3.5 – Esquema dos genes do rRNA com indicação da localização dos primers utilizados e da região

sequenciada.

3.3.1 Estirpes de leveduras analisadas

As análises ao DNA incidiram sobre 4 estirpes de leveduras pertencentes aos géneros

Candida (espécies Candida cantarellii, EVN 366; Candida stellata, EVN 367),

Kluyveromyces (espécie Kluyveromyces thermotolerans, EVN 373) e Wickerhamiella (espécie

Wickerhamiella domercqiae, EVN 385).

3.3.2 Condições de cultura

As estirpes de levedura foram inoculadas em placas de meio YEPD-agar, e incubadas

numa estufa a 28 ºC durante 3 a 4 dias.

5S NTS2 ETS 17 – 18 S ITS1 5.8S ITS2 NTS1 5S25 – 28 S

D1 / D2

NL1 NL4 LR6ITS5

45


3.3.3 Extracção do DNA

Foram retiradas 3 hansadas fortes de cultura fresca de cada uma das estirpes, e

ressuspendidas em 500 l de tampão de lise celular [50 mM Tris, 250 mM NaCl, 50mM

EDTA, e 0,3 % (p/v) de SDS, pH = 8,0]. Foi adicionado o equivalente ao volume de 200 l

de esferas de vidro (0,5 mm ∅), e efectuou-se uma agitação através de um agitador em

vórtice, por um período de 2 minutos à velocidade máxima. Os tubos foram selados com

parafilme e incubados em banho-maria a uma temperatura de 65 ºC, durante uma hora,

seguindo-se de nova agitação em vórtice durante 2 minutos, à velocidade máxima. De seguida

efectuou-se uma centrifugação a 14000 r.p.m. (18188 g), durante 10 min. a 4 ºC (centrifuga

Biofuge stratos, Heraeus), recolheu-se o sobrenadante para outro eppendorf e foram

adicionados 600 l de solução clorofórmio/álcool isoamílico [proporção 2:1 (v/v)],

homogeneizou-se por inversão, e centrifugou-se a 14000 r.p.m. (18188 g), 10 min. à

temperatura ambiente. No sobrenadante efectuou-se a precipitação do DNA com a adição de

1/10 do volume de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol absoluto frio (-20ºC),

misturados por inversão, centrifugou-se a 14000 r.p.m. (18188 g), durante 10 min. à

temperatura ambiente.

Por último retirou-se o sobrenadante e efectuou-se a lavagem do DNA, com a adição

de cerca de 500 l de solução de etanol 70 % (v/v) a -20ºC, a qual foi cuidadosamente

retirada, e o pellet foi seco em estufa (37ºC, 2 h 30 min.), e resuspendido em TE (100 mM

Tris-HCl, pH = 8; 100 mM EDTA), e conservado a 4ºC. Foi separada uma alíquota de 5 l do

DNA extraído para observação, através do sistema de electroforese horizontal de modo

contínuo e tampão único, em gel de agarose.

Observação do DNA extraído por electroforese em gel de agarose

Efectuou-se uma preparação do gel de agarose 0,8 % (p/v) em TBE 0,5x (descrito no

Anexo II), com as dimensões 6 x 7 cm e 7 mm de espessura, a qual se levou a uma cozedura

num microondas, até obtenção de uma solução límpida. Verteu-se o preparado num molde,

fixou-se o pente para formação dos poços, e deixou-se a gelificar durante uma hora. De

seguida o gel foi introduzido no sistema de electroforese (SHU6, Sigma-Aldorich), e foi

vertido o tampão TBE 0,5x. Às alíquotas de 5l de extracto foram adicionados 2 l de tampão

46


de aplicação (6X Loading Dye Solution, Fermentas), mediante a utilização de uma

micropipeta foi homogeneizado pipetando por up & down, e seguidamente as amostras foram

introduzidas nos poços do gel, e por fim foram introduzidos no primeiro poço, 5 l de

marcador de pesos moleculares (DNA Ladder Mix, Fermentas). Iniciou-se de seguida a

electroforese para este sistema, a 90 V (fonte de alimentação EPS 301 Amersham, Pharmacia

Biotech) durante duas horas. Findo o tempo de electroforese, mergulhou-se o gel numa

solução de brometo de etídio 5 ‰ (p/v) durante 2 min., e descorou-se em seguida,

mergulhando o gel em água destilada durante 35 min. Seguidamente o gel foi colocado num

transiluminador (Vilber Lourmat) e as bandas foram visualizadas por meio de luz ultavioleta

(= 312 nm). Fotografou-se o gel por meio de uma câmara digital (modelo Kodak 290C)

numa câmara escura, e recorreu-se ao sistema de software (Kodak 1D - Image Analysis

Limited Edition, versão 3.5) para tratamento da imagem digitalizada do gel.

A análise da fotografia digital obtida do gel foi efectuada com base em dois

parâmetros, a intensidade bandas e a sua espessura. Estas foram comparadas com as bandas

do marcador de pesos molecular (DNA Ladder Mix, Fermentas), e assim foram determinadas

as diluições das amostras, para efectuar a reacção de amplificação por reacção PCR, com os

primers externos ITS5 e LR6.

3.3.4. Amplificação de DNA (PCR)

Amplificou-se a região D1/D2 da subunidade grande do rDNA, por PCR, com os

primers externos ITS5 (5’- GGA AGT AA AGT CGT AAC AAG G) e LR6 (5’-CGC CAG

TTC TGC TTA CC). A mistura de reacção foi estabelecida para um volume final de 50 l,

com os seguintes componentes:

Tampão de PCR 1x

MgCl2 2,5 mM

Primers 0,75 pmol. l-1

DNA molde 0,4-0,8 pg. l-1

dNTP´s 0,25 mM

Taq DNA Polimerase 0,04 U. l-1

47


A reacção de PCR foi efectuada num termociclador (T Gradient 96, Whatman-

Biometra), a qual consistiu numa desnaturação inicial a 94ºC durante 3 min., e 36 ciclos de

PCR de:

Desnaturação – 1 min., 94ºC;

Emparelhamento – 1 min., 58ºC;

Extensão – 1.5 min., 72ºC.

Aos 36 ciclos de PCR seguiu-se uma extensão final, que decorreu a 72ºC durante 5 min. Para

confirmar a amplificação efectuou-se a sua observação mediante electroforese em gel de

agarose 0,8 % (p/v) em TBE 0,5x. Para tal foi separada do produto PCR uma alíquota de 3 l

à qual foram adicionados 2 l de tampão de aplicação (6X Loading Dye Solution, Fermentas),

assim como foram introduzidos no primeiro poço 3 l de marcador de pesos moleculares

(DNA Ladder Mix, Fermentas), deu-se início à electroforese a 90 V durante 50 minutos, na

qual foram seguidos os procedimentos descritos em 3.3.3. Após essa confirmação efectuou-se

uma purificação do produto da reacção PCR, para ser submetido à sequenciação, mediante a

utilização de um kit de purificação – Jetquick PCR (Genomed), para o qual foram seguidos os

procedimentos do fabricante. Após a purificação do produto PCR foi efectuada uma outra

corrida electroforética aplicando os procedimentos atrás descritos. A partir da análise do gel

deste modo assim obtido, efectuou-se uma determinação aproximada da quantidade de

amostra a utilizar na reacção de sequenciação.

3.3.5. Sequenciação de rDNA (D1/D2)

A sequenciação de DNA seguiu o método de Sanger ou Terminação dideoxi, em que

mediante a elevação de temperatura se promove a separação das cadeias homólogas de rDNA,

às quais se acopla o primer (NL1 ou NL4) e dá-se início à actividade da DNA polimerase.

Esta efectua a síntese a partir dos referidos primers, por inserção das quatro bases (dNTPs- A,

G, T, C), assim como de bases homólogas marcadas por fluoróforos específicos (ddNTPs- A,

G, T, C), as quais actuam como terminais de transcrição. Originam-se deste modo diversos

fragmentos nucleotídicos com tamanhos consecutivos e são, por meio de um sequenciador

48


automático, separados por electroforese capilar e é detectada a sua fluorescência (Towner e

Cockayne, 1993).

Sequenciaram-se duas cadeias complementares da região D1/D2 mediante novas

reacções PCR do anterior produto PCR purificado, respectivamente com os primers internos

NL1 (5’- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) e NL4 (5’- GGT CCG TGT TTC

AAG ACG G). Em primeiro lugar procedeu-se à diluição da amostra de DNA (3 l de

produto PCR purificado, para cada estirpe) com água ultrapura esterilizada até perfazer 10 l,

seguindo-se a sua desnaturação a 95ºC, durante 8 min. no termociclador (T Gradient 96,

Whatman-Biometra). Colocaram-se as amostras em gelo e adicionou-se 2 l do primer NL1

(25 pmol.l-1) ou do primer NL4 (25 pmol.l-1), e a adição de 8 l do kit de amplificação

CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman Coulter), seguidamente efectuou-se uma

centrifugação instantânea a 13000 r.p.m. (15682 g) para misturar os componentes de reacção

de amplificação, e foi programado o termociclador (T Gradient 96, Whatman-Biometra) para

efectuar 36 ciclos de PCR de:

Desnaturação – 20 seg., 96ºC;

Emparelhamento – 20 seg., 50ºC;

Extensão – 4 min., 60ºC.

A cada eppendorf foram adicionados 5 l de solução STOP (1 volume glicogénio; 2

volumes 3M NaOAc pH =5,2; 2 volumes 100mM EDTA) e efectuou-se uma agitação num

agitador tipo vortex. Foram adicionados 60 l de etanol a 95% (v/v) frio (-20ºC), os quais

foram misturados pipetando “up & down”. Seguidamente efectuou-se a transferência para

eppendorfs de 1,5 ml de capacidade, incubou-se a -20ºC durante 10 minutos, e centrifugou-se

a 13000 r.p.m. (15682 g), a 4ºC durante 30 minutos, e foi retirado o sobrenadante. Lavou-se

com uma solução de etanol a 70 % (v/v) que se encontrava a -20ºC e centrifugou-se a 13000

r.p.m. (15682 g), a 4ºC durante 10 minutos. Removeu-se cuidadosamente o sobrenadante por

meio de uma micropipeta, e repetiu-se a operação de lavagem. Deixou-se o eppendorf secar à

temperatura ambiente durante 40 minutos, e findo o tempo de secagem resuspendeu-se em

30 l de formamida, seguiu-se a transferência para uma placa com capacidade para 96

amostras, e efectuou-se uma centrifugação instantânea a 3000 r.p.m. (1369 g). A cada poço

preenchido pelas amostras foi adicionada uma gota de óleo mineral. Encheu-se outra placa

com 96 poços (placa de lavagem) com tampão de separação (Beckman Coulter), nos locais

49


correspondentes às amostras. Colocaram-se ambas as placas no sequenciador automático CEQ

8000 (Beckman Coulter), e procedeu-se à separação dos fragmentos obtidos por electroforese

capilar.

As sequências directas e inversas obtidas foram alinhadas através da utilização do

software CEQuence Investigator (Beckman Coulter), e obtida a sequência consenso após

correcção de eventuais erros.

3.3.6. Comparação dos nucleótidos sequenciados

A sequência consenso da região D1/D2 foi inserida num site fornecido pelo National

Center for Biotechnology Information (NCBI), o qual efectua uma busca de sequências

nucleotídicas semelhantes numa série de bases de dados. Assim, cada sequência nucleotídica

foi introduzida na janela do Portal de busca (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), e

utilizou-se uma ferramenta de busca de locais de alinhamentos (BLAST- Basic Local

Alignment Search Tool), a qual forneceu as sequências nucleotídicas mais semelhantes,

provenientes das bases de dados de sequências nucleotídicas Gen Bank (NCBI, Estados

Unidos da América), EMBL (European Molecular Biology Laboratory- European

Bioinformatics Institute, Reino Unido), DDBJ (DNA Data Bank of Japan- National Institute

of Genetics, Japão) e PDB (Protein Data Bank- NCBI, Estados Unidos da América), com as

sequências obtidas no presente trabalho.

50

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi

Resultados e Discussão

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Perfis isoenzimáticos

Os perfis electroforéticos de EST, ACP, LDH, G6PD e ADH obtidos foram muito

heterogéneos sendo distintos para cada uma das estirpes em estudo. Obtiveram-se assim 32

perfis electroforéticos para as 32 estirpes estudadas. Na Figura 4.1 apresentam-se as imagens

digitalizadas dos perfis electroforéticos originados pelos cinco complexos isoenzimáticos

estudados, armazenados na base de dados elaborada com o software Gelcompar II.

384T

392385 395T

365T

369T

381NT

381a 382 383

391T

375T

376

377396T

368T

386T

394T

367NT

393T

378T

380 378a 379

379a 370NT

371 390T

389T

373 387T

374

372T

388T

366

384T

392385 395T

365T

369T

381NT

381a 382 383

391T

375T

376

377396T

368T

386T

394T

367NT

393T

378T

380 378a 379

379a 370NT

371 390T

389T

373 387T

374

372T

388T

366

ESTEST LDHLDH ADHADH ACPACP G6PDG6PD

Figura 4.1 – Imagens digitalizadas de perfis electroforéticos dos cinco complexos enzimáticos nas 32

estirpes analisadas.


Determinaram-se os valores das mobilidades electroforéticas relativas (Rm), das

bandas obtidas para cada um dos sistemas enzimáticos estudados de acordo com o descrito em

3.2.2.7.

As estirpes da espécie Candida cantarellii (EVN 365 e 366) apresentaram perfis

idênticos, com uma só banda de actividade enzimática para LDH e ACP e revelaram

diferentes perfis para EST, ADH e G6PD. A estirpe EVN 365 apresentou duas bandas nos

sistemas enzimáticos EST e G6PD e uma banda para ADH, enquanto que a estirpe EVN 366

não revelou actividade enzimática para ADH e apresentou uma banda para G6PD, revelando

um perfil de EST idêntico ao da estirpe EVN 374, igualmente com uma banda.

As duas estirpes de Candida stellata (EVN 367 e 387) apresentaram uma total

dissemelhança nos perfis de bandas para todos os sistemas enzimáticos. Assim a estirpe EVN

367 apresentou duas bandas para LDH e G6PD, e uma banda para EST, ADH e ACP,

enquanto que EVN 387 apresentou uma só banda de actividade enzimática para todos os

sistemas estudados.

A estirpe de Candida vanderwaltii, EVN 368, revelou um perfil de EST idêntico ao

das estirpes EVN 373 e 387, com uma banda de actividade enzimática, mas apresentou perfis

de bandas únicos, para os restantes sistemas enzimáticos, designadamente com três bandas

para LDH, e com uma banda para G6PD, e com duas bandas para ADH e para ACP.

A estirpe de Pichia mexicana, EVN 369, apresentou um perfil com uma banda de

actividade enzimática para ADH, idêntico ao da estirpe EVN 376 e apresentou perfis

característicos com uma banda para EST e G6PD, e com duas bandas para ACP e não revelou

possuir actividade enzimática para LDH.

As estirpes da espécie Pichia fluxuum, EVN 370 e 371, apresentaram um perfil

idêntico para ACP, e perfis diferentes para ADH, respectivamente com duas bandas e uma

banda de actividade enzimática. Para os restantes complexos enzimáticos, as estirpes

revelaram possuir algumas bandas em comum.

As estirpes da espécie Kluyveromyces thermotolerans (EVN 372, 373 e 374) não

apresentaram actividade enzimática para ADH e ACP. As estirpes EVN 372 e 374, não

revelaram possuir actividade enzimática para LDH, enquanto que a estirpe EVN 373

apresentou um perfil de uma banda. Para G6PD as estirpes EVN 372 e 374 apresentaram um

perfil idêntico com uma banda, e a estirpe EVN 373, revelou um perfil idêntico aos das

estirpes 379 e 390, também com uma banda. O complexo enzimático EST, revelou não ser


adequado para identificação desta espécie, uma vez que as três estirpes estudadas

apresentaram perfis diferentes, cada uma com uma banda.

As estirpes EVN 375, 376 e 377 da espécie Metschnikowia pulcherrima, apresentaram

um único perfil para G6PD, com duas bandas. Para os restantes complexos estudados não

houve uma tão boa concordância, sendo que para EST e LDH, foram detectados perfis

diferentes para as três estirpes, mas com bandas em comum. Para os complexos ADH e ACP

estas estirpes apresentaram respectivamente uma e duas bandas de actividade enzimática,

verificando-se que em ambos os casos a estirpe EVN 376 revelou um perfil diferente do perfil

das estirpes EVN 375 e 377.

As estirpes EVN 378, 379 e 380 da espécie Pichia carsonii, revelaram perfis idênticos

em ACP, com 2 bandas de actividade enzimática, em EST e em LDH, com uma banda em

cada. Para o último sistema enzimático, algumas das estirpes em estudo (EVN 384, 391, 393 e

394) revelaram um perfil idêntico, razão pela qual não pode ser utilizado para distinção da

espécie. Para ADH, a estirpe tipo (EVN 378) não revelou actividade enzimática, e as restantes

duas, um perfil com uma banda em comum. Para G6PD, as estirpes EVN 378 e 380

apresentaram um perfil idêntico de uma banda, e a estirpe EVN 379 apresentou um perfil de

uma banda semelhante aos perfis das estirpes EVN 373 e 390.

Para as estirpes da espécie Saccharomyces exiguus (EVN 381, 382 e 383), foi

detectado um perfil característico, no sistema enzimático LDH, com uma banda, e ainda um

único perfil com uma banda para ADH, contudo também idêntico ao da estirpe de

Hanseniaspora occidentalis (EVN 392). As estirpes EVN 382 e 383 apresentaram um perfil

idêntico de uma só banda para EST, com uma banda também presente no perfil da estirpe

tipo, EVN 381, de três bandas. As estirpes EVN 381 e 383 revelaram um perfil idêntico de

uma banda para ACP, o qual diferiu do perfil da estirpe 382 também com uma só banda. Para

G6PD as estirpes EVN 382 e 383, apresentaram um perfil idêntico com 5 bandas, com uma só

banda em comum com o perfil da estirpe tipo, de 3 bandas.

As estirpes de Wickerhamiella domercqiae, EVN 384 e 385, não apresentaram um

único perfil de bandas idêntico, nos cinco complexos enzimáticos estudados. Para ADH a

estirpe EVN 385 não apresentou actividade enzimática, e a estirpe EVN 384 apresentou duas

bandas, para G6PD e LDH, ambas as estirpes revelaram um perfil com uma banda. Para ACP

a estirpe tipo (EVN 384) apresentou duas bandas e a EVN 385 uma, sucedendo o inverso para

EST.

A estirpe EVN 386 da espécie Lodderomyces elongisporus, apresentou um perfil de

bandas que permite a sua diferenciação para os complexos enzimáticos estudados,


nomeadamente EST com duas bandas, LDH com uma banda e ADH com duas bandas. Tal

não é válido para ACP devido a apresentar um perfil idêntico ao da estirpe EVN 368, com

uma banda.

A estirpe EVN 388 de Dekkera naardenensis, apresentou perfis característicos para

cada um dos sistemas enzimáticos estudados, assim revelou uma banda para EST, LDH e

ACP, e duas bandas para ADH e G6PD.

Foram estudadas cinco estirpes pertencentes ao género Hanseniaspora, nomeadamente

das espécies H. guilliermondii (EVN 390), H. occidentalis (EVN 391), H. osmophila (EVN

392) e H. uvarum (EVN 393 e 394). A estirpe de H. uvarum apresentou um perfil

característico, com duas bandas de actividade para G6PD, enquanto que as estirpes EVN 390

e 391 revelaram um diferente perfil, com respectivamente, uma e duas bandas de actividade

enzimática, sendo que a estirpe EVN 392 revelou possuir uma banda em comum com o perfil

desta última. A estirpe EVN 393 revelou possuir uma banda em comum com o perfil de duas

bandas da estirpe tipo (EVN 394) para EST, e as estirpes EVN 390, 391 e 392 revelaram

perfis dissemelhantes para o mesmo complexo enzimático, com respectivamente uma, três e

duas bandas de actividade. Para as estirpes das espécies H. occidentalis e H. uvarum

observou-se um perfil idêntico de uma banda para LDH, enquanto que para este complexo

enzimático as estirpes EVN 390 e 392 apresentaram diferentes perfis, com respectivamente

duas e três bandas. A estirpe da espécie H. occidentalis revelou um perfil característico de 4

bandas para ADH, e para o mesmo sistema enzimático, a estirpe de H. guilliermondii,

apresentou um perfil característico com uma banda. Quanto às estirpes de H. uvarum, estas

apresentaram perfis diferentes mas com uma banda de actividade enzimática em comum. Para

o complexo ACP, à excepção de H. uvarum, todas as estirpes das restantes espécies

pertencentes ao mesmo género revelaram não possuir actividade enzimática. As duas estirpes

EVN 393 e 394 apresentaram perfis diferentes com respectivamente uma e duas bandas de

actividade enzimática.

A estirpe tipo da espécie Saccharomycodes ludwigii (EVN 395) revelou perfis

característicos para EST e LDH, com duas bandas e ACP, com três bandas de actividade

enzimática. Para G6PD revelou um perfil idêntico ao da estirpe EVN 385 da espécie

Wickerhamiella domercqiae, assim como revelou, para ADH, um perfil idêntico ao da estirpe

EVN 367 da espécie Candida stellata.

Em relação à estirpe de Schizosaccharomyces pombe, EVN 396, esta revelou um perfil

característico para os complexos EST, LDH, ADH e G6PD, com uma banda de actividade


enzimática. Para ACP apresentou também um perfil com uma banda idêntico aos dos perfis de

bandas de actividade enzimática das estirpes EVN 381 e 383.

Na análise de reprodutibilidade (3.2.2.10), verificou-se que os perfis de bandas de

actividade enzimática da estirpe EVN 378 e do seu duplicado (EVN 378a) foram iguais para

todos os complexos enzimáticos, assim para EST, LDH e G6PD, apresentaram uma banda,

para ACP duas bandas, enquanto que para ADH, ambas as estirpes não revelaram possuir

actividade enzimática. Para a estirpe EVN 379 a comparação dos perfis isoenzimáticos com o

seu duplicado, EVN 379a, revelou que os perfis eram idênticos para quase todos os

complexos isoenzimáticos estudados, assim para LDH e G6PD apresentaram uma banda, e

para EST e ADH duas bandas. No entanto, para ACP o resultado designado EVN 379

apresentou uma banda adicional em relação ao seu duplicado. A estirpe EVN 381 e o seu

duplicado, EVN 381a, revelaram possuir perfis idênticos para EST e G6PD de três bandas, e

para LDH, de uma banda. Em relação ao complexo ADH foi obtido uma banda adicional para

além da banda comum, e para ACP o duplicado não revelou actividade neste complexo

enzimático, enquanto que a estirpe EVN 381 apresentou uma banda, mas muito ténue.

4.2 Análise numérica dos perfis isoenzimáticos obtidos

Métodos de análise numérica foram aplicados aos dados obtidos para inferir os

relacionamentos entre as estirpes de leveduras estudadas, assim como a utilização da análise

de perfis de isoenzimas para fins taxonómicos. A partir dos perfis electroforéticos dos cinco

complexos enzimáticos estudados, foi construída a matriz original de dados (presente no

anexo III), na qual para cada estirpe foi assinalada a presença (1) ou ausência (0) de banda de

actividade enzimática com determinado valor de Rm, num total de 92 bandas. Por aplicação

do coeficiente de Dice à matriz original, conforme o descrito em 3.2.2.9, foi originada uma

matriz de semelhanças. Obteve-se a sua representação gráfica mediante a forma de um

dendrograma ao aplicar o método de agregação UPGMA. O dendrograma encontra-se

representado na figura 4.2, no qual podem ser observadas as relações entre os perfis

electroforéticos distintos, obtidos para as 32 estirpes estudadas neste trabalho experimental.

Foi igualmente avaliado o grau de distorção da representação gráfica da matriz de

semelhanças, conforme o descrito em 3.2.2.9, ao ter sido calculado o coeficiente de correlação


cofenética (r). Obteve-se um r=0,88, o que permite verificar que o dendrograma obtido se

trata de uma boa representação da matriz de semelhanças.

A reprodutibilidade de toda a metodologia de análise de perfis electroforéticos de

isoenzimas foi também analisada, mediante a introdução de extractos proteícos provenientes

de duplicados de culturas de três das estirpes em estudo, os quais foram tratados pela análise

numérica de um modo independente, conforme o descrito em 3.2.2.10. Verificou-se o

agrupamento dos duplicados efectuados com o da estirpe correspondente, a níveis de

semelhança muito elevados, designadamente 100% de semelhança entre EVN 378a e EVN

378, e aproximadamente 94% de semelhança entre EVN 379a e EVN 379. Como se fazia

supor para os resultados da estirpe EVN 381 e duplicado, em que para os perfis dos

complexos enzimáticos ADH e ACP foram encontradas algumas diferenças, a análise

numérica revelou um agrupamento a um menor nível de semelhança de aproximadamente

88%.

No dendrograma presente na figura 4.2, foram postos em evidência os

relacionamentos entre a totalidade das estirpes estudadas, p podendo ser observado uma clara

separação das estirpes pertencentes a espécies diferentes. De modo a facilitar a análise do

dendrograma é possível delimitar grupos, utilizando para tal um mesmo critério ao longo de

todo o dendrograma, designadamente traçando uma linha recta (Sneath e Sokal, 1973). A

recta foi traçada de modo a que estirpes de espécies diferentes ficassem separadas, sendo este

o nível de semelhança (42%) acima do qual as estirpes pertenceriam à mesma espécie e vice-

versa. Assim foram obtidos 23 grupos, para os quais será efectuada uma detalhada análise

caso a caso. A fiabilidade para delimitar as espécies revelou ser bastante elevada, visto que na

análise de reprodutibilidade a maior divergência encontrada foi na ordem de 88% de

semelhança, e que para inferir as espécies os valores de semelhança estipulados foram de 42%

de semelhança.


Figura 4.2 – Dendrograma representando a semelhança entre a totalidade de estirpes de leveduras analisadas

neste trabalho, com base em perfis electroforéticos dos cinco complexos isoenzimáticos (EST, ACP, ADH,

LDH, G6PD). A escala corresponde a uma medida numérica de semelhança, r, coeficiente de correlação

cofenética. T – estirpe tipo; NT- estirpe neotipo.

378a

Índice de semelhança0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

396T

389T

390 371 370NT

387T

373

368T

395T

385

386T

392

384T

391383

382

381a 381NT

377

376

375T

379 379a

378T

378a 380

394T

393

367388T

372T

374

369T

365T

366

r = 0.88


Em algumas das espécies estudadas neste trabalho, somente foi analisada a estirpe tipo

dessas espécies ou do anamorfo respectivo. As estirpes designadas são: a estirpe EVN 368 da

espécie Candida vanderwaltii, a estirpe EVN 369 da espécie Pichia mexicana, a estirpe EVN

386 da espécie Lodderomyces elongisporus, a estirpe EVN 388 da espécie Debaryomyces

hansenii var. fabryii, a estirpe EVN 389 de Dekkera naardenensis, a estirpe EVN 390 da

espécie Hanseniaspora guilliermondii, a estirpe EVN 391 da espécie H. occidentalis, a estirpe

EVN 392 da espécie H. osmophila, a estirpe EVN 395 da espécie Saccharomycodes ludwigii

e a estirpe EVN 396 da espécie Schizosaccharomyces pombe. Da análise do dendrograma

presente na figura 4.2, verificou-se que todas as estirpes acima referidas se posicionaram

isoladas no dendrograma, que portanto não agrupavam com outras estirpes de outras espécies

estudadas, encontrando-se assim deste modo claramente separadas. É de referir que o facto de

se tratarem de estirpes tipo da sua respectiva espécie ou do anamorfo da espécie, confere

ainda mais consistência ao bom resultado obtido.

No que diz respeito às restantes espécies ocorreu agrupamento das estirpes EVN 370 e

371 da espécie Pichia fluxuum, das estirpes EVN 375, 376 e 377 da espécie Metschnikowia

pulcherrima, das estirpes EVN 393 e 394 da espécie Hanseniaspora uvarum. Também para as

referidas espécies, a presença nos agrupamentos das estirpes tipo confere uma consistência

para estes resultados obtidos. O mesmo pode ser também aplicado para as estirpes EVN 378,

379 e 380 da espécie Pichia carsonii, e para as estirpes EVN 381, 382 e 383 da espécie

Saccharomyces exiguus, nas quais se verificou um agrupamento para cada uma das duas

espécies, e de que nesses agrupamentos também foi igualmente verificada a presença dos seus

duplicados de crescimento, o que também contribui para assegurar fiabilidade da análise

isoenzimática.

As estirpes EVN 365 e 366 da espécie Candida cantarellii, agruparam efectivamente,

contudo esse agrupamento verificou-se a um menor índice de semelhança (sensivelmente 34

%), o que não respeita ao definido critério de semelhança (42%) que indica conspecificidade.

Este facto já era previsto na análise dos seus perfis isoenzimáticos, onde foi constatada uma

dissemelhança para os perfis electroforéticos dos complexos EST, ADH e G6PD. As estirpes

EVN 367 e 387 de Candida stellata não agruparam, assim como não foram verificados

agrupamentos com outras estirpes. Da análise dos seus perfis electroforéticos, foi verificada

uma dissemelhança para todos os complexos enzimáticos, facto esse que já fazia supor o não

agrupamento entre as estirpes, revelado no dendrograma da figura 4.2. As estirpes EVN 384 e

385 da espécie Wickerhamiella domercqiae, não agruparam, assim como não foram

verificados agrupamentos com outras estirpes foi verificada uma dissemelhança entre as duas


estirpes, nos perfis electroforéticos dos cinco complexos enzimáticos focados. Nas estirpes

pertencentes à espécie Kluyveromyces thermotolerans, EVN 373, 374 e a estirpe tipo EVN

372, foi verificada uma heterogeneidade nos perfis exibidos de alguns complexos

enzimáticos. Assim, para a estirpe EVN 374 e a estirpe tipo foi verificado o seu agrupamento,

mas o mesmo não foi verificado para EVN 373, a qual também não agrupou com outras

estirpes focadas no presente trabalho.

Assim as estirpes EVN 366 (Candida cantarellii), EVN 367 (C. stellata), EVN 373

(Kluyveromyces thermotolerans) e EVN 385 (Wickerhamiella domercqiae) não agruparam

com as estirpes tipo da sua espécie, acima do valor de semelhança definido pela recta traçada.

Podem ser utilizadas duas hipóteses explicativas para este resultado, designadamente, os cinco

sistemas enzimáticos não foram suficientes para agrupar as estirpes destas espécies, tendo que

ser utilizadas enzimas adicionais, ou as estirpes foram mal classificadas taxonomicamente.

Foi utilizada uma outra metodologia para verificar esta última hipótese avançada no

parágrafo anterior. Para tal utilizou-se a sequenciação de regiões do DNA ribossómico

(rDNA), mais especificamente a região D1/D2 do rDNA 26S, visto tratar-se uma metodologia

de referência utilizada em estudos taxonómicos na identificação de leveduras ao nível da

espécie.


4.3 Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S

Para a identificação das estirpes EVN 366 (Candida cantarellii), EVN 367 (C.

stellata), EVN 373 (Kluyveromyces thermolerans) e EVN 385 (Wickerhamiella domercqiae),

foi utilizada a sequenciação da região D1/D2 da subunidade 26S do rDNA, a qual tem uma

dimensão de aproximadamente 600 pares de bases nucleotídicas (pb).

Para tal efectuou-se a extracção e purificação de DNA conforme descrito em 3.3.3., na

qual resultou a imagem digitalizada do gel de agarose presente na figura 4.3, para permitir

efectuar uma diluição do DNA para a reacção de PCR com base na sua observação.

500

800

1500

20003000

pb

M 1 2 3 4

500

800

1500

20003000

pb

500

800

1500

20003000

pb

M 1 2 3 4

Figura 4.3 – Perfis de bandas do DNA extraído das estirpes em estudo. M, marcador de pesos molecular; 1,

EVN 366; 2, EVN 367; 3, EVN 373; 4, EVN 385.

Na análise do gel presente na figura 4.3, ao comparar as bandas exibidas pelas estirpes

com as bandas presentes no marcador de pesos moleculares, verificou-se que as estirpes

possuíam sensivelmente a mesma quantidade de DNA. Assim, foi efectuada uma diluição de

1/100 para as quatro amostras de DNA analisadas, para serem submetidas a uma reacção

PCR, mediante utilização dos primers externos ITS5 e LR6. Para tal foram seguidos os

procedimentos descritos em 3.3.4, e realizou-se uma electroforese em gel de agarose para

verificar se tinha ocorrido a amplificação, tendo sido obtida a imagem digitalizada do gel

presente na figura 4.4.


500800

150020003000

pbM 1 2 3 4

500800

150020003000

pb

500800

150020003000

pbM 1 2 3 4

Figura 4.4 – Perfis de bandas do produto PCR amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6. M, marcador

de pesos molecular; 1, EVN 366; 2, EVN 367; 3, EVN 373; 4, EVN 385.

Ao comparar as bandas exibidas pelas estirpes com as bandas presentes no marcador

de pesos moleculares, é constatado que da primeira amplificação por PCR, são gerados

fragmentos com aproximadamente 2000 pb para as estirpes EVN 366 e 373, e 1500 pb para

EVN 367 e 385.

Efectuou-se a purificação do produto PCR mediante utilização do kit de purificação

(Jetquick PCR, Genomed) e realizou-se nova observação, para avaliar a quantidade de

amostra a usar na reacção de sequenciação, foi assim obtida a imagem digitalizada do gel

presente na figura 4.5. Verificou-se que os fragmentos nucleotídicos continham

aproximadamente 2000 pb para as estirpes EVN 366 e 373, e 1500 pb para EVN 367 e 385.

500800

150020003000

pb

M 1 2 3 4

500800

150020003000

pb

500800

150020003000

pb

M 1 2 3 4

Figura 4.5 – Perfis de bandas do produto PCR purificado, amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6.

M, marcador de pesos molecular; 1, EVN 366; 2, EVN 367; 3, EVN 373; 4, EVN 385.


Na reacção de sequenciação obteve-se uma sequência nucleotídica consenso, de

acordo com o descrito em 3.3.5, a qual para se obter a identificação, foi comparada com

sequências nucleotídicas num portal de acesso a diversas Bases de Dados de genoma,

conforme descrito em 3.3.6, que é apresentado nas figuras 4.6 a 4.9.

Os resultados da estirpe EVN 366, classificada como Candida cantarellii encontram-

se na figura 4.6, tendo sido detectadas seis bases nucleotídicas de diferença numa sequência

com a totalidade de 540 pb, com a sequência da estirpe tipo da espécie (CBS 4878), o que

corresponde a 98,9 % de semelhança, 1,1% de dissemelhança na região D1/D2 entre as duas

estirpes. Segundo os autores Kurtzman et al. (2001), trata-se de um valor superior ao valor

considerado para a variabilidade intraspecífica (1%), assim estamos muito provavelmente na

presença de uma má classificação da estirpe EVN 366 na espécie C. cantarellii e é

confirmado o resultado da análise isoenzimática.

Figura 4.6 – Alinhamento das sequências parciais do rDNA das estirpes EVN 366 e CBS 4878 (Gen Bank

acesso nº U45814, Kurtzman e Robnett, 1997).

Para a estirpe EVN 367, classificada como Candida stellata, foi obtida uma sequência

de 508 bases. Esta revelou na comparação da sequência nucleotídica (figura 4.7) uma

divergência ainda mais considerável com a estirpe tipo da espécie (CBS 157), sendo que

foram detectadas trinta e seis diferenças de pares de bases nucleotídicas numa sequência com

a totalidade de 476 pb, o que corresponde a 91 % de semelhança, valor este muito inferior ao

referido por Kurtzman et al. (2001), para que as estirpes sejam consideradas da mesma

espécie. Contudo a estirpe revelou possuir 100 % de semelhança com a estirpe 10-372,

designada por Sipiczki como Candida cf. stellata, numa totalidade de 475 pb comparados, e

com o isolado EJ1, designado por Mills et al. (2002) como pertencente ao género Candida,

1

c c t t a g t a a c g g c g a g t g a a g c g g c a a g a g c t c a a a t t t g a a a t c t g g c g t c t t a c g g c g t c c g a a t t g t a a t t t g t a g a g g t a a c t t t g g a g g c g g t c c t t g c a t a t g t t c c t t g g a a c 120

CBS 4878 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

121

a g g a c g t c a t a g a g g g t g a g a a t c c c g t a c g t g g t g g g g t g c c c g t c t c c t t g t a a a g t g c c t t c g a c g a g t c g a g t t g t t t g g g a a t g c a a c t c t a a g t g g g t g g t a a a t t c c a t c t a a 240

CBS 4878 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

241

a g c t a a a t a t c a g c g a g a g a c c g a t a g c g a a c a a g t a c a g t g a t g g a a a g a t g a a a a g a a c t t t g a a a a g a g a g t g a a a c a g t a c g t g a a a t t g t t g a a a g g g a a g c c t t t g a g a t c a g a 360

CBS 4878 ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････a･････････････････････････････････････････

361

c a t g g c t t t c g g t g a t c a g c t a c c c t t c g t g g g t g g t g c a c t c g c c g t t g g c t g g g c c a a c a t c g g t t c g g a t g g t g g g a t a a a a g c a t t g g a a t g t a g c t t c t t c t g a a g t g t t a t a g c 480

CBS 4878 ･････････････････････t･････-･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････t･･g･････････a･

481

c t t t g t t c a t a c c g c c t g t c t g g a c c g a g g a c c g c g c t t c g g c t a g g a t g t t g g c g t a a t 540

CBS 4878 ････････････････････････････････････････････････････････････

EVN 366

EVN 366

EVN 366

EVN 366

EVN 366


num total de 469 pb comparados. A estirpe 10-372 foi estudada por Sipiczki (Gen Bank

acesso nº AY160761), e foi isolada de um vinho Tokaj, o qual trata-se de um tipo de

vinificação especial em que são vinificados mostos provenientes de uvas infectadas por

Botrytis cinerea (Sipiczki et al., 2001). A estirpe EJ1 foi isolada por Mills et al. (2002), num

estudo da caracterização do impacto da temperatura na diversidade das leveduras presentes

durante a fermentação de vinhos doces de marcas comerciais, nas quais foram usados mostos

provenientes de uvas brancas inoculadas com Botrytis cinerea. Este resultado vem de

encontro ao resultado da análise isoenzimática, e aponta muito provavelmente para uma má

classificação da estirpe EVN 367 na espécie C. stellata.

Figura 4.7 – Alinhamento das sequências parciais do rDNA da estirpe EVN 367 com as estirpes CBS 157, 10-

372, e EJ1 (respectivamente Gen Bank acesso nº U45730, Kurtzman e Robnett, 1997; nº AY160761, Sipiczki,

não publicado; nº AY078348, Mills et al., 2002).

De referir que a estirpe EVN 367 é estirpe neotipo da espécie Saccharomyces

bacillaris, e de que a estirpe EVN 387, é estirpe tipo da espécie Saccharomyces stellatus. As

duas referidas espécies foram isoladas por Kroemer e Krumbholz (1931; cit. in Lodder, 1970),

em uvas em estado de sobrematuração e em mostos concentrados. Os autores observaram

diferenças no arranjo e tamanho das células assim como na intensidade de fermentação entre

os dois grupos de isolados, pelo que descreveram-nos como pertencentes a diferentes

espécies. As duas espécies foram transferidas separadamente para o género Torulopsis por

Lodder (1932; cit in Lodder, 1970), e assim mantidas por Lodder e Kregger-van Rij (1952;

cit. in Lodder, 1970). Não foram verificadas diferenças por van Uden e Vidal-Leiria (1970),

entre as estirpes tipo e outras estirpes pertencentes às espécies Torulopsis stellata e

T. bacillaris, pelo que os autores efectuaram a sua união numa espécie, e foi seleccionado o

EVN 367

EVN 367

EVN 367

EVN 367

1

a a a c c a a c a g g g a t t g c c c t a gt a a c g g c g a g t g a a c a g g c a a g a g c t c a g a t t t g a a a g g c a c t t t t g t g c c g t t g t a t t c t g a a g t t a g g g t c c t g a g a a a c g a t g c t t a a g t c t t c t 120

CBS 157 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････- -･････a･･････････････････a･t･･t g ･･･c････a ･c･････t････ EJ1 ･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

10-372 ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

121

g g a a a gg a g c g c c a t g g a g g g t g a t a g c c c c g t c t a g c a t t g a c c t c a t a t a g g a t c t t a a c a t g g a g t c g a g t t g t t t g g g a a t g c a g c t c a a a t g g g t g g t a t g c t c c a t c t a a a g c t 240

CBS 157 ･･････a･a････････････････････････a c g･ t･･･････c a･･････････････････t t ･････････････････････････････････････････････････g･･･ EJ1 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

10-372 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

241

a a a t a t c t g c g a g a g a c c g a t a g t a a a c a a g t a c t g t g a g g g a a a g a t g a a a a g a a c t t t g a a a a g a g a g t g a a a a a g t a c g t g a a a t t g t t g a a a t g g a a g g g t a g g c c g c t a a c c a t g 360

CBS 157 ･･････t････････････････c g･･････････････a････････････････････････････････････t･･････････････････････････････････t･･････････ EJ1 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

10-372 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

361

t a g a g c c g t g t t t g g g g g g a a g a t a a a t g c t g t a g a a t g t a g c t c c t c g g a g t a t t a t a g a t g c a g t t c a t a t t c c c a c c c g a g c g c g a g g a t c t c a g g t t c t a c t a a a t g g t g g t 475

CBS 157 ････a･･････････････････････a････c････c･･･a･･････････c･･････････････c･･････････t･････････････････････････････････････ EJ1 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

10-372 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････


epíteto específico stellata para a nomenclatura da espécie criada. No entanto, e dado o

paralelismo observado entre os resultados obtidos na análise isoenzimática e sequenciação,

estamos muito provavelmente na presença de duas espécies distintas, sendo necessários

estudos adicionais para consolidar esta hipótese.

Para as estirpes EVN 373 e 385 os resultados da comparação das sequências

nucleotídicas não detectaram uma divergência significativa, com as estirpes tipo das suas

respectivas espécies (figura 4.8 e figura 4.9). A sequenciação da região D1/D2 de rDNA não

suportou a hipótese avançada, com base na análise isoenzimática, de uma má classificação ao

nível da espécie para as duas estirpes visadas. Para a estirpe EVN 373, a comparação das

sequências nucleotídicas com a estirpe tipo da espécie Kluyveromyces thermotolerans (CBS

6340), estudada por Kurtzman e Robnett (1998), revelou uma diferença de uma base numa

sequência com o total de 519 pb, enquanto que para a estirpe EVN 385 a comparação com a

sequência nucleotídica da estirpe tipo da espécie Wickerhamiella domercqiae (CBS 4351)

estudada por Kurtzman e Robnett (1997), detectou a diferença de duas bases numa sequência

com o total de 517 pb. Os resultados fornecidos pela sequenciação de rDNA (região D1/D2)

confirmam que as duas estirpes EVN 373 e EVN 385 são pertencentes respectivamente às

espécies Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae. Para estes dois casos

os resultados da análise de perfis electroforéticos, com base nos cinco sistemas isoenzimáticos

estudados não foram adequados para a sua classificação, e a análise isoenzimática terá que ser

efectuada com complexos enzimáticos adicionais.



1

c c t t a g t a a c g g c g a g t g a a g c g g c a a a a g c t c a a a t t t g a a a t c t g g c a t c t t c g g t g t c c g a g t t g t a a t t t g a a g a a g c t a c t t t g g g g c t a g t c c t t g t c t a t g t t c c t t g g a a c a 120

CBS 6340 ･･････････････････････････････････････････････････c･････････････････････････････････････････････････････････････････････

121

g g a c g t c a t g g a g g g t g a g a a t c c c g t a t g g c g a g g a g t c t a g t c c t a t g t a a a g t g c t t t c g a c g a g t c g a g t t g t t t g g g a a t g c a g c t c t a a g t g g g t g g t a a a t t c c a t c t a a a g c 240

CBS 6340 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

241

t a a a t a t t g g c g a g a g a c c g a t a g c g a a c a a g t a c a g t g a t g g a a a g a t g a a a a g a a c t t t g a a a a g a g a g t g a a a a a g t a c g t g a a a t t g t t g a a a g g g a a g g g c a t t t g a t c a g a c a t 360

CBS 6340 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

361

g g t g t t t t g c g a c c c t c g c t c c t t g t g g g t g g g g a t c t c g c a g c t c a c t g g g c c a a c a t c a g t t t t g g c g g t a g g a t a a a t c t t t g g g a a c g t g g c t t g t c t t c g g a g a a g c g t t a t a g c 480

CBS 6340 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

481

c c a g g g g a a t a c t g c c a g c c g g g a c t g a g g a c t g c g a c t 519

CBS 6340 ･････････････････････････････････････････

EVN 373

EVN 373

EVN 373

EVN 373

EVN 373

r = 0.88

Coefficient

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

Y-12628

260253 255 256 251 167 262 166267237263 Saccharomyces cerevisiae258261264257 265266268254252NT

259216 Zygosaccharomyces lentus230382383 Saccharomyces exiguus381NT

329T Debaryomyces hansenii222 N. I. 284T

285299302292 293 Pichia membranifaciens298301290291303287 N. I. 269271T

270 Saccharomyces bayanus272 273 274276277 Saccharomyces pastorianus275NT

278 235 355 Zygosaccharomyces rouxii242T

243244245248 Zygosaccharomyces bisporus246 247 249390 Hanseniaspora guilliermondii279NT

280281 Saccharomyces paradoxus283282370NT

371 Pichia fluxuum378T

380 Pichia carsonii379 212223217219213 215218224 Zygosaccharomyces bailii229 227 220221225 228226T

312NT

310 Pichia anomala311 340 341 Kluyveromyces marxianus342384T Wickerhamiella domercqiae392 Hanseniaspora osmophila391 Hanseniaspora occidentalis345 346NT Rhodotorula mucilaginosa231T Zygosaccharomyces florentinus368T Candida vanderwaltii373 Kluyveromyces thermotolerans387T Candida stelatta354T Zygosaccharomyces mellis348 349 Saccharomycodes ludwigii395T

339 394T Hanseniaspora uvarum393 367 Candida stellata305308 Pichia kluyveri307 388T Debaryomyces hansenii var. fabryii168350351 Schizosaccharomyces pombe396T

294288 289 Pichia manshurica300295 336 337 Issatchenkia orientalis338T

326NT Torulaspora delbrueckii327372T Kluyveromyces thermotolerans374232234 233 241NT Zygosaccharomyces rouxii238 239333T

334 Dekkera bruxellensis335 330T

331 Dekkera anomala332385 Wickerhamiella domercqiae236 N.I. 375T

376 Metschnikowia pulcherrima377 343 344 Lodderomyces elongisporus386T

389T Dekkera naardenensis296 N.I. 369T Pichia mexicana304 306 Pichia scaptomyzae297 N.I. 286 N.I. 309 Pichia farinosa 365T

366 Candida cantarellii325 N.I

Índice de semelhança

IV

V

VI

VIII

I

II

III

VII




4.4 Comparação com os perfis isoenzimáticos das estirpes da base de

dados da EVN

Os resultados obtidos neste trabalho foram adicionados aos da base de dados de perfis

electroforéticos de isoenzimas existente na Estação Vitivinícola Nacional (Duarte, 2000),

perfazendo na sua totalidade 160 estirpes e cerca de 50 espécies de leveduras.

Para verificar os relacionamentos entre a totalidade das estirpes inseridas na base de

dados, efectuou-se a análise numérica dos dados isoenzimáticos, de acordo com os

procedimentos anteriormente descritos em 3.4.2., resultando o dendrograma presente na

figura 4.10., encontrando-se a azul as estirpes analisadas no presente trabalho. O traçado de

uma linha recta a um nível de semelhança de aproximadamente 0,42 evidenciou uma elevada

correspondência entre os agrupamentos e as espécies estudadas. Foi calculado o coeficiente de

correlação cofenética, r= 0,88, o que permite indicar que o dendrograma gerado trata-se de

uma boa representação da matriz de semelhanças. É contudo, de referir que os valores de Rm

determinados no presente trabalho deveriam ter sido comparados em gel com os das estirpes

da base de dados existente que apresentaram valores semelhantes.

1

g c g a g t g a a g c g g c a a a a g c t c a a a t t t g a a a t c c g t c t t t t g a t g g a g t t g t a a t t t g a a g a t a a c a a t t c t t g a a g c a g c c c t g c t c a a g t t t c c t g g a a c g g a a c a t c a t g g a g g g t 120

CBS 4351 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

121

g a g a a t c c c g t g a t g c g g g g g c t c t g c t t c t c t a c a g a g t g t t a t c g a c g a g t c g a g t t g t t t g g g a a t g c a g c t c t a a g t g g g t g g t a a a t t c c a t c t a a g g c t a a a t a t t g g c g a g a g 240

CBS 4351 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

241

a c c g a t a g c g a a c a a g t a c t g t g a a g g a a a g a t g a a a a g c a c t t t g a a a a g a g a g t g a a a t a g a a c g t g a a a t t g t t g a a g t g g a a g g g t t t g a a g t t a g a c t t g g t a g t t t a c g c t c c a 360

CBS 4351 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

361

c g a t c c c t c g g g g c c g t g t a c t c g t t t t c t g c c g g g c c a g c a t c a g t t t t g a t a g a a g t a c a a a g a c a t t g g a a c g t g c c t t c t t a t g t t g g t t t a t a g a c t t t g t t a a t g c t t c t c a t c 480

CBS 4351 ･･････t ･･････t･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

481

g g g a c t g a g g a c c g c g c t t t t t g c t a g g a t g c t g g c g 517

CBS 4351 ･････････････････････････････････････

EVN 385

EVN 385

EVN 385

EVN 385

EVN 385


Figura 4.10 – Dendrograma representando as relações da totalidade de estirpes estudadas (160 estirpes), com base nos perfis electroforéticos de EST, ACP, G6PD, LDH e ADH. A escala corresponde a uma medida numérica de semelhança. r, coeficiente de correlação cofenética. N. I.= Não Identificada; T – estirpe tipo; NT – estirpe neotipo.


Para as estirpes das espécies estudadas neste trabalho, as quais somente foi analisada

isoenzimaticamente a estirpe tipo das respectivas espécies ou do anamorfo, nomeadamente a

estirpe EVN 368 da espécie Candida vanderwaltii, a estirpe EVN 369 da espécie Pichia

mexicana, a estirpe EVN 388 de Debaryomyces hansenii var. fabryii, a estirpe EVN 389 de

Dekkera naardenensis, a estirpe EVN 390 da espécie Hanseniaspora guilliermondii, a estirpe

EVN 391 da espécie H. occidentalis e a estirpe EVN 392 da espécie H. osmophila, mediante a

análise do dendrograma presente na figura 4.10., verificou-se que tal como na figura 4.2, que

surgiam isoladas no dendrograma, também não agruparam com as outras estirpes existentes

na base de dados anterior.

Verificou-se o agrupamento (agrupamento II) das estirpes EVN 370 e 371 da espécie

Pichia fluxuum, o qual se efectuou a um nível de semelhança idêntico ao agrupamento

verificado no dendrograma 4.2. O mesmo foi igualmente verificado para as estirpes EVN 378,

379 e 380 da espécie Pichia carsonii (agrupamento III), e para as estirpes EVN 375, 376 e

377 da espécie Metschnikowia pulcherrima (agrupamento VII). Para as estirpes EVN 381,

382 e 383, da espécie Saccharomyces exiguus, verificou-se o seu agrupamento, (agrupamento

I) como foi verificado anteriormente no dendrograma 4.2, contudo inserida neste

agrupamento, a estirpe EVN 230 pertencente a outra espécie (Zygosaccharomcyces lentus), a

qual fazia parte da base da dados anterior. Terá de ser efectuada a comparação dos valores de

Rm das bandas dos respectivos perfis por análise num mesmo gel, de modo a confirmar, ou

não, este resultado.

Na análise do dendrograma presente na figura 4.10, verificou-se que as estirpes que

não agruparam com as estirpes tipo da sua espécie, no dendrograma presente na figura 4.2.,

devido às dissemelhanças encontradas entre os perfis dos cinco sistemas enzimáticos

estudados e os perfis exibidos pelas estirpes tipo da sua espécie, as quais foram a estirpe EVN

366 (Candida cantarellii), EVN 367 (C. stellata), EVN 373 (Kluyveromyces thermolerans) e

EVN 385 (Wickerhamiella domercqiae), continuaram igualmente a não agrupar, bem como

não foi verificado um agrupamento com as outras estirpes de outras espécies estudadas em

trabalhos anteriores. É contudo, de referir que para as estirpes EVN 366 e 367 os resultados

de sequenciação da região D1/D2 vieram confirmar estes resultados.

Algumas das estirpes visadas neste trabalho experimental, são a estirpe tipo de

espécies constantes da base de dados existente, e foram analisadas com o objectivo de

confirmar a adequada identificação de estirpes de interesse enológico pela análise

isoenzimática. Assim, as estirpes visadas foram: EVN 386 (Lodderomyces elongisporus),


EVN 393 e 394 (Hanseniaspora uvarum), EVN 395 (Saccharomycodes ludwigii) e EVN 396

(Schizosaccharomyces pombe). As estirpes visadas anteriormente geraram agrupamentos com

as estirpes já estudadas e existentes na base de dados de perfis isoenzimáticos. No caso das

estirpes EVN 348, 349 e EVN 395 (estirpe tipo) da espécie Saccharomycodes ludwigii,

verificou-se o seu agrupamento (agrupamento IV) para o qual foram obtidas boas

semelhanças (cerca de 57%). Para as estirpes da espécie Hanseniaspora uvarum, EVN 339,

393 e a estirpe tipo EVN 394 analisadas, foi verificado o seu agrupamento (agrupamento V) e

foram obtidas boas semelhanças (cerca de 60%). As estirpes EVN 343, 344 e EVN 386

(estirpe tipo) de Lodderomyces elongisporus, também agruparam (agrupamento VIII), com

boas semelhanças (cerca de 58%). Contudo não foi verificado um agrupamento para as

estirpes da espécie Schizosaccharomyces pombe, EVN 168, 350, 351 e a estirpe tipo EVN

396, que respeitasse o critério definido pelo traçado da linha, isto é foram obtidos baixos

índices de semelhança (cerca de 37%), assim o agrupamento verificado (agrupamento VI) não

satisfaz os requisitos para que as estirpes sejam consideradas pertencentes à mesma espécie.

Assim, para a espécie Schizosaccharomyces pombe, não foi então possível a sua identificação

e diferenciação com base na análise electroforética de perfis dos cinco sistemas enzimáticos

estudados neste trabalho experimental.

Conclusões

5. CONCLUSÕES

Pode-se concluir que os cinco sistemas enzimáticos usados na análise de perfis

electroforéticos, esterase (EST), lactato desidrogenase (LDH), álcool desidrogenase (ADH),

fosfatase ácida (ACP) e glucose-6-fostato desidrogenase (G6PD), foram bastante

discriminantes na diferenciação entre as espécies estudadas neste trabalho experimental, e

conseguiu-se a diferenciação da maior parte das 32 estirpes de 19 espécies. Quatro das

estirpes estudadas não agruparam com as estirpes tipo da respectiva espécie, pelo que a sua

identificação foi verificada por outra metodologia a sequenciação da região D1/D2 do rDNA

26S, técnica muito utilizada na identificação de espécies de leveduras. Para duas das estirpes

esta metodologia veio a confirmar uma incorrecta identificação na espécie (EVN 366 e 367), e

suportou deste modo os resultados da análise isoenzimática, e para as restantes duas estirpes

foi confirmada a sua classificação (EVN 373 e 385). Para estas, pertencentes às espécies

Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae, a utilização dos cinco sistemas

enzimáticos não permitiu a identificação e discriminação ao nível da espécie, deste modo é

necessário o estudo de sistemas enzimáticos adicionais.

A comparação dos resultados isoenzimáticos das estirpes analisadas no presente

trabalho com a base de dados da EVN, permitiu verificar que apenas com cinco sistemas

enzimáticos foi possível diferenciar a generalidade das cinquenta espécies em comparação.

Verificou-se também que as estirpes tipo, estudadas no presente trabalho, de algumas das

espécies já existentes na base de dados da EVN, agrupavam com estas. Contudo, é necessário

efectuar uma confirmação lado a lado num mesmo gel das estirpes deste trabalho com as

estudadas anteriormente, uma vez que só assim é possível constatar o grau de semelhança dos

perfis electroforéticos exibidos.

A análise de perfis isoenzimáticos trata-se de uma técnica com um enorme potencial

no controlo de qualidade da tecnologia alimentar, nomeadamente no rastreio de espécies de

contaminação na indústria enológica, devido a não necessitar de uma exigente formação

profissional de operadores de laboratório, devido à facilidade de execução, de ser uma técnica

que necessita de equipamento pouco dispendioso, e o facto de ser relativamente rápida aliado

à sua fiabilidade sob condições estandardizadas, características que a tornam esta técnica

adequada para utilização em rotina na indústria alimentar.

Referências Bibliográficas

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Acquaah, G. 1992. Practical protein electroforesis for genetic research. (Dudley, T. R. ed.).

Discorides Press, Portland.

Arnavielhe, S.; A., Blancard; M., Mallié; F., Gouin; A. Ottomani; J., C., Manelli; J., M.,

Bastide.1996. Suivi mycologique d'infections à Candida albicans dans divers

services hospitalaires. Typage moléculaire des souches isolées et enquête

épidémiologique. Path. Biol. 447-451.

Baleiras-Couto, J., T. W., E., Vogels; H., Hofstra; J., H., J., Huis in’t Veld; J., M., B., M.,

van der Vossen.1995. Random amplified polymorphic DNA and restriction

enzyme analysis of PCR amplified rDNA in taxonomy: two identification

techniques for food-borne yeasts. J. Appl. Bacteriol., 79, 525-535.

Baleiras-Couto, M., M.; B., Ejsma; H., Hofstra; J., H., J., Huis in’t Veld; J., M., B., M., van

der Vossen.1996a. Evaluation of molecular typing techniques to assign genetic

diversity among Saccharomyces cerevisiae strains. Appl. Environ. Microbiol., 62, 41-

46.

Baleiras-Couto, M., M.; B., J., Hartog; J., H., J., Huis in’t Veld; H., Hofstra; J., M., B., M.,

van der Vossen.1996b. Identification of spoilage yeasts in a food-production chain by

microsatellite polymerase chain reaction fingerprinting. Food Microbiol., 13, 59-67.

Barnett, J., A.; M., A., Delaney; E., Jones; A., B., Magson; B., Winch.1972. The number of

yeasts associated with wine grapes of Bordeaux. Arch. Microbiol., 83, 52-55.

Barnett, J., A.; R., W., Payne; D., Yarrow; L., Barnett.2000. Yeasts: Characteristics and

identification. 3ª ed., Cambridge Univ. Press, Cambridge.

Bisson, L. F.1993. Yeasts-Metabolism of sugars. In: Wine microbiology and

biotechnology (G., H., Fleet ed.), 55-75. Harwood academic publishers, Chur.

70


Bonde, M., R.; J., A., Micales; G., L., Peterson.1993. The use of isoenzyme analysis for

identification of plant-pathogenic fungi. Plant Dis., 77, 961-968.

Bréchot, P.; J., Chauvet; H., Girard.1962. Identification des levures d'un moût deBeaujolais au

cours de sa fermentation. Ann. Technol. Agric., 11, 235-244.

Castelli, T; S., Georgantas.1970. Gli agenti della fermentazione vinaria nel nord della Grecia.

Vini d'Italia,12, 185-191 (abstract).

Constantí, M. ; M., Poblet ; L., Arola ; A., Mas ; J., Guillamón.1997. Analysis of yeast

populations during alcoholic fermentation in a newly established winery. Am. J. Enol.

Vitic., 48 (3), 339-344.

Davenport, R., R.1974. Microecology of yeasts and yeast-like organisms associated with an

English vineyard. Vitis, 13, 123-130.

Deak, T.; L., R., Beuchat.1996. Handbook of food spoilage yeasts. CRC Press, Inc., Boca

Raton.

Demain, A, L.; H. J., Phaff, C., P., Kurtzman.1998. The industrial and agricultural

significance of yeasts. In: The Yeasts, a Taxonomic study. 4ª ed. (Kurtzman, C. P.;

Fell J. W. eds.), 13-19. Elsevier. Amesterdão.

Doebbeling, B., N.; P., F., Lehmann; R., J., Hollis; L., C., Wu; A., F., Widmer; A., Voss; A.,

Pfaller.1993. Comparison of pulsed-field electrophoresis with isoenyme profiles as a

typing system for Candida tropicalis. Clin. Infect. Dis., 16, 377-383.

Donèche, B., J.1993. Botrytized wines. In: Wine microbiology and biotechnology,

(Fleet, G., H. ed.), 327-352, Harwood Academic Pub., Chur.

Duarte, F., L.; C., Pais; I., Spencer-Martins; C., Leão.1999. Distinctive electrophoretic

isoenzyme profiles in Saccharomyces sensu stricto. Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 1907-

1913.

71


Duarte, F., L. 2000. Perfis electroforéticos de isoenzimas na diferenciação de leveduras de

interesse enológico. Tese Doutoramento, Universidade do Minho, Braga.

Eiras-Dias, J., E.1994. O polimorfismo isoenzimático na identificação de cultivares de Vitis

vinifera L. Tese de Doutoramento, Instituto Superior de Agronomia, U.T.L., Lisboa.

Esteve-Zarzoso, B.; C., Belloch; F., Uruburu; A., Querol.1999. Identification of yeasts by

RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribossomal internal transcribed

spacers. Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 329-337.

Esteve-Zarzoso, B.; M., J., Peris-Torán; E., Garcia-Maiquez; F., Uruburu; A., Querol.2001.

Yeast population dynamics during the fermentation and biologicalaging of Sherry

wines. Appl. Environ. Microbiol., 64, 2056-2061.

Fell, J., W.; T., Boekhout; A., Fonseca; G., Scorzetti; A., Statzell-Tallman.2000. Biodiversity

and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA

D1/D2 domain sequence analysis. Int. J. Syst. Evol. Microb., 50, 1351-1371

(abstract).

Ferreira, M., E.; D., Grattapaglia.1995. Introdução ao uso de marcadores RAPD e RFLP em

análise genética. EMBRAPA-CENARGEN, Brasília.

Fleet, G., H.; S., Lafon-Lafourcade; P., Ribéreau-Gayon.1984. Evolution of yeasts and lactic

acid bacteria during fermentation and storage of Bourdeaux wines. Appl. Environ.

Microbiol., 48, 1034-1038.

Fleet, G., H.; G., M., Heard.1993. Yeasts growing during fermentation. In: Wine microbiology

and biotechnology, (Fleet, G., H. ed.), 27-54. Harwood academic publishers, Chur.

Gancedo, C.; R., Serrano.1989. Energy-Yielding metabolism. In: The Yeasts, vol. 3 -

metabolism and physiology of yeasts (A., H., Rose, J., S., Harrison eds.), 205-251, 2nd

ed., Academic Press, Londres.

72


Gandini, A.1969. Microbiological investigations of Moscato d'Asti. Infection occurring

during bottling and the effect of using an iodine-containing compound. Vini

d'Italia, 11, 455-527 (abstract).

Gao, C.; G., H., Fleet.1988. The effects of temperature and pH on the ethanol tolerance of the

wine yeasts, Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata and Kloeckera apiculata. J.

Appl. Microbiol., 65, 405-409.

Goto, S.; H., Oguri; M., Yamazaki.1984. Yeast population in botrytized grapes. J. Inst. Enol.

Vitic. Yamanashi Univ., 19, 1-5 (abstract).

Guarro, J.; J., Gené; A., M., Stchigel.1999. Developments in fungal taxonomy. Clin.

Microbiol. Rev., 12, 454-500.

Guerzoni E.; R., Marchetti.1987. Analysis of yeast flora associated with grape sour rot and

of the chemical disease markers. App. Environ. Microbiol., 53., 571-576.

Hames, B., D.1990. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In: Gel

electrophoresis of proteins: a practical approach. 2ª ed. (Hames, B., D.; D.,

Rickwood eds.), 1-139. IRL Press, Oxford.

Heelan, J.; E., Sotomayor; K., Coon; J., B., d’Arezzo.1998. Comparison of the rapid yeast

plus panel with the API20C yeast system identification of clinically significant isolates

of Candida species. J. Clin. Microbiol., 36,1443-1445.

Hennequin, C.; A., Thierry; G., F., Richard; G., Lecointre; H., V., Nguyen; C., Gaillardin; B.,

Dujon.2001. Microsatellite typing as a new tool for identification of Saccharomyces

cerevisiae strains. J. Clin. Microbiol., 39, 551-559.

Hidalgo, P.; M., Flores.1994. Occurrence of the killer character in yeasts associated with

Spanish wine production. Food Microbiol., 11, 161-167 (abstract).

73


Holzschu, D., L.; H., J., Phaff; J. Tedrick; D. Hedgecock.1985. Resolution of the varietal

relationship within the species Pichia opuntiae and establishment of a new species,

Pichia thermotolerans comb. nov. Int. J. Sist. Bacteriol., 35, 457- 461.

James, S., A.; J., Cai ; I., N., Roberts; M., D., Collins.1997. A phylogenetic analysis of the

genus Saccharomyces based on 18S rRNA gene sequences: description of

Saccharomyces kunashirensis sp. nov. and Saccharomyces martiniae sp. nov. Int. J.

Syst. Bacteriol., 47, 453-460.

Kirschner, C.; K., Maquelin; P., Pina; N., A., Ngo-Thi; L., P., Choo-Smith; G., D.,

Sockalingum; C., Sandt; D., Ami; F., Orsini; S., M., Doglia; P., Allouch; M.,

Mainfait; G., J., Puppels; D., Naumann.2001. Classification and Identification of

Enterococci: a comparative phenotypic, genotypic and vibrational spectroscopy

study. J. Clin. Microbiol., 39, 1763-1770.

Kreger van Rij, N., J., W. (ed.).1984. The yeasts, a taxonomic study. 3ª ed., Elsevier

Science Pub, Amesterdão.

Kümmerle, M.; S., Scherer; H., Seiler.1998. Rapid and reliable identification of food-borne

yeasts by Fourier-transform infrared spectroscopy. Appl. Environ. Microbiol., 64,

2207-2214.

Kurtzman, C., P.1984. Synonymy of the yeast genera Hansenula and Pichia

demonstrated through comparisons of deoxyribonucleic acid relatedness. Antonie van

Leeuwenhoek, 50, 209-217.

Kurtzman, C., P.1992. DNA relatedness among phenotypically similar species of

Pichia. Mycologia, 84, 1, 72-76.

Kurtzman, C., P.1994. Molecular taxonomy of the yeasts. Yeast., 10, 1727-1740.

Kurtzman, C., P.; C., J., Robnett.1997. Identification of clinically important

ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5’ end of the large-

subunit (26S) ribosomal DNA gene. J. Clin. Microbiol., 35, 1216-1223.

74


Kurtzman, C., P.; C., J., Robnett.1998. Identification and phylogeny of ascomycetous

yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial

sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73, 331-371.

Kurtzman, C., P.; P., A., Blanz.1998. Ribossomal RNA/DNA sequence comparisons for

assessing phylogenetic relationships. In: The yeasts, a taxonomic study (Kurtzman, C.,

P.; J., W., Fell eds.), 4ª ed., Elsevier, Amesterdão.

Kurtzman, C., P.; J., W., Fell (eds.).1998. The yeasts, a taxonomic study. 4ª ed., Elsevier,

Amesterdão.

Kurtzman, C., P.; C., J., Robnett; E., Basehoar-Powers.2001. Zygosaccharomyces

kombuhaensis, a new ascosporogenous yeast from “Kombucha tea”. FEMS Yeast

Research I, 133-138.

Kyselakova, M.1994. Observation of yeast occurrence in wine cellars. Acta Universitatis

Agriculturae Facultas Horticulture, Bro., 9, 11-15 (abstract).

Kyselakova, M.1995. Investigation no the occurrence of Candida sp. in cellars and cellar

equipment. Vinohrad, Bratislava., 33, 13-14 (abstract).

Lachance, M., A.; W., T., Starmer; C., A., Rosa; J., M., Bowles; J., Stuart; F., Barker; D.,

H., Janzen.2001.Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers and their insects.

FEMS Yeast Res. I, 1-8.

Llaguno, C.; M., J., Fernandez; M., D., Garrido, J., Garrido.1970. Influence du taux

d’activité de l’alcool-deshydrogenase des levures de “fleur” sur le vieillissement des

vins. Conn. Vigne Vin., 4, 123-131.

Lema, C.; C., Garcia-Jares; I., Orriols; L., Angulo.1996. Contribution of Saccharomyces and

non-Saccharomyces populations to the production of some components of Albariño

wine aroma. Am. J. Enol. Vitic., 47, 206-216.

75


Lewicka, K.; M., Mallie; J., M., Bastide.1995. Genetic variability in the Saccharomyces sensu

stricto complex revealed by multilocus enzyme electrophoresis. Int. J. Syst. Bateriol.,

45, 538-543.

Lodder, J. (ed.).1970. The yeasts. A taxonomic study. 2ª ed., North-Holland Pub. Co.,

Amesterdão.

Longo, E.; J., Cansado; D., Agrelo; T.,G., Villa.1991. Effect of climatic conditions on yeast

diversity in grape musts from northwest Spain. Am. J. Enol. Vitic., 42, 141-144.

Loureiro, V.2000. Spoilage yeasts in foods and beverages: characterisation and ecology or

improved diagnosis and control. Food Res. Int., 33, 247-256 (abstract).

Maiquez, E., G.1995. Los microorganismos del Jerez. Microbiología Sem., 11, 51-58.

Malfeito-Ferreira, M.1996. Perfis de ácidos gordos e toxicidade de ácidos fracos em

leveduras de contaminação de alimentos. Tese Doutoramento, Instituto Superior de

Agronomia, U.T.L., Lisboa.

Mannarelli, B., M.; C., P., Kurtzman.1998. Rapid identification of Candida albicans and

other human pathogenic yeasts by using short oligonucleotides in a PCR. J. Clin.

Microbiol., 36, 1634-1641.

Martini, A.; M., Ciani; G., Scorzetti.1996. Direct enumeration and isolation of wine

yeasts from grape surfaces. Am. J. Enol. Vitic., 47, 435-440.

Masneuf, I.; D., Dubourdieu.1994. Comparaison de deux techniques d’identification des

souches de levures de vinification basées sur le polymorphisme de l’ADN

génomique: réaction de polymérisation en chaîne (PCR) et analyse des caryotypes

(électrophorèse en champ pulsé). J. Int. Vigne Vin, 28, 153-160.

Mateo, J., J.; M., Jiménez; T., Huerta; A., Pastor.1991. Contribution of different yeasts

isolated from musts of monastrell grapes to the aroma of wine. Int. J. Food

Microbiol., 14, 153-160.

76


Millán, C.; J., M., Ortega.1988. Production of ethanol, acetaldehyde, and acetic acid in wine

by various yeast races: role of alcohol and aldehyde dehydrogenase. Am. J. Enol.Vitic.,

39, 107-112.

Mills, D., A.; E., A., Johansen; L., Cocolin.2002. Yeast diversity and persistence in

Botrytis-affected wine fermentations. Appl. Environ. Microbiol., 68 (10), 4884-4893.

Minarik, E.1971. Etude de la flore levurienne des régions viticoles périphériques en

Tchécoslovaquie. Conn. Vigne Vin., 5, 185-197.

Minarik, E.1982. Levures de contamination des vins embouteillés. Bulletin OIV, 628,

414-419.

Mora, J.; J., I., Barbas; A., Mulet.1990. Growth of yeast species during fermentation of musts

inoculated with Kluyveromyces thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae. Am.

J.Enol. Vitic., 41, 156-159.

Mora, J.; A., Mulet.1991. Effects of some treatments of grape juice on the population and

growth of yeast species during fermentation. Am. J. Enol. Vitic., 42, 133- 136.

Mortimer, R.; M., Polsinelli.1999. On the origin of wine yeast. Res. Microbiol., 150, 199-204.

Nadal, D.; B., Colomer; B., Piña.1996. Molecular polymorphism distribution in

phenotypically distinct populations of wine yeast strains. Appl. Environ. Microbiol.,

62, 1944-1950.

Naumann, D.; D., Helm; H., Labischinski.1991.Microbiological characterization by FT- IR

spectroscopy. Nature, 351 (6321), 81-2 (abstract).

Naumov, G.,I.; E.,S., Naumova; P., D., Sniegowski.1997. Differentiation of European and

Far East Asian populations of Saccharomyces paradoxus by allozyme analysis. Int. J.

Syst. Bacteriol., 47,341-344.

77


Neto, M., L.1994. Estudos bioquímicos e moleculares aplicados à caracterização de

variedades de milho (Zea mays L.). Prova de aptidão pedagógica e capacidade

científica, Universidade do Minho, Braga.

Oberreuter, H.; J., Charzinski; S., Scherer.2002. Intraspecific diversity of Brevibacterium

linens, Corynebacterium glutamicum and Rhodococcus erythropolis based on

partial 16S rDNA sequence analysis and Fourier – transform infrared (FT-IR)

spectroscopy. Microbiology, 148, 1523-1532.

Olive, D., M; P., Bean.1999. Principles and applications of methods for DNA-based

typing of microbial organisms. J. Clin. Microbiol., 38, 1661-1669.

Pardo, I.; M., J., García; M., Zúñiga; F., Urubu.1989. Dynamics of microbial populations

during fermentation of wines from Utiel-Requena region of Spain. Appl. Environ.

Microbiol., 55, 539-541.

Parish, A., E.; D., E., Carrol.1985. Indigenous yeasts associated with muscadine (Vitis

rotundifolia) grapes and musts. Am. J. Enol. Vitic., 36, 165-169.

Park, Y., H.; A., Bertrand.1974. Contribution a l’étude des levures de cognac: II – étude des

produits volatils formés au cours de la fermentation par les levures de Cognac. Conn.

Vigne Vin., 8, 343-373.

Pasteur, N.; G., Pasteur; F., Bonhomme; J., Catalan; J., Britton-Davidian.1987. Manuel

technique de génétique par électrophorèse des protéines. Techniques et

Documentations. Editions Lavoisier, Paris.

Peltroche-Llacsahuanga, H.; S., Schimdt; M., Seibold; R., Lütticken; G., Haase.2000.

Differentiation between Candida dubliniensis and Candida albicans by fatty acid

methyl ester analysis using gas-liquid chromatography. J. Clin. Microbiol., 38,

3696-3704.

Peynaud, E.; S., Domerq.1959. A review of microbiological problems in wine-making in

France. Am. J. Enol. Vitic., 10, 69-77.

78


Poncet, S.; R., Montrocher; A., Couble.1992. Electrophoretic isoenzyme patterns of some

yeast strains used in wine industry. Cryptogamie, Mycol., 13, 283-293.

Quesada, M., P.; J., L., Cenis.1995. Use of random amplified polymorphic DNA (RAPD-

PCR) in the characterization of wine yeasts. Am. J. Enol. Vitiv., 46, 204- 208.

Ribéreau-Gayon, J.; E. Peynaud.1960. Traité d'œnologie. Tome Premier. Maturation du

raisin, fermentation alcoolique, vinification. Lib. Polytechnique Béranger, Paris.

Ribéreau-Gayon, P.; D., Dubourdieu; B., Donèche; A., Lonvaud.1998. Traité d’œnologie –

microbiologie du vin, vinifications. Tome 1. Dunod, Paris, 97-141.

Romano, P.; G., Suzzi; G., Comi; R., Zironi.1992. Higher alcohol and acetic acid

production by apiculate wine yeasts. J. Appl. Bacteriol., 73, 126-130.

Rosini, G.; F., Federici; A., Martini.1982. Yeast flora of grape berries during ripening.

Microb. Ecol., 8, 3-89.

Sampaio, A., M.1998. Análise de polimorfismos isoenzimáticos e de DNA com vista à

caracterização de populações Portuguesas de milho (Zea mays L.). Tese de

Mestrado, Universidade do Minho, Braga.

Sampaio, J., P.; M., Gadanho; S., Santos; F., L., Duarte; C., Pais; A., Fonseca; J., W.,

Fell.2001. Polyphasic taxonomy of the basidiomycetous yeast genus

Rhodosporidium: Rhodosporidium kratochvilovae and related anamorphic

species. Int. J. Syst. Evol. Microb. 51, 687-697.

Santos, S.1998. Influência das condições de crescimento nos perfis isoenzimáticos de

leveduras. Tese licenciatura, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologia,

Lisboa.

Santos, S.; F., L., Duarte; C., Pais.1999. Stability of yeast isoenzyme profiles in different

growth conditions. Food Technol. Biotechnol., 37, 263-269.

79


Selander, R., K.; D., A., Caugant; H., Ochman; J., M., Musser, M., N., Gilmour; T.,

Whittam.1986. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial

population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol., 51, 873-884.

Sindenberg, D., G.; M., A., Lachance.1983. Speciation, species delineation, and

electrophoretic isoenzyme patterns of the type strains of Kluyveromyces van der Walt

emend van der Walt. Int. J. Syst. Bacteriol., 33, 822-830.

Sipiczki, M.; P., Romano; G., Lipani; I., Miklos; Z., Antunovics.2001. Analysis of

yeasts derived from natural fermentation in a Tokaj winery. Antonie van

Leeuwenhoek, 79, 97-105.

Smith, M., T.; M., Yamazaki; G., A., Poot.1990. Dekkera, Brettanomyces and Eeniella:

electrophoretic comparison of enzymes and DNA-DNA homology. Yeast., 6, 299-310.

Smith, M., B.; D., Dunklee; H., Vu; G., L., Woods.1999. Comparative performance of the

Rapid Yeast Plus system and the API 20C AUX clinical yeast system.

J. Clin.. Microbiol., 37, 2697-2698.

Sneath, P., H., A.; R., R., Sokal.1973. Numerical taxonomy, the principles and practice of

numerical classification. W. W. Freeman and Company, São Francisco.

Sponholz, W., R.1993. Wine spoilage by microorganisms. In: Wine microbiology and

biotechnology, (G., H., Fleet ed.), 395-420. Harwood academic publishers, Chur.

Stender, H.; C., P., Kurtzman; J., J., Hyldig-Nielsen; D., Sørensen; A., Broomer; K., Oliveira;

H., Perry-O’Keefe; A., Sage; B., Young; J., Coull.2001. Identification of Dekkera

bruxellensis (Brettanomyces) from wine by fluorescence in situ hybridization using

peptide nucleic acid probes. Appl. Environ. Microbiol., 67, 938-941.

Stollarova, V.1992. Populations of yeasts on grapes, Vitis vinifera L., in the vinicity of the

nuclear power station at Mochovce. Biologia Bratislava., 47, 697-701 (abstract).

80


Subden, R., E.; R., Cornell; A., C., Noble.1980. Evaluation of API 20C clinical yeast

identification system for must and wine yeast identification. Am. J. Enol. Vitiv., 31,

364-366.

Subden R., E.; D., Irwin; J., D., Cunningham; A., G., Meiering.1982. Wine yeast isoenzimes.

I. Genetic differences in 18 stock cultures. Can. J. Microbiol., 28, 1047-1050.

Tenreiro, R.2001. In: V curso teórico-prático de Taxonomia molecular. FCUL, Lisboa.

Thomas, S.1993. Yeasts as spoilage organisms in beverages. In: The Yeasts. (A., H., Rose; J.

S. Harrison eds.) , 517-561, 2ª ed., Academic Press, Londres.

Timmins, E., M.; S., A., Howell; B., K., Alsberg; W., C., Noble; R., Goodacre.1998. Rapid

differentiation of closely related Candida species and strains by pyrolysis-mass

spectrometry and Fourier Transform-Infrared spectroscopy. J. Clin. Microbiol., 36,

367-374.

Towner, K., J.; A., Cockayne.1993. Molecular methods for microbial identification and

typing. Chapman & Hall, Londres.

Tredoux, H., G.; J., L., F., Kock; P., M., Lategan; H., B., Muller. 1987. A rapid identification

technique to differentiate between Saccharomyces cerevisiae strains and other yeast

species in the wine industry. Am. J. Enol. Vitiv., 38, 161-164.

van Uden, N., M.; M., Vidal-Leiria.1970. Genus 10, Torulopsis Berlese. In: The yeasts. A

taxonomic study. (Lodder, J. ed.), 1235-1308, North-Holland Pub. Co., Amesterdão.

van der Vossen, J., M.; H., Hofstra.1996. DNA based typing, identification and detection

systems for food spoilage microorganisms: development and implementation. Int. J.

Food Microbiol., 33, 35-49.

van der Walt, J., P.1987. The typological yeast species, and its delimitation. In: The

Yeasts, vol 1. (A., H., Rose; J. S. Harrison eds.), 95-121, 2ª ed., Academic Press,

Londres.

81


van Vuuren, H., J., J.; L., van der Meer.1987. Fingerprinting of yeasts by protein

electrophoresis. Am. J. Enol. Vitiv., 38, 49-53.

Vancanneyt, M.; B., Pot; G., Hennebert; K., Kersters.1991. Differentiation of yeast

speciesbased on electrophoretic whole-cell protein patterns. System. Appl.

Microbiol., 14, 23-32.

Vandamme, P.; B., Pot; M., Gillis; P., de Vos; K., Kersters ; J., Swings.1996. Polyphasic

taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev., 60,

407-438.

Venturin, C.; H., Boze; L., Fahrasmane; G., Moulin; P., Galzy.1994. Influence de la

concentration en glucose et en oxygène sur la capacité fermentaire de la souche

Hanseniaspora uvarum K5 (Niehaus). Sci. Aliments., 14, 321-333.

Yamamoto, N.; N., Yamamoto; H., Amemiya; Y., Yokomori; K., Shimizu; A., Totsuka.1991.

Electrophoretic karyotypes of wine yeasts. Am. J. Enol. Vitic., 42, 358-363.

Yamazaki, M.; K., Komagata.1982. Asporogenous yeasts and their supposed

ascosporogenous states: an electrophoretic comparison of enzymes. J. Gen. Appl.

Microbiol., 28, 119-138.

Yamazaki, M.; S., Goto; K., Komagata.1983. An electrophoretic comparison of the

enzymes of Saccharomyces yeasts. J. Gen. Appl. Microbiol., 29, 305-318.

Yamazaki, M.; C., P., Kurtzman; J., Sugiyama.1998. Electrophoretic comparisons of

enzymes. In: The yeasts, a taxonomic study (Kurtzman, C., P.; J., W., Fell eds.), 4ªed.,

elsevier, Amesterdão.

82

ANEXOS

Anexo I

SOLUÇÕES UTILIZADAS NA ELECTROFORESE DAS ISOENZIMAS

1. Solução de tampão depósito superior (10x)

Tris 0,25 M

Glicina 1,92 M

Após adição dos dois reagentes e água ultrapura, filtrar por papel Whatman nº1 ou 2 a

4ºC.

1.1 Solução de tampão depósito superior

Solução 10x (tampão depósito superior) diluída (1/10) em água ultrapura, com acerto

de pH por solução ácido cítrico 2 M, até pH 8,2.

1.2 Solução de tampão depósito superior – fosfatase ácida

Solução (tampão depósito superior) diluída (1/10) em água ultrapura, com acerto de

pH por solução HCl 30% (p/v) até pH 8,2.

2. Solução de tampão depósito inferior (10x)

Tris-HCl 0,25 M

Acerto do pH 8,3 com uma solução de HCl 30% (v/v) diluir com água ultrapura.

2.1 Solução de tampão depósito inferior

Diluição (1/10) da solução 10x de tampão de depósito inferior, com água ultrapura.

Anexo II

SOLUÇÃO UTILIZADA NA ELECTROFORESE DO DNA

1. Solução TBE (5x)

Tris 0,45 M

Ácido bórico 0,45 M

EDTA 0,001 M

Acerto de pH por adição de solução de HCl 30% (v/v) até pH 8,0; autoclavar.

1.1 Solução TBE (0,5x)

Diluição (1/10) da solução TBE 5x, com água ultrapura esterilizada; autoclavar.

Anexo III

Tabela A.1 – Matriz dos resultados obtidos de todas as estirpes estudas, para tratamento por análise numérica. As bandas de actividade enzimática estão representadas por uma letra, correspondente a cada complexo enzimático (E – EST; L – LDH; A – ADH; F – ACP; G – G6PD), seguida do valor de Rm dessa banda. A presença ou ausência de banda de actividade enzimática é assinalada respectivamente com 1 ou 0.

E0.21 E0.28 E0.32 E0.4 E0.42 E0.48 E0.52 E0.54 E0.58 E0.61 E0.62 E0.63 E0.65 E0.67 E0.68 E0.74 E0.76 E0.78 E0.80 E0.82 E0.84 E0.87 E0.96

365 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0366 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0367 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0368 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0369 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0370 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0371 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0372 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0373 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0374 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0375 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0376 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0377 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0378 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0379 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1380 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0381 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0382 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0383 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0384 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0385 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0386 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0387 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0388 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0389 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0390 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0391 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0392 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0393 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0394 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0395 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0396 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0378a 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0379a 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1381a 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

Anexo III

Tabela A.1 (continuação)

L0.22 L0.24 L0.26 L0.28 L0.32 L0.34 L0.36 L0.38 L0.43 L0.45 L0.47 L0.5 L0.52 L0.54 L0.6 L0.65 0L.67 L0.72

365 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0366 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0367 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0368 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1369 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0370 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0371 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0372 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0373 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0374 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0375 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0376 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0377 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0378 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0379 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0380 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0381 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0382 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0383 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0384 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0385 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0386 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0387 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0388 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1389 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0390 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0391 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0392 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0393 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0394 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0395 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0396 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0378a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0379a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0381a 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Anexo III


A0.18 A0.22 A0.3 A0.32 A0.36 A0.38 A0.42 A0.44 A0.48 A0.5 A0.52 A0.54 A0.56 A0.58 A0.6

365 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0366 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0367 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0368 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0369 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0370 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0371 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0372 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0373 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0374 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0375 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0376 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0377 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0378 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0379 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0380 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0381 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0382 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0383 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0384 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1385 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0386 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0387 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0388 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0389 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0390 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0391 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0392 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0393 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0394 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0395 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0396 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0378a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0379a 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0381a 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

Anexo III


F0.23 F0.25 F0.27 F0.28 F0.33 F0.35 F0.37 F0.39 F0.41 F0.43 F0.48 F0.5 F0.54 F0.56 F0.76 F0.78 F0.8 F0.87

365 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0366 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0367 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0368 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0369 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0370 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0371 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0372 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0373 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0374 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0375 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0376 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0377 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0378 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0379 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0380 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0381 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0382 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0383 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0384 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0385 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0386 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0387 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0388 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1389 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0390 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0391 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0392 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0393 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0394 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0395 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0396 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0378a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0379a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0381a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Anexo III


G0.22 G0.24 G0.3 G0.34 G0.38 G0.4 G0.42 G0.44 G0.45 G0.46 G0.48 G0.5 G0.52 G0.54 G0.58 G0.64 G0.65

365 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0366 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0367 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1368 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0369 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0370 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0371 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0372 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0373 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0374 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0375 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0376 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0377 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0378 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0379 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0380 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0381 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0382 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0383 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0384 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0385 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0386 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0387 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0388 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0389 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0390 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0391 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0392 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0393 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1394 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1395 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0396 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0378a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0379a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0381a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0

Documents

Contributo à Diferenciação de Leveduras com interesse Enológico por Perfis Isoenzimáticos