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Campus Campos-Centro
Curso Técnico em Química
Microbiologia
Ação de diferentes temperaturas sobre os microrganismos
Áurea, Daniele, Flavia e Ingrid. Módulo II – Tarde
Laci Gonçalves Viana
26 de Abril de 2010.
1
Sumário
1- OBJETIVOS................................................................................................................03
2- FUNDAMENTOS TEÓRICOS..................................................................................03
3- MATERIAIS, VIDRARIAS.......................................................................................10
4- EQUIMAMENTOS....................................................................................................11
5- REAGENTES USADOS............................................................................................11
6- MEIOS DE CULTIVO...............................................................................................12
7- AMOSTRA.................................................................................................................12
8- PROCEDIMENTO.....................................................................................................13
9- REAÇÕES..................................................................................................................16
10- CÁLCULOS E RESULTADOS..............................................................................16
11- DISCUSSÕES E CONCLUSÕES..........................................................................17
12-ATIVIDADES DE VERIFICAÇÃO.......................................................................19
13- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................21
2
Ação de diferentes temperaturas sobre os microrganismos
1- OBJETIVOS
Preparar meios de cultivo líquidos e solidificados;
Realizar o plaqueamento dos meios de cultivo solidificados, assim como realizar a
esterilização dos mesmos por autoclavação;
Avaliar as alterações promovidas no meio líquido a partir do crescimento de
microrganismos.
Avaliar o efeito de diferentes temperaturas sobre os microrganismos;
Realizar a técnica do esgotamento do inoculo;
Realizar coloração de Gram.
2- FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Conceito de esporos
Esporos são formas dormentes de uma célula bacteriana e são produzidos por certas
espécies de bactérias em situações de escassez de nutrientes. O esporo é resistente a condições
adversas, incluindo altas temperaturas e solventes orgânicos. A esporulação, processo pelo qual
alguns gêneros de bactérias formam esporos, ocorre quando estas bactérias estão em situações
críticas para sua sobrevivência, ou seja, as condições ambientais são adversas para o crescimento
bacteriano. De maneira geral, isto ocorre quando há falta de nutrientes, como carbono ou
nitrogênio.
Os esporos apresentam-se sob a forma de corpúsculos esféricos ou ovóides, livres ou no
interior da bactéria. Formam-se pela invaginação de uma dupla camada de membrana celular, que
se fecha para envolver um cromossoma e uma pequena quantidade de citoplasma, garantindo a
sobrevivência da espécie. Esta camada é responsável pela resistência à coloração e ao ataque dos
agentes físicos e químicos da esterilização e desinfecção.
Apresentam algumas características, decréscimo na quantidade total de água em
comparação com o estado vegetativo, refratividade, alta resistência a condições ambientais
3
adversas, habilidade de germinar e produzir células vegetativas após longos períodos de
estocagem.
Na fase esporulada, as bactérias não realizam atividade biossintética e reduzem sua
atividade respiratória. Nesta fase também não ocorre multiplicação e crescimento bacteriano.
As bactérias podem permanecer viáveis na forma de esporos durante anos, se mantidos a
temperaturas usuais e em estado seco. Entretanto, assim que o ambiente se torna favorável, estes
esporos podem voltar a se reproduzir e multiplicar.
A estrutura do esporo é constituída de uma primeira camada interna, próximo ao cerne
do esporo – a parede do esporo – composta de peptidoglicano, a qual vai dar origem à parede da
célula vegetativa, por ocasião da germinação. Envolvendo a parede do esporo fica a córtex,
camada espessa, composta de um peptidoglicano diferente que apresenta menos ligações
cruzadas que o peptidoglicano existente na parede da célula que o originou.
Externamente a córtex fica a capa do esporo, estrutura rígida composta de proteína rica
em ligações de dissulfetos intramoleculares; ela confere resistência aos agentes químicos. A
camada mais externa recebe o nome de exósporo e consiste numa membrana lipoprotéica que
contem aminoaçucares.
Tipos de bactérias no solo
Existem vários tipos de microorganismos que habitam o solo e realizam importantes
mudanças bioquímicas. Eles são essenciais para vários processos bioquímicos que reciclam
importantes elementos como o enxofre, o nitrogênio e o carbono.
O solo pode abrigar microorganismos patogênicos, dependendo da natureza do animal,
dos tecidos das plantas e das excretas presentes nas plantas. A maioria destes vive 10 centímetros
acima do solo onde a matéria orgânica está presente.
As bactérias são alguns dos menores e mais abundantes micróbios no solo. Em um único
grama de solo, há bilhões de bactérias, uma estimativa de 60 mil espécies diferentes de bactérias,
a maioria não nomeada, e cada uma têm sua própria função e capacidade.
Algumas espécies de bactérias são muito frágeis e podem ser mortas por pequenas
mudanças no ambiente do solo. Outras espécies são extremamente resistentes, capazes de resistir
a calor severo, frio ou secagem, podendo permanecer dormentes por décadas à espera de
condições favoráveis.
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As bactérias desempenham um papel importante na decomposição de materiais orgânicos,
especialmente nas fases iniciais de decomposição quando os níveis de umidade são elevados.
Bacillus subtilis e Pseudomonas fluorescens são exemplos de bactérias decompositoras.
A bactéria Rhizobium pode ser inoculada em leguminosa semente para fixar nitrogênio no
solo. Estas bactérias fixadoras de nitrogênio vivem em nódulos de raiz em especial as
leguminosas, tais como o trevo, feijão. . Elas extraem gás nitrogênio do ar e o converte na forma
que as plantas podem usar. Esta forma de fixação de nitrogênio pode adicionar o equivalente a
mais de 100 kg de azoto por hectare por ano. Azotobacter, Azospirillum, Agrobacterium,
Gluconobacter, Flavobacterium, Herbaspirillum Gluconobacter, Flavobacterium e
Herbaspirillum são exemplos de bactérias fixadoras de nitrogênio.
Bactérias actinomicetes, incluindo espécies de Nocardia, Streptomyces, e Micronospora
- em milhões por grama estão presentes nos solos secos e quentes. Esses organismos são
responsáveis pelo odor característico de mofo e de terra seca de um campo arado. Os
actinomicetes podem degradar muitas substâncias complexas e, desta forma, são importantes no
melhoramento da fertilidade do solo.
Os actinomicetes são conhecidos pela capacidade de produzir antibióticos em
laboratório, mas quantidades detectáveis de antibióticos são raramente encontradas no solo. E
possível que os antibióticos possam estar presentes e ativos somente em áreas localizadas
imediatamente junto as das células dos actinomicetes.
Técnica de coloração de Gram
O método de coloração de bactérias foi desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans
Christian Joachim Gram, em 1884, que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço
bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina
básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-
negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de
bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-
acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em
meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um
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fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira
idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de
um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com
um solvente orgânico, o etanol-acetona que dissolve a porção lipídica das membranas externas
das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as
células. Nas Gram-positivas o solvente desidrata as espessas paredes celulares e provoca a
contração dos poros da peptidoglicana, tornando-as impermeáveis ao complexo, o corante
primário é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um
corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão
coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.
Deve ter atenção na etapa da descoloração, pois a exposição prolongada ao solvente irá
provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados
falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e
químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e
integridade.
O uso de material fresco é importante, pois células de bactérias Gram-positivas, células
velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o
cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas
como Gram-negativas.
Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento
com etanol-acetona for omitido.
O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de
metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora
muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora
prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por
álcool 95%.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em
laboratórios de microbiologia, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de
amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias
associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou
Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao
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clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de
vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas
podem ser montadas permanentemente e preservadas como documentação.
Bactérias coradas pelo método de Gram
Bactéria Gram-positiva Bacillus brevis
Bactéria Gram-negativa Aeromonas hydrophila
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Tipos de crescimento em meio líquido
Aeróbias, que dependem de oxigênio para conseguir energia e não sobrevivem sem esse
gás.
Anaeróbias facultativas, que podem viver com ou sem oxigênio; se houver oxigênio no
ambiente, podem realizar respiração aeróbia; caso contrário, sobrevivem à custa de processos
anaeróbios, embora a quantidade de energia obtida seja inferior à obtida na respiração aeróbia.
Um exemplo são os lactobacilos, que realizam fermentação láctica, usada na produção de
iogurtes, coalhadas, queijos e outros produtos.
Anaeróbias obrigatórias ou estritas, que não possuem as enzimas necessárias ao
aproveitamento do oxigênio e, por isso, morrem com determinada concentração de oxigênio no
ambiente, porque, ficando livre na célula, esse gás pode danificar moléculas importantes, como o
DNA e as enzimas.
Em condições adversas (temperatura muito alta ou muito baixa, meio muito acido ou
básico, presença de substâncias tóxicas no ambiente, etc.), algumas bactérias formam esporos,
estruturas de parede resistente e com pouca água no citoplasma, nas quais a bactéria permanece
em estado de vida latente, com as funções reduzidas ao mínimo.
Mesófilas, psicrófilas e termófilas
Bactérias mesófilas
Bactérias mesófilas apresentam crescimento ótimo em temperaturas variando entre 25ºC e
40ºC, ou seja, a faixa de temperatura mais comum na superfície da Terra e nos organismos
animais.
A maioria dos patógenos humanos apresenta crescimento ótimo em temperaturas
próximas de 37°C. Bactérias termodúricas, tais como Bacillus cereus, Clostridium botulinum e
Listeria monocytogenes, geralmente vivem como mesófilas, mas podem suportar temperaturas
elevadas por curtos períodos de tempo.
Se o processo de aquecimento de alimentos envasados em recipientes metálicos ou de
vidro for inadequado, tais bactérias podem sobreviver e deteriorar o produto, representando uma
séria ameaça à segurança dos alimentos.
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Bactérias psicrófilas obrigatórias
Bactérias psicrófilas obrigatórias requerem baixas temperaturas para seu crescimento. Um
ótimo crescimento se dá em temperaturas abaixo de 15ºC.
Algumas espécies marinhas toleram temperaturas negativas uma vez que a água do mar
permanece líquida em temperaturas abaixo de 0°C. Tais organismos morrem quando expostos à
temperatura ambiente.
Sua adaptação a baixas temperaturas é devido ao alto conteúdo de ácidos graxos
insaturados em suas membranas. Estas moléculas permanecem fluidas em temperaturas nas quais
membranas contendo ácidos graxos saturados não são funcionais.
A bactéria Bacillus globisporus não cresce em temperaturas
acima de 20°C.
Bactérias psicrófilas facultativas
Bactérias psicrófilas facultativas ou psicrotróficas apresentam crescimento ótimo em
temperaturas abaixo de 20ºC, mas podem crescer, embora mais lentamente, em temperaturas de
refrigerador e têm alta probabilidade de contaminar e estragar produtos resfriados tais como
alimentos (por exemplo, Bacillus cereus) e sangue.
Bactérias termófilas
Bactérias termófilas são aquelas cujas taxas de crescimento ótimo estão entre 50ºC e
60ºC; são encontradas em pilhas de adubo orgânico.
Algumas espécies toleram temperaturas de até 110 °C em fontes termais.
As enzimas dos organismos termófilos apresentam propriedades de termo-estabilidade
que lhes permitem atingir um pico de atividade entre 60ºC e 80ºC. Dentro dessa categoria
encontram-se os organismos termófilos obrigatórios que só crescem em temperaturas acima de
37°C e os termófilos facultativos que podem crescer em temperaturas abaixo de 37° C.
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A bactéria Bacillus stearothermophillus cresce otimamente entre 65 e 75°C, mas pode
apresentar um pequeno crescimento e deteriorar alimentos em temperaturas em torno de 30°C.
Os esporos dessa bactéria são utilizados para controlar o funcionamento de autoclaves em
laboratórios de microbiologia.
Dentre os termófilos obrigatórios encontram-se as bactérias hipertermófilas que
apresentam crescimento ótimo em temperaturas em torno e acima dos 85°C. Há apenas três
gêneros de bactérias hipertermófilas: Aquifex, Thermocrinis e Thermotoga.
Nenhum psicrófilo sobrevive no corpo humano.Do ponto de vista prático, altas e baixas
temperaturas são utilizadas para evitar o crescimento de microrganismos.
A refrigeração de alimentos a 4°C impede o sua deterioração por organismos psicrófilos e
pela maioria da bactérias. Mas, em casos de armazenamento por longos períodos de tempo, e se o
material suportar congelamento, a temperatura ideal é 30°C negativos.
Altas temperaturas são utilizadas para esterilização de materiais, como aqueles utilizados
em laboratórios e na prática médica.
3- MATERIAIS, VIDRARIAS
Erlenmeyer de 250 mL;
2 Beckers de 250 mL;
4 estantes de tubos de ensaio;
Pinça;
Bucha de algodão hidrofóbico;
7 tubos de ensaios com tampa;
Fósforo;
2 suportes para lâminas;
Bico de Bunsen;
4 Placas de Petri;
4 alças de nichrome;
8 Lâminas;
Papel de filtro;
Tripé;
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Pipeta graduada 10 mL;
Pêra de sucção ou repipetador de plástico com três vias;
Berço de coloração de lâminas;
4- EQUIMAMENTOS
Estufa bacteriológica Olidef CZ 220V – 37ºC;
Microscópio óptico binocular 110V;
Geladeira;
Autoclave;
5- REAGENTES USADOS
Solução salina (NaCl) 0,5 %m/v;
Óleo de cedro (imersão);
Soluções para a coloração de Gram:
I. Cristal violeta: (segundo Hucker) - corante de Gram
a) Cristal violeta 4g
Álcool a 95o 20mL
b) Oxalato de amônio 0,8g
Água destilada 300mL
Para uso, misturar partes iguais de a e b.
II. Lugol - Mordente
a) Iodo metálico 1g
Iodeto de potássio 2g
Água destilada 300mL
III. Descorante - Diferenciador
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a) Álcool etílico a 95o ou partes iguais de acetona e álcool etílico
IV. Fucsina - Contracorante
a) Fuscina básica 0,3g
Álcool a 950 10mL
b) Fenol fundido 5mL
Água destilada 95mL
Para uso, mistura a e b e diluir a 1:10
6- MEIOS DE CULTIVO
Meio sólido
APC – Agar para contagem de microorganismos em placas
Composição g/L
Peptona de caseína 5,0 (fonte de proteína)
Extrato de levedura 2,5 (fonte de vitaminas)
Glicose 1,0 (fonte de carbono e energia)
Agar bacteriológico 15,0 (meio solidificante)
Meio Liquido
Extrato de levedura (nitrogênio)
25g – 1000ml
7- AMOSTRA
Solo 10g;
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8- PROCEDIMENTO
A- Plaqueamento
Derramar o meio de cultivo na quantidade necessária para cobrir o fundo da
placa de Petri (em torno de 20 mL);
Deixar as placas à temperatura ambiente para que haja solidificação (15 min);
Armazenar as placas já embrulhadas em geladeira (+ ou – 4º C) até posterior
utilização;
B- Inoculação da amostra
Transferir 10g de terra de jardim para o caldo nutritivo armazenado em
Erlenmeyer.
Agitar a mistura por 5 minutos e em seguida, deixar o Erlenmeyer em repouso
por mais 5 minutos.
Utilizando manobra asséptica, transferir 10mL da mistura preparada para 5 tubos
de ensaio previamente esterilizados.
Etiquetar os tubos de ensaio, colocando no rótulo o nome dos alunos, número do
tubo e o volume transferido.
C- Ação de diferentes temperaturas sobre microrganismos
O tubo número I deverá ficar a temperatura ambiente até a próxima aula.
O tubo II deverá ser fervido por 5 minutos em banho-maria e em seguida deverá
ser colocado a temperatura ambiente até a próxima aula.
O tubo III deverá ser autoclavado e em seguida, deverá ser exposto a
temperatura ambiente até a próxima aula.
O tubo IV deverá ir para estufa bacteriológica regulada a 60º C e vai
permanecer nesta temperatura até a próxima aula.
O tubo V irá para a geladeira e lá permanecerá até a próxima aula.
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D- Interpretação do crescimento em caldo nutritivo
Arrumar os tubos de ensaio na estante tendo o cuidado de não agitá-lo. Coloque-
os na ordem crescente numérica.
Comparar os cinco tubos e anotar a ordem crescente de turbidez, película e
avalie o odor após o crescimento microbiano.
Verificar também se houve alteração da cor do meio.
E- Inoculação pela técnica do esgotamento do inóculo
Flambar a alça de Nichome e deixá-la próxima à chama do bico de Bunsen.
A placa de Petri contendo o meio de cultivo a ser inoculado deve ser dividida, ou
mentalmente ou por intermédio do lápis dermográfico (fundo da placa), em quatro quadrantes.
Utilizando a técnica asséptica, coletar uma alçada do material a ser inoculado e,
mantendo a placa de Petri próxima à chama, "riscar" de maneira ordenada, em zigue-zague, sem
ferir o meio, o 1º quadrante, esgotando o conteúdo de microrganismos da alçada na superfície do
meio solidificado.
Imediatamente, tocando-se no zigue-zague do 1º quadrante com a alça,
realizaremos o segundo e assim sucessivamente, até a realização do último quadrante.
Após incubação deste material durante 48 horas a temperatura ambiente
poderemos visualizar colônias isoladas umas das outras atingindo o nosso objetivo que é a
multiplicação a partir de 1 microrganismo e a colônia só possui indivíduos geneticamente
idênticos, isto é, toda a descendência igual.
F- Observação macroscópica das colônias
Em região asséptica, observar as placas de Petri inoculadas. Começar
observando a placa com amostra do tubo I, verifique quantas colônias diferentes aparecem nesta
placa.
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Anote suas características (forma, elevação, cor, tamanho e brilho) e prepare
uma lâmina de cada colônia diferente. Repita o procedimento acima para as demais placas. Não
há necessidade de realizar esfregaços de colônias que se repetem em mais de uma placa.
Fixar as lâminas, identificá-las e em seguida realizar a coloração de Gram.
G- Coloração de Gram
O método consiste em adicionar à lâmina contendo os esfregaços, as seguintes
substâncias, observando a ordem:
1. Solução de cristal violeta - cobrir todo o esfregaço e deixar por 1 minuto. A seguir, lavar com
água corrente.
2. Lugol - (mordente): cobrir todo o esfregaço e deixar por 1 minuto. A seguir, lavar com água
corrente.
3. Álcool-acetona - (diferenciador): lavar a lâmina por 15 segundos e em seguida lavar com
água.
4. Fucsina - (contra-coloração): cobrir todo o esfregaço, deixar por 30 segundos e
lavar com água corrente para retirar o excesso de corante.
Terminada a coloração de Gram, deixar a preparação secar ao ar e observar ao
microscópio com objetiva de imersão (100 x de aumento).
H-Técnica de observação por imersão:
Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;
Fixar a lâmina na platina;
Mover a lâmina com o auxílio do charriot de forma que o óleo de imersão fique
na direção da objetiva;
Girar o revólver e posicionar a objetiva de 100x;
Olhando pela lateral, girar o macrométrico até que a objetiva mergulhe no óleo
de cedro e encoste na lâmina;
Girar o macrométrico no sentido contrário até achar o foco inicial;
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Se necessário mova o charriot para analisar toda a lâmina;
Ao final da observação limpe a objetiva com solvente apropriado (Xileno ou
álcool/eter).;
9- REAÇÕES
Não houve reações nesta prática.
10- CALCULOS E RESULTADOS
Observação do crescimento de microorganismos nos tubos
I- Temperatura ambiente
II- Fervura/temperatura ambiente
III- Autoclave
IV- Estufa bacteriológica 60ºC
V- Geladeira
Tubo Turvação Película Odor Outros aspectos observados
I + + + + + + + + + Houve crescimento em todo o tubo:
Bactérias aerófilas facultativas
II + - + + Crescimento do meio do tubo para
baixo: Bactérias micro-aerófilas
III - - - Não houve crescimento.
IV + + - + Crescimento em todo o tubo:
Bactérias aerófilas facultativas
V - - - Não houve crescimento.
Legenda:
+ + + Muito
+ + Médio
+ Pouco
– Nenhum
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Esfregaço Tubo Forma Arranjo Gram
1 I Bacilos Paliçada Positovo
2 Cocos Estafilococos Negativo
3 Bacilos e esporos Isolados Negativo
4 Bacilos e esporos Isolados Negativo
Esboço das visualizações:
11- DISCUSSÕES E CONCLUSÕES
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microorganismos. Estes meios
fornecem os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutritivas
estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais minerais. Alguns
microorganismos também necessitam de fatores de crescimento que são substâncias que eles não
podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos etc.
Outras condições inerentes ao meio de cultura necessário ao desenvolvimento são as
condições de pH, pressão osmótica e grau de umidade.
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As bactérias representam a maior parte da população microbiana do solo, tanto em
quantidade e quanto em variedade. Pela contagem por meio de cultura em placa de uma amostra
fornece apenas uma fração desse numero(milhões).
A quantidade e os tipos de microorganismos no solo dependem de muito fatores
ambientais:
1.Quantidade e tipo de nutrientes disponíveis.
2.Umidade disponível.
3.Grau de aeração.
4.Temperatura.
5.pH
6.Praticas e eventos que podem introduzir grande numero de microorganismos no solo,
como a aplicação de adubos ou dejetos de esgoto e a ocorrência de enchentes, ou aqueles que
podem remover os microorganismos, como as tempestades de poeiras.
O esporo bacteriano é uma célula de parede espessa formada no interior de algumas
bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e a outros agentes químicos e físicos; é capaz
de permanecer o estado latente por longos períodos e, em seguida, dando origem a uma nova
célula vegetativa.
A finalidade da coloração é facilitar a observação microscópica das bactérias e
diferenciá-las de acordo com suas características tintoriais.
Em todo método de coloração há vários fatores que podem influenciar nos resultados
como, por exemplo, o pH das soluções de lavagem, a limpeza das lâminas, a pureza dos
reagentes, o modo de preparação do corante e mesmo o tempo dispendido na preparação desse
corante.
A coloração de Gram é muito utilizada por que a maioria das bactérias cora-se por este
método, permitindo observar sua morfologia e fornecendo informações a respeito do
comportamento do material celular diante de corantes básicos (corantes de Gram).
Foi observado que apenas um tubo conteve crescimento de microorganismos Gram-
positivos. Este mesmo tubo apresentou película – formação de esporos – forte odor e crescimento
uniforme. Conclui-se que este teve melhores condições de temperatura e pH, além de nutrientes.
18
12-ATIVIDADES DE VERIFICAÇÃO
a) Por que precisamos ferver os meios solidificados?
Para que o Agar se dissolva uniformemente em todo o meio.
b) Agar é um nutriente utilizado pelos microrganismos?
Não. O Agar é apenas um meio solidificante.
c) Como sabemos que há crescimento de microrganismos em meio líquido e solidificado?
Basta observarmos a aparência do meio. Em meios líquidos, a turvação e odor são
características aparentes, já em meios sólidos a mudança de cor do meio e a aparição de
colônias nos garantem crescimento.
d) Qual a diferença básica entre preparo de meio de cultivo líquido e preparo de meio de
cultivo solidificado?
A diferença é que o meio líquido não precisa ser aquecido, pois não contém Agar a ser
dissolvido, o que ocorre com o meio solido.
e) Qual a função do banho-maria nesta prática?
O banho-maria serve para evitar que o meio em preparo entre em ebulição e não dissolva
completamente o Agar, também para que o Agar não concentre caso superaqueça.
f) Por que não devemos aquecer o meio solidificado em excesso?
Para evitar que o meio fique concentrado.
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g) Qual a finalidade de realizarmos a técnica do esgotamento do inóculo?
Para que possamos conseguir colônias isoladas com microorganismos geneticamente
idênticos.
h) Quanto à temperatura de crescimento, a espécie é termófila, mesófila ou psicrófila?
Mesófila
i) Defina inoculação.
Inoculação é a introdução de um microorganismo em um meio a fim de conseguir
produzir uma colônia com microorganismos geneticamente idênticos.
j) Definir esfregaço e alçada.
Esfregaço é uma leve camada de matéria orgânica colocada sobre lâmina de vidro para ser
examinada ao microscópio.
Alçada é a retirada de uma parte da cultura para a inoculação em outro meio ou para
visualização.
k) Citar os critérios de segurança a serem observados quanto à realização do esfregaço.
O esfregaço deve sempre ser feito próximo a zona de assepsia do bico de Bunsen. Deve-
se flambar a alça de Nichrome constantemente, a fim de evitar contaminações.
l) Em que se baseia o método de Gram?
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de
bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-
acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
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13- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Sites
http://ube-164.pop.com.br/repositorio/4488/meusite/micro/ microbiologia_pratica2.htm#Coloração de Gram
Dia: 30/04/2010 http://translate.google.com/translate?hl=pt-BR&langpair=en%7Cpt&u=http://
www.dpi.nsw.gov.au/__data/assets/pdf_file/0017/41642/Soil_bacteria.pdfDia: 02/05/2010
http://www.ucg.br/ACAD_WEB/professor/SiteDocente/admin/arquivosUpload/3909/ material/Crescimento%20Populacional%20de%20Bact%C3%A9rias.pdf
Dia: 02/05/2010 http://www.knoow.net/ciencterravida/biologia/esporulacao.htm#vermais
Dia: 26/04/2010 http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/
bacterias.htmDia: 26/04/2010
http://ube-164.pop.com.br/repositorio/4488/meusite/micro/esporulacao.htm Dia: 26/04/2010
http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/chapter_1_bp.htm Dia: 26/04/2010
http://www.hospvirt.org.br/enfermagem/port/esporo.htm Dia: 26/04/2010
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2004/microorganismos/ BACTERIAS.htm
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www.dpi.nsw.gov.au/__data/assets/pdf_file/0017/41642/Soil_bacteria.pdfDia: 26/04/2010
Livros
Ribeiro, Mariangela Cagnoli; Microbiologia prática: Roteiro e manual. Editora
Atheneu. Rio de Janeiro, 1993, p. 5 a 39.
PELCZAR, M.J.,CHAN ,E.C.S., KRIEG,N.R. Microbiologia: Conceitos e
aplicações.2.ed.São Paulo: MAKRON Books, 1996, p.
21