UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos

Tese

TERMOINATIVAÇÃO DE POLIFENOLOXIDASES E PEROXIDASES E

DESTRUIÇÃO TÉRMICA DE LEVEDURAS EM PURÊ DE PÊSSEGO DA

CULTIVAR JUBILEU

ANDRÉA MENEZES LOPES

PELOTAS, 2013.

i

ANDRÉA MENEZES LOPES

Bacharel em Química de Alimentos

M. Sc. em Engenharia e Ciência de Alimentos

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência e Tecnologia de

Alimentos da Universidade Federal de Pelotas,

como requisito parcial à obtenção do título de

Doutor em Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Comitê de orientação:

Prof. Dr. César Valmor Rombaldi (FAEM/DCTA)

Prof. Dr. Pedro Luis Antunes (in memorian)

Prof. Dr. Ricardo Peraça Toralles

Pelotas, 2013.

ii

Banca examinadora

_________________________________________________

Prof. Dr. César Valmor Rombadi (DCTA -UFPEL)

__________________________________________________

Prof. Dr. Carlos Prentice Hernandez (EQA- FURG)

___________________________________________________

Prof. Dra. Leonor Almeida de Souza Soares (EQA-FURG)

__________________________________________________

Prof. Dr. Ricardo Peraça Toralles (IF - Sul)

_________________________________________________

Prof. Dr. Rui Carlos Zambiazi (DCTA - UFPel)

iii

A minha mãe Marlene Menezes Lopes, que

mesmo ausente fisicamente continua sendo

minha maior incentivadora, dedico!

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela minha vida!

A minha famíla: a princesinha Marina, minha filha, uma criança que transborda alegria

e me fez entender o verdadeiro sentido do amor incondicional. Em especial ao meu

amor, meu marido Everton, que sempre esteve ao meu lado, pelo amor, apoio,

conselhos e compreensão em todos os momentos de ausência. Aos meus pais Paulo e

Marlene, meus maiores amigos, meus amores e minha inspiração, por terem feito tudo

que estava ao alcance para me ajudar sempre, por me encaminharem na vida com

tanto carinho e paciência, respeito e valores. Agradeço-os por me ensinarem, corrigirem

e incentivarem. Ao meu irmão Paulo André, pelo carinho, apoio, incentivo e por ter sido

fonte de inspiração. Sem vocês nenhuma conquista valeria a pena!

Aos meus sogros Alvanir e Neuza e a bisa Norma, por sempre me incentivarem!

Ao Prof. Ricardo Toralles, o meu reconhecimento pela oportunidade de realizar este

trabalho; pela orientação e amizade, meu respeito e admiração pela sua serenidade e

conhecimentos.

Ao Prof. Pedro Antunes (in memorian), pelo estímulo no desenvolvimento deste

trabalho.

Ao Prof. Cesar Rombaldi, pela orientação e pelos ensinamentos transmitidos.

A bolsista Verônica, pela sua dedicação, sem a qual não teria desenvolvido este

trabalho.

As alunas Ísis e Priscila, obrigada pela ajuda!

A minha amiga Lorena pelo incentivo, amizade e disponibilidade em sempre me ajudar.

Aos colegas do Departamento de Quimica do IF-Sul, por porporcionarem a realização

das análises.

Aos colegas da FURG pela compreensão e incentivo.

v

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1.1 Parâmetros de inativação da PPO e POD de pêssego cv. Jubileu 46

Tabela 2.1 Caracterização físico-química do purê de pêssego cultivar Jubileu 63

Tabela 2.2 Parâmetros A e B da curva padrão do ácido pirúvico usando DNF 65

Tabeal 2.3 Constantes de inativação térmica 74

Tabela 2.4 Valores D para S. cerevisiae comercial 75

Tabela 2.5 Valores D para levedura isolada do purê de pêssego 76

Tabela 2.6 Valores de D e Z para inativação térmica de S. cerevisiae 77

vi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Pêssego cultivar Jubileu. 7

Figura 2 Estrutura da enzima polifenoloxidase 9

Figura 3 Reação de oxidação catalítica, pela PPO, do monofenol e ortodifenol produzindo o-quinona 11

Figura 4 Estrutura da enzima peroxidase 13

Figura 5 Esquema da reação na qual a enzima peroxidase converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol (composto colorido) 13

Figura 6 Saccharomyces sp observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x 18

Figura 7 Termoinativação da S. cerevisiae em glicose para diferentes tempos de

quecimento 20

Figura 1.1 Termoinativação da polifenoloxidase em catecol. 43

Figura 1.2 Termoinativação da peroxidase em guaiacol. 44

Figura 1.3 Gráfico de Arrhenius da constante de velocidade de termoinativação da PPO e POD. 45

Figura 1.4 Simulação da desnaturação da PPO Jubileu e Granada 47

Figura 2.1 Transformação da glicose em etanol 56

Figura 2.2 Placa com colônias típicas de leveduras 59

Figura 2.3 Esquema da inativação térmica da levedura 61

Figura 2.4 Curva padrão do ácido pirúvico 65

Figura 2.5 Efeito do pH no acúmulo de ácido pirúvico durante a fermentação da glicose por S. cerevisiae a 300C 66

Figura 2.6 Efeito da temperatura no acúmulo de ácido pirúvico durante a fermentação da glicose por S.cervisiae em pH 8,0 67

Figura 2.7 Cromatograma etanol e acetaldeído em pH 5,0 68

Figura 2.8 Efeito do pH na produção de etanol e acetaldeido 69

Figura 2.9 Termoinativação da Sacharomyces cerevisiae comercial 70

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vii

Figura 2.10 Termoinativação da levedrua isolada do purê de pêssego cv. Jubileu 71

Figura 2.11 Placas com colônias típicas de fungos 72

Figura 2.12 Comparação de K entre a S. cerevisie comercial, a levedura isolada do purê de pêssego e as enzimas PPO e POD 73

Figura 2.13 Determinação de Z para levedura comercial 75

Figura 2.14. Determinação de Z para levedura isolada de purê de pêssego 76

viii

NOMENCLATURA

A Fator pré-exponecial

Ao Atividade inicial da enzima

At Atividade após o tempo de aquecimento

ANOVA Análise de variância

AR Atividade Relativa

BDA Batata, dextrose, ágar

BM Banho- maria

oBrix Graus Brix

cm Centímetros

Co Concentração inicial do microrganismo

Ct Concentração após tempo de aquecimento

cv Cultivar

D Tempo de redução decimal

DFH Dinitrofenilhidrazina

Ea Energia de ativação

oC Graus celsius

g Gramas

GC Cromatografia gasosa

h Horas

ha hectares

HMF hidroximetilfurfural

k Constante de velocidade de inativação de primeira-ordem

K Kelvin

Kg kilograma

Km Constante de Michaelis-Menten

KJ kilojoule

L litro

LD Limite de detecção

LQ Limite de quantificação

ix

log Logarítmo em base dez

ln Logarítimo neperiano

mL mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

M Molar

min Minutos

N Normalidade

nm nanômetro

PDC Piruvatodescarboxilase

PME Polimetilgalacturonase

PPO Polifenoloxidase

POD Peroxidase

PVP Polivinilpirrolidona

R Constante universal dos gases

s Segundos

S Substrato

SS Sólidos solúveis

SS/AT Sólidos solúveis por acidez titulável

T Temperatura

t1/2 Tempo de meia-vida

TCA Ácido tricloroacético

U Unidades

UFC Unidade Formadora de Colônia

UV Ultravioleta

Vmax/Km Coeficiente de especificidade

Z Temperatura para reduzir 10 vezes valor D

x

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ........................................................................................... iv

ÍNDICE DE TABELAS ...........................................................................................v

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................... vi

NOMENCLATURA ............................................................................................. viii

SUMÁRIO ..............................................................................................................x

Resumo........... ................................................................................................... xiii

Abstract.. ............................................................................................................. xv

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1

1.1 Hipótese ...................................................................................................... 3

1.2 Objetivos ..................................................................................................... 3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 5

2.1 Pêssego ...................................................................................................... 5

2.2 Enzimas do escurecimento do pêssego ...................................................... 8

2.2.1 Polifenoloxidases .................................................................................... 8

2.2.2 Peroxidases ........................................................................................... 11

2.2.3 Atividade enzimática .............................................................................. 13

2.2.4 Inativação enzimática ............................................................................ 13

2.3 Purê e néctar de Pêssego ......................................................................... 14

2.3.1 Padrões de identidade e qualidade ........................................................ 14

2.3.2 Purê de pêssego .................................................................................... 15

2.4 Microflora presente ................................................................................... 16

2.4.1 Fermentação alcóolica ........................................................................... 18

2.4.2 Modelo linear para D e Z ...................................................................... 18

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 21

xi

CAPíTULO 1 _____________________________________________________

TERMOINATIVAÇÃO DAS ENZIMAS PPO E POD EM PURÊS DE PÊSSEGO

DA CULTIVAR JUBILEU .................................................................... 31

Resumo... ........................................................................................................... 31

Abstract... ........................................................................................................... 32

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 34

2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 36

2.1 Frutas ........................................................................................................ 36

2.2 Preparo do pó-de-proteína ........................................................................ 36

2.3 Preparo do extrato enzimático .................................................................. 36

2.4 Estudo da atividade da polifenoloxidase e da peroxidase ......................... 37

2.5 Estabilidade térmica, parâmetros de Arrhenius e tempo de meia-vida. .... 38

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 39

3.1 Inativação térmica da PPO e POD ............................................................ 39

4. CONCLUSÕES .............................................................................................. 45

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 46

CAPíTULO 2 _____________________________________________________

DESTRUIÇÃO TÉRMICA DA Sacharomyces cerevisiae COMERCIAL E DAS

LEVEDURAS ISOLADAS DE PURÊ DE PÊSSEGO CV. JUBILEU.. 50

Resumo . ............................................................................................................ 51

Abstract.... .......................................................................................................... 51

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 52

2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 54

2.1 Matéria-prima ............................................................................................ 54

2.2 Isolamento da levedura ............................................................................. 55

2.3 Curva padrão do ácido pirúvico ................................................................. 56

2.4 Efeito do pH e temperatura na produção do ácido pirúvico....................... 56

2.5 Quantiticação dos metabólitos intermediários na fermentação ................. 57

2.6 Estudo da estabilidade térmica ................................................................ 57

xii

2.6.1 Saccharomyces cerevisiae comercial .................................................... 57

2.6.2 Levedura isolada do purê de pêssego .................................................. 58

2.7 Determinação de D e Z ............................................................................. 59

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 60

3.1 Caracterização do purê ............................................................................. 60

3.2 Curva padrão de ácido pirúvico ................................................................ 60

3.3 Efeito do pH na produção de etanol e acetaldeído ................................... 64

3.4 Inativação térmica da S. cerevisiae comercial e de levedura isolada de

pêssego .......................................................................................................... 66

3.5 Determinação de D e Z ............................................................................. 71

4 CONCLUSÃO .................................................................................................. 75

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 76

Comentários finais .............................................................................................. 79

APÊNDICE A ...................................................................................................... 80

APÊNDICE B ...................................................................................................... 90

APÊNDICE C ..................................................................................................... 93

ANEXO A.... ....................................................................................................... 98

xiii

RESUMO

LOPES, Andréa Menezes. Inativação térmica da polifenoloxidase, peroxidase e leveduras em purê de pêssego da cultivar Jubileu. 2013. 115f.

Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustiral. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

A polifenoloxidase (PPO) e A peroxidase (POD) são responsáveis pelo

escurecimento enzimático em pêssegos. Por outro lado, a Saccharomyces

cerevisiae, quando não devidamente inativada durante a pasteurização, pode

provocar a fermentação do purê basicamente em duas etapas chaves: a

transformação do açúcar em piruvato e a do piruvato em etanol. O conhecimento

da termoestabilidade dessas enzimas e da S. cerevisiae é muito importante para

branqueamento e pasteurização de polpas, purês e néctares. A cv. Jubileu é

amplamente cultivada no Sul do RS e tem características sensoriais favoráveis

para elaboração de purês e derivados. Entre a PPO, POD e leveduras da cultivar

Jubileu, o objetivo foi definir um indicador de termoinativação determinando-se

os parâmetros: constante de velocidade de inativação (k), energia de ativação

(Ea), tempo de meia-vida (t1/2) e tempo de redução decimal (D). Para esta

finalidade, implantaram-se três experimentos consecutivos. No primeiro

experimento, as enzimas PPO e POD foram extraídas usando o método do pó-

de-proteína, purificação parcial pela precipitação com (NH4)2SO4 seguido de

diálise. A atividade enzimática foi determinada por medida do incremento na

absorbância a 420 nm para PPO e 470 nm para POD, utilizando um

espectrofotômetro Varian. A análise cinética dos resultados sugere que a

desnaturação térmica foi bem descrita por um modelo cinético de primeira

ordem, e a dependência da temperatura foi significativamente representada pela

lei de Arrhenius. As constantes cinéticas para PPO variaram de 6,4. 10-4 até 5,5.

10-2 s-1 na faixa de temperatura de 50-90oC e Ea de 111,1 kJ.mol-1. Para POD de

3,6.10-3 até 1,9.10-2 s-1 entre 50-650C e com Ea de 97,2 kJ.mol-1. No segundo

experimento, foi estudado o efeito do pH e temperatura na produção de ácido

pirúvico, durante a fermentação por S. cerevisiae comercial. O conteúdo de

ácido pirúvico foi determinado por colorimetria usando dinitrofenilhidrazina.

Também estudou-se o efeito do pH na produção de etanol e acetaldeído, os

xiv

quais foram determinados por cromatografia gasosa. Com base nos resultados

de pH e temperatura ótimas de fermentação para S. cerevisiae comercial

estudou-se a termoinativação de levedura isolada de pêssego cv. Jubileu,

usando a comercial como testemunha. Finalmente, nas condições estudadas a

S. cerevisiae comercial desenvolveu ótima condição de fermentação em pH 5,0

a 300C, decorrente da baixa concentração de ácido pirúvico e alta concentração

de etanol. A S. cerevisiae foi mais termoestável do que a levedura isolada do

purê de pêssego. Os valores D 600C em pH 5,0 foram de 1,53 e 1,87 min para a

S. cerevisiae comercial e a levedura isolada do purê de pêssego,

respectivamente. Ambas as leveduras demonstraram-se menos termoestáveis

que as enzimas PPO e POD da cv. Juibileu. Os resultados demonstram que

cultivares diferentes de pêssego não podem ter os mesmos parâmetros de

tempo e temperatura no branqueamento e na pasteurização.

xv

ABSTRACT

LOPES, Andréa Menezes. Thermal inactivation of polyphenoloxidase, peroxidase and yeast in peach puree cv. Jubileu. 2013. 115f. Thesis - Graduate Program in Agroindustrial Science and Technology. Federal University of Pelotas, Pelotas.

The polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) are responsible for

enzymatic browning in peaches. Moreover, Saccharomyces cerevisiae, when not

properly inactivated during the pasteurization, can cause fermentation of the

puree basically in two key steps: transformation of sugar into pyruvate and of

pyruvate into ethanol. Knowledge of thermostability of these enzymes and of S.

cerevisiae is very important for the bleaching and pasteurization of pulps, purees

and nectars. The cv. Jubileu is widely cultivated in southern Rio Grande do Sul,

Brazil, and has sensory characteristics favorable for the elaboration of purees

and derivatives. Among PPO, POD and yeast of the cultivar Jubileu, the objective

was to define an indicator of thermoinactivation determining the parameters:

inactivation rate constant (k), activation energy (Ea), half-life time (t1/2) and

decimal reduction time (D). For this purpose, were implanted three consecutive

experiments. In the first experiment, the enzymes PPO and POD were extracted

using the method of acetone powder, partial purification by precipitation with

(NH4)2SO4 followed by dialysis. The enzymatic activity was determined by

measuring the increase in absorbance at 420 nm for PPO and 470 nm for POD,

using a Varian spectrophotometer. Kinetic analysis of the results suggests that

the thermal denaturation was well described by a first order kinetic model, and

the temperature dependence was significantly represented by the Arrhenius law.

The kinetic constants for PPO varied from 6,4. 10-4 to 5,5. 10-2 s-1 in the

temperature range of 50-90oC and Ea of 111,1 kJ.mol-1. For POD from 3,6.10-3 to

1,9.10-2 s-1 between 50-650C and with Ea of 97,2 kJ.mol-1. In the second

experiment, we studied the effect of pH and temperature on ethanol production

and pyruvic acid, during fermentation by commercial S. cervisiae. The pyruvic

acid was determinate by colorimetry using dinitrophenylhydrazine. We also

studied the effect of pH on ethanol production and acetaldehyde by gas

xvi

chormatograph. Based on the results of pH and temperature optimum

fermentation to s. cerevisiae comercial was studied the thermal resistence yeast

isolated from peach puree cv. Jubileu, using commercial as witness. Finally,

under the conditions studied it commercial Saccharomyces cerevisiae developed

great condition of fermentation at pH 5.0 at 30oC, due to the low concentration of

pyruvic acid and high ethanol concentration. The s. cerevisiae was more

thermostable than the yeast isolated from peach puree. The D60-values in buffer

at pH 5 were 1,53 and 1,87 min for the comercial Sacharomyces cerevisiae and

yeats isolated from spoiled Jubileu peach puree, respectively. Both yeasts were

less than thermostable enzymes PPO and POD of the cv. Jubileu. The results

demonstrate that different peach cultivars may not have the same type of

blanching and pasteurising.

xvii

1

1. INTRODUÇÃO

O pêssego é uma fruta climatérica da espécie Prunus persica (L.)

Batsch, originária da Ásia. Sua expressiva produção comercial no mundo,

geralmente, localiza-se em regiões de clima temperado, entre as latidudes

30oN e 45oS (SCORZA, 2005). É a oitava fruta mais produzida no mundo, com

15,4 milhões de toneladas, e é uma das frutas mais consumidas in natura

(FAO, 2010) .

A produção brasileira de pêssego em 2010 foi de 239.149 toneladas

produzidas em uma área cultivada de 21.326 hectares, com produtividade de

11.2Kg.ha-1. Analisando o período de 2000 a 2008, observa-se a média de

produção de 215000 toneladas anuais, com área de 23.098 hectares e

produtividade média de 9.3Kg.ha-1(IBGE, 2010).

Segundo dados do IBGE (2010), o Rio Grande do Sul foi o maior

produtor nacional, respondendo por 65% da safra de pêssego. De acordo com

o Sebrae (2009), a produção da safra 2008/2009 no município de Pelotas (RS)

atingiu 55 mil toneladas, 10% superior a safra 2007/2008.

A maior parte da produção nacional, tradicionalmente, destina-se ao

processamento de pêssegos em calda, geléias e doces em massa, mas, existe

um grande potencial de crescimento de mercado, tanto em termos da fruta in

natura como na forma de purê, néctar e suco de pêssego clarificado

(VENDRUSCOLO e VENDRUSCOLO, 2003).

O valor de comercialização do pêssego é reflexo da demanda e de sua

apreciação pelo consumidor, bem como de sua adaptabilidade para a indústria.

A compreensão de que os frutos de algumas cultivares são mais valorizados e

que esta valoração pode estar relacionada com as características de gosto e

sabor, possibilita o estabelecimento de uma estratégia de comercialização,

visando ao aumento do consumo e da receita do produtor (ALMEIDA ,2006).

Suas peculiaridades de sabor e aroma resultam do equilíbrio de

açúcares, ácidos orgânicos, compostos fenólicos, carotenóides e compostos

2

voláteis, fazendo do pêssego uma fruta muito apreciada e de grande

importância comercial, incluindo “commodities” derivadas da cadeia produtiva

(CRISOTO et al., 1998; GIL et al., 2002; VERSARI, 2002).

O purê de pêssego é uma “commodity” usualmente comercializado no

mercado internacional, entre 30-32oBrix, e é usado para elaboração néctares,

sucos, sorvetes, geléias, espumantes, vinho e produtos reestruturados (LUH,

1980; MCHUGH, 1996). A concentração de purês visa aumentar a vida-de-

prateleira, reduzir o custo de transporte e facilitar a comercialização (DEUEL e

PLOTTO, 2010).

Além das alterações devidas à ação de microorganismos, o purê de

pêssego também pode ser modificado em função das enzimas presentes. A

polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) são responsáveis pelo

escurecimento enzimático em pêssegos. Por outro lado, Saccharomyces

cerevisiae, quando não devidamente inativada durante a pasteurização, pode

provocar a fermentação do purê basicamente em duas etapas chaves: a

transformação do açúcar em piruvato e a do piruvato em etanol (TORALLES et.

al., 2011; GARZA et.al, 1994). O conhecimento da termoestabilidade da PPO

e POD e da S. cerevisiae é muito importante para definir as condições de

branqueamento e pasteurização de polpas, purês e néctares.

Os tratamentos térmicos comercialmente usados no processamento de

frutas e vegetais são pouco efetivos para uma inativação irreversível

principalmente da peroxidase. O efeito da termoinativação enzimática é função

do tempo e termperatura utilizados. (VALDERRAMA et. al., 2001).

No Brasil, não existe uma legislação específica para produtos novos

como purê, mas foi estabelecida para néctar de pêssego (BRASIL, 2003). Além

disso, empresas envolvidas nessa cadeia produtiva vêm usando, como

matéria-prima para elaboração de néctar de pêssego, purê concentrado de

pêssego importado de vários países, em detrimento do nacional, devido a

questões de qualidade relacionadas com cor, sabor, textura e segurança

alimentar (TEIXEIRA et al., 2003).

3

Atualmente se tem um bom conhecimento sobre as características

físico-químicas, sensoriais e o potencial de escurecimento de diversas

cultivares brasileiras, mas poucos dados específicos sobre a resistência

térmica das enzimas responsáveis pelo escurecimento e das leveduras

responsáveis pela fermentação. A cv. Jubileu é amplamente cultivada no Sul

do RS e tem características sensoriais de sabor e cor favoráveis para

elaboração de purês e derivados.

O melhor aproveitamento das cultivares brasileiras de frutas com o

desenvolvimento de processamento térmico eficiente é de grande importância,

pois gera benefícios para todos envolvidos nessa cadeia produtiva, incluindo

consumidores que contarão com melhor qualidade e menor custo.

A elaboração de purê de pêssego combinando adição de ácido

ascórbico seguido de tratamento térmico a 750C por 4 min. pode não ser

suficiente para inativar a PPO de cultivares diferentes do que a Granada, que

foi utilizada como indicador de termoinativação por TORALLES E

VENDRUSCOLO (2007). Além disso, neste tipo de produto, as leveduras

podem sobreviver ao tratamento térmico.

Definir um indicador de termoinativação, entre PPO, POD e leveduras,

para purês de pêssego produzidos a partir da cv. Jubileu, determinando-se os

parâmetros de constante de velocidade de inativação (k), energia de ativação

(Ea), tempo de meia-vida (t1/2), tempo de redução decimal (D) e valor Z).

Para tal finalidade implantaram-se três experimentos consecutivos,

divididos em dois capítulos:

1.1 Hipótese

1.2 Objetivos

4

1. Termoinativação das enzimas PPO e POD de purês de pêssego

da cv. Jubileu: estudou-se a termoestabilidade das enzimas de escurecimento

em purês de pêssego produzidos a partir da cv. Jubileu, que é amplamente

cultivada no Sul do Rio Grande do Sul, Brasil. Desse experimento resultou o

conhecimento da enzima mais termoestável entre PPO e POD.

2. Cinética da destruição térmica da S. cerevisiae comercial:

obteve-se as condições ótimas de fermentação, através do estudo do efeito do

pH e da temperatura na atividade da enzima PDC de S. cervisiae comercial.

Desse experimento resultou o conhecimento da desnaturação térmica do

microrganismo, que foi bem descrito por um modelo cinético de primeira ordem

e a dependência da temperatura foi significativamente representada pela lei de

Arrhenius.

3. Cinética de destruição térmica da S.cerevisiae em purês de

pêssego da cv. Jubileu: estudou-se a cinética de inativação da levedura

extraída de pêssego da cultivar Jubileu, determinando os seguintes

parâmetros: constante de inativação(k), energia de Ativação (Ea), tempo de

meia-vida (t1/2), tempo de redução decimal (D) e valor Z. Desse experimento

resultou o conhecimento das constantes cinéticas de inativação do

microrganismo.

Este trabalho objetiva complementar estudos para elaboração de purê

de pêssego, visando a obtenção de um produto estável utilizando uma cultivar

brasileira e servirá de base para a indústria processadora deste tipo de

produto.

5

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O pêssego e a nectarina são frutas muito apreciadas pelo sabor,

aparência e pelo seu valor econômico no âmbito da cadeia produtiva. No Brasil,

é possível produzir estas frutas, apenas nos estados do Sul e Sudeste, onde

predomina o clima temperado.

A produção mundial de pêssegos e nectarinas está em torno de 12

milhões de toneladas, crescendo ao redor de 20% a cada 10 anos. A China é o

maior produtor mundial, com cerca de 27% de participação na oferta global,

seguida da Itália e dos Estados Unidos, que produziram em 1998, 1,4 milhão e

1,3 milhão de toneladas, respectivamente.

No Brasil, o pêssego e a nectarina são produzidos nos Estados do Sul e

Sudeste, onde as condições naturais, sobretudo o clima temperado, favorecem

a exploração comercial. O Rio Grande do Sul é o principal produtor, com cerca

de 65% da produção nacional, ocupando uma área superior a 10 mil hectares.

Conforme dados da ASCAR/EMATER-RS(2010), o Rio Grande do Sul

produziu na safra 2008/2009, 129.515 toneladas de pêssego. A produtividade

média do RS é de 9.9 kg.ha-1 e a média de área por produtor é de 2,68 ha.

Para o processamento industrial, a produção foi de 71.095 toneladas, colhidos

em uma áera de 8.220 hectares.

Toda a produção nacional de pêssego e nectarina se destina ao

mercado interno. O Brasil não exporta esta fruta, sendo considerado um grande

mercado para os principais produtores mundiais, principalmente para o Chile,

país vizinho, e tradicional exportador da América Latina.

2.1 Pêssego

6

Pêssegos são ricos em potássio, fósforo e cálcio. Ferro e sódio são

encontrados em pequenas quantidades. A vitamina encontrada em maior

quantidade no pêssego é a vitamina C, sendo 10 vezes superior ao conteúdo

encontrado na laranja, seguida da niacina e da vitamina A (MAHAN e

ESCOTT- STUMP, 1999).

Os carotenóides são responsáveis por grande parte da cor amarela,

alaranjada e vermelha das frutas (KADER e BARRET, 2005). O caroteno,

critoxantina, luteína, violaxantina e zeaxantina são os principais carotenóides

encontrados no pêssego (LUH, 1980).

Pêssegos contêm diferentes tipos de compostos fenólicos que

desempenham um papel relevante na qualidade de frutos frescos e

processados, estando envolvidos com a cor do exocarpo, escurecimento

enzimático, a adstringência do mesocarpo e com escurecimento não

enzimático que ocorre em certos cultivares de pêssego quando processadas

termicamente (SAINZ, 2006).

A cultivar Jubileu (Figura 1) foi disponibilizada pelo Melhoramento

Genético da Embrapa Clima Temperado em 1998. A planta é produtiva,

apresenta boa sanidade e é indicada para áreas de 250 a 350 horas de

acúmulo de frio hibernal (temperatura menor ou igual a 7,2ºC). Produz frutos

redondos, sem ponta de película amarela, podendo apresentar até 20% de

vermelho. A polpa é firme, de sabor doce-ácido, de cor amarela-escura e o

caroço é aderente. Os frutos têm tamanho grande com diâmetro em geral,

superior a 6 cm. O conteúdo de sólidos solúveis tem variado de 12°Brix a 16,6

ºBrix (EMBRAPA, 2011).

Figura 1 1 Planta cultivar Jubileu. Fonte: Embrapa, 2011.

7

Em estudos sensoriais realizados por TORALLES et al. (2006), o

equilíbrio entre o doce e o ácido foi o principal atributo de preferência, e o

residual amargo como o principal atributo de rejeição dos purês de pêssego. A

relação SS/AT (sólidos solúveis/acidez titulável) foi um bom parâmetro para

indicar a qualidade e os purês elaborados a partir das cultivares Jubileu e

Eldorado foram os preferidos dos consumidores. Quanto à cor, as cultivares

Granada, Jade, Esmeralda e Jubileu, com menor potencial de escurecimento

enzimático, originaram purês de coloração amarela característica, desejável

nesse tipo de produto.

Figura 1. Pêssego cultivar Jubileu. Fonte: Embrapa, 2011.

8

2.2 Enzimas do escurecimento do pêssego

Desde a sua descoberta no século passado, as enzimas PPO e POD têm sido

objeto de extensas pesquisas científicas. Com isso, considerável importância tem sido

acumulada sobre suas propriedades moleculares e catalíticas.

As polifenoloxidases (PPO) e peroxidases (POD) fazem parte de um grande

número de enzimas conhecidas como oxiredutases, podendo promover uma variedade

de reações, principalmente a peroxidase. A polifenoloxidase (PPO; EC 1.10.3.1) e a

peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) estão presentes em um grande grupo de frutas e

vegetais.

A investigação desse grupo de enzima tem sido de grande importância para a

tecnologia de alimentos, uma vez que a continuidade da atividade enzimática pode

ocasionar mudança na cor, variações de aroma, alterações no teor de vitaminas e até

modificações na textura. A manutenção da cor natural é um dos fatores de qualidade

mais importantes no processamento de purês, polpas, néctares e sucos (LEONARD et

al., 1981; ASHURST, 1995; GUERRERO-BELTRAN et al., 2004; GARCIA e BARRET,

2005). A cor amarela típica está associada ao purê de pêssego de alta qualidade, porém

modificações na coloração dos pêssegos durante colheita, pós-colheita, processamento e

armazenamento causam declínio drástico na qualidade, quando não controlados

(VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981; TOURJEE et al., 1998; CHENG & CRISOTO, 1995; GARZA et

al., 1999; GIRNER et al., 2002).

2.2.1 Polifenoloxidases

Polifenoloxidase (Figura 2), monofenol oxidase (tirosinase, EC1.14.18.1),

catecol oxidase ou o-difenol oxigênio redutase, são algumas das diferentes

nomenclaturas que as enzimas responsáveis pela oxidação de fenóis podem receber

(MAYER, 2006; FARIA et al., 2007). As distintas designações são atribuídas devido ao

tipo de substrato catalisado e/ou devido à atividade da enzima (cresolase, catecolase,

difenolase e fenolase) (RICHARD-FORGET e GAUILLARD, 1997). A enzima PPO é

9

encontrada praticamente em todos os tecidos vegetais, em concentrações especialmente

altas em cogumelo, batata, pêssego, maçã, banana, manga, folhas de chá, abacate e

café (BOUCHILLOUX, 1963).

Muito das características sobre a função biológica das PPO ainda é desconhecida

(MAYER, 2006). As PPO são classificadas em catecol oxidases e lacases; ambas

oxidam substratos fenólicos (OSUGA et al., 1994). As catecol oxidases podem catalisar a

oxidação dos o-difenóis em o-quinonas usando a atividade catecolase (MAYER e

HAREL, 1979). As lacases, por sua vez, catalisam reações de oxidação, dimetilação e

polimerização de compostos fenólicos (MAYER, 1987).

Inúmeros trabalhos têm sido citados com diversos substratos catalisados pela

PPO (CHEYNIER e MOUTONET, 1992). No entanto, esta enzima pode demonstrar

preferência por um determinado substrato. O pH ótimo de atuação da PPO pode variar

com a fonte de origem do substrato. Entretanto, na maioria dos casos, o pH ótimo de

atuação encontra-se entre 6 e 7, sendo a enzima inativada em pH 4 ou abaixo.

Figura 2 Estrutura da enzima polifenoloxidase. Fonte: Protein Date Bank/ PDB,

2012.

10

Na Figura 3 observa-se a formação de quinonas pela oxidação das

hidroxilas fenólicas do catecol. A formação da quinona é dependente do oxigênio

e da enzima. Uma vez formadas, as reações subseqüentes ocorrem

espontaneamente, não dependendo mais da enzima nem do oxigênio (ARAÚJO,

2004; GOMES et al., 2001).

As cultivares de pêssego podem ser divididas em dois grupos: aquelas com forte

tendência ao escurecimento e as com baixa tendência, sendo que a forte tendência ao

escurecimento enzimático tem sido relacionada à alta atividade da PPO, baixa valor de

Km e ao alto conteúdo de compostos fenólicos, principalmente, o do ácido clorogênico

(VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).

TORALLES et al. (2004), em estudo comparativo entre concentração total de

fenóis e a constante de Michaelis-Menten (Km) usando catecol como substrato, para

quatro cultivares de pêssego brasileiras, obtiveram a seguinte ordem crescente para o

potencial de escurecimento enzimático: Granada, Jade, Esmeralda e Maciel. Essa ordem

foi coincidente com a obtida através da relação do coeficiente de especificidade (Vmax/Km).

Segundo esses autores, uma isoenzima com 0,35 de mobilidade relativa pode ser

responsável pelo maior escurecimento enzimático observado pela PPO-Maciel e PPO-

Esmeralda em catecol.

Figura 3. Reação de oxidação catalítica, pela PPO, do monofenol e

ortodifenol produzindo o-quinona. Fonte: FATIBELLO-FILHO e VIEIRA, 2002.

11

2.2.2 Peroxidases

A peroxidase é uma enzima resistente a elevadas temperaturas e sua inativação

tem sido freqüentemente usada como índice da efetividade do branqueamento, que

consiste no tratamento térmico usual aplicado em alimentos para inibir a ação das

enzimas.

A perda da sua atividade enzimática no produto branqueado indica uma perda

correspondente da atividade para outras enzimas de deterioração. Por ser a enzima mais

termoestável em sistemas vegetais, uma vez que pode recuperar sua atividade após

tratamento térmico, a peroxidase é utilizada como parâmetro de eficiência do

branqueamento (GONÇALVES et al., 2007; AGÜERO et al., 2008).

No organismo humano a peroxidase possui função antioxidante, impedindo que o

peróxido de hidrogênio gere radicais livres como o íon hidroxila (-OH) e o ácido

hipocloroso (HOCl). Níveis baixos de peroxidase e de outras enzimas antioxidantes estão

relacionados ao desenvolvimento de câncer, doenças relacionadas ao sistema nervoso e

distúrbios cardiovasculares (ANESINI et al., 2006). Nos alimentos a peroxidase é

responsável por mudanças indesejáveis no aroma, na cor (escurecimento) e na textura

(FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002; GONÇALVES et al., 2007).

A enzima peroxidase (Figura 4) possui um grupo prostético ferriprotoporfirina

(Fe+++) pertencente à classe das hemeproteínas, o qual influencia as reações químicas

catalisadas por esta enzima. A função da peroxidase é proteger os tecidos animal e

vegetal contra os efeitos tóxicos do H2O2 formado durante o metabolismo celular. A POD

oxida compostos fenólicos somente na presença do H2O2 . Sua detecção, medida por

espectrofotometria, é baseada no desenvolvimento da cor na presença do substrato

guaiacol e água oxigenada como substrato secundário. O complexo peroxidase-peróxido

formado oxida o guaiacol (incolor), transformando-o em um produto final colorido (o

tetraguaiacol), conforme reação ilustrada na Figura 5 (ARAÚJO, 2004).

12

A PPO e POD de pêssegos são enzimas com comportamento michaeliano

(LUH & PHITHAKPOL, 1972). A constante de Michaelis-Menten (Km), uma constante

empírica igual à concentração em substrato para o qual há uma velocidade inicial igual à

Figura 4. Estrutura da enzima peroxidase. Fonte: Protein Date Bank/ PDB, 2012.

Figura 5 Esquema da reação na qual a enzima peroxidase converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol (composto colorido). Fonte: FATIBELLO-FILHO e VIEIRA, 2002.

13

Vmax/2 em condições experimentais definidas, vem sendo determinada para caracterizar o

escurecimento enzimático in vitro.

2.2.3 Atividade enzimática

A atividade enzimática de uma enzima é medida através de sua velocidade de

reação, em condições de ensaio estabelecidas. A atividade enzimática deve ser

quantificada considerando-se a velocidade da reação durante a fase linear (LIMA et al.,

2001).

O método espectrofotométrico é o mais usado para acompanhar

quantitativamente as atividades da PPO e POD, normalmente definidas em termos de

incremento da absorbância por minuto por miligrama de proteína solúvel a 420 nm para

PPO e 470 nm para POD (FLURKEY & JEN, 1978; SILVA & NOGUEIRA, 1984;

TIJSKENS et. al., 1997; TORALLES 2003).

Segundo a IUB (International Union of Biochemistry) uma unidade internacional

(UI) de atividade enzimática representa a quantidade de enzima que catalisa a

transformação de um micromol de substrato por minuto nas condições de ensaio

definidas. A atividade enzimática específica é utilizada em várias situações sendo

expressa em unidades (UI) por massa de proteína. A atividade enzimática residual é

definida como a atividade enzimática após tratamento térmico sobre a atividade

enzimática inicial (REED, 1975; LIMA et al., 2001; SHALINI et al., 2008).

2.2.4 Inativação enzimática

Na indústria alimentícia, a inativação enzimática visa eliminar ou retardar

reações enzimáticas que resultam na degradação dos alimentos. A inativação enzimática

é considerada um processo químico. LUMRY E EYRING (1954) propuseram um

esquema geral para inativação térmica enzimática onde ocorre primeiramente um

desdobramento parcial reversível seguido de uma etapa irreversível onde a enzima

encontra-se inativada.

A cinética de inativação enzimática é o acompanhamento do progresso da

inativação em relação ao tempo. Modelos matemáticos são utilizados para descrever o

comportamento da curva de inativação e, a taxa de inativação é determinada pelos

parâmetros cinéticos desses modelos (LOEY et al., 2003).

A estabilidade cinética depende da energia de ativação (Ea, energia de barreira

14

necessária para desdobrar a proteína). Também o tempo de meia-vida (t1/2) e a constante

de velocidade de inativação de primeira-ordem (k) são parâmetros amplamente utilizados

para estudar a estabilidade cinética (VIEILLE & ZEIKUS, 2001; BOCK et al., 1999). Em

geral, uma energia de ativação alta implica que uma menor variação de temperatura é

necessária para inativar a enzima (YEMENICIOGLU et al., 1997).

TIJSKENS et al. (1997), trabalhando com termoinativação da POD de pêssegos da

cultivar Andross, relataram que a Ea foi de 150 kJ.mol-1 e k = 8,44.10-3 s-1 a 60oC.

Posteriormente, NEVES (2002) determinou uma energia de aproximadamente 171

kJ.mol-1 para POD da cv. Rei da Conserva. Já WONG et al. (1971) estudaram a

termoestabilidade de quatro isoenzimas de PPO da cv. Cortez, sendo que os tempos de

meias-vidas foram de 5,5 até 50 minutos a 50oC e, acima de 76oC, todas as izoenzimas

foram rapidamente inativadas.

TORALLES (2005) verificou que a PPO e POD de pêssego Granada apresentaram

ótima atividade, respectivamente, em pH 6,2 e em pH 5 a 30oC. O tratamento térmico

reduziu significativamente a atividade enzimática da PPO e POD, sendo que foi efetiva a

termodesnaturação acima de 70oC. A estabilidade térmica da PPO foi superior a da POD

e, assim, a polifenoloxidase poderia ser um bom indicador de termoinativação para

controle do escurecimento enzimático em pêssegos, no entanto a POD apresentou maior

atividade do que a PPO.

Em contraste com a energia de ativação em pêssegos, ANTHON et al. (2002),

trabalhando com a termoinativação das enzimas do tomate, chegaram a resultados mais

elevados para POD com uma Ea de 557 kJ.mol-1 e k = 32,4.10-3 s-1 a 70

oC.

YEMENICIOGLU et al. (1997), comparando diferentes cultivares de maçãs, concluíaram

que a cultivar Amasya (Ea=255,6 kJ.mol-1) apresentou menor termoestabilidade que a

cultivar Starking Delicious (Ea= 240,6 kJ.mol-1). Na temperatura de 68oC os tempos de

meias-vidas foram respectivamente 32,1 e 48,5 minutos.

2.3 Purê e néctar de Pêssego

2.3.1 Padrões de identidade e qualidade

Não há, na legislação brasileira, padrões para produtos novos como purê de

pêssego. A Instrução Normativa N.o 1, de 7 de janeiro de 2000, trata do regulamento

técnico geral para fixação dos padrões de identidade e qualidade para polpas de várias

15

frutas destinados somente ao consumo como bebida, mas nada trata especificamente

sobre polpa ou purê de pêssego simples ou concentrado. De acordo com a norma geral,

polpa de fruta é definida como produto não fermentado, não concentrado, não diluído,

obtido de frutos polposos, através de processo tecnológico adequado, com um teor

mínimo de sólidos totais, proveniente da parte comestível do fruto. A norma também

define linhas gerais para as características físicas, químicas e sensoriais para polpa de

fruta, mas sem citar limites. Os padrões microbiologicos para polpas segundo essa norma

são: (a) Salmonella ssp: ausência em 25 g; (b) Coliformes fecais (máximo): 1 g-1; (c)

bolores e leveduras (máximo): 5.103 g-1 para polpa in natura e 2.103 g-1 para polpa

conservada quimicamente (BRASIL, 2000).

Para néctar de pêssego, a Instrução Normativa N.o 12, de 4 de setembro de 2003,

estabelece padrões de identidade e qualidade. De acordo com essa norma, o néctar de

pêssego é a bebida não fermentada, obtida da dissolução, em água potável, da parte

comestível do pêssego (Prunus persica L.) e açúcares, destinado ao consumo direto,

podendo ser adicionado de ácidos. O néctar deve apresentar cor amarelada, sabor

característico e aroma próprio da fruta.

2.3.2 Purê de pêssego

O processo para produção de purê de pêssego não concentrado foi descrito por

HEALTON et al. (1966) citados por LUH (1980). Recentemente, TORALLES e

VENDRÚSCULO (2007), propuseram um processo para elaboração de purê de pêssego

concentrado (Anexo A - Figura 1A). Neste processo, as frutas devem ser processadas

frescas, completamente maduras e preferencialmente no mesmo dia da colheita para

preservar características de sabor e aroma da fruta. As frutas são selecionadas, lavadas,

descaroçadas, descascadas e lavadas. Recomenda-se a pelagem com solução de NaOH

a 5%, na temperatura de 2100F pelo tempo entre 1 e 2 minutos. Posteriormente, as

metades são lavadas com jatos de água em lavadores rotativos. Após a pelagem, a polpa

é branqueada em um termoinativador enzimático tubular contínuo a 750C por 4 minutos.

A polpa é refinada em despolpadeira e o purê integral é acondicionado em tanques para

adição de 0,08 % em peso de ácido ascórbico, sob agitação. Após, é pasteurizado a 910C

por 7 segundos e rapidamente resfriado em torno de 20C. Os purês de pêssegos

normalmente são comercializados entre 30-32oBrix no mercado internacional e são

usados para elaboração de néctares, sucos, sorvetes, geléias, espumantes, vinhos e

produtos reestruturados (LUH, 1980; MCHUGH, 1996). Embalagens flexíveis têm sido

utilizadas para purês (CARVALHO-FILHO e MASSEGUER, 1997).

16

2.4 Microflora presente

As leveduras são fungos que se apresentam, usual e predominantemente, sob

forma unicelular. Sua reprodução vegetativa se faz principalmente por gemulação.

Possuem parede celular e são facilmente diferenciadas das bactérias em virtude de suas

maiores dimensões e propriedades morfológicas. Cada espécie tem uma forma

característica, mas, mesmo em culturas puras, há consideráveis variações de tamanho e

de forma das células individuais, dependendo da idade e do ambiente (GOMES, 2004).

O gênero Saccharomyces é um dos grupos de microrganismos mais estudados

pela comunidade científica. Esse interesse é função da ampla aplicação desses

microrganismos na indústria de biotecnologia. Essa levedura tem sido relatada como

agente de transformação desde 1800 (ANDRIETTA et. al, 2006)

Saccharomyces cerevisiae (Figura 6) é uma espécie de levedura utilizada há

milhares de anos em produtos de panificação e na fermentação de bebidas alcoólicas,

sendo a levedura fermentativa por excelência, tendo sido utilizada ultimamente na

produção de bioetanol. É também muito importante como organismo modelo

(OSTERGAARD et al., 2000) em estudos fisiológicos (efeitos de diversos tipos de

stresse - osmótico, oxidativo,formação de etanol e ácidos fracos), sendo o

microrganismo eucariótico mais estudado e aquele cujo genoma foi o primeiro a ser

sequenciado (WILLIAMS, 1996).

As colônias apresentam uma coloração que varia entre o branco

(predominantemente) e o creme (ocasionalmente), apresentando forma convexa e lisa.

Este microrganismo pode formar pseudohifas, que consistem em cadeias simples de

células esféricas, elipsoidais ou cilíndricas. Reproduzem-se na maioria das vezes por

gemulação multilateral, onde a nova gémula é formada na porção lateral da célula-mãe.

17

A temperatura é um dos parâmetros mais importantes para o desempenho das

leveduras durante o processo fermentativo (FLEET e HEARD, 1993).

PARISH e HIGGINS (1989) pesquisaram uma variedade de produtos cítricos,

incluindo casca seca de laranja utilizada como forragem de gado, suco de laranja

pasteurizado e não pasteurizado, e suco de laranja refrigerado com relação à microbiota

fúngica. As seguintes leveduras foram isoladas: Candida maltosa, C.sake, Hanseniaspora

guilliermondii, Hanseniaspora spp.; Pichia membranaefaciens, Saccharomyces cerevisiae

(suco de laranja não pasteurizado - comercial); Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora

delbrueckii (suco de laranja não pasteurizado - experimental) e Rhodotorula spp (casca

de laranja seca).

PUT et al. (1976) estudaram a alta resistência de 120 espécies de leveduras,

representativas da biota fúngica de refrigerantes e produtos alimentícios ácidos. Foram

testadas 35 espécies de leveduras esporogênicas (Brettanomyces, Candida, Kloeckera,

Rhodotorula e Torulopsis) e 85 espécies de ascomicetos (Debaryomyces, Hansenula,

Kluyveromyces, Lodderomyces, Pichia, Saccharomyces e Saccharomycopsis). As

temperaturas testadas foram 55, 60, 62,5 e 65°C nos tempos de 10 e 20 minutos. Os

resultados obtidos evidenciaram que, das espécies testadas, a Saccharomyces

cerevisiae e a Saccharomyces chevalieri mostraram-se mais resistentes.

Figura 6. Saccharomyces sp observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x. Fonte: Fugelsang e Edwards, 2007.

18

Segundo SPLITTSTOESSER (1975); DEVÈZE e RIBÉREAU-GAYON (1977);

WALLS e CHUYATE (1998); JACKSON (2008), cada microrganismo tem determinado

nível de resistência ao calor. Modelos matemáticos de destruição térmica tem sido

propostos para avaliar a inativação de S. cerevisiae em alimentos. Podem ser citados

estudos de BELTRÁN e CÁNOVAS (2006) para néctar de manga, GUERRERO et. al

(2004) para suco de maçã, GARZA et. al (1994) para purê de pêssego e REVERON

(2012) para cerveja Pilsen.

2.4.1 Fermentação alcóolica

As leveduras são os microrganismos mais importantes na obtenção do álcool por

via fermentativa. A fermentação alcoólica é, portanto, um processo biológico conduzido

pela levedura, normalmente Saccharomyces cerevisiae (LIMA, BASSO e AMORIM,

2001).

A fermentação alcoólica é a ação das leveduras sobre açúcares fermentescívieis

contidos em uma solução. É um processo biológico no qual a energia fornecida por

reações de oxidação parcial pode ser utilizada para o crescimento de leveduras e

oxidação parcial anaeróbia da hexose na produção de álcool e CO2 (LIMA e

MARCONDEES, 2002).

A transformação da sacarose em etanol e CO2 envolve reações em sequência

ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica (LIMA, BASSO e AMORIM,

2001).

A principal rota metabólica envolvida na fermentação etanólica é a glicólise, na qual

uma molécula de glicose é metabolizada e duas moléculas de piruvato são produzidas.

Dois ATPs produzidos na glicólise são usados na condução da biossíntese das

leveduras, que envolve diversas biorreações que requerem energia. Portanto, a produção

do etanol está fortemente relacionada com o crescimento das leveduras, o que significa

que leveduras podem ser produzidas como subproduto (BAI, ANDERSON e MOO-

YOUNG, 2008). As enzimas piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase convertem o

piruvato em etanol e em dióxido de carbono e re-oxidam 2 moléculas de NADH que são

produzidas na glicólise (BARNETT, 2003).

2.4.2 Modelo linear para D e Z

A inativação de muitos microrganismos a uma temperatura constante segue uma

cinética de 1ª ordem, que é representado por um gráfico log C/Co versus tempo (Figura

7).

19

Figura 7. Termoinativação da S. cerevisiae em glicose para diferentes tempos de

aquecimento. Fonte: Toralles et. al., 2011.

De acordo com este modelo, todas as células da população tem igual

probabilidade de morte (BUZRUL et al, 2005; BUZRUL e ALPAS, 2007). A partir de um

gráfico deste tipo, pode-se determinar o valor D, que é o tempo de redução decimal

necessário para reduzir em 90% a população microbiana a uma temperatura constante.

Quando se representa a população microbiana em coordenadas semilogarítmicas, o valor

de D é o tempo necessário para a redução de uma ordem logarítmica no número de

microrganismos. O valor de D não depende da população microbiana inicial já que

depende, unicamente, da inclinação da linha reta. A exposição da população microbiana

a temperaturas mais altas produz uma diminuição no valor de D (SINGH e HELDMAN,

1995).

Outro parâmetro cinético importante é o valor Z, denominado constante de

resistência térmica. Este é um fator que descreve a resistência térmica dos esporos

microbianos e é definido como o aumento de temperatura necessário para causar uma

diminuição de 90% no tempo de redução decimal (D). Representando-se os valores de D,

obtidos a diferentes temperaturas, em coordenadas semi-logarítmicas, o valor de Z

representa o aumento de temperatura necessário para modificar uma ordem logarítmica

no valor de D (SINGH e HELDMAN, 1995).

Os valores de D e Z são função de diversos fatores, como por exemplo,

20

microrganismo, meio em que se encontra, ph do meio. Entre outros fatores que têm

influência sobre os valores D e Z está a metodologia empregada nessa determinação

(SILVA, 2011).

A representação gráfica do logaritmo decimal de sobreviventes, em relação ao

tempo de exposição à temperatura constante resulta em curva linearizada decrescente. A

variação do número de sobreviventes, com o tempo de exposição, é função do número

de microrganismos inicialmente presentes.

Inúmeros estudos vem sendo realizados com a levedura S. cerevisiae,

determinando-se os parâmetros (D) e (Z), com o objetivo de verificar a resistência

térmica do microrganismo em alimentos.

Para S. cerevisiae de purês de pêssego, GARZA et. al. (1994) encontraram

D60°C de 0,5 minutos. TAJCHAKAVIT et al. (1999), estudando a levedura em sucos de

maçã encontraram D 600C de 3,8 minutos. REVERON et. al. (2012) encontraram D50°C

de 0,68 minutos para Saccharomyces cerevisiae em cerveja.

Estudos realizados por SILVA (2011), apontam valores de D e Z para a

Saccharomyces cerevisiae utilizando o aquecimento convencional e o aquecimento

dielétrico. Para o aquecimento convencional encontraram valores de D57°C de 2,15

minutos e Z de 4,27°C, enquanto que com o aquecimento por microondas obtiveram

D57°C de 0,73 minutos e Z de 3,10°C.

21

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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31

RESUMO

Estudou-se a inativação térmica da PPO e POD em extrato enzimático de

pêssego da cv. Jubileu, que é amplamente cultivada no Sul do Rio Grande do

Sul, Brasil. A polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) foram extraídas

usando o método do pó-de-proteína, submetido a purificação parcial pela

CAPÍTULO 1

TERMOINATIVAÇÃO DAS ENZIMAS PPO E POD EM

PURÊS DE PÊSSEGO DA CULTIVAR JUBILEU

32

precipitação com (NH4)2SO4 seguido de diálise. A atividade enzimática foi

determinada por medida do incremento na absorbância a 420 nm para PPO e

470 nm para POD, utilizando um espectrofotômetro Varian. A análise cinética

dos resultados sugere que a desnaturação térmica foi bem descrita por um

modelo cinético de primeira ordem, e a dependência da temperatura foi

significativamente representada pela lei de Arrhenius. As constantes cinéticas

para PPO variaram de 6,4. 10-4 até 5,5. 10-2 s-1 na faixa de temperatura de 50-

90oC e Ea de 111,1 kJ.mol-1. Para POD de 3,6.10-3 até 1,9.10-2 s-1 entre 50-

650C e com Ea de 97,2 kJ.mol-1, demonstrando maior resistência da PPO.

Palavras-chave: Pêssego Jubileu, desnaturação, energia de ativação,

Arrhenius.

ABSTRACT

It was studied the thermal inactivation in peach of the cv. Jubileu, which is

widely cultivated in southern of Rio Grande do Sul, Brazil. The

polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) were extracted using the

method of protein powder, and submited partial purification by precipitation with

33

(NH4)2SO4 followed by dialysis. The enzymatic activity was determined by

measuring the increase in absorbance at 420 nm for PPO and 470 nm for POD,

using a Varian spectrophotometer. Kinetic analysis of the results suggests that

the thermal denaturation was well described by a first order kinetic model and

the temperature dependence was significantly represented by the Arrhenius

law. The kinetic constants for PPO varied from 6,4. 10-4 to 5,5. 10-2 s-1 in the

temperature range of 50-90oC and Ea of 111,1 kJ.mol-1. For POD from 3,6.10-3

to 1,9.10-2 s-1 between 50-650C and with Ea of 97,2 kJ.mol-1, demonstrating

increased resistance of PPO.

Keywords: Jubileu peach, denaturation, activation energy, Arrhenius.

34

1. INTRODUÇÃO

A cor e sabor naturais das frutas são atributos importantes para escolha

do consumidor (TORALLES et al., 2006). Preservá-los é um grande desafio em

frutas minimamente processadas, purês, néctares e sucos (GUERRERO-

BELTRAN et al., 2004; MCLELLAN e PADILLA-ZAKDUR, 2005; QUEVEDO et

al. 2011).

A polifenoloxidase (PPO) e a peroxidase (POD) são enzimas associadas

com reações de deterioração oxidativa que podem causar o escurecimento

destes produtos quando não devidamente controladas (BRITO et al., 2005,

TORALLES et al., 2010). Além da alteração da cor, o escurecimento enzimático

pode induzir severas mudanças de sabor, textura e perdas nutricionais

(VALDERRAMA e CLEMENTE, 2004; GARCIA e BARRET, 2005, PROHENS

et al. 2007; BI et. al., 2013).

As polifenoloxidases catalisam a oxidação de substratos fenólicos

usando o oxigênio como aceptor de hidrogênio em dois tipos de reações. A

PPO (EC 1.14.18.1, monofenol, L-dopa: oxigênio oxidoredutase) está envolvida

na hidroxilação de monofenóis para originar o-difenóis e a PPO (E.C. 1.10.3.1,

1,2-benzenodiol:oxigênio oxidoredutase) que catalisa a remoção de hidrogênio

de o-difenóis para produzir uma o-quinonona (RAMIREZ e WHITAKER, 2003).

A peroxidase catalisa quatro tipos de reações: peroxidação, oxidação,

catalática e hidroxilação. Para substratos fenólicos, somente a reação de

peroxidação é importante. Neste caso, a POD (E.C. 1.11.1.7., doador H2O2,

oxidoredutase) catalisa a reação do peróxido de hidrogênio ou outro peróxido

orgânico, que é reduzido, enquanto que um doador de elétrons (AH2) é

oxidado. O doador de elétrons pode ser ascorbato, fenóis, aminas ou outros

compostos orgânicos (BRITO et al., 2005). Em muitos casos o produto da

oxidação é colorido e serve como base para a determinação colorimétrica da

atividade da peroxidase. Por outro lado, a reação oxidativa pode ocorrer na

ausência do peróxido de hidrogênio, no entanto, necessita da presença de

oxigênio e cofatores (manganês e fenol). A hidroquinona, o ácido

dihidroxifumárico e o ácido ascórbico, são os substratos possíveis de serem

35

tratados neste tipo de reação (PINTO, 2008) . Além disso, a ação da enzima

objetiva principalmente controlar o nível de peróxidos gerados em quase todos

compartimentos celulares e, na ausência de um doador de hidrogênio, a

peroxidase converte peróxido de hidrogênio em H2O e O2. Esta reação

catalática é pelo menos mil vezes mais lenta que a de peroxidação (RANIERI

et al., 2001; PINTO, 2008).

Em pêssegos, a atividade da PPO e a POD e seu controle são

conhecidas de longa data e continuam a ser estudadas (REYES & LUH, 1960;

FLURKEY & JEN, 1978; ALBA et al., 1996; GIRNER et. al., 2002). Para

cultivares nacionais, apesar de serem conhecidas as cinéticas de

escurecimento e de desnaturação da PPO e da POD Granada (TORALLES et

al., 2005), e até mesmo o potencial de escurecimento de algumas cultivares de

pêssegos brasileiras (TORALLES et al., 2004), a literatura pertinente tem

poucos relatos sobre a inativação térmica de cultivares brasileiras. Tal

conhecimento cinético de desnaturação é muito importante porque,

tradicionalmente, o controle do escurecimento enzimático em sucos e purês de

frutas resulta da combinação do tratamento térmico e de inibidores químicos

(MCEVILY et al., 1992; FUNAMOTO et al., 2003, TORALLES et al., 2010).

Neste trabalho, estudou-se a termoinativação das enzimas PPO e POD

em pêssego da cv.