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Biologia Microbiana 2009/2010 1
8 Métodos directos
* Contagem de células totais
v Métodos de medição do crescimento populacional
Biologia Microbiana 2009/2010
cfu por µl vol. =superfície contada (mm2)* x profundidade
da câmara (0,1 mm) x diluição
cfu contadas
cfu/µl =nº contados x 1/400 x 0,1 x 10-D
células contadas
* = nº contados x 1/400
=nº contados
cfu contadasx 4000 x 10D = N x 4 x 103 x 10D
cfu/ml = N x 4 x 106 x 10D
1 mm
1 mm
Vcamâra = 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 400 quadrados pequenos (25 x 16 )
Vcontagem = 0,1/400 mm3 = 1/4 x 106 mL
8 Métodos directos
* Contagem de células totais
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Escala de McFarland
McFarland Scale
No. Bacteria (x106/ml)
1 300
2 600
3 900
4 1200
5 1500
6 1800
7 2100
8 2400
9 2700
10 3000
Células totais
McFarland Standard No.
0.5 1 2 3 4
1.0% Barium chloride (ml)
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1.0% Sulphuric acid (ml)
9.95 9.9 9.8 9.7 9.6
Approx. cell density (1X108ml)
1.5 3.0 6.0 9.0 12.0
% Transmittance*
74.3 55.6 35.6 26.4 21.5
Absorbance* 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669*Wavelength of 600 nm
McF 0.5 Ec 0.5 SF
Células - suspensões
Correlação com:
- peso fresco
- peso seco
- células/ml
- cfu/ml
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8 Métodos directos
* Contagem de células viáveis
Espalhamento à superfície
Incorporação
v Métodos de medição do crescimento populacional
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8 Métodos directos
* Contagem de células viáveis
v Métodos de medição do crescimento populacional
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Células - suspensões
Células viáveis
100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
100 μl
900 μlSF
≈ 1 ml
100 μl 100 μl
PÉROLAS ESPALHADOR
Distribuir o inóculo por toda a superfície do meio de forma homogénea.
McF 1 = 3x108 cfu/mlMcF 2 = 6x108 cfu/ml
1007 mlSF
1 colónia ≈ 106 a 108 células
Método de espalhamento à superfície
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s (desvio padrão)Medida da variação dos dados
CV (coeficiente de variação)Comparar a variabilidade das
amostras
Distribuição de Poisson
n é muito grande, p é muito pequeno, np é finito
p = probabilidade de uma determinada resposta acontecer numa única tentativa
n = nº total de tentativas
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8 Métodos indirectos
* Determinação do peso seco
o tamanho da amostra deve ser adequado (50 - 100 mL amostra pouco densa)
1 célula E. coli m = 9,5 x 10-13 g4 70% H2O 4 peso seco: 2,8 x 10-13 g
reflecte a actividade biossintética total da cultura, é um excelente parâmetro indicativo
da conversão de nutrientes em material celular.
* Doseamento de constituintes celulares
proteínas, N total, C total, DNA, ATP, P total, clorofila
* Quantificação do produto final
bactérias fermentativas 4titulação do ácido produzido como produto final
4actividade metabólica usada como indicador de crescimento
* Quantificação da actividade respiratória
taxas de consumo de O2 4bactérias com respiração aeróbia
quantificação de H2S 4 crescimento de bactérias anaeróbias com redução
dissimilativa de SO4
redução de azul de metileno e sais de tetrazol (aceitadores de e-)4amostras
de solo
* Determinação da turbidez
DO a 540 nm (verde), 600 nm (laranja) ou 660 nm (vermelha)
v Métodos de medição do crescimento populacional
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Fisiologia do crescimento - Crescimento exponencial
Tempo de geração (g): tempo necessário para a duplicação
da população celular
* depende do meio de crescimento e das condições de
incubação
taxa de crescimento - alteração do nº de células ou massa celular por unidade de tempo
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N = N0eµt
ln N = ln N0 + µt
ln N - ln N0 = µt
t =ln N - ln N0
µ
µ = 0,693 / t
N = 2N0
t = ln 2N0 - ln N0
µ
t = ln 2
= 0,693
µ µ
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Fases e cinética da curva de crescimento populacional (em “batch”)
Fase de latência ou fase lag: período inicial durante o qual não se observa crescimento
Fase log ou exponencial: a divisão celular segue uma função logarítmica; o crescimento é balanceado, todas as actividades biossintéticas ocorrem à mesma taxa da divisão celular
Fase estacionária: período durante o qual o número de células viáveis é constante
Fase de declínio ou morte: a morte celular ocorre a uma taxa superior à da divisão celular
> 106 células / mL
