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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Polyana Lima Meireles Dalpiaz
A Influência dos Hormônios Sexuais no Balanço entre as Citocinas Pró-Inflamatórias e Anti-
Inflamatórias em Machos e Fêmeas SHR, Após o Tratamento com Enalapril.
VITÓRIA
2011
2
A Influência dos Hormônios Sexuais no Balanço entre as Citocinas Pró-Inflamatórias e Anti-
Inflamatórias em Machos e Fêmeas SHR, Após o Tratamento com Enalapril.
POLYANA LIMA MEIRELES DALPIAZ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em 16 de Dezembro de 2011 por:
---------------------------------------------------------------------------
Profa. Dr a. Nazaré Souza Bissoli - Orientadora, UFES
---------------------------------------------------------------------------
Profa. Dra. Margareth Ribeiro Moyses - Co-orientadora, UFES
---------------------------------------------------------------------------
Profa. Dr a. Sonia Alves Gouvea, UFES
---------------------------------------------------------------------------
Profa. Dr a. Ana Raquel S. de Medeiros Garcia, IFES
3
___________________________________________________
Dalpiaz, Polyana Lima Meireles
A Influência dos Hormônios Sexuais no Balanço entre as
Citocinas Pró-Inflamatórias e Anti-Inflamatórias em Machos e
Fêmeas SHR, Após o Tratamento com Enalapril
Vitoria - 2011.
xii, 70p (UFES, M. Sc., Ciências Fisiológicas, 2011)
Orientadora: Profa. Dr a. Nazaré Souza Bissoli
Co-orientadora: Profa. Dra. Margareth Ribeiro Moyses
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Espírito
Santo, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas.
4
DEDICATÓRIA
Á Meus Pais, as raízes; onde tudo começou.
Ao Adair, a terra firme, fértil, onde tudo floresce.
Aos meus irmãos, o equilíbrio dos galhos e a sombra para o descanso.
Ao Arthur e a Ana e os meus sobrinhos, as minhas sementes. A esperança de renovação.
Me torno uma árvore forte a cada dia, por que tenho vocês como elemento da minha existência.
5
AGRADECIMENTOS
Á Deus e a Nossa Senhora da Penha que estão ao meu lado em todos os
momentos, escolhendo os meus caminhos, e me preparando para segui-los.
Á minha orientadora e incentivadora, Profa. Dra. Nazaré de Souza Bissoli, ‘mãe
cientifica’ de todos seus alunos, exemplo de pessoa e de profissional. Obrigada
por me ajudar transpor mais etapa da minha vida, por caminhar de mãos dadas
comigo, esperar o meu ritmo com paciência e me ensinar os primeiros passos
da ciência.
Ao Profa. Dra Margareth Ribeiro Moyses pelo carinho, confiança, disponibilidade
e atenção.
A Profa. Dra.Adriana Carmona e seu Aluno Marcio Alves, por ter me recebido
em seu laboratório de enzimologia -USP e com toda paciência e disposição me
ajudaram nas dosagens da ECA.
Ao Prof. Dr. Dalton Vassalo e a Profa. Dra Alessandra S. Padilha por disporem o
uso do pletismógrafo e pela companhia nestes longos dias.
A Profa. Dra Elenice Moreira Lemos pela ajuda nas dosagens das citocinas.
Ao Prof. Dr. Henrique e sua ex-aluna Renata Tiradentes por terem me acolhido
e aberto não só a portas do seu laboratório, mas os horizontes para novas
perspectivas para minha vida acadêmica.
As alunas de iniciação científica, Glauciene J. de Souza e Lara Nascimento
Gusmão, pelos sábados, domingos, feriados de parceria nos experimentos.
Aos amigos do laboratório Ana Raquel, Phablo, Karine, Tadeu, Elaine, Marcos,
Antonio e em especial Aline, Isabela pela parceria, amizade, incentivo. Na
medida do tempo, da necessidade, da solicitação, todos, uns mais, outros
6
menos, uns fisicamente outros intelectualmente, outros de todas as formas e
intensidades, participaram deste resultado.
Ao Edson dias pelo convívio, amizade e apoio técnico no laboratório.
A todos os demais professores, alunos e funcionários do PPGCF pelo convívio,
auxílio e companheirismo.
Se tiverdes fé do tamanho de um grão de mostarda, direis a
este monte: Passa daqui para acolá, e ele passará. E Nada vos
será impossível" (Mt 17.20).
7
SUMARIO
PAGINAS
Lista de Figura e Tabelas ...................................................................................... 9
Lista de Abreviaturas....... ...................................................................................... 10
INTRODUÇÃO........................................................................................................ 13
1.1 Doenças Cardiovasculares e Citocinas............................................................. 14
1.2 Citocinas............................................................................................................ 15
1.2.1 IL-6, TNF- e IL-10 .......................................................................................... 17
1.3 SRA e hormônios sexuais.................................................................................. 21
2 OBJETIVOS.......................................................................................................... 24
2.1 Objetivo Geral.................................................................................................... 25
2.2 Objetivos Específicos......................................................................................... 25
3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 26
3.1 Animais Experimentais...................................................................................... 27
3.2 Grupos Experimentais....................................................................................... 27
3.3 Protocolo experimental..................................................................................... 28
3.4 Registro da Pressão Sistólica (PAS) ................................................................ 29
8
3.5 Ovariectomia...................................................................................................... 30
3.6 Orquidectomia .................................................................................................. 31
3.7 Tratamento com inibidor da Enzima Conversora de Angiotensina.................... 33
3.8 Determinação fase do ciclo estral..................................................................... 33
3.9 Coleta de sangue para determinação da concentração das citocinas e da ECA............................................................................................................................. 36
3.10 Análise dos Níveis Séricos de IL-6 ,IL-10 e TNF-α .......................................... 36
3.11 Análise da atividade da ECA plasmática.............................................................. 37
3.12 Análise Estatística.............................................................................................. 38
4- RESULTADOS....................................................................................................... 39
4.1. Verificação do peso corporal inicial e final..................................................... 40
4.2 Verificação da PAS.............................................................................................. 40
4.3 Atividade da Enzima Conversora de Angiotensina ........................................ 42
4.4 IL-6....................................................................................................................... 43
4.5 TNF-α..................................................................................................................... 44
4.6 IL-10...................................................................................................................... 45
4.7 Razão IL-10/ TNF-α ......................................................................................... 46
4.8 Razão entre as citocinas IL-10/ IL-6.................................................................... 47
5- DISCUSSÃO........................................................................................................ 49
5.1 Diferenças sexuais no desenvolvimento da hipertensão.................................. 49
5.2 Diferenças sexuais nos níveis plasmáticos de citocinas e os efeitos do Enalapril 51
9
5.3 Diferenças entre os sexos no Balanço Citocinas............................................ 54
6- CONCLUSÃO........................................................................................................ 56
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 57
LISTA DE FIGURAS E TABELAS PAGINA
Figura 1: Resposta pró-inflamatória via NFkB, ativada pela Ang II e inibida pelo Quinalapril e outros IECAs................................................. 22
Figura 2: Organograma do protocolo experimental............................ 29
Figura 3: Fotografia da técnica de execução da ovariectomia............ 30
Figura 4: Desenho técnica de execução da orquidectomia................. 32
Figura 5: Fotografia do posicionamento da rata para realização da coleta do lavado vaginal...................................................................... 34
Figura 6: Lâmina com esfregaço vaginal- Fase Metaestro.................. 34
Figura 7: ilustração das fases do ciclo estral detectada através do esfregaço vaginal................................................................................. 35
Figura 8: Representação da PAS em mmHg e da variação do percentual de queda. .......................................................................... 41
Figura 9: Valores dos níveis de atividade da ECA. ............................. 42
Figura 10: Valores dos níveis séricos de IL-6...................................... 43
Figura 11: Valores dos níveis séricos de TNF-α. .............................. 44
Figura 12: Valores dos níveis séricos de IL-10.................................... 45
Figura 13: Razão de IL-10/TNF-α. ..................................................... 46
Figura 14: Razão de IL-10/TNF-α. ...................................................... 47
10
Tabela 1: Valores do peso corporal inicial e final............................................ 40
LISTA DE ABREVIATURAS
AFU Unidades arbitrarias de fluorescência
Ang II Angiotensina II
CEF Castrada tratada com enalapril Fêmea
CEM Castrado tratado com enalapril Macho
CSF Fatores Estimulador de Colônias
CVF Castrada tratada com veiculo Fêmea
CVM Castrado tratado com veiculo Macho
DCNT Doenças crônicas não transmissíveis
DCVs. Doenças cardiovasculares
ECA Enzima conversora de angiotensina
IECA Inibidor da enzima conversora de angiotensina
IFN Interferons
IL Interleucinas
NK Células natural killers
OVX Ovariectomia
PAS Pressão Arterial Sistólica
PCR Proteina c reativa
SEF Sham tratada com enalapril Fêmea
11
SEM Sham tratado com enalapril Macho
SVM Sham tratado com veiculo Macho
SHR Rato Espontaneamente Hipertenso
SRA Sistema renina angiotensina
SVF Sham tratada com veiculo Femea
Th. Linfócitos T auxiliares
TNF Fator de Necrose Tumoral RESUMO A Influência dos Hormônios Sexuais no Balanço entre as Citocinas Pró-inflamatórias e Anti-Inflamatórias em Machos e Fêmeas SHR, Após o Tratamento com Enalapril. Introdução: A angiotensina II, peptídeo formado a partir da ação da enzima conversora da angiotensina (ECA) sobre a angiotensina I, é um dos principais mediadores do sistema renina-angiotensina (SRA) e além de ter efeitos hemodinâmicos, está envolvida em eventos chaves do processo inflamatório. A utilização dos inibidores da ECA, além de benefícios hemodinâmicos, está associado a efeitos antiinflamatórios, entretanto, ainda não está claro se os IECAs possuem ação benéfica sobre o equilíbrio entre as citocinas pró e antiinflamatórias e se hormônios podem interferir nesta relação. Assim, este estudo foi desenhado para investigar em ratos SHR, machos e fêmeas, castrados e não castrados, o potencial benéfico dos inibidores da ECA nos níveis séricos dos biomarcadores inflamatórios, IL-10, IL-6, e TNF-α, uma vez que estas citocinas desempenham papéis importantes na patogênese de doenças inflamatórias. Objetivo: Avaliar a influência do gênero no efeito do enalapril sobre os níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e TNF-α) e antiinflamatória (IL-10) em ratos SHR. Metodologia: Ratos SHR, adultos, ambos os sexos, com 12 semanas, peso de 150 ± 8 g (fêmeas) e 230 ± 10g (machos), foram separados em 8 grupos experimentais (n=7) sendo: Fêmeas e Machos 1) SHAM + tratamento com veiculo, 2) SHAM + tratamento com Enalapril, 3)Castração + tratamento com Enalapril, 4)Castração + tratamento com veiculo. O tratamento por gavagem com Maleato de Enalapril (10mg/Kg/dia), foi iniciado após 21 dias da castração e teve duração de 4 semanas. Os animais do grupo Sham foram submetidos à cirurgia fictícia e os animais do grupo castrado, sofreram ovariectomia e orquidectomia bilateral, machos e fêmeas respectivamente. Foram analisadas a atividade da ECA plasmática as citocinas IL-10, IL-6, e TNF-α. Nivel de significância: p<0,05. Resultados: O enalapril reduziu e igualou a PAS e a atividade da ECA em todos os grupos tratados, observamos dimorfismo sexual nos níveis plasmáticos de IL-
12
10, TNF-α e IL-6 nos grupos sham, com valores maiores nas fêmeas. A retirada dos hormônios sexuais fez desaparecerem a diferença entre machos e fêmeas em relação ao citocinas inflamatórias e inverteu o padrão de resposta, ou seja, os machos tiveram aumento e as fêmeas redução de IL-10. Nos machos tanto a castração quanto o tratamento com enalapril aumentaram a IL-10 e reduziram a ECA. O tratamento com enalapril aumentou a IL-10 em todos os grupos tratados, dessa forma melhorou o balanço pró e antiinflamatório, independente do gênero. Conclusão: A neutralização das ações da angiotensina II por inibidores da ECA em SHR pode exercer efeitos antiinflamatórios e anti-hipertensivos, independentemente do sexo, mas dependente dos hormônios sexuais para reduzir citocinas pró-inflamatórias. Palavras-chave: Citocinas, dimorfismo sexual, enalapril, inflamação, ECA. ABSTRACT
The influence of sex hormones in the balance between pro-inflammatory and Anti-Inflammatory in male and female SHR, after treatment with enalapril. Introduction: Angiotensin II, a peptide formed from the action of angiotensin converting enzyme (ACE) on angiotensin I, is a primary mediator of the renin-angiotensin system (RAS) and in addition to hemodynamic effects, is involved in key events the inflammatory process. The use of ACE inhibitors, apart from hemodynamic benefits, is associated with anti-inflammatory effects, however, still unclear whether ACE inhibitors have beneficial effects on the balance between pro-and anti-inflammatory cytokines and hormones can interfere with this relationship. Thus, this study was designed to investigate in SHR rats, males and females, castrated and intact, the potential benefit of ACE inhibitors on serum levels of inflammatory biomarkers, IL-10, IL-6 and TNF-α, since that these cytokines play important roles in the pathogenesis of inflammatory diseases. Objective: To evaluate the influence of gender on the effect of enalapril on serum levels of proinflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and antiinflammatory (IL-10) in SHR rats. Methods: SHR, adults, both sexes, with 12 weeks, weight 150 ± 8 g (females) and 230 ± 10 g (males), were separated into eight experimental groups (n = 7) are: Males and Females 1) SHAM + Treatment with vehicle, 2) SHAM + treatment with enalapril, 3) castration + treatment with enalapril, 4) castration + treatment with vehicle. Treatment by gavage with enalapril (10mg/kg/day) was started after 21 days of castration and lasted 4 weeks. Sham group animals underwent sham surgery group and the castrated animals, underwent bilateral ovariectomy and orchidectomy, males and females respectively. We analyzed the plasma ACE activity of the cytokines IL-10, IL-6 and TNF-α. Level of significance: p <0.05. Results: Enalapril reduced SBP and ACE activity in all treated groups, we observed sexual dimorphism in plasma levels of IL-10, TNF-α and IL-6 in the sham groups, with higher values in females. The withdrawal of sex hormones made disappear the difference between males and females in relation to inflammatory cytokines and reversed the pattern of response. Enalapril
13
treatment increased IL-10 in all treated groups, thus improving the balance pro-and anti-inflammatory, regardless of gender. Conclusion: The neutralization of the actions of angiotensin II by ACE inhibitors in SHR may exert anti-inflammatory and anti-hypertensives, regardless of sex, but dependent on sex hormones to reduce pro-inflammatory cytokines. Keywords: Cytokines, sexual dimorphism, enalapril, inflammation, ACE.
14
1 - INTRODUÇÃO
1-INTRODUÇÃO
Componentes da resposta inflamatória são ativados em diversas doenças
cardiovasculares (Nickenig & Harrison, 2002; Savoia & Schiffrin, 2007) e
também em situação de deficiência de estrogênio (Kamada, 2001). Entre os
numerosos mediadores envolvidos nesta resposta inflamatória, citocinas pró-
inflamatórias exercem ações adversas que podem agravar o curso da
doença (Mehra e cols, 2005). Por outro lado, estudos demonstram que o
aumento de Angiotensina II (Ang II) está diretamente envolvido na hipertrofia
e proliferação celular, estresse oxidativo e resposta inflamatória (Dinh e cols.,
2001; Ferrario & Strawn, 2006), além de seus efeitos hemodinâmicos bem
definidos. Além disso, os inibidores da ECA possuem efeitos anti-
inflamatórios em pacientes com hipertensão arterial ou insuficiência cardíaca
congestiva (Ma e cols., 2010; Vijayaraghavan & Deedwania e cols., 2011).
Assim, estudos que avaliem a interação de citocinas, SRA e hormônios
sexuais em animais hipertensos podem contribuir para elucidar os possíveis
mecanismos pelos quais os inibidores da ECA exercem seus efeitos
imunomoduladores.
1.1 Doenças Cardiovasculares e Citocinas
O grupo das doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) compreende
majoritariamente doenças cardiovasculares, diabetes, câncer e doenças
15
respiratórias crônicas. Muitas doenças deste grupo têm fatores de risco
comuns, e demandam por assistência continuada de serviços e ônus
progressivo, na razão direta do envelhecimento dos indivíduos e da população.
No Brasil, segundo dados de 2009 do Sistema de Informação de Mortalidade,
as DCNT concentram 72% do total de óbitos, percentual que representa mais
de 742 mil mortes por ano. As que mais matam são as doenças
cardiovasculares (31,3%), o câncer (16,2%), as doenças respiratórias crônicas
(5,8%) e o diabetes mellitus (5,2%) (http://www.saude.gov.br).
Nos últimos anos, tem-se considerado o papel da inflamação subclínica na
progressão das doenças cardiovasculares (DCV) (Suliman & Stenvinkel,
2008; Mehra e cols., 2005). A inflamação é um processo fisiológico em
resposta a diferentes estímulos como infecções, alterações físico-químicas
ou danos traumáticos. A resposta inflamatória necessita ser precisamente
regulada, uma vez que deficiências ou excessos dessa resposta estão
diretamente relacionados com mortalidade e a morbidade (Tracey, 2002).
Uma grande variedade de doenças cardíacas tem sido associada à
inflamação e a modulação de citocinas. Estas incluem hipertensão,
aterosclerose, infarto agudo miocárdio, lesão de reperfusão cardíaca,
miocardite, rejeição do enxerto, sepse associada à disfunção cardíaca e
insuficiência cardíaca crônica (ICC) (Mehra e cols., 2005). As citocinas são
conhecidas por sofrerem “up-regulation” em pacientes com ICC e têm sido
implicadas na fisiopatologia desta doença. As citocinas são moléculas que
interligam, amplificam e propagam a resposta imune inata e adaptativa,
estão envolvidas em recrutar células para áreas de inflamação, estimulando
sua divisão, proliferação e diferenciação. A ação das citocinas sobre o
sistema cardiovascular está bem assentada em bases experimentais que
demonstram promoção de inflamação, disfunção endotelial, coagulação
intravascular, geração de radicais livres, perda gradativa de massa muscular
e intolerância ao exercício, entre outros efeitos ( Adamopoulos e cols., 2001;
Mann, 2002).
1.2 Citocinas
16
As citocinas são um grande grupo de proteínas reguladoras de baixo peso
molecular (15-30 kDa), que incluem, interleucinas (IL), Fatores de Necrose
Tumoral (TNF), Interferons (IFN), Fatores Estimulador de Colônias (CSF),
Fator Transformador de Crescimento (TGF), e as Quimiocinas. São
produzidas por diferentes células do sistema imunológico, como os
monócitos, macrófagos, células T ativadas, células B, células natural killer
(NK) e fibroblastos (Sprague & Khalil, 2009; Mehra e cols., 2005), e outras
células, fibroblastos, plaquetas, endotélio, músculo liso vascular (Torre-
Amione e cols.,2005;). Para exercer seus efeitos biológicos, as citocinas
ligam-se a receptores específicos na membrana da célula alvo e agem de
forma autócrina, parácrina e justacrina, ou seja, estimulam as células que as
produzem, as células adjacentes, ou ainda intervêm diretamente por meio da
interação célula-célula, respectivamente. Além disso, uma única citocina,
dependendo do tipo de célula, do tempo de liberação e da quantidade de
receptores no tecido, pode agir em diversos tipos de células e assim produzir
múltiplas respostas biológicas (pleiotropia) (Hirano,1999). Estas ações
podem ser sinérgicas, quando a associação de duas citocinas amplifica a
sua atividade como, por exemplo: IL-12 e IL-18, TNF-α IFN-y, antagônica,
quando suas atividades se opõem , IL-10 e TNF-α, (Bolger et al, 2002) ou
ainda pode ser redundante, quando diferentes citocinas possuem um mesmo
efeito sobre determinado tipo celular ,como a IL-6 e o TNF-α, (Tedgui &
Mallat,2006; Sprague & Khalil, 2009).
As citocinas podem ser classificadas de diversas formas, uma das mais
comuns é quanto a sua fonte celular, linfócitos T auxiliares (Th).
Classificadas em tipo Th-1 e tipo Th-2. As citocinas Th-1, como IL-2, IFN-γ, e
TNF-α, são principalmente pró-inflamatórias promovem a ativação de
macrófagos, células NK, neutrófilos, linfócitos citotóxicos, ampliam a
resposta imunológica celular e podem exacerbar o quadro em algumas
doenças como a aterosclerose (Calcagni & Elenkov, 2006; Sprague & Khalil,
2009; Mehra e cols.; 2005). As citocinas tipo Th-2, como a IL-4, IL-5, IL-6, IL-
10, são predominantemente anti-inflamatórias e tem o efeito de
contrabalançar a resposta pró-inflamatória por meio da diminuição das
citocinas pró-inflamatórias e da supressão da ativação de monócitos
17
(Dinarello, 2000; Calcagni & Elenkov, 2006; Sprague & Khalil, 2009). Apesar
da IL-6 ser classificada como uma citocina tipo Th2, ela apresenta caráter
dual e demostra ter efeitos variáveis (Kleemann e cols. 2008) devido a sua
capacidade de estimular e ser estimulada por outras citocinas,
principalmente a IL-1 e o TNF-α (Huber e cols. 1999) Os dois tipos de
resposta não agem isoladamente, dependem do tempo de liberação de
citocinas, da presença de fatores sinérgicos ou concorrentes, da densidade
de receptores de citocinas, da capacidade de resposta para cada citocina. O
equilíbrio na produção das citocinas do tipo Th1 e Th2 é essencial para
manter a homeostase no sistema imunológico e seu desequilíbrio está
envolvido na patogênese de muitas doenças humanas, como alergia e
doenças autoimunes, doenças infecciosas e septicemia, aterosclerose,
obesidade de tipo visceral, síndrome metabólica (Cizza e cols, 2001).
1.3 IL-6, TNF- e IL-10
Como descrito acima, a IL-6 e o TNF-α apresentam propriedades pró-
inflamatórias e pró-aterogênicas, enquanto a IL-10 tem papel fundamental na
supressão dessa resposta inflamatória. Assim, o balanço desses marcadores
biológicos pode vir a ser uma ferramenta benéfica no diagnóstico, tratamento e
prevenção de eventos vasculares (Ferrario & Strawn, 2006), por isso essas
citocinas tornaram-se objetos do nosso estudo.
Interleucina-6
A IL-6 é uma citocina multifuncional, sintetizada por monócitos, células
endoteliais, fibroblastos e outras células, em resposta a microrganismos e
também à estimulação por outras citocinas, principalmente interleucina-1
(IL-1) e TNF-α ( Heinrich & Andus, 1990). Constitui importante marcador
inflamatório por regular a resposta imune, as reações de fase aguda e a
principal citocina pró-coagulante, pois determina a produção e a elevação
das concentrações plasmáticas de fibrinogênio e em especial, da proteína C
reativa (PCR), por estimular a síntese no fígado destas proteínas (Willerson
& Ridker, 2004; Yudkin e cols.; 1999). Embora, ainda não haja consenso
sobre métodos de dosagem e valores de referência para a IL-6, sabe-se que
18
ela é normalmente é expressa em níveis baixos, exceto durante infecção,
trauma ou outros fatores estressores. Entre os vários fatores que regulam a
expressão do gene da IL-6, estão o estrogênio e a testosterona (Ershler &
Keller, 2000).
Na Síndrome Metabólica (SM), o aumento da IL-6 se correlaciona, de forma
dependente da obesidade, com aumento da glicemia, circunferência da cintura,
níveis séricos de triglicerídeos e de HDL-colesterol, pressão sistólica, pressão
diastólica e a obesidade (Volp e cols, 2008). Em homens aparentemente
saudáveis, níveis elevados de IL-6 estão associados ao risco aumentado de
futuras isquemias miocárdicas (Ridker e cols, 2000). Na Insuficiência cardíaca,
na aterosclerose, na hipertrofia cardíaca (Haugen e cols., 2008), os níveis
periféricos da IL- 6 e expressão miocárdica do mRNA, desta citocina e de seu
receptor estão aumentados de forma significativa e quanto mais elevada, pior
a gravidade da doença, apresentando duas vezes mais o risco de óbito em 24
meses (Rauchhaus e cols,. 2000). Desta forma, os níveis desta citocina podem
predizer morbidade em pessoas saudáveis e mortalidade em pessoas que já
apresentaram algum evento cardiovascular (Francisco e cols., 2006).
Fator de Necrose Tumoral-α
Classicamente, o TNF-α é descrito como uma citocina versátil que altera o
remodelamento tecidual, a permeabilidade da barreira de células epiteliais,
promove ativação de macrófagos e recrutamento de infiltrados inflamatórios,
além de amplificar as respostas de moléculas de adesão. É produzido, não
apenas por células do sistema imune como os macrófagos e mastócitos, mas
também por outras células como a músculo liso e do tecido adiposo (Sprague &
Khalil, 2009). Atua, preferencialmente, por meio de dois receptores da família
de receptores de TNF-α, o TNF-R1 de 55 kDa, e o TNF-R2 de 75 kDa. A
ligação do TNF-α a esses receptores induz a transdução do sinal intracelular
que pode resultar na ativação de diferentes eventos como regulação da
apoptose, indução de genes de resposta imediata e ativação da transcrição de
genes de resposta inflamatória, inclusive genes codificadores de outras
citocinas como IL-1β, IL-6 e IL-10 (Hotamisligil, 2003).
19
O TNF-α, assim como a IL-6, é mediador central da resposta de fase aguda da
resposta imune, pois também determina a produção e a elevação das
concentrações plasmáticas de fibrinogênio, inibidor do ativador de
plasminogênio-1 (PAI-1) e, em especial, da PCR (Francisco e cols, 2006;
Willerson & Ridker, 2004; Yudkin e cols, 1999). Desempenha papel importante
na fisiopatologia, em uma variedade de infecções e doenças inflamatórias,
como a artrite reumatóide, asma, choque séptico, febre hemorrágica, caquexia,
resistência insulínica relacionada à obesidade e grande variedade de tumores
(Beutler & Cerami, 1988) e hipertensão (Agarwal e cols., 2009). No infarto do
miocárdio, por meio de diversos efeitos em quase todos os tipos celulares
envolvidos na lesão cardíaca, o TNF-α é capaz de suprimir a contratilidade
cardíaca, aumentar apoptose dos cardiomiócitos (Engel e cols., 2004),
estimular a expressão de outras citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e
moléculas de adesão por leucócitos e células endoteliais, além de regular
metabolismo da matriz extracelular, reduzindo a síntese de colágeno,
aumentando as Metalloproteinases de Matrix e a atividade em fibroblastos
cardíacos (Siwik e cols., 2000).
Interleucina-10
Foi originalmente descrita como um fator de inibição da síntese de citocina
devido a sua capacidade de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias por
meio dos macrófagos e das células Th1. A IL-10, hoje é reconhecida como uma
das mais importantes citocinas anti-inflamatórias e anti-aterogênicas (Wang e
cols., 2009;Kaur e cols., 2009). Além de inibir a proliferação das células Th1, a
IL-10 estimula a proliferação das células Th2 e a ativação de células NK
(Thompson et cols. 1991). Como já descrito, as células Th1 são facilitadoras de
uma resposta imunológica pró-inflamatória, pois secretam interleucina IL-1β, IL-
2, IL-12, interferon-γ e o TNF-α, e as células Th2 por secretarem as citocinas
IL-4, IL -6, IL -10 e IL -13 contribuem para uma resposta anti-inflamatória
(Lakoski e cols., 2008; Kaur e cols., 2009). Assim a IL-10, além de facilitar o
desenvolvimento de respostas das células Th2, é capaz de diminuir a função
citolítica e secretora de citocinas por Th1, constituindo componente chave em
muitos aspectos da resposta imune (Moore e cols.,2001). Do mesmo modo, a
20
redução da produção de IL-10 pode estar associada a uma maior
suscetibilidade a doenças infecciosas e a verificação da redução do nível sérico
de IL-10, não é apenas um biomarcador de aumento do risco de eventos
cardiovasculares como também é indicativo de mau prognóstico (Kleemann e
cols., 2008; Tziakas e cols., 2003). Em pacientes com síndrome coronariana
aguda, baixos níveis séricos de IL-10, estão associados com a instabilidade da
placa aterosclerótica e altos níveis demonstraram diminuição do risco (Tziakas
e cols., 2003).
A IL-10 também pode agir como um antagonista do TNF-α, contrabalançando
os efeitos adversos desta citocina pró-inflamatória (Dhingra e cols. 2007),
sendo um componente de neutralização da inflamação, uma vez que reduz a
duração e a magnitude do processo (Kaur e cols., 2006;2009). Ambas citocinas
são fundamentais para o equilíbrio entre as células Th1/Th2, no qual o
desequilíbrio está criticamente envolvido em várias infecções (Yndestad e cols.,
2007). A diminuição de IL-10 ou o aumento na proporção de TNF-α parecem
estar correlacionados com lesões ateroscleróticas, angina instável, síndrome
coronariana aguda, atopias e tumores. (Fearon & Locksley, 1996). No coração
o desequilíbrio entre estas duas citocinas pode resultar em resposta
inflamatória e assim promover papel patogênico na progressão das doenças
cardiovasculares (Kaur e cols., 2009; Yndestad e cols, 2007).
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a maneira pela qual a IL-
10 inibe a síntese das citocinas pró-inflamatórias. (Schottelius e cols, 1999).
Uma das mais estudadas é a inibição do fator de transcrição nuclear NFkB
(Wang e cols., 1995; Fernández & Kaski, 2002). O NFk-b é um fator de
transcrição que regula diversas substâncias pró-inflamatórias e pode ser
ativado por múltiplos estímulos, como hipóxia, espécies reativas de oxigênio,
endotoxinas bacteriana, citocinas, entre outros (Valen e cols, 2001; Henke e
cols., 2007). O tecido miocárdico de pacientes com IC de diversas etiologias
exibe aumento da expressão dessa molécula e dos genes que ela regula, como
por exemplo, à síntese do TNF-α, moléculas de adesão leucocitária e de
metaloproteinases. Já foi demonstrado que muitos tipos celulares em cultura,
como células endoteliais, macrófagos, leucócitos e cardiomiócitos, respondem
21
a alguns estímulos de citocinas com a síntese de NFk-b em um padrão de
retroalimentação positiva que perpetua a própria ativação inflamatória (Valen e
cols., 2001). Quando não estimulado, o fator NF-kB encontra-se no citoplasma
ligado a uma proteína inibitória: o IkB. Esse complexo impede a translocação
do NF-kB para o núcleo. Assim, a fosforilação e a degradação do IkB são
necessárias para que ocorra a translocação. Vários estímulos levam à
fosforilação do IkB, que é fundamental para sua degradação. A proteína IkB
fosforilada recebe a adição de ubiquitina, pela ação da ubiquitina ligase, sendo
em seguida degradada pelo complexo proteossoma 26S. Isso resulta na
liberação do NF-kB. O desmembramento do complexo IkB/NF-kB permite o
transporte do NF-kB para o núcleo, com consequente ligação desse nos genes
junto à região promotora, levando a um aumento na expressão do gene alvo
(Schottelius e cols.,1999; Baldwin, 1996). Na sepse, o estímulo com LPS
fosforila o IkB e promove a translocação do NF-kB para o núcleo onde ele vai
estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias. A implicação desse fator
de transcrição como alvo terapêutico decorre da enorme quantidade de genes
que sofrem regulação pelo fator NF-kB, e participam de vários processos
celulares, tais como desenvolvimento, plasticidade, morte e defesa celular e
consequentemente também estão implicados em doenças como aterosclerose,
asma, artrite, câncer, distrofia muscular, infarto e infecções virais (Kumar e
cols., 2004). Segundo Schottelius e cols.,1999, a IL-10 bloqueia a degradação
IkBα e assim inibe a translocação nuclear do NF-kB e consequentemente sua
atividade. Assim, muitos de seus efeitos antiinflamatórios podem ser por meio
desse mecanismo (Savoia & Schiffrin, 2007; Raines e cols, 2004).
1.4 SRA e hormônios sexuais.
Estudos demonstram que o aumento de Ang II, peptídeo formado a partir da
ação da enzima conversora da angiotensina (ECA) sobre a angiotensina I, um
dos principais mediadores do SRA, está diretamente envolvido no crescimento,
na proliferação celular, no estresse oxidativo e na resposta inflamatória (Dinh e
cols., 2001; Ferrario & Strawn, 2006, Graninger e cols., 2004; Ruiz-Ortega e
cols., 2001) por meio da ativação do NF-kB (Brasier e cols., 2000, Hall e cols.
2006). Assim, além de seus efeitos hemodinâmicos, o foco tornou-se o
22
entendimento da Ang II como modulador da inflamação. Ang II aumenta a
permeabilidade vascular, recruta células inflamatórias para o tecido, e ativa
diretamente a infiltração de células imunes competentes (Suzuki e cols. 2003) e
media o processo pró-inflamatório, promovendo a geração de citocinas e
radicais livres (Ruiz-Ortega e cols, 2001). Por outro lado, pesquisa recente
também descreve que citocinas, como a IL-10, pode limitar o estresse oxidativo
e a disfunção vascular mediada pela Ang II e promover um efeito protetor na
parede vascular (Didion e cols., 2009).
Os inibidores da ECA são eficazes em reduzir a pressão arterial e regredir a
hipertrofia ventricular esquerda tanto em humanos com hipertensão essencial,
quanto em modelos animais de hipertensão arterial, como o SHR (Vapaatalo e
cols, 2000; Uggere e cols., 2000). Adicionalmente, podem reverter o aumento
na produção de superóxido e a ativação do sistema NF-kB, reduzir a elevada
expressão de citocinas pró-inflamatórias, em aortas de ratos (Gonzalez e cols,
2000) e em modelo de aterosclerose em coelhos (Hernandez-Presa e
cols,1997) e bloquear a ativação do NF-kB em pulmões de ratos Sprague-
Dawley, após o tratamento com um inibidor da ECA (He e cols., 2007). O
bloqueio do NFkB pelo IECA representado na figura 1 (Egido & Ruiz-Ortega,
2007).
23
Sabe-se que os hormônios sexuais são capazes de modular a ação de
citocinas e do SRA, e que as diferenças na produção de citocinas na
suscetibilidade a doenças podem ser devido a diferenças de gênero (Cutolo
cols., 1996; Tamir cols., 2002, Katzenellenbogen e cols., 1990). Nas células
vasculares do musculo liso, em humanos, o estrogênio inibe a expressão da IL
-1, e IL-6, demonstrando os efeitos de anti-inflamatórios do estrogênio. Estudos
in vitro, demonstram evidência que a testosterona pode suprimir a expressão
de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, IL-1ß e IL-6 (D'Agostino e cols.,
1999) e potencializar a expressão de antiinflamatórias como a citocina IL-10
(Bebo e cols., 1999). Em ratos hipertensos a atividade da ECA é maior em
machos do que em fêmeas (Pendergrass e cols., 2008) e administração de
estrogênio em fêmeas ovariectomizadas transgênicas (mRen2)27 diminui a
atividade da ECA no plasma, rim e aorta (Brosnihan e cols., 1997). Diferenças
entre machos e fêmeas em relação aos outros componentes do SRA, como a
concentração de Ang II (Miller e cols., 1999; Pollock, 2007) e o
Figura 1 Resposta pró-inflamatória via NFkB, ativada pela Ang II e inibida pelo Quinalapril e outros IECAs. Anti-inflammatory Actions of Quinapril. Egido & Ruiz-Ortega Cardiovasc Drugs Ther (2007).
24
angiotensinogênio (Danser e cols., 1999; Yanes e cols., 2009) também são
encontradas.
A medição das citocinas pode ser uma ferramenta benéfica no diagnóstico,
tratamento e prevenção de eventos vasculares, além de ser importante na
determinação da eficácia de agentes antiinflamatórios usados na doença
vascular, monitorando os componentes da via inflamatória e fornecendo
informações importantes sobre a gravidade e progressão das DCVs.
Além disso, embora os inibidores da ECA tenham revelado efeitos
antiinflamatórios inclusive em pacientes com hipertensão arterial ou
insuficiência cardíaca congestiva (Ma e cols., 2010; Vijayaraghavan &
Deedwania e cols., 2011), ainda não está claro sua ação sobre o equilíbrio
entre as citocinas pró e antiinflamatórias.
Assim, este estudo foi desenhado para investigar em ratos SHR, machos e
fêmeas, o potencial benéfico dos inibidores da ECA nos níveis séricos dos
biomarcadores inflamatórios, IL-10, IL-6, e TNF-α, uma vez que os mesmos
desempenham papéis importantes na patogênese de doenças inflamatórias.
25
2- OBJETIVOS
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
26
Avaliar a influência do gênero no efeito do enalapril sobre os níveis séricos
das citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e TNF-α) e anti-inflamatória (IL-10) em
ratos SHR.
2.2 Objetivos Específicos
Determinar os efeitos do tratamento com enalapril sobre:
• O peso corporal de ratos SHR, machos e fêmeas, castrados e não
castrados.
• PAS de ratos SHR, machos e fêmeas, castrados e não castrados.
• Atividade plasmática da enzima conversora de angiotensina (ECA)
em ratos SHR, machos e fêmeas, castrados e não castrados.
• Balanço de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatória (IL-10/
TNF- α e IL-10/ IL-6).
27
3-MATERIAIS E MÉTODOS
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais Experimentais
28
Todos os procedimentos experimentais adotados obedeceram às normas
estabelecidas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade
Federal do Espírito Santo (UFES), aprovados sob o n° 023/2009. Foram
utilizados ratos espontaneamente hipertensos (SHR) adultos, ambos os sexos,
com 12 semanas de idade, peso inicial de 150 ± 8 g (fêmeas) e 230 ± 10g
(machos), provenientes do Biotério da UFES. Esses animais foram mantidos
em ambiente, temperatura (20-24ºC) e luz controlada. Ciclo claro-escuro de 12
horas. Todos os animais receberam água e ração de modo irrestrito.
3.2 Grupos Experimentais
Os animais foram separados em 8 grupos experimentais, n= 7, sendo:
Fêmeas:
1. Sham tratada com veiculo veículo (SVF)
2. Sham tratada com enalapril fêmea (SEF)
3. Castrada tratada com veiculo (CVF)
4. Castrada tratada com enalapril (CEF)
Machos:
1. Sham tratado com veiculo macho (SVM)
2. Sham tratado com enalapril macho (SEM)
3. Castrado tratado com veiculo (CVM)
4. Castrado tratado com enalapril (CEM)
3.3 Protocolo experimental
1° semana do protocolo (11 semanas de idade)
29
• Aclimatação
• Determinação da PAS por pletismografia
2° semana do protocolo (12 semanas de idade)
• Determinação da PAS por pletismografia
• Verificação do peso corporal
• Execução da técnica de Orquidectomia e Ovariectomia nos
animais, com exceção dos animais SHAM, no quais se realizou
cirurgia fictícia.
3° e 4° semana do protocolo (13 e 14 semanas de idade)
• Verificação do peso corporal
5°, 6°, 7°, 8° semana do protocolo (15 16,17e18 semanas de idade)
• Verificação do peso corporal e cálculo da dose a ser administrada nos
animais tratados com maleato de enalapril. Os animais tratados com
veiculo receberam água.
7° semana do protocolo, grupo de fêmeas sham (Fêmeas - 18 semanas de
idade)
• Determinação e acompanhamento da fase do ciclo estral
8 ° semana do protocolo (19 semanas de idade)
• Medida da PAS por pletismografia
30
• Determinação e acompanhamento da fase do ciclo estral
• Coleta, centrifugação e armazenagem do soro e plasma para
posterior análise dos níveis séricos das citocinas (IL-6,IL-10,TNF-α)
Figura 2: Organograma do protocolo experimental
3.4 Registro da Pressão Sistólica (PAS)
Para determinação da PAS foi utilizado o método de Pletismografia de cauda,
fabricado pela II TC Life Science Inc (Woodland Hills, CA, EUA). Os ratos foram
acondicionados em um tubo cilíndrico de acrílico, no qual a região proximal da
cauda se encaixava a um manguito de borracha ligado ao esfigmomanômetro
para insuflar e desinsuflar automaticamente em intervalos fixos de
aproximadamente 40 segundos. Próximo ao manguito estava acoplado um
transdutor de pulso (sensor) que captava os sinais a serem enviados e
registrados no computador. O experimento só teve início após um período de
aclimatação, onde os animais por três vezes, em dias diferentes, por dez
minutos, foram submetidos à mesma situação de medida da PAS. Este
procedimento tem o objetivo de adaptá-los a situação de medida, para que ele
31
se movimente a menor quantidade de vezes possível durante o registro. A
pressão arterial foi medida pelo menos cinco vezes para cada animal.
3.5 Ovariectomia
A ovariectomia foi realizada bilateralmente sob anestesia com cloral
hidratado 10% (Vetec Química Fina LTDA, RJ Brasil). A cirurgia consistiu de
uma incisão perpendicular de 1 a 1,5 cm na pele entre a última costela e a
coxa, a 1 cm da linha mediana, seguida de uma outra incisão perpendicular
na camada muscular para abertura da cavidade peritoneal, como
demonstrado na figura 3. Posteriormente, foi realizada ligadura da tuba
uterina e remoção dos ovários. A cavidade peritoneal foi então suturada e
limpa e ao final do procedimento os animais receberam 0,1 ml por 100 g de
peso do antibiótico Enrofloxacina 2,5% (Flotril ® Shering- Plough) por via
intramuscular e em seguida recolocados em gaiolas individuais. No grupo
SHAM foi realizada uma cirurgia fictícia de ovariectomia, a fim de estabelecer
parâmetros semelhantes em todos os animais deste estudo.
3.6 Orquidectomia
Figura 3: Fotografia da técnica de
execução da ovariectomia.
32
A orquidectomia foi realizada sob anestesia com cloral hidratado 10% (Vetec
Química Fina LTDA, RJ Brasil). A cirurgia consistiu em uma incisão
perpendicular de 0,5 a 1,0 cm no tegumento e celular subcutâneo da bolsa
escrotal, rompendo a cavidade escrotal, em seguida realizou-se outra incisão
na camada muscular até atingir a túnica vaginallis. Os testículos foram
expostos por compressão e uma ligadura feita em torno do cordão
espermático para posterior remoção das gônadas, como demonstrado na
figura 4 (A-J). Ao final do procedimento os animais receberam 0,1 ml por 100
g de peso do antibiótico Enrofloxacina 2,5% (Flotril ® Shering- Plough) em
seguida recolocados em gaiolas individuais. No grupo SHAM foi realizada
uma cirurgia fictícia de orquidectomia, a fim de estabelecer parâmetros
semelhantes em todos os animais deste estudo.
33
A
Figura 4: desenho técnica de execução da orquidectomia. Prof. Dr.
Norberto G. Cairasco, Fisiologia, FMRP, USP
34
3.7 Tratamento com inibidor da Enzima Conversora de Angiotensina
Os animais SHR, após 21 dias de castração ou cirurgia fictícia (SHAM), foram
submetidos ao tratamento diário com maleato de enalapril (10 mg/kg/dia ) , um
inibidor da enzima conversora da angiotensina (IECA) durante 4 semanas nos
machos e devido a fase do ciclo estral ,as fêmeas sham 4 semanas ±2 dias. O
tratamento foi administrado por gavagem intragástrica. Para tanto, os animais
foram pesados semanalmente para ajuste da dose.
3.8 Determinação fase do ciclo estral
O ciclo estral da rata com duração de 4 ou 5 dias é caracterizado por 4 fases,
proestro, estro, metaestro e diestro, que foram monitoradas por meio da
técnica de esfregaço vaginal , na qual o posicionamento da rata esta
demonstrado na figura 5. Através da observação a fresco de três tipos
celulares, Células Nucleadas, Epiteliais e Leucócitos, é possível a
determinação da fase do ciclo, como demonstrado nas figuras 6 e 7. O fluido
vaginal foi coletado através de micro pipetas plásticas contendo 0,1 mL de
solução salina (NaCl 0,9%) em seguida transferido para lâminas de vidro e
sobrepostos com lamínulas para posterior observação em microscópio ótico
com lente objetivas de 10x e 40 x de aumento. Este procedimento foi realizado
diariamente, durante 7 a 10 dias, entre 8:00 e 10:00 hs da manhã ( Becker
2005, Marcondes ,2002) . Utilizaram-se no experimento somente ratas com
ciclos estrais regulares, e o sacrifício sempre no proestro.
35
Figura 6: Lâmina com esfregaço vaginal- Fase Metaestro.
Figura 5: Fotografia do posicionamento da rata para
realização da coleta do lavado vaginal.
36
Figura 7: ilustra as fases do ciclo estral detectada através do esfregaço vaginal em microscópio ótico com um aumento de 40 vezes.
A- Metaestro ou Diestro I- caracterizada por um pouco das 3 células. (Células Nucleadas, Epiteliais e Leucócitos).
B- Diestro II- caracterizada por infiltrado leucocitário
C- Proestro – caracterizada por presença predominante de células nucleadas
D- Estro – caracterizada por presença predominante de células epiteliais.
37
3.9 Coleta de sangue para determinação da concentração das citocinas e
da atividade da enzima conversora de angiotensina.
Um dia após a segunda medida da PAS, os animais foram decapitados, sem
anestesia, e aproximadamente 8 ml de sangue foi coletado em 2 alíquotas de
aproximadamente 4 ml cada. Uma em tubos vazios para obtenção soro para
dosagem das citocinas e outra em tubo heparinizado para dosagem da
atividade da enzima conversora de angiotensina. As amostras de soro e
plasma foram centrifugadas a 4°C, a 1000g por 15 minutos, em seguida
armazenadas a -80°C até o momento das dosagens.
3.10 Análise dos Níveis Séricos de IL-6 ,IL-10 e TNF-α pela técnica ELISA
(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
Os níveis das citocinas pró-inflamatórias Interleucina 6 (IL-6) e Fator de
Necrose Tumoral Alfa (TNF-α), e o da citocina anti-inflamatória Interleucina 10
(IL-10) foram determinados através do método de Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay (ELISA) por meio de kits da Invitrogen-BioSource International
(Camarillo, CA) em parceria com o Núcleo de Doenças Infecciosas (NDI) da
Universidade Federal do Espírito Santo - UFES em amostras de soro dos
animais. A técnica se baseia no método sanduíche. Amostras de soro
armazenadas a -80°C foram previamente descongeladas e colocadas em
placas individuais sensibilizadas com anticorpo específico para interleucina IL-
6, IL-10 e outra para TNF-α de rato. As amostras, incluindo os padrões de
conteúdos conhecidos de IL-6, IL-10 e TNF-α e espécimes controle foram
38
pipetados para os diferentes poços, seguidos da adição de um segundo
anticorpo monoclonal conjugado. Após esta etapa seguiu-se o período de
incubação por 2 horas. Durante a primeira incubação a IL-6, IL-10 e o TNF-α se
ligam simultaneamente ao anticorpo imobilizado (captação) em um sítio, e ao
segundo anticorpo conjugado (adicionado) em um segundo sítio. Após a
remoção do excesso de segundo anticorpo por 4 sucessivas lavagens, a
estreptavidina-peroxidase (enzima) foi adicionada. Esta se liga ao anticorpo
conjugado para completar os quatro membros do sanduíche. Após uma nova
incubação por 30 minutos e novamente 4 sucessivas lavagens para remoção
de todas as enzimas não ligadas, uma solução substrato (cromógeno) foi
adicionada e que reage com a enzima para produção de cor (azul). A
intensidade do produto colorido é diretamente proporcional à concentração das
citocinas presentes. O procedimento do ELISA foi realizado para duplicatas das
amostras e padrões, sendo realizada a média entre as absorbâncias a partir da
leitura realizada através do aparelho Dynex Technologies – analisador
automático de ELISA, em comprimento de onda de 450nm. Para correções de
diluições sofridas durante o procedimento, as médias foram multiplicadas por 2,
obtendo-se o valor real da absorbância.
3.11 Análise da atividade da ECA plasmática (espectrofotofluorimetria)
Protocolo para a determinação da atividade da ECA
O ensaio, para a medida da atividade proteolítica da enzima conversora de
angiotensina I (ECA-I), empregou o substrato Abz_FRK(Dnp)P-OH, ideal para
os estudos em cinéticas enzimáticas e para a análise da atividade somática
dos domínios C e N da ECA-I. Os ensaios foram realizados diretamente em
39
Espectroflorímetro (TECAN GENios) de microplaca automático equipado com
controlador de temperatura e shaker, placa de 96 poços de poliestireno preta.
As amostras de plasma foram descongeladas em gelo. Em cada poço da
microplaca, foi colocada 20 µl de amostra de plasma do grupo pretendido, em
seguida adicionou-se a mistura do tampão de ensaio (12,1 g de Tris.Base, 2,92
g de NaCl em 1 litro de água deionizada, o pH 7,0 ajustado com HCl) e 10 Μm
de Abz-FRK (dnp)P-OH .Gravou-se o aumento da fluorescência com excitação
- λex: 320nm e emissão λem: 420 nm, com a temperatura de 37ºC e agitação
constante. A atividade da Eca foi expressa em AFU (unidades arbitrarias de
fluorescência) (Carmona e cols., 2006).
3.12 Análise Estatística
Os dados estão expressos como média ± erro padrão da média (EPM), N
experimental de cinco animais para interleucinas e 7 para PAS. As diferenças
estatísticas entre os grupos foram determinadas por análise de variância
(ANOVA) de duas vias para os fatores tratamento e sexo, com medidas
repetidas, seguida de teste de comparação de médias (post hoc) de Fisher.
Todos os resultados foram avaliados através do software GB-Stat School Pak
®. Valores de p menores ou iguais a 0,05 foram considerados significativos.
40
5 - RESULTADOS
41
GRUPOS Peso inicial Peso Final
(g) (g)
SVM 232 ± 8* 278 ± 4 * SVF 158 ± 4 187 ± 3 SEM 224 ± 5* 264 ± 7 * SEF 152 ± 5 183 ± 4 CVM 239 ± 6* 280 ± 6 * CVF 153 ± 3 217 ± 5 + CEM 236 ± 3* 264 ± 5* CEF 157 ± 5 216 ± 3 +
4- RESULTADOS
4.1. Verificação do peso corporal inicial e final.
Na tabela 1 está representado o peso corporal dos animais experimentais que
foi medido no início e ao final do tratamento. No início do estudo não há
diferença do peso corporal entre os grupos do mesmo sexo analisados.
Comparando fêmeas ovariectomizadas com fêmeas SHAM, houve aumento no
peso corporal final, diferentemente do macho que não houve diferença quando
comparado aos outros grupos do mesmo sexo. Tanto o peso inicial, quanto o
peso final foram diferentes entre os sexos.
Tabela 1: Valores do peso corporal nos grupos Sham Veículo Macho (SVM), Sham Veículo Fêmea (SVF), Sham + Enalapril Macho (SEM), Sham + Enalapril Fêmea (SEF), Castrados + Veiculo Macho (CVM), Castrados + Veiculo Fêmea (CVF), Castrados + Enalapril Macho (CEM) e Castrados + Enalapril Fêmea (CEF).
Os valores foram apresentados com média ± EPM. *p<0,05 quando comparado á fêmea do mesmo grupo, + p<0,05 quando comparado ao grupo SV do mesmo sexo.
4.2 Verificação da PAS
42
Ao inicio do protocolo experimental, a PAS inicial dos machos se apresentou
diferente das fêmeas, entretanto, não houve diferença entre os grupos do
mesmo sexo (machos 219 ± 5 mmHg e fêmeas 177 ± 3 mmHg, p <0,05). Ao
final do período experimental, como representado na Figura 8 (Painel A e B)
observamos a diferença sexual nos níveis de PAS entre os animais do grupo
Sham Veiculo (SV machos: 222 ± 5 mmHg, SV fêmeas: 188 ± 3,6mmHg).
Como esperado, o tratamento com enalapril não só foi capaz de reduzir a PAS,
em ambos os sexos, como também as igualou (SE machos: 153 ± 5 mmHg, SE
fêmeas: 152 ± 2 mmHg) e fêmeas (152 mmHg). O percentual de queda nos
machos foi de -31%, enquanto nas fêmeas foi de -19%. A castração em ambos
os sexos, manteve a PAS a níveis semelhantes aos dos animais Sham Veículo
(CVM: 221 ± 3 mmHg, CVF: 192 ± 2 mmHg). O tratamento com enalapril em
ratos castrados, da mesma forma que no grupo sham veiculo, reduziu e igualou
a PAS (CEM: 148 ± 4 mmHg; -33%/ CEF: 139 ± 3 mmHg; -25%)
desaparecendo a diferença entre o sexos.
Figura 8: (Painel A e B). Representação da PAS em mmHg (A) e da variação do percentual de queda (B) da PAS dos grupos Sham Veículo (SV), Sham + Enalapril (SE), Castrado + Veiculo (CV), Castrado + Enalapril (CE). Os valores foram apresentados com média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo grupo ; + p< 0,05 vs animal sham veiculo ; # p< 0,05 vs animal do mesmo sexo castrado.
100
125
150
175
200
225
250
SV SE CV CE
* *
+ ++#
+#
PAS (mmHg)
-35-30-25-20-15-10-5051015
SE CV CE
*+
+
*+#
MACHO
FEMEA
+#
delta PAS (%)
A B
43
4.3 Atividade da Enzima Conversora de Angiotensina
Na Figura 09 observamos a diferença sexual na atividade da ECA no grupo
Sham, com o macho apresentando o maior valor (SV machos: 1500 ± 131 ± 1,2
UAF; SV fêmeas: 1234 ± 80 UAF). O tratamento com enalapril foi eficiente em
reduzir a atividade da ECA. A castração nos machos promoveu diminuição na
atividade da ECA plasmática, enquanto na fêmea não houve alteração em
relação ao grupo SVM (CVM: 790 ± 58 UAF, CVF: 1161 ± 39 UAF). O
tratamento com enalapril foi efetivo em ambos os grupos, castrados e não
castrados. (SEM: 59 ± 20 UAF; SEF: 21 ± 4 UAF; CEM: 8 ± 5 UAF; CEF: 32 ± 3
UAF).
0306090700
950
1200
1450
1700
+
* +
+ + #
SV SE CV CE
+
*
+ #
MACHO
FEMEA
ECA/ UAF
Figura 9: Valores dos níveis de atividade da ECA nos grupos Sham Veiculo (SV), Sham Enalapril (SE), Castrado Veiculo (CV), Castrado Enalapril (CE). Os valores foram apresentados com média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo grupo ; + p< 0,05 vs animais do mesmo sexo, do grupo SV; # p< 0,05 vs animais do mesmo sexo do grupo CV.
44
4.4 IL-6
Na figura 10 estão demonstrados os resultados referentes à dosagem da
citocina IL-6. Pode se observar dimorfismo sexual entre os animais do
grupo Sham Veiculo, (SVM: 7,2 ± 0,2 pg/ml; SVF: 10,31± 0,2 pg/ml). O
tratamento com enalapril, a castração e as duas intervenções
associadas, reduziram e igualaram os níveis desta citocina em ambos os
sexos (SEM: 3.31 ± 0.9 pg/ml; SEF: 3.46 ± 0.2 pg/ml e CVM: 4,2 ± 0,23
pg/ml; CVF: 4,07 ± 0,6 pg/ml, CEM: 5,9 ± 0.4 pg/ml e CEM: 5,5 ± 0,6
pg/ml).
2
6
10
14
SV SE CV CE
+
*
++
+
++
MACHO
FEMEA
IL-6 (pg/ml)
Figura 10: Valores dos níveis séricos de IL-6 nos grupos Sham Veiculo (SV), Sham Enalapril (SE), Castrado Veiculo (CV), Castrado Enalapril (CE). Os valores foram apresentados com média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo grupo ; + p< 0,05 vs a animais do mesmo sexo, do grupo SV.
45
4.5 TNF-α
Em relação à citocina pró-inflamatória TNF-α, como representado na figura 11,
observamos que no grupo Sham veiculo, as fêmeas apresentaram maiores
valores desta citocina que os machos (SVM: 12,76 ± 1.02 pg/ml; SVF: 16,30 ±
1,6 pg/ml). Nos machos, não foi observada mudança em nenhum dos grupos
estudados (SEM: 14,06 ± 0,49 pg/ml; CVM 12,7 ± 1,0 pg/ml; CEM: 14,2 ± 1,2
pg/ml). Diferentemente do grupo de fêmeas, nos quais tanto o tratamento com
enalapril quanto a castração, reduziram as concentrações desta citocina (SEF:
13,0 ± 1,2 pg/ml; CVF: 10,9 ± 0,8 pg/ml; CEF: 12,7 ± 1,6 pg/ml).
3
7
11
15
19
SV SE CV CE
+*
MACHO
FEMEA+ +
TN
F-α
(p
g/m
l)
Figura 11: Valores dos níveis séricos de TNF-α nos grupos Sham Veiculo (SV),
Sham Enalapril (SE), Castrado Veiculo (CV), Castrado Enalapril (CE). Os
valores foram apresentados com média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo
grupo; + p< 0,05 vs grupo sham veiculo do mesmo sexo
46
4.6 IL-10
Conforme figura12, demonstramos dimorfismo sexual nas concentrações sérica
de IL-10 observadas entre o grupo Sham Veiculo (SVM: 12,8 ± 1,2 pg/ml, SVF:
16,4 ± 1,1 pg/ml) e também entre o grupo Castrado Veiculo (CVM: 15,3 ± 2,1
pg/ml, CVF: 8,9 ± 0,9 pg/ml). Ainda nesta figura, observamos que o tratamento
com enalapril no grupo Sham, em ambos os sexos, foi capaz de aumentar as
concentrações de IL-10. (SEM: 19,2 ± 3,1 pg/ml, SEF: 23,5 ± 1,8 pg/ml),
diferentemente do grupo castrado tratado, que somente os machos
apresentaram diferença quando comparado ao sham veículo e este tratamento
eliminou a diferença de gênero (CEM: 19,8 ± 0,7 pg/ml, CEF: 20,1 ± 1,8 pg/ml).
5
9
13
17
21
25
SV SE CV CE
+
+
*
+
*
+#+ MACHO
FEMEA
IL-10 (pg/ml)
Figura 12: Valores dos níveis séricos de IL-10 nos grupos Sham Veiculo (SV), Sham Enalapril (SE), Castrado Veiculo (CV), Castrado Enalapril (CE). Os valores foram apresentados com média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo
47
grupo; + p< 0,05 vs animais do mesmo sexo, do grupo SV ; # p< 0,05 vs animais mesmo sexo, do grupo CV.
4.7 Razão IL-10/ TNF-α
A razão entre a citocina anti-inflamatória IL-10 e a pró- inflamatória TNF-
α está demonstrada na figura 13 . No grupo Sham Veiculo, não foi
observado diferença entre os sexos na razão destas citocinas (SV
macho: 0,96 ± 0,02 pg/ml; SV fêmea: 1,03 ± 0,05 pg/ml). O tratamento
com enalapril, independente do sexo, foi efetivo em aumentar esta razão
em machos e fêmeas castradas (CEM: 1,4 ± 0,09 pg/ml; CEF: 1,6 ± 0,9
pg/ml) e não castrados (SE macho: 1,3± 0,1 pg/ml; SE fêmea: 1,7 ± 0,08
pg/ml). Quando comparado ao grupo sham veiculo, a castração
provocou resposta inversa entre os gêneros, enquanto nos machos
aumentou , nas fêmeas reduziu (CV macho: 1,2 ± 0,1 pg/ml; CV fêmea:
0,8 ± 0,4 pg/ml).
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
SV SE CV CE
+
+
+#
+*+*
+
MACHO
FEMEA
RAZÃO IL-10/TNF- αα αα
Figura 13: Razão de IL-10/TNF-α nos grupos Sham Veiculo (SV), Sham Enalapril (SE),
48
Castrado Veiculo (CV), Castrado Enalapril (CE). Os valores foram apresentados com
média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo grupo; + p< 0,05 vs animais do mesmo sexo,
do grupo SV ; # p< 0,05 vs animais mesmo sexo, do grupo CV.
4.8 Razão entre as citocinas IL-10/ IL-6
Na figura 14 está demonstrada a razão entre a citocina anti-inflamatória IL-10
e a pró- inflamatória IL-6. No grupo Sham Veiculo, observamos similaridade
entre os sexos na razão destas citocinas (SVM: 1,7 ± 0,1 pg/ml; SVF: 1,60 ±
0,15 pg/ml). O tratamento com enalapril manteve a similaridade entre os
gêneros e assim como na razão de IL-10/ TNF-α também foi efetivo em
aumentar este balanço, independente do gênero, tanto nos animais castrados
(CEM: 3,4 ± 0,3 pg/ml; CEF: 3,7 ± 0,2 pg/ml), quanto nos animais não
castrados (SEM: 5,8 ± 0,6 pg/ml; SEF: 6,6 ± 0,6 pg/ml). Quanto à castração,
nos machos, promoveu aumento neste balanço (CVM: 3,5 ± 0,5 pg/ml), e não
se alterou nas fêmeas (CVF: 2,3 ± 0,3 pg/ml).
0
2
4
6
8
10
SV SE CV CE
MACHO
FEMEA
+
+
+
+
+
IL-10/IL-6
49
Figura 14: Razão de IL-10/TNF-α nos grupos Sham Veiculo (SV), Sham Enalapril (SE), Castrado Veiculo (CV), Castrado Enalapril (CE). Os valores foram apresentados com média ± EPM. * p< 0,05 vs fêmea do mesmo grupo; + p< 0,05 vs animais do mesmo sexo, do grupo SV.
5 - DISCUSSÃO
50
5- DISCUSSÃO
Neste estudo, foi observado dimorfismo sexual nos níveis plasmáticos das
citocinas IL-6,TNF-α e IL-10 de ratos SHR. Os valores dessas citocinas foram
maiores nas fêmeas e a castração alterou esse padrão. Além disso, nós
demonstramos pela primeira vez que os hormônios sexuais podem modular
diretamente o balanço de citocinas, bem como o enalapril foi capaz de
modificar os níveis de IL-6 e IL-10 nos animais machos e fêmeas hipertensos, e
os níveis plasmáticos de TNF-α, somente nas fêmeas. Nos animais castrados,
o enalapril aumentou IL-10, mas não foi capaz de alterar as concentrações de
citocinas pró-inflamatórias. Enalapril melhorou o equilíbrio entre as citocinas
pró- e antiinflamatória em ambos os sexos, com exceção dos machos
castrados.
5.1 Diferenças sexuais no desenvolvimento da hipertensão
Estudos sugerem que as diferenças sexuais no desenvolvimento da
hipertensão sejam por exacerbação dos andrógenos nos machos e /ou devido
à proteção dada pelo estrogênio nas fêmeas (Reckelhoff e cols., 2001, Izumi, e
cols., 2007; McGuire e cols.,2007). Nossos resultados são semelhantes aos
demonstrados por Woods e cols. 2010, que a castração não reduziu a pressão
arterial, demonstrando que a remoção dos hormônios sexuais nestes animais,
não foi capaz de mudar o curso da hipertensão. A não alteração na PAS, pode
estar relacionada a elevada PAS inicial de nossos animais, bem como a idade
51
em que os mesmos foram castrados. Além disso, a gênese e controle da
hipertensão são multifatoriais (Armani e cols., 2011), assim, a remoção de um
desses fatores não necessariamente levaria a mudanças na PAS, como o
observado por estudos em nosso laboratório, no qual a denervação renal em
ratos SHR, também não reduziu a pressão arterial média (Andrade e cols.,
2010).
A castração nos machos reduziu 47,3% da atividade da ECA, sem alterar nas
fêmeas, permanecendo a diferença sexual. Estes resultados confirmam dados
anteriores que demonstraram que ratos machos hipertensos têm maior
atividade da ECA plasmática do que as fêmeas (Pendergrass e cols., 2008) e
em humanos normotensos (Zapater e cols., 2004). Apesar de pesquisadores
mostrarem que a atividade da ECA pode ser regulada pelo estrogênio (Lim e
cols., 2002), neste estudo, não encontramos redução na atividade da ECA
após a ovariectomia. Seltzer e cols., (1992) demonstrou que a administração
de estrogênio a ratas ovariectomizadas reduziu a atividade da ECA na hipófise
anterior, mas nenhuma mudança na atividade da ECA circulante ou da hipófise
foi detectado com o ciclo estral normal, sugerindo que atenuação da atividade
da ECA ocorre apenas após exposição crônica ao estrogênio em doses
maiores que as concentrações endógenas.
Em relação ao IECA, o tratamento com enalapril por 4 semanas, reduziu a PAS
e a atividade da ECA em todos os grupos, ou seja, machos e fêmeas,
castrados e não castrados, eliminando qualquer diferença de gênero nos níveis
destes parâmetros entre os grupos, demonstrando que o desenvolvimento de
hipertensão em SHR é mediada, pelo menos em parte, pela SRA.
52
5.2 Diferenças sexuais nos níveis plasmáticos decitocinas e os efeitos do
Enalapril
Neste estudo observamos dimorfismo sexual nos níveis plasmáticos de IL-6,
TNF-α e IL-10 e esses valores se apresentaram maior nas fêmeas. Após a
castração, a citocinas pró-inflamatórias, IL-6, tornou-se similar entre os sexos e
oTNF-α e a IL-10 diminuíram nas fêmeas. A castração aboliu a diferença
sexual da IL-6 e o TNF- α e inverteu o padrão da IL-10, ou seja, o macho
apresentou concentrações maiores que na fêmea. O estrogênio parece ter
dupla ação sobre a polarização da resposta imune que depende da
concentração deste esteroide, podendo potenciar tanto a produção de citocinas
Th1(IL-1, IFN) quanto de citocinas Th2 (IL-10, Il-6). Assim, baixos níveis de
estrógenos exógenos podem favorecer uma resposta pró-inflamatória do tipo
Th1 (IL-1, IFN), enquanto altas doses de estrógenos podem sustentar uma
resposta Th2 por aumentar a produção de IL-4, IL-10 e IL-6 (Nicot, 2009,
Gilmore e cols.,1997; Correale e cols.,1998) e diminuir a secreção de TNF-α a
partir de células imunes (Nicot, 2009). Esta última observação em relação ao
TNF-α parece diferir dos nossos resultados, já que a OVX reduziu esta citocina,
entretanto, a relação do estrogênio com as concentrações destas citocinas é
complexa, uma vez que existem estudos que demonstram desde a falta de
ação estrogênica nos níveis circulantes destas citocinas (Sharma e cols., 2008,
Rogers e cols.,1998,Zanger e cols.,2000, Keller e cols., 2001),a respostas
estimulatórias da síntese de TNF-α, e IL-6 (D'Agostino e cols.,1999 , Gregory e
53
cols., 2000, Kawasaki e cols., 2000), ou até respostas inibitórias (Kireev e
cols., 2010). Além disso, torna-se difícil comparar os resultados por causa das
grandes diferenças metodológicas (diferenças de espécie, tipo de célula, o
tempo após OVX, concentrações de estrogênio, ou condições de cultura) entre
esses estudos e o nosso estudo, que foi realizado em fêmeas com
concentrações fisiológicas de estrogênio, por isso, a coleta sanguínea do grupo
sham ocorreu na fase do proestro, fase de maior concentração do estrogênio
endógeno, uma vez que o nível de indução desses marcadores inflamatórios
pode variar significativamente em função estágio do ciclo estral (Sundaye cols.,
2006; Nicot, 2009).
Alternativamente, o estrogênio pode mudar a sua resposta de supressão ou de
estimulação, dependendo do contexto individual celular. Por exemplo,
experimentos in vivo, em ratos saudáveis a secreção de IL-6 por monócitos foi
inibida pelo estrogênio, mas a inibição foi revertida quando a função imune foi
ativada (Gregory e cols., 2000) ou estudo in vitro que mostram que o estradiol
na concentração de 1-10 nM inibe a produção TNF-α induzida por
lipopolissacarídeo (LPS) em células mononucleares do sangue periférico ,mas
é estimulante, na ausência de LPS (Asai e cols., 2001),ilustrando a importância
do contexto celular.Assim, mostramos que houve uma redução nos valores de
03 citocinas estudadas em ratos OVX comparado aos valores encontrados na
fase de proestro, diferente de outros estudos que têm reposição hormonal com
doses baixas ou altas de estrogênio. Este resultado demonstra que o
estrogênio endógeno pode ser o fator principal nessas mudanças, uma vez que
a ovariectomia não alterou a ECA ou a PAS.
54
Diferença entre os sexos foi observada pela castração em relação à IL-10.
Enquanto na femea a IL-10 diminuiu, o macho mostrou aumento desta citocina,
mantendo a diferença entre os sexos. Nos machos, a atividade da ECA foi
reduzida e a IL-10 e a razão de IL-10/TNF-α aumentou nos grupos sham
enalapril, castrado veiculo, e castrado enalapril. A capacidade da IL-10 em
neutralizar as ações do TNF-a, são bem conhecidas (Dhingra e cols. 2007;
Bolger e cols, 2002),que pode ser um dos fators de não termos observado
mudança nas concentrações individuais do TNF-α. Em trabalhos anteriores,
enalapril foi capaz de produzir um aumento nos níveis plasmáticos de IL-10 em
pacientes com doença arterial coronariana e hipertensão arterial (Schieffer e
cols.; 2004) e em machos SHR (Miguel-Carrasco e cols., 2010).
Em relação a IL-6, nos machos, a redução dos hormônios sexuais foi
fundamental para a diminuição desta citocina. Resultados de Wang e cols.
(2005) apontam que o bloqueio dos receptores de testosterona com a
flutamida, ou castração em machos Sprague-Dawley melhora a função
miocárdica após isquemia-reperfusão aguda, por uma diminuição do TNF-α, IL-
1β e IL-6. No nosso estudo, o enalapril também reduziu IL-6 em machos e
fêmeas. Em ratos Wistar machos, uma única dose de enalapril após infusão
intravenosa de Ang II suprimiu IL-6 no rim (Niimi e cols.; 2002).Na ausência dos
hormônios sexuais, o enalapril não foi capaz de alterar as concentrações de
citocinas pró-inflamatórias, demonstrando a interação entre esses hormônios e
enalapril.
Embora os mecanismos subjacentes ao papel dos inibidores da ECA sobre a
síntese de citocinas não sejam bem compreendidos, eles têm sido
tradicionalmente atribuída à inibição da formação de Ang II (Schindler e cols.,
55
1995, Papapetropoulos e cols.; 1996). Os efeitos benéficos dos inibidores da
ECA em modular a células do sistema imunológico pode ser ao menos em
parte, atribuível à prevenção de eventos decorrentes da formação de Ang II e,
consequentemente, a regulação de várias genes relacionados ao NF-kB,
citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão, NO sintase e outros fatores, que
estão envolvidos na patogênese da lesão vascular inflamatória e hipertensão
(Ferrario & Strawn e cols., 2006, Miguel-Carrasco e cols., 2010).
5.3 Diferenças entre os sexos no Balanço Citocinas
O TNF-α está elevado em algumas doenças cardíacas, incluindo miocardite,
infarto agudo do miocárdio, angina instável (Kaur e cols., 2006a,b; Levine e
cols., 1990; Torre-Amione e cols., 2005). A IL-10 inibe e antagoniza a produção
de várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF- α (Bolger e cols., 2002).
Adicionalmente, estas duas citocinas são fundamentais para o equilíbrio entre
as células Th1/Th2, o que demonstra a importância de estudar o equilíbrio
destas citocinas.Sobre os nossos resultados, a castração nos machos não
alterou o equilíbrio IL-10/TNF-α, contudo, em fêmeas castradas quando
comparada ao grupo sham, observamos que esta relação está com valor
abaixo de 1,devido a grande diminuição da IL-10, menor redução do TNF-α,
assim a IL-10pode não oferecer proteção contra o TNF- α , e desta forma
predominar os efeitos inflamatórios do TNF- α (Kaur e cols., 2009), reforçando
a importância do estrogênio endógeno no controle das DCV.O tratamento com
enalapril aumentou o balanço IL-10/TNF-α em todos os grupos tratados (exceto
no grupo macho castrado), principalmente, pelo aumento da IL-10. A diferença
56
entre os sexos foi observada na presença de enalapril, devido a maior
proporção nas fêmeas do que nos machos.
Embora, não tenhamos encontrado estudos relacionando o tratamento com
inibidores da ECA, dimorfismo sexual e os níveis de citocinas em SHR, nossos
resultados são consistentes com vários estudos que demonstraram,em
diferentes modelos experimentais, semelhante capacidade dos IECA em
modular as citocinas (Wee cols.,2002;Niimi e cols., 2002; Miguel Carrasco e
cols., 2010;Krysiak e cols., 2008). O efeito do enalapril em aumentar o balanço
de IL-10/TNF-αpode ser protetor sobre o SCV, como demonstrado em estudo
com macho Sprague-Dawley após infarto do miocárdio, que o Losartan
melhorou a função cardíaca associada ao maior balanço de IL-10/TNF-α (Kaur
e cols., 2006a ; b), reduzindo os efeitos deletérios do TNF-αem relação a sua
ação de gerar espécies reativas de oxigênio ROS (Dhingra a cols.,
2007). Sobre a razão IL-6/IL10 não observamos diferença de gênero entre os
grupos, somente diferenças individuais como anteriormente descrito. Na
presença de hormônios sexuais o tratamento com enalapril aumentou esta
relação em ambos os sexos, devido ao aumento de IL-10 e redução das
concentrações de IL-6.
O equilíbrio entre a IL-6/IL-10 pode, eventualmente, constituir perfil prognóstico
de aterogenicidade (Ferrario&Strawn, 2006). Em homens aparentemente
saudáveis, níveis elevados de IL-6 estão associados ao risco de infarto do
miocárdio. Estudo de Taniguchi e cols. (1999) observou que em pacientes que
não sobreviveram a síndrome da resposta inflamatória sistêmica apresentaram
57
diminuição nesta razão (IL-6/IL-10), confirmando a importância do equilíbrio ser
maior que 1, e portanto favorecendo as ações anti-inflamatórias de IL-10 .
58
6-CONCLUSÃO
6- CONCLUSÃO
Este estudo fornece evidências de que em machos e fêmeas SHR, existe
diferença entre os sexos nos níveis de citocinas pró-inflamatórias e
antiinflamatórias; os efeitos da castração causados na concentração de
citocinas independem dos níveis da pressão arterial em ambos os sexos, uma
vez que a castração não alterou o PAS. O enalapril aumentou IL-10 em todos
os grupos tratados dessa forma melhorou o balanço pró e anti-inflamatório,
independente do gênero.
Assim, a neutralização das ações da Ang II por inibidores da ECA em SHR
pode exercer efeitos anti-inflamatórios e anti-hipertensivos, independentemente
do sexo, mas dependente dos hormônios sexuais para reduzir citocinas pró-
inflamatórias.
Se o dimorfismo sexual em relação as citocinas, demonstrados neste estudo,
existem em pacientes hipertensos e se o efeito do IECA em modificá-las pode
ou não determinar relevância clinica é uma questão a ser considerada em
estudos futuros.
59
60
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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