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ADRIANA GUIA DA CRUZ
"TARGETING VASCULAR": TRATAMENTO E CURA DE TUMORES SÓLIDOS
São Paulo
2007
1
CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
CURSO DE FARMÁCIA
ADRIANA GUIA DA CRUZ
"TARGETING VASCULAR": TRATAMENTO E CURA DE TUMORES SÓLIDOS
Trabalho Conclusão de Curso submetido
ao curso de graduação em Farmácia e
Bioquímica do Centro Universitário das
Faculdades Metropolitanas Unidas, sob
a Orientação do Professor “Leonardo
Sokolnik de Oliveira”
São Paulo
2007
ADRIANA GUIA DA CRUZ
2
"TARGETING VASCULAR": TRATAMENTO E CURA DE TUMORES SÓLIDOS
Trabalho Conclusão de Curso submetido
ao curso de graduação em Farmácia e
Bioquímica do Centro Universitário das
Faculdades Metropolitanas Unidas, sob
a Orientação do Professor “Leonardo
Sokolnik de Oliveira”
Aprovado por:
Prof. Leonardo Sokolnik de Oliveira FMU-Orientador
Prof. Dr. Paolo Ruggero Errante FMU
Prof. Cristiane Farias FMU
RESUMO
Tumores sólidos em expansão recrutam novos vasos sangüíneos através do
mecanismo de angiogênese para suprir suas demandas metabólicas. Estes novos
vasos sangüíneos dentro dos tumores constituem a principal via metastática e
3
expressam proteínas na superfície das células endoteliais, entre as quais as αv
integrinas, que são ausentes ou raramente detectadas em vasos sangüíneos
quiescentes normais.
Através da utilização de bibliotecas peptídicas expressas em fagos filamentosos
pode-se pesquisar os níveis de expressão das αv integrinas em vasos tumorais e
determinar seqüências peptídicas que se ligam especificamente as αv integrinas
dentro destes vasos. A ligação αv integrinas-peptídeos impede que essas integrinas
se liguem aos seus ligantes circulantes naturais, ocasionando inibição do
mecanismo de angiogênese com conseqüente regressão tumoral e inibição de
metástases.
Estas descobertas comprovaram a hipótese de que as αv integrinas poderiam ser
utilizadas como alvo vascular tumoral ou "Targeting Vascular".
A terapia “Targeting Vascular” baseia-se em acoplar um peptídeo à um agente
quimioterápico, o conjugado é injetado intravenosamente e então viaja através da
circulação até entrar nos vasos sangüíneos do tumor. Neste local, o conjugado
interage com uma proteína expressa na superfície luminal do endotélio vascular (αv
integrinas) somente nos tumores e não em outros tecidos. Devido a alta
especificidade e afinidade do peptídeo para a proteína alvo, o conjugado se acumula
seletivamente e rapidamente no tumor, onde exerce sua ação farmacológica
localmente. Desta forma, reduz os efeitos colaterais, a resistência a drogas, a
dosagem terapêutica e metástases, além de aumentar a eficácia terapêutica.
A terapia “Targeting Vascular” foi descrita para tratamento de carcinoma, sarcoma e
melanoma15; estudos comprovaram eficácia no tratamento de câncer de mama15,
pulmão13, rins3 e bexiga10, bem como sua a utilização para diagnostico3,10. Palavras-chave: "Targeting vascular", Angiogênese, Integrinas, Bibliotecas peptídicas. SUMÁRIO
1 Introdução 5
2 Objetivo 8
3 Estratégias e Abordagens 9
3.1 Angiogênese e Metástase Tumoral 9
3.2 Receptores αv Integrinas em Vasos Sangüíneos Tumorais 13
4
3.3 RGD e Outras Seqüências de Reconhecimento para Integrinas 15
3.4 Construção de Bibliotecas Peptídicas em Fagos Filamentosos 16
3.4.1 Design do Vetor 17
3.4.2 Ciclo de Infecção do Fago 18
3.4.3 Design do Inserto 19
3.4.4 Clonagem do Inserto 20
3.4.5 Transfecção do Vetor Clonado em E.coli 21
3.4.6 Integrinas como Receptores de Ligantes Circulantes para
Alvo Tumoral 24
3.5 "Targeting Vascular In Vivo" 27
4. Outros Estudos Utilizando "Targeting Vascular" 32
5. Conclusão 35
6. Referências Bibliográficas 38
5
6
7
8
1 INTRODUÇÃO
A neoplasia é um processo patológico que resulta em mais de 100 diferentes
doenças malignas que compartilham uma biologia e estória natural comum.
Qualquer célula do corpo que pode sofrer mitose ou divisão celular pode ser afetada.
Como uma desordem fundamental do crescimento celular e desenvolvimento ou
diferenciação, o câncer é essencialmente uma desordem genética a nível celular.
As células tumorais mostram crescimento descontrolado principalmente no
local de invasão com disrupção dos tecidos e mais tarde metástase em expansão
para vasos linfáticos e circulação sangüínea.
O câncer atinge anualmente 9 milhões de pessoas e causa 5 milhões de
morte. Em países desenvolvidos é a segunda causa mais comum de mortes, e
evidências epidemiológicas apontam uma emergente tendência similar em países
em desenvolvimento. O principal fator é a aumentada proporção de pessoas idosas,
nas quais o câncer é mais prevalente. 25,26,30,34
9
Tabela 1. A tabela abaixo mostra novos casos de câncer e mortes no mundo inteiro
em 1985 e a previsão para o ano 2015 26:
ANO
REGIÃO NOVOS CASOS
(MILHÕES)
MORTES
(MILHÕES)
Países Desenvolvidos 4 2
1985 Países em
Desenvolvimento
5 3
Todos os Países 9 5
Países Desenvolvidos 5 3
2015 Países em
Desenvolvimento
10 6
Todos os Países 15 9
Atualmente o tratamento mais utilizado para o câncer é a quimoterapia. Ela
pode ser feita antes ou após uma cirurgia, isoladamente ou em associação com a
radioterapia.24
As drogas quimioterápicas agem no mecanismo de multiplicação das células
provocando a morte de um número considerável de células tumorais, porém atinge
10
outras células do organismo, uma vez que age indistintamente nas células
ocasionando inúmeros efeitos colaterais, dependendo das drogas utilizadas e da
predisposição individual.24,31
Os efeitos colaterais mais comuns na quimioterapia são24,31:
1. Enjôos / Vômitos;
2. Feridas na Boca;
3. Queda de Cabelo;
4. Febre;
5. Diarréia;
6. Baixa de imunidade;
7. Outros: diminuição de glóbulos vermelhos, plaquetas, problemas de pele.
Muito embora os objetivos da quimioterapia sejam a limitação do crescimento
tumoral, alívio dos sintomas ocasionados pelo desenvolvimento do mesmo, e a
busca da cura 31, a frase: matando o tumor, matando o paciente, é uma realidade do
tratamento convencional de quimioterapia2. Além disso, as células tumorais mutam
rapidamente e se tornam resistentes às drogas.2,4,22
Ruoslahti e col. (1998) acoplou os peptídeos RGD (Arg-Gly-Asp) e NGR (Asn-
Gly-Arg), selecionados através de bibliotecas peptídicas como fortes ligantes para as
αv integrinas, à doxorubicina, e testou os conjugados dox-RGD e dox-NGR em
carcinoma de mama xenográfico, sarcoma e melanoma, obtendo resultados muito
promissores para o tratamento de câncer utilizando a estratégia terapêutica de
"targeting vascular"15.
11
2 OBJETIVO
A alta incidência do câncer no contexto mundial, com alta taxa de mortalidade
e tratamentos convencionais que muitas vezes não são suficientemente efetivos, e
que de um modo geral debilitam física e psicologicamente o paciente, fazem com
que a busca de novas alternativas para tratamento e cura do câncer sejam alvos de
muitas pesquisas científicas.
O presente trabalho tem por objetivo abordar uma nova estratégia terapêutica
denominada "Targeting Vascular" para tratamento e cura de tumores sólidos.
O "Targeting Vascular" consiste em utilizar peptídeos, que se ligam
seletivamente à receptores-alvos na vasculatura tumoral, inibindo a angiogênese e
ocasionando inibição de metastáses e regressão tumoral. Estes peptídeos
acoplados a drogas quimioterápicas apresentam uma considerável redução da
dosagem terapêutica, diminuição dos efeitos colaterais e aumento da sobrevida.
Faz parte do objetivo, a abordagem do mecanismo de angiogênese e
metátase tumoral, descrição dos receptores-alvos na neovascultura, construção de
bibliotecas peptícas expressas em fagos filamentosos para seleção de peptídeos
ligantes, e a apresentação e discussão dos resultados de pesquisas utilizando a
estratégia “Targeting Vascular".
12
3 ESTRATÉGIAS E ABORDAGENS
3.1 ANGIOGÊNESE E METÁSTASE TUMORAL.
A angiogênese é a formação de novos vasos sangüíneos que se formam a
partir de vasos pré - existentes em resposta direta às demandas
teciduais.4,7,9,22,23
Novos vasos sangüíneos no sítio tumoral são absolutamente
requeridos para a expansão de um tumor esférico de 1 a 2 mm, no qual o
ponto de difusão de nutrientes, oxigênio e detritos metabólicos, tornam-se
fatores limitantes para o desenvolvimento do tumor. As células tumorais
passam então a produzir estimuladores angiogênicos incluindo fatores de
crescimento de Fibroblastos (FGF1 ou bFGF) e a família de fatores de
crescimento endotelial vascular (VEGF).4,7,9,22,23
A hipóxia upregula VEGF, aumentando a transcrição mediado por
fator-1 induzível por hipoxia (HIF-1) e um aumento na estabilidade do RNA m.
A maquinaria molecular para iniciar a angiogênese pode assim ser dirigida por
privação de oxigênio e nutrientes, tais como glicose, a qual regula a
expressão gênica requerida neste processo.7,9,22
13
O mecanismo responsável pela vascularização de tumores “in situ” e
os detalhes das mudanças genéticas e seus efeitos na angiogênese são
ainda precariamente entendidos.7,9
Os novos vasos sangüíneos formados pela angiogênese fornecem a
principal rota pelas quais as células tumorais no sítio do tumor primário
entram na circulação. Assim, a angiogênese é um componente crítico na
metástase tumoral fornecendo uma eficiente rota para as células tumorais
deixarem o sítio primário e entrarem na corrente sangüínea (Fig1).22
A angiogênese permite a entrada das células tumorais na circulação
por fornecer uma densidade aumentada de vasos sangüíneos altamente
permeáveis e imaturos que tem pouca membrana basal e menos complexos
funcionais intracelulares que vasos maturos normais.22
Se vasos sangüíneos são essenciais para o crescimento tumoral e
metástase, inibindo a angiogênese, inibe-se a expansão tumoral.4,7,22,23
Experimentos estão sendo realizados para desenvolver estratégias
terapêuticas para agentes antiangiogênicos, os quais tem reduzida toxicidade
e é menos provável de causarem resistência, uma vez que células tumorais
são geneticamente instáveis, mutam rapidamente, e são capazes de gerar
clones resistentes à drogas, enquanto células endoteliais vascular são
geneticamente estáveis e raramente se tornam resistentes.2,4,22,23
Outra limitação da terapia convencional para o câncer é que elas tem
freqüentemente um uso limitado na regressão tumoral que tem metástase à
distância ou disseminada. E uma das potenciais vantagens da terapia
antiangiogênica é que, pelo menos em animais experimentais, agentes
antiangiogênicos podem causar regressão de lesões metastáticas e prevenir
sua disseminação.22
14
a0
a b c
d
f
15
g e
Figura 1.22 Componentes Vasculares de Metástases Tumoral. As etapas da via
metastática envolve interações com vasos sangüíneos: a) pequeno tumor primário (<
2mm) permanesce avascular até que b) eles invadem a membrana epitelial basal
local. Se as células tumorais produzem fatores angiogênicos c) a angiogênese
ocorrerá. d) Os novos vasos sangüíneos fornecem a rota de entrada na circulação
sangüínea até que elas morram ou atacam especialmente células endoteliais nos
vasos dos orgãos adjacentes. e) As células tumorais extravasam através da parede
dos vasos e então migram para sítios próximos à arteríolas onde crescem. f)
Micrometástases podem permanecer dormentes por um longo período de tempo
durante o qual a angiogênese é suprimida. g) Iniciação da angiogênese no sítio
secundário liberam colônias metastáticas da dormência e cresce rapidamente.
16
3.2 RECEPTORES αV INTEGRINAS EM VASOS SANGÜÍNEOS TUMORAIS
Quando os tumores mudam para um fenótipo angiogênico e recrutam
novos vasos sangüíneos, as células endoteliais nesses vasos expressam
proteínas em sua superfície luminal que não são produzidas pela vasculatura
quiescente normal (fig. 2). Assim, a vasculatura tumoral sob contínua
angiogênese expressa marcadores moleculares que caracterizam estes
vasos. 4,15,16
Os marcadores no endotélio angiogênico incluem certos receptores
para fatores de crescimento vascular, tais como vários receptores para VEGF,
e receptores de superfície celular de fibronetina (α5 β1 integrina), vitronectina
(αv β3 e αv β5 integrinas) e fibrinogênio (αIIb β3 integrinas).19
A adesão celular mediada por integrinas apresenta um importante
papel em uma variedade de processos biológicos básicos, assim, influencia e
regula a orientação celular em suas locações apropriadas no corpo,
17
fornecendo ancorage celular, controlando proliferação celular, diferenciação e
apoptose.4,7,18,28
Peptídeos que imitam os ligantes para estas integrinas, capazes de
inibir suas ligações ao seus ligantes naturais, causam apoptose de células
endoteliais em microvasos em proliferação, tendo efeitos antiangiogênico e
antitumoral.4,5,15,16,18,19 Além disso, podem ser utilizados para pesquisar
funções das integrinas em vários sistemas biológicos.18
Figura 2. Vasos tumorais23:
A) Vasos sangüíneos angiogênicos : Representam um excelente alvo para terapia
tumoral porque eles são requeridos para crescimento e metástase tumoral.
18
B) Alvos potenciais nos vasos sanguíneos tumorais incluem: 1) moléculas na
superfície endotelial expostas a circulação sangüínea, 2) moléculas na superfície
endotelial expostas à membrana vascular basal, e 3) moléculas dentro da própria
membrana basal vascular.
3.3 RGD E OUTRAS SEQÜÊNCIAS DE RECONHECIMENTO PARA
INTEGRINAS
A seqüência de adesão celular RGD (Arginina-Glicina-Ácido Aspártico)
foi descoberta na fibronectina por Piershbacker & Ruoslahti em 198418.
A seqüência RGD juntamente com as integrinas que servem como
receptores para eles, constituem o maior sistema de reconhecimento para
adesão celular18.
Vários trabalhos foram realizados para determinar se as integrinas são
realmente ativas e disponíveis para a ligação com ligantes (RGD e outros) em
circulação, quais as melhores conformações dessas moléculas que levam a
uma melhor especificidade de ligação, e se os níveis de expressão para as
integrinas são suficientemente diferentes para permitir “targeting
vascular.”5,15,17,19
19
Para responder a estas questões todos os trabalhos utilizaram a
engenharia genética para a construção de bibliotecas peptídicas expressas
em fagos filamentosos.
3.4 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS PEPTÍDICAS EM FAGOS
FILAMENTOSOS.
Um “fusion phage” é um bacteriófago filamentoso expressando em sua
superfície um peptídeo “foreign” fundido a uma proteína de superfície do
vírus21.
Esta técnica é chamada de “phage display” e é acompanhada pela
inserção de um gene ou fragmento de gene de interesse no gene de uma
proteína de superfície do fago. Desde que a fase de leitura esteja correta e
que o inserto não interfira com as funções essenciais da proteína de
superfície, o inserto resultará em um peptídeo ou proteína de fusão na
superfície do fago.21,32,33,36
A inserção aleatória de seqüências de oligonucleotídeos sintéticos
degenerados em fagos filamentosos fornece a construção de bibliotecas que
representam bilhões de seqüências peptídicas. O número de peptídeos
20
obtidos com este tecnologia é de 100 a 1000 vezes mais do que sistemas de
expressão convencionais.21
O peptídeo quando bem exposto na superfície do fago será capaz de
agir como um ligante, enzima, imunógeno ou participar ativamente de
processo bioquímicos.32
Se o fago exibe um peptídeo que é um forte ligante para outra proteína
de ligação ( Acs, receptores como integrinas e etc...), ele pode ser facilmente
purificado de uma biblioteca contendo um vasto excesso de clones não
ligantes.32
3.4.1 DESIGN DO VETOR21,32,33,36
O fago tem dez diferentes genes, dos quais dois tem sido
utilizados em “phage display” (fig. 3):
Gene III (g III): codifica a proteína de superfície (p III), que é a
proteína requerida para a ligação do fago em E. coli, se ligando ao final
da pili da bactéria. Esta proteína é responsável pela infectividade do
fago e está presente em 3 a 5 cópias.
Gene VIII (g VIII): codifica a proteína de superfície p VIII,
chamada proteína maior, uma vez que forma o corpo do fago e está
presente em 2.7000 cópias.
21
3.4.2 CICLO DE INFECÇÃO DO FAGO
O ciclo de infecção do fago é iniciado pela fixação da proteína
de superfície p III do fago no pilus F da bactéria, seguido pela
introdução do DNA viral fita simples (ssDNA). Esta fita é então
chamada fita “plus” e serve de molde para a síntese das fitas “minus”,
que começa em uma origem específica e resulta em uma forma
replicativa dupla fita (RF). A RF é o molde para a transcrição do RNA
m, replicação RF, e produção da progênie ssDNA. As partículas virais
progênie sofrem extrução através da parede bacteriana sem ocasionar
morte da célula. Quando o ssDNA emerge da célula, ele adquire sua
camada envoltória intracelular de proteínas de superfície da
membrana. O envoltório consiste de milhares de proteínas p VIII e 4
proteínas menores, incluindo aproximadamente 5 cópias da proteína p
III incorporada na região infectiva do vírus emergente (fig.4).21,35
O vetor mais utilizado nos trabalhos abordados aqui é o fUSE5.
22
3.4.3 DESIGN DO INSERTO
Independente do inserto ser expressado como parte de uma p III
ou p VIII, o epitopo do peptídeo de fusão compreende uma região
variável, tal que cada epitopo na biblioteca constitui uma seqüência de
diferentes aminoácidos. Cada aminoácido variável na região do epitopo
é aleatoriamente codificado por um códon degenerado, NNK ou NNS,
os quais incluem todos os quatro nucleotídeos (N) na 1ª e na 2ª
posição, e G e T (K) ou G e C (S) na 3ª posição, respectivamente.21,33
Todos os vinte aminoácidos e um stop codon são codificados
por 32 diferentes códons representados por NNK ou NNS. Assim, para
a construção de uma biblioteca, um oligonucleolídeo degenerado é
sintetizado usando simples nucleotídeos em posições codificando a
seqüência invariável de um aminoácido ao longo da seqüência
variável, e uma mistura equimolar dos nucleotídeos mencionados
acima onde aminoácidos aleatórios são codificados.33
23
Os insertos fitas simples são submetidos a três ciclos de PCR
para originarem fita dupla.19
3.4.4 CLONAGEM DO INSERTO
O inserto de oligonucleotídeos degenerados são clonados em
sítios apropriados no gene III ou no gene VIII das proteínas de
superfície do vírus. O DNA do vetor é clivado com enzimas de
restrição, sendo que o maior dos vetores apresentam dois sítios de
restrição. O “stuffer” entre os dois sítios é removido, originando
terminações que não são complementares. Nesta região o inserto é
inserido de forma que suas terminações sejam compatíveis com as
terminações do sítio de clonagem.21
A clonagem do inserto é geralmente realizada na região
“downstream’ do peptídeo sinal da proteína p III, ou seja, no gene
III.21,32,33
A clonagem deve ser realizada de forma, que o gene III
recombinante não perca suas funções, uma vez que é responsável
pela infectividade e propagação do fago21,32,33,36
24
3.4.5 TRANSFECÇÃO DO VETOR CLONADO EM E. COLI:
A bactéria E. coli MC 1061 portando pilus sexual (codificada
pelo episoma F), é utilizada para a transfecção do vetor clonado, o
qual pode ser lentamente adsorvido na parede da bactéria (21) ou
transfectado por eletroporação (19). As bactérias são então
propagadas em meios de cultura NZY, e os vírus transfectados se
propagarão através do seu ciclo infectivo, sem morte da bactéria, e
assim o DNA viral recombinante será propagado e a seqüência do
inserto expresso na proteína de superfície do vírus. Cada colônia
contada representa uma unidade de transdução (TU). Os clones
então são coletados e os vírus recombinantes são purificados e
quantificados espectrofotometricamente.21
Deste modo, bilhões de epitopos peptídicos podem estar
contidos em poucos microlitros da solução para serem avaliados
efetivamente pela forte ligação com uma dada proteína.
25
Utilizando simples procedimentos microbiólogicos e tecnologia
do DNA recombinante, a biblioteca peptídica está pronta para ser
utilizada nos mais diversos tipos de experimentos (fig. 5).21,32,33,35,36
Figura 3. Arquitetura geral de fagos filamentosos.35
26
Figura 4. Via de infecção do fago.35
Figura 5.35
27
a) DNA do fago filamentoso contendo o inserto de oligonuceotídeos degenerados
clonados no gene III.
b) Peptídeos de interesse exibidos como parte integrante da proteina pIII do fago,
resultado da expressão do gene III.
3.4.6 INTEGRINAS COMO RECEPTORES DE LIGANTES CIRCULANTES
PARA ALVO TUMORAL.
Vários trabalhos foram realizados para determinar quais seqüências
peptídicas, bem como a sua conformação, são capazes de se ligarem
seletivamente as integrinas, mais particularmente as αv integrinas.5,15,19
Utilizando a tecnologia de construção de bibliotecas peptídicas
descritas acima , foram selecionados peptídeos contendo a seqüência RGD
(Arg - Gly - Asp), como forte ligante para as αv integrinas.5,15,19 Veja tabela 218.
Tabela 2. Seqüências de ligação à integrinas e as integrinas reconhecidas por essas
seqüências(10).
28
KQAGDV
LDV/IDS RLD/KRLDGS RGD L/IET R D YYGDLR/
YFDLR
(α5β1)
(α5β1) α5β1
α8β1
αIIbβ3
α4β1 αVβ3 αvβ1
αvβ3
αvβ5
αvβ6
αvβ8
αIIbβ3
αMβ2 (α2β1)
(α3β1)
(α4β1)
(α7β1)
αLβ2 α1β1 α2β1
* Ligações fracas que ocorrem somente em ocasiões especiais.
Peptídeos contendo a seqüência NGR (Asn - Gly - Arg) também foram
descritos em alguns trabalhos.15,18,19. Porém, nem todas as proteínas
contendo a seqüência RGD medeiam a adesão celular, de fato somente uma
minoria de 2600 tem esta capacidade. Isto se deve ao fato de a seqüência
RGD nem sempre estar disponível na superfície de uma proteína, ou estar
num contexto que não é compatível para a ligação com as integrinas.18
As conformações que apresentam melhor afinidade e seletividade para
integrinas são conformações cíclicas com dupla ponte dissulfeto (fig. 6).
(5,16,18,19). Assim, os aminoácidos que flanqueiam a seqüência RGD tem
fundamental importância na seletividade e especificidade das seqüências
RGD para as integrinas. A circularização do aminoácido pode ser
acompanhada pela construção de bibliotecas peptídicas contendo resíduos de
cisteína em ambos os lados de uma seqüência peptídica que se deseja
expressar. Tais bibliotecas apresentam uma estrutura geral CXnC, onde C é a
cisteína e X é qualquer aminoácido.18
29
Vinte e três aminoácidos na subunidade β da integrina (113-153) são
capazes de se ligar a peptídeos como o RGD através de cátions bivalentes.
Neste contexto, o ácido aspártico é de suma importância devido ao seu
potencial em contribuir com a ligação ao cátion bivalente. Uma hipótese é que
a ligação de ligantes à integrinas postula que o ligante forneça o sítio de
coordinação para a ligação ao cátion bivalente da subunidade β e compartilhe
um cátion bivalente; assim a ligação é feita transientemente.
A B
30
Figura 6. A e B: Estrutura conformacional do peptídeo contendo a seqüência RGD e
seu sítio de reconhecimento para as αv integrinas em destaque18.
3.5 " TARGETING VASCULAR IN VIVO"
Ruoslahti em 1998 realizou experimentos para determinar se a seleção
“in vivo” das bibliotecas peptídicas expressando seqüências RGD e NGR
podem ser utilizadas em alvo de vasos sangüíneos tumorais (fig. 7).15
Ruoslahti utilizou ratos suportando carcinoma de mama humano MDA-
MB 435, melanona e sarcoma de Kaposi, submetendo os à injeção
endovenosa de bibliotecas peptídicas expressando os seguintes peptídeos:
CDCRGDCFC, CNGRCVGCAGRC, CNGRAHA (peptídeos linear),
CVLNGRMEC (peptídeo cíclico). Fagos controles expressando outras
seqüências peptídicas e fagos controles sem inserto também foram injetados
(Fig. 8).
31
Os fagos foram deixados em circulação por 3 a 5 minutos em um
primeiro grupo, e por 24 horas em um segundo grupo, quando mais de 90%
dos fagos não estavam mais em circulação. Após o período de circulação, os
órgãos e tumores foram retirados e o "homing" dos fagos para os tumores e
órgãos controles foram avaliados por imunocoloração. Forte coloração dos
fagos foram vistos nas vasculatura tumoral, mas não em endotélio normal.
Fagos controles também não mostraram nenhuma coloração nos tumores .
A identificação dos fagos encontrados nos tumores revelou que os
fagos apresentaram as seqüências RGD-4C e NGR. Estes peptídeos
migraram seletivamente para a vasculatura tumoral independente do tipo e
espécie de tumor (carcinoma, sarcoma e melanoma), confirmando resultados
obtidos anteriormente.16,17
Foi avaliada também a inibição ou não dos fagos filamentosos por
peptídeos cognatos livres. A migração do fago RGD-4C foi inibida pelo
peptídeo RGD cognato livre, mas não pelo peptídeo NGR, nem por outro
peptídeo controle. A migração do fago NGR também foi inibida pelo peptídeo
cognato NGR livre, porém foi parcialmente inibido pelo peptídeos RGD.15,17
Estes resultados sugerem que o RGD e NGR migram seletivamente
para a vasculatura tumoral, embora ligando-se a diferentes receptores,
portanto as integrinas podem ser utilizadas como alvos na vasculatura tumoral
mediante a ligação à ligantes contendo seqüências RGD e NGR.
Um segundo grupo de experimentos foram realizados para determinar
se o “homing” tumoral dos peptídeos poderia ser utilizado para melhorar o
índice terapêutico de quimioterápicos para tratamento contra o câncer. Os
peptídeos contendo RGD-4C e NGR foram conjugados com doxorubicina
(dox). A doxorubicina é um dos agentes quimioterápicos mais utilizados e um
dos poucos a ter atividade antiangiogênica15.
A dose de dox utilizada em ratos portadores de câncer de mama
xenográfico é de 50 a 200 μg semana. Em uma avaliação inicial foi utilizado 5 32
μg de dox conjugado com RGD por semana, uma vez esperado que o
conjugado seja mais eficaz que a dox livre. Os ratos tratados com o
conjugado viveram mais do que os ratos controles, todos os quais morreram
de doença disseminada.15
Uma dosagem de 30 μg de dox conjugada com RGD-4C foi
administrada a cada 21 dias por 84 dias. Todos os ratos tratados com o
conjugado sobreviveram 6 meses mais do que os ratos controles, sugerindo
que ambos o tumor e metástase foram inibidos. 15
Na necrópsia os ratos mortos e tratados com o conjugado
apresentaram tumores menores, menor dispersão para nódulos regionais
periféricos e menos número de metástases pulmonares do que os ratos
tratados com dox livre. 15
Análises histopatológicas revelaram extensa destruição das células
tumorais dos ratos tratados com o conjugado, enquanto os que foram tratados
com dox livre foi minimamente afetado.15
A toxicidade do conjugado em comparação com a dox livre também foi
avaliada. Neste experimento 200 μg de dox livre e 200 μg de dox-RGD foram
administrada. Todos os ratos tratados com dox livre morreram dentro de 48
horas após a administração da droga, enquanto os tratados com o conjugado
viveram mais de uma semana. A acumulação do conjugado dentro dos
tumores parece ter seqüestrado a droga conjugada, reduzindo a sua
toxicidade para outros órgãos, enquanto que a dox livre por não ser alvo
específico atinge vários outros órgãos15
Resultados similares foram obtidos com o conjugado dox - NGD15
Peptídeos solúveis não conjugados juntamente com dox foram usados
como controle, e a combinação não foi mais efetiva do que a dox livre.15
33
Figura 7. Conceito de “Targeting Vascular in Vivo”15:
Uma sonda “targeting” (peptídeo ou anticorpo) acoplada a um efetor farmacológico
(droga ou toxina) é injetado intravenosamente e então viaja através da circulação até
entrar nos vasos sangüíneos do tumor. Neste local, o conjugado interage com uma
proteína expressada na superfície luminal do endotélio vascular somente nos
tumores e não em outros tecidos. Devido a alta especificidade e afinidade da sonda
“targeting” e a especificidade da proteína alvo, o conjugado se acumula
seletivamente e rapidamente no tumor, onde exerce sua ação farmacológica local. O
34
tratamento dos tumores pode requerer mais do que o “targeting” na superfície do
epitélio tumoral, por exemplo, induzir apoptose de endotélio em proliferação ou
coagulação localizada que rompe o fornecimento de nutrientes e oxigênio para o
tumor. Pode também ser útil para proteínas alvo capazes de movimentar-se através
da barreira endotelial-celular para a distribuição seletiva para células teciduais.
Figura 8. “Targeting” de marcadores vasculares orgão-específico e
marcadores expressados na neovasculatura tumoral. Em uma biblioteca
peptídica expressa em bacteriófago, cada fago expressa um único peptídeo,
construído pela clonagem de um fragmento de DNA aleatório no gene de uma
proteína de superfície do fago. O peptídeo é uma extensão da proteína do
fago e mediará a ligação com receptores para os quais os peptídeos tem
capacidade de se ligarem. A figura acima mostra a utilização de bibliotecas
peptídicas “in vivo” para identificar marcadores nas células endoteliais que
são tecido-específico ou seletivamente expressos na vasculatura tumoral15.
35
4 OUTROS ESTUDOS UTILIZANDO “TARGETING VASCULAR"
Novas estratégias-alvo foram descritas por vários pesquisadores para
tratamento de outras patologias além do câncer, tais como osteoporose, trombose, e
outras. Bem como na terapia gênica. 2,16,18,28
Bruce Zetter22 da Faculdade de Medicina de Harvard em 1998 fez a seguinte
observação: “A técnica provavelmente age em ambos os vasos sangüíneos e células
tumorais, e esta é uma grande vantagem. Ela proporciona um efeito duplamente
prolongado.”
Márcia Barinaga2 escreveu em 1998 um artigo sobre o trabalho desenvolvido
por Ruoslahti e col, onde ressaltou que esta estratégica pode superar ambos os
problemas de efeitos colaterais e resistência à drogas.
Por outro lado, Jan E. Schinitizer20 em 1998 também escreve um artigo
fazendo uma abordagem sobre o tema, e fez o seguinte comentário: “O mecanismo
de tais conjugados permanece rudimentar. "Targeting vascular" direto de uma droga
tóxica é possível, mas improvável, porque integrinas que se ligam aos peptídeos
carreadores existe não somente nas células tumorais, mas também em várias
células endoteliais e outros tipos celulares. Nós precisamos de uma maior
seletividade, especificidade e afinidade que os peptídeos podem oferecer.”
Ruoslahti14 em seu artigo “Drug targeting to specific vascular sites”, 2002,
confirmou que os vasos sangüíneos de cada um dos tecidos são bioquimicamente
distintos, e lesões patológicas tem sua própria vasculatura. Em tumores, ambos os
vasos sangüíneos e linfáticos diferem dos vasos normais, o que pode ser 36
comprovado através de screnning utilizando bibliotecas peptídicas em fagos
filamentosos. Peptídeos e anticorpos capazes de reconhecer receptores nos vasos
tumorais podem ser utilizados para liberação de agentes terapêuticos nos vasos
alvos.
Em 2004 Ruoslahti13 realizou experimento semelhante ao realizado em 1998,
porém determinando marcadores vasculares em câncer de pulmão. Concluiu que os
vasos angiogênicos tumorais de pulmão também apresentam extensas diferenças
moleculares e com alto grau de especialização vascular, apresentando-se muito útil
para terapia “targeting vascular.”
Alessi et al1 em 2004 realizaram uma revisão bibliográfica focando os
recentes avanços no desenvolvimento de ligantes para marcadores alvos nos vasos
sangüíneos tumorais e novos vasos sangüíneos na angiogênese de várias doenças.
Relatam que estudos utilizando marcadores moleculares são seletivamente
expressados em estroma e na neo-vasculatura dos locais com tumores sólidos
agressivos e são particularmente úteis para estratégias tumor alvo baseadas em
ligantes para estes marcadores.
Em 2005 Ruoslahti et al12 verificou que peptídeos de penetração celular são
específicos. Estes peptídeos podem ser potencialmente úteis na liberação de
drogas, pois podem penetrar nas células-alvo e chegar até a organelas subcelulares
como o núcleo. Estes peptídeos penetram nas células endoteliais tumorais, mas não
penetram nas células endoteliais de tecidos normais. Estes peptídeos também foram
identificados utilizando bibliotecas peptídicas em fagos filamentosos.
Li et al6 em 2006 comprovou que peptídeos ligantes e suas proteínas
celulares correspondentes podem fornecer ferramenta molecular para a seletividade
alvo tumoral e seus vasos sangüíneos patológicos e podem aumentar a eficácia da
terapia enquanto reduzem os efeitos colaterais.
Ruoslahti et al11 publicam em 2006 um artigo sobre o “Anginex”, peptídeo
sintético (β sheet) com anti-angiogênico e atividade antitumoral. Este conjugado
quando adicionado em culturas de células endoteliais em concentrações de 2,5
37
microM a 25 microM induziu a morte celular. Relatam que o Anginex conjugado com
fluoresceína acumulou na superfície da célula endotelial, mas não alcançou o
citoplasma, indicando que a membrana da célula é o alvo primário do peptídeo. Em
poucos minutos de tratamento, o Anginex causou permeabilização da membrana
celular, e este processo foi amplificado quando as células foram ativadas com
peróxido de hidrogênio. Em contrapartida, os glóbulos vermelhos não foram afetados
pelo Anginex. Os dados sugerem que a citotoxicidade do Anginex esta na sua
capacidade de romper a membrana da célula endotelial alvo, explicando a atividade
angiostática do peptídeo.
Em recente trabalho publicado em janeiro de 2007, Ruoslahti et al10,
confirmou os resultados obtidos em seu trabalho em 1998, realizando estudos em
câncer de bexiga. Identificaram através de bibliotecas peptídicas em fagos
filamentosos seqüências peptídicas que se ligam especificamente as células de
tumor de bexiga humano, evidenciado em cultura de células. O peptídeo sintético
quando injetado na veia caudal de ratos migrou somente para o tumor de bexiga,
não sendo detectado em bexiga normal e em nenhum outro órgão. Também
relataram que o peptídeo pode detectar células tumorais na urina de pacientes com
câncer de bexiga, mostrando que o peptídeo conjugado com fluoresceína se liga a
células tumorais de bexiga, mas não a outros tipos de linhagem de células tumorais
e mostram pouca ligação com células urinárias de pacientes com inflamação ou
outras patologias. Conclui-se que peptídeos identificados através de bibliotecas
peptídicas em fagos filamentosos podem ser utilizados tanto na terapia como no
diagnóstico de câncer de bexiga.
Outro trabalho publicado recentemente em março de 2007 por Bussolati at al3
comprova a diversidade molecular e fenotípica, associada a vasculatura tumoral, e
fornece a base para o desenvolvimento de terapia e diagnóstico baseado em
“targeting vascular”. Estes pesquisadores desenvolveram um peptídeo que se liga
especificamente as células endoteliais de tumor humano (TEC), derivados de
carcinomas renais, utilizando bibliotecas peptídicas em fagos filamentosos e
modelos de murinos para realização dos experimentos. O peptídeo denominado BB1
se liga a TEC “in vivo” e ”in vitro”. BB1-saporina induziu seletiva apoptose celular e
ruptura das rede de células vasculares de TEC. Nenhuma apoptose celular foi
38
encontrada em outro órgão de murinos. Os pesquisadores concluíram que a
identificação de seqüências peptídicas capazes de se ligarem seletivamente a
células endoteliais derivadas de tumor humano pode representar uma ferramenta
para liberar agentes antiangiogênicos e antitumorais em vasos neoplásicos.
5. CONCLUSÃO
A terapia “targeting vascular” foi descrita para tratamento de carcinoma,
sarcoma e melanoma.15 Estudos comprovaram eficácia no tratamento de câncer de
mama15, pulmão13, rins3 e bexiga10, bem como sua a utilização para diagnóstico.3,10
A diversidade molecular e fenotípica associada a vasculatura tumoral fornece
a base para o desenvolvimento de terapia e diagnóstico baseado em “targeting
vascular”.3
As integrinas são um fascinante sistema de reconhecimento de interação
proteína - proteína conhecido, com profunda importância biológica e médica. 7
Extensos trabalhos realizados15,16,17 comprovaram a especificidade e
seletividade dos peptídeos contendo a seqüência RGD e NGR para αv integrinas na
vasculatura tumoral. A especificidade e seletividade dos fagos expressando RGD-4C
e NGR foram comprovadas pelos seguintes resultados:
Somente fagos expressando RGD-4C ou NGR acumularam-se nos
tumores, mas não em tecidos normais. Os fagos presentes no órgãos
controles foram na maioria das vezes, se não em todas, inespecíficos;
Os peptídeos cognatos RGD e NGR inibiram o "homing tumoral” dos fagos
RGD-4C e NGR respectivamente;
“Homing” do fago é dependente do peptídeo que ele expressa, e não de
uma coincidente propriedade do fago, uma vez que fagos controles sem
inserto não se acumularam na vasculatura tumoral;
39
A grande diferença entre o “homing” tumoral dos fagos RGD-4C e NGR
em relação aos fagos controles refletem o potencial do “targeting tumoral”;
Assim estes peptídeos direcionados às αv integrinas são potencialmente
úteis para alvo tumoral em paciente com câncer.
Uma segunda abordagem de Ruoslahti15, foi a conjugação de doxorubicina à
estes peptídeos, o que rendeu um aumento da sobrevida, considerável regressão
tumoral, redução de metástases e menor toxicidade, quando comparado com a
quimioterapia convencional.
As vantagens da utilização do “targeting vascular” de peptídeos conjugados
com quimioterápicos sobre os tratamentos convencionais de quimioterapia são:
1ª Ação sobre angiogênese e metástase tumoral:
O conjugado atua principalmente na vasculatura tumoral que nutre o tumor,
destruindo as células e inibindo a angiogênese e a metástase tumoral. A
quimioterapia convencional não tem nenhuma ação, ou muito pouca ação sobre
o mecanismo de angiogênese e metástase.
2ª Ausência de clones resistentes à drogas:
Devido ao conjugado agir nas células endoteliais, as quais não são cancerosas e
são geneticamente estáveis, não levam a geração de clones resistentes às
drogas, enquanto que a quimioterapia convencional, por agir em células tumorais
que são altamente mutáveis, acarreta a geração de clones resistentes à drogas e
mais agressivos.
3ª Redução da Toxicidade:
Uma vez que os conjugados são alvo-específicos, eles direcionam a droga
somente para o tumor e requerem uma dosagem terapêutica menor que as
convencionais; enquanto que a quimioterapia convencional requer uma dosagem
maior e age indistintamente nas células, principalmente em sistema gastro-
intestinal e medula óssea, sendo responsável por uma série de efeitos colaterais.
40
Segundo Ruoslahti15, ele não encontrou nenhuma dosagem de doxorrubicina
livre que fosse mais efetiva que o conjugado.
4ª O “Targeting Vascular” apresenta um mecanismo de amplificação
intrínseco.
Tem sido estimado que a eliminação de uma simples célula endotelial pode inibir
o crescimento de 100 células tumorais.15
Em comparação com outras terapias anti-angiogênicas correntes, o “targeting
vascular” não age somente na prevenção do crescimento de vasos sangüíneos
tumorais, mas na rápida e seletiva destruição da vasculatura que nutre o tumor.
Os resultados de extensos trabalhos sugerem que pode ser possível utilizar
peptídeos direcionados às αv integrinas para carrear além de drogas, radionuclídeos,
genes e outras substâncias, tanto para a vasculatura tumoral quanto para o
parênquima do tumor. Além disso, os peptídeos possuem a vantagem de serem
menores e, provavelmente difundem se mais eficientemente dentro de tumores e
são provavelmente menos imunogênicos.16
A tecnologia de construção de bibliotecas peptídicas, pode também ser
utilizada para a produção de anticorpos monoclonais para fins terapêuticos, vacinas,
terapia gênica e pesquisas para melhorar a interação hormônio-receptor.21,32,36
Novas estratégias-alvo, incluindo a descrita aqui, pode ser o início de uma
nova farmacologia, utilizada inclusive para osteoporose, trombose, terapia gênica e
outras.2,16,18,28
A princípio, esta nova estratégia terapêutica poderia já ser traduzida na
prática na utilização em humanos, uma vez que quimioterápicos, como a
doxorubicina, são drogas aprovadas e utilizada no tratamento convencional, e os
peptídeos são fáceis de construir e baratos.
41
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