AGROTÓXICOS: TÉCNICA DE PREPARO DE AMOSTRAS, DETERMINAÇÃO E ESTUDO

Laboratório de Pesquisas em Cromatografia Líquida

AMOSTRAS, DETERMINAÇÃO E ESTUDO DE CASO DA ÁREA DE RECARGA DO

AQUÍFERO GUARANI

Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim

BENEFÍCIOS• Produção de alimentos de qualidade

• Atender à demanda crescente por alimentos

AGROTÓXICOSAGROTÓXICOS

MALEFÍCIOS• Contaminação do meio ambiente e

dos alimentos

• Efeitos adversos à saúde dos consumidores e dos produtores rurais

Toxicidade dos Agrotóxicos

- Cancerígenos - Mutagênicos

- Teratogênicos

- Mimetizadores de hormônios

Origem da Contaminação do Solo e do Origem da Contaminação do Solo e do Ambiente Aquático pelos AgrotóxicosAmbiente Aquático pelos Agrotóxicos

Pulverização Transporte de vapor e de poeiraPrecipitação

Escoamento

Aplicação no solo ou na plantação

Lavagem de materiais usados na aplicação

Efluentes industriais

Aplicação direta ou mobilização a partir de seu uso na agricultura

fotólise

agrotóxico dessorvido

agrotóxico adsorvido

decomposição química ou física

biodegradação

Água Superficial

Esgotos municipais

Água subterrânea

industriaisvolatilização

Lixiviação

Solo

dissolvidoassociado ao

sedimento

decomposição química ou

física

biodegradação

Etapas da determinação de multirresíduosEtapas da determinação de multirresíduos

AmostragemAmostragem

Preparo da amostraPreparo da amostra

Extração do analito da matrizEliminação de interferentes (clean-up)

Concentração dos analitosConcentração dos analitos

Separação, identificação e determinação dos Separação, identificação e determinação dos analitosanalitos

Técnicas cromatográficas

Validação do métodoValidação do método

MATRIZ

estado físico(sólido, líquido

ou gasoso)

tamanho da amostra

conteúdo de matéria orgânica

conteúdo de gordura,

pigmentos, proteínas,

etc.

pH

ANALITOANALITO

propriedades físicas

propriedades químicas

massa molar

carga

polaridade

volatilidade

pKa

propriedades que permitam a

detecção

absorção UV-vis

fluorescência

eletroatividade

concentração

CARACTERÍSTICAS DESEJADAS DO CARACTERÍSTICAS DESEJADAS DO MÉTODO DE PREPARO DE AMOSTRAMÉTODO DE PREPARO DE AMOSTRA

número mínimo

de etapas

rápidoalto fator

de concentração

seletivo

alta eficiência

consumo mínimo de

automação e baixo custo da

análise de traços e

ultra traços

reduz errosdetecção de

concentrações mais baixas

eficiência mínimo de solventes e reagentes

química verde

baixo custo da instrumentação

EXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SOLOEXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SOLO

• Extração por Soxhlet

• Agitação Mecânica

• Banho Ultrassônico

Técnicas convencionaisTécnicas convencionais

• Extração por fluido

Técnicas alternativasTécnicas alternativas

• Extração por fluido supercrítico

• Líquido pressurizado ou acelerada por solvente

• Assistida por microAssistida por micro--ondasondas

• QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)

Extração por Agitação MecânicaExtração por Agitação MecânicaExtração por Banho Extração por Banho UltrassônicoUltrassônico

• Promovem contato efetivo entre o solvente e a matriz da amostra durante a extração

• Podem ser feita à temperatura ambiente, o que permite a análise de compostos termolábeiscompostos termolábeis

• Possibilidade de realizar mais de 20 extrações simultaneamente

• Fácil acesso e baixo custo dos equipamentos

• Podem consumir muito tempo• Uso de solventes orgânicos

Extração por Fluido SupercríticoExtração por Fluido Supercrítico

Fluidos supercrítico:• elevado poder de solvatação• elevada difusivilidade

CO2 solvente mais utilizado em SFE. É considerado “solvente verde” por não trazer problemas ao meio ambiente.

VANTAGENS:• baixa toxicidade • facilidade de ser produzido e purificado• condições relativamente brandas para atingir o estado crítico (Tc=

43 oC e P = 73 bar)

DESVANTAGEM:• baixa polaridade, o que dificulta a extração de solutos de média

polaridade e polares.

Extração por Fluido SupercríticoExtração por Fluido Supercrítico

• A extração com fluido supercrítico é amplamente empregada nas áreas de alimentos, combustíveis, saúde e meio ambiente.

• VANTAGEM → facilidade com a qual pode ser acoplada em linha com as técnicas cromatográficas (GC, HPLC, CE).

• DESVANTAGEM → elevado custo dos equipamentos disponíveis comercialmente.

Extração por Líquido Pressurizado ou Extração por Líquido Pressurizado ou Acelerada por SolventeAcelerada por Solvente

• Cartuchos similares aos utilizados em extração em fase sólida.

• Solvente ou mistura de solventes em estado líquido sob pressão e temperatura relativamente altas.

• Acetona, metanol ou mistura de água e metanol como solventes extratores (volumes baixos)

• Sistema automatizado (possibilidade de realizar mais de 20 extrações simultaneamente)

Extração Assistida Por MicroExtração Assistida Por Micro--ondasondas

• Vantagens

Aquecimento de amostras, que contenham analitos dipolares, pela incidência de radiação micro-ondas, que aquece a amostra de dentro para fora, de forma rápida e uniforme.

Recomendada pela Agência de Proteção ao Meio Ambiente dos Estados Unidos (USEPA) para análise de amostras sólidas.

Vantagens

– Aumento da velocidade de extração

– Extração de múltiplas amostras, inclusive analitos termicamente instáveis

– Redução no consumo de solventes

– Uso de micro-ondas caseiro

• Desvantagens– Dificuldade de automação

– Cuidado quanto à segurança ao usar o micro-ondas caseiro.

QuEChERSQuEChERS(“quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”)(“quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”)

• Minimiza as etapas de preparo das amostras: 2 etapas– partição com acetonitrila, utilizando uma mistura de sais (MgSO4, NaCl e tampão citrato)– limpeza do extrato por EFS dispersiva, utilizando um sorvente composto por aminas primárias e

secundárias (PSA)

• MgSO4 – remove o excesso de água

• PSA – remove açúcares, ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos

• NaCl – ajuste da força iônica

• tampão citrato – ajuste do pH ~ 5

• Capaz de extrair agrotóxicos:– altamente polares– de elevada acidez ou basicidade

• Utiliza pequenas quantidades de solvente

• Relativamente mais rápido e robusto

MODIFICADO

*acetato de etila ou acetona

*C18 – remove interferentes não polares

*Carbono – remove pigmentos esteróides e interferentes apolares

TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOSAGROTÓXICOS

• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) eCromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC):determinação de compostos não voláteis, termicamenteinstáveis e de alta polaridade.

• Detectores:• Detectores:

- Arranjo de diodos (DAD)

- Espectrômetro de massas (MS):

- LC-MS/MS: técnica recomendada por agências reguladoras

Desenvolvimento e Validação de Métodos para a Determinação de Agrotóxicos em Solo das Áreas de Recarga do Aquífero Guarani, na Região das

Nascentes do Rio Araguaia, GO/MT

ESTUDO DE CASOESTUDO DE CASO

• Desenvolvimento e validação de métodos para determinação dosagrotóxicos imazetapir, nicossulfurom, imazaquim, carbofuram,atrazina, linurom, clorimurom-etil e diflubenzurom em solo utilizandoHPLC-DAD e a LC-ESI-MS/MS.

• Determinação dos agrotóxicos em amostras de solo das áreas derecarga do Aquífero Guarani, situadas na divisa entre MT e GO.

Águas Subterrâneas no BrasilÁguas Subterrâneas no Brasil

Sistema Aquífero GuaraniSistema Aquífero Guarani

• 45 % do volume total.

• Apresenta diversos pontos de recarga ou

• 61% da população• 80% SP, MA e PI

Abastecem:

Mapa Esquemático do Aquífero Guarani

SP

MG

GO

MT

MS

PR

Local estudado (Áreas de recarga do

Aquífero Guarani, nascentes do Rio

Araguaia)

• Apresenta diversos pontos de recarga ou afloramento.

• Exibe alta vulnerabilidade à contaminação por agrotóxicos decorrente de atividades agrícolas.

• Avaliação do nível de contaminação.

• Avaliação da sorção no solo.

• Foco principal deste trabalho.

Áreas de afloramento

Áreas de confinamento

PR

SC

RS

• Aumento no cultivo de grãos (soja e milho) na região que compreende os

estados de Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul

• Cultivo de lavouras na região: 100 % de aumento entre 1995 a 2006

• Região Centro-Oeste: 2a maior produtora de grãos

O Cultivo de Soja e Milho na Região Centro-Oeste do Brasil e Situação Atual do Sistema Aquífero Guarani na

Região das Nascentes do Rio Araguaia

• Mato-Grosso: maior produtor nacional de grãos (2009)

• Alto consumo e utilização indiscriminada de agrotóxicos

• Região abriga uma área considerável de recarga do Aquífero Guarani, situada

nas nascentes do Rio Araguaia.

• Solo: Neossolo quartzarênico (arenosos, com baixos teores de matéria

orgânica e de minerais) → favorecem a lixiviação dos agrotóxicos para as

águas subterrâneas.

Procedimentos de Extração e Determinação dos Procedimentos de Extração e Determinação dos Agrotóxicos em SoloAgrotóxicos em Solo

• Extração por agitação mecânica (MEC), extração por banhoultrassônico (BUS) e extração assistida por micro-ondas caseiro (MIC).

• Variáveis otimizadas: solventes, pH da solução aquosa, tempo de extraçãoe potência do micro-ondas.

Condições Otimizadas

VariáveisMEC/HPLC-

DADBUS/HPLC-

DADMIC/HPLC-

DADMIC/LC-ESI-

MS/MS

Acetato de etila (mL)

10 5 10 10

Água, pH 2,5 (mL)

1 2 1 1

Acetona (mL) --- 5 --- ---

Tempo (min) 120 60 2 2

Potência (W) --- --- 200 200

SeletividadeSeletividade: análise de pureza dos picos e comparação entrecromatogramas de brancos da matriz e de brancos da matrizfortificados.

LimitesLimites dede DetecçãoDetecção ee dede QuantificaçãoQuantificação dodo InstrumentoInstrumento (LDI(LDI eeLQILQI)): concentração dos analitos que resultou em um sinal igual a 3 e 10

Validação dos Métodos de Determinação Validação dos Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solodos Agrotóxicos em Solo

LQILQI)): concentração dos analitos que resultou em um sinal igual a 3 e 10vezes o ruído da linha de base, respectivamente.

LimiteLimite dede QuantificaçãoQuantificação dodo MétodoMétodo (LQM)(LQM): a menor concentraçãodos analitos na amostra que produziu um sinal igual ao LQI após osprocedimentos de extração.

CurvaCurva AnalíticaAnalítica: seis pontos com valores de concentrações em funçãodo LQM.

LinearidadeLinearidade: determinada através da regressão linear das curvas eavaliada através dos gráficos de resíduos.

ExatidãoExatidão: determinada através da porcentagem de agrotóxicosrecuperada (R) em três níveis de fortificação: 1x, 2x e 10x, o LQM.

Validação dos Métodos de Determinação Validação dos Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solodos Agrotóxicos em Solo

PrecisãoPrecisão::

a)a) RepetitividadeRepetitividade: determinada em um mesmo dia, com três séries detrês replicatas dos níveis de concentração (1x, 2x e 10x, o LQM).

b)b) PrecisãoPrecisão IntermediáriaIntermediária: determinada em três dias diferentes, comtrês replicatas dos níveis de concentração (1x, 2x e 10x, o LQM).

Validação dos Métodos de Determinação dos Validação dos Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solo Empregando Agrotóxicos em Solo Empregando HPLCHPLC--DADDAD

SeletividadeSeletividade

Res

post

a do

det

ecto

r

Res

post

a do

det

ecto

r

(6)

(5)(4)

(3)

Res

post

a do

det

ecto

r

(3)

MEC/HPLC-DAD BUS/HPLC-DAD MIC/HPLC-DAD

� Brancos do solo � Brancos do solo fortificados

Agrotóxicos: (1) Imazetapir, (2) Nicossulfurom, (3) Imazaquim, (4) Carbofuram, (5) Atrazina, (6)Linurom, (7) Clorimurom-etil, (8) Diflubenzurom. Condições cromatográficas: coluna analítica de150 x 3,9 mm e coluna de guarda de 2,0 x 3,9 mm, C18, 4 µm, NovaPak, Waters. Vazão: 0,8 mLmin-1, eluição por gradiente com FM acetonitrila:H2O pH=3 (H3PO4) ; volume de injeção: 10 µL;detecção: UV, 220 nm.

0 5 10 15 20 25 30

(1)

Res

post

a do

det

ecto

r

t (min)

(8)(7)(6)

(5)(4)

(3)

(2)

0 5 10 15 20 25 30

Res

post

a do

det

ecto

r

t (min)

(8)(7)

(5)(2)

(1)

0 5 10 15 20 25 30

Res

post

a do

det

ecto

r

t (min)

(8)(7)

(6)(5)(4)

(3)

(2)(1)

Limites de Detecção e de Quantificação do Limites de Detecção e de Quantificação do Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)

AgrotóxicoLDI

(ng mL-1)LQI

(ng mL-1)LDM

(ng g-1)LQM

(ng g-1)Conc. d.a.

(ng g-1)

Imazetapir 57 200 5,7 20 31

Nicossulfurom 35 100 3,5 10 16,1

Imazaquim 12 36 1,2 3,6 41

Determinação dos agrotóxicos em solo empregando Determinação dos agrotóxicos em solo empregando MEC, USB e MEC, USB e MIC/HPLCMIC/HPLC--DADDAD

Imazaquim 12 36 1,2 3,6 41

Carbofuram 35 150 3,5 15 438

Atrazina 6 30 0,6 3 659

Linurom 8 40 0,8 4 322

Clorimurom 38 100 3,8 10 15

Diflubenzurom 41 100 4,1 10 13,2

• Extrações: 5 g →→→→ 500 µL (fator de concentração = 10)

• LQM < Concentração da dose de aplicação (d.a.)

CurvasCurvas AnalíticasAnalíticas ee LinearidadeLinearidade

AgrotóxicoCurva Analítica Intervalo de

Linearidade(ng mL-1)

a (intercepto)

b (inclinação)

r

Imazetapir -569 24,7 0,9992 160 - 2400

Nicossulfurom 243 18,9 0,9993 80 - 1200

Imazaquim -732 83 0,9997 28 - 420

Determinação dos agrotóxicos em Determinação dos agrotóxicos em solosolo empregando empregando MEC, USB e MEC, USB e MIC/HPLCMIC/HPLC--DADDAD

Imazaquim -732 83 0,9997 28 - 420

Carbofuram -878 23,4 0,9996 120 - 1800

Atrazina -504 101 0,9997 24 - 360

Linurom -160 49,7 0,9993 32 - 480

Clorimurom -719 32,1 0,9997 80 - 1200

Diflubenzurom -172 28 0,9997 80 - 1200

• r > 0,999 = < a dispersão do conjunto de pontos experimentais e< a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.

• ANVISA = r > 0,99.• Gráficos de resíduos não apresentaram tendência ou padrão.

Exatidão (Recuperação) e Precisão Exatidão (Recuperação) e Precisão (repetitividade e intermediária) (repetitividade e intermediária)

• Recuperação na faixa aceitável de 70 a 120 % com as três técnicas de extração. Recuperações obtidas em um mesmo dia variaram na faixa de 76 a 112 % e as obtidas em dias diferentes variaram de 77 a 111 %.

• Com apenas 2 min de extração assistida por micro-ondas • Com apenas 2 min de extração assistida por micro-ondas caseiro foram obtidas recuperações de 83 a 112 %.

• Precisão (repetitividade) para os três tipos de extração, os valores de CV (0,2 - 10,2 %) ficaram abaixo do limite recomendado de 15 %.

• Precisão (intermediária)os valores de CV variaram de 0,3 a 11,7 %, mostrando-se adequados.

Validação do Método de Determinação dos Validação do Método de Determinação dos Agrotóxicos em Solo Empregando Agrotóxicos em Solo Empregando MIC/LCMIC/LC--ESIESI--MS/MSMS/MS

1) NICO

2) IMZA

411,3>182,2 ES+

312,4>199,2 ES+

5) ATRAZ

6) CLOR

216,2>174,2 ES+

415,2>186,2 ES+

4) CARBO

3) IMZE289,3>177,2 ES+

222,3>122,8 ES+

Cromatogramas obtidos para o branco do solo fortificado com os agrotóxicos após a extração por MIC,empregando LC-ESI-MS/MS. Condições cromatográficas: coluna analítica de 150 x 3,9 mm e coluna deguarda de 2,0 x 3,9 mm, C18, 4 µm, Waters. Vazão: 0,7 mL min-1, eluição por gradiente com FMacetonitrila:H2O, 1 % de ácido acético; volume de injeção: 10 µL.

7) LINU

8) DIFLU

249,1>160,2 ES+

309,3>156,1 ES-

LDI (ng mL-1) LQI (ng mL-1) LDM (ng mL-1) LQM (ng mL-1)

3 10 0,3 1

Curva Analítica Intervalo de

CurvasCurvas AnalíticasAnalíticas ee LinearidadeLinearidade

Limites de Detecção e de Quantificação do Limites de Detecção e de Quantificação do Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)

Extrações: 5 g → 500 µL (fator de concentração = 10)

Determinação dos agrotóxicos em Determinação dos agrotóxicos em solosolo empregando empregando MIC/LCMIC/LC--ESIESI--MS/MSMS/MS

AgrotóxicoCurva Analítica Intervalo de

Linearidade(ng mL-1)a (intercepto) b (inclinação) r

Nicossulfurom 10,78 11,8 0,9995 5 - 120

Imazaquim 6,76 10,3 0,9998 5 - 120

Imazetapir -0,28 2,05 0,9996 5 - 120

Carbofuram -5,44 7,94 0,9998 5 - 120

Atrazina -13,5 31,95 0,9995 5 - 120

Clorimurom -3,39 9,6 0,9998 5 - 120

Linurom -4,78 5,85 0,9998 5 - 120

Diflubenzurom -1,18 5,98 0,9997 5 - 120

MEC/ HPLC-DAD

USB/ HPLC-DAD

MIC/ HPLC-DAD

MIC/ LC-ESI-MS/MS

Recuperação a (%) 76 - 112 82 - 111 83 - 112 81 - 110

Recuperação b (%) 77 - 107 82 - 111 86 - 111 83 - 108

Repetitividade CV

Exatidão, Precisão em termos de Repetitividade e Exatidão, Precisão em termos de Repetitividade e Precisão Intermediária Precisão Intermediária

Repetitividade CV (%)

0,3 - 9,9 1,5 - 10,2 0,2 - 5 1 - 10,7

Precisão intermediária CV (%)

1,2 - 11,7 0,4 - 8,1 0,3 - 4,9 1,2 - 12,1

SANCO: 70 < R < 120 %

AOAC International: CV < 15 %

a Intervalos das recuperações obtidas em um mesmo diab Intervalos das recuperações obtidas em três dias diferentes

Aplicação do Método Validado

• Locais das coletas de solo.

Fazenda Município Tipo de Cultura

Latitude Longitude

Chitolina Mineiros/GO 17.89.083 53.11.917

Levi Goiânia/GO Soja e Milho

16.67.888 49.25.388

Resultado: nenhum dos agrotóxicos estudado foi detectado

Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solo Empregando MEC, BUS e MIC/HPLCSolo Empregando MEC, BUS e MIC/HPLC--DAD e DAD e

MIC/LCMIC/LC--ESIESI--MS/MSMS/MS

• A validação dos métodos empregando as três técnicas de

extração resultou em valores aceitáveis na literatura.

• MIC/LC-ESI-MS/MS: resultou em LQM menores.

• Extração assistida por micro-ondas: rápida (2 min), simples e

o equipamento empregado é de baixo custo e de fácil acesso.

• Alternativa às outras técnicas de extração, as quais

consumiram no mínimo uma hora de extração.

AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS

À comissão organizadora do 4o Seminário sobre contaminantes em alimentos

Ao grupo de pesquisa, em particular a doutoranda Laís Sayuri Ribeiro de Morais que desenvolveu o Laís Sayuri Ribeiro de Morais que desenvolveu o

presente trabalho

À DEUS

À todos pela atenção