ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI - repositorio.ufpe.br · calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo

Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 0

ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI

POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN

VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor

circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO

EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS

RECIFE 2008


UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN

VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor

circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO

EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS


RECIFE

2008



POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO

DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP

050: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE

CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Nutrição, Departamento de Nutrição do

Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal

de Pernambuco em cumprimento aos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Nutrição - Área de

Concentração: Ciências dos Alimentos.

Orientador (a): Profª. Drª. Tânia Lúcia Montenegro Stamford

Co - orientador (a): Profª. Drª. Thayza Christina Montenegro Stamford

RECIFE 2008


Fai, Ana Elizabeth Cavalcante

Potencial do efeito antimicrobiano in vitro de quitosana extraída de Mucor circinelloides UCP 050: uma abordagem para uso em sistemas deconservação de alimentos / Ana Elizabeth CavalcanteFai. – Recife : O Autor, 2008.

94 folhas + 16 anexos: il., fig., tab., graf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Nutrição. 2008.

Inclui bibliografia e anexos. 1. Quitosana. 2. Patógeno alimentar. 3.

Propriedade antibacteriana. 4. Conservantes de alimentos. I. Título.

612.39 CDU (2. ed.) UFPE 664.024 CDD (22. ed.) CCS03-2008



POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE

QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP 050:

UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE

CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS

Aprovada em 07 de fevereiro de 2008


Dedico Essa dissertação aos meus pais, Maria das Graças Cavalcante Fai e Andres Bartolome Fai (in memoriam) e aos meus irmãos Maria Julieta Fai Serpa e Rafael José Serpa Cavalcante Fai. Obrigada por confiar em mim e acreditar em meu potencial. Longe ou perto, mas sempre morando em meu coração. Amo vocês!


“Pouca ciência afasta de Deus, muita a Ele reconduz”.

Louis Pasteur

“Nenhuma mente que se abre para uma nova idéia voltará a ter o tamanho original”.

Albert Einstein

“Um cientista em seu laboratório não é somente um técnico, é também uma criança colocada diante de fenômenos naturais que a impressionam como um conto de fadas”.

Marie Curie


AGRADECIMENTOS

A Deus por sempre me proteger e guiar meus passos. A Profª. Drª. Tânia Lúcia Montenegro Stamford pela orientação e dedicação sem as quais não seria possível realizar este sonho. Agradeço por ter me ensinado o verdadeiro objetivo da pesquisa científica e por ter me ajudado a crescer como pesquisadora e como ser humano. Minha estima especial a Drª. Thayza Christina Montenegro Stamford pela total dedicação. Agradeço a Deus pela sua co-orientação, valiosos ensinamentos e pelo exemplo de pesquisadora que é. Obrigada pela paciência, delicadeza e confiança, imprescindíveis para a realização deste trabalho. As palavras se tornam pequenas para tamanho agradecimento. A Profª. Drª. Galba Maria de Campos-Takaki pelo prestimoso estímulo, ensinamentos e por disponibilizar gentilmente o laboratório do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco, possibilitando a realização deste trabalho. Agradeço por me ensinar o verdadeiro significado da palavra colaboração em pesquisa. Ao meu namorado Pedro Henrique P. Buarque de Gusmão pelo carinho, compreensão e incentivo constante. Obrigada por você existir e fazer parte da minha vida. A amiga e ex-professora Drª. Evânia Altina Teixeira de Figueiredo pela constante preocupação e incentivo desde a época da graduação até os dias atuais. Agradeço por todo o conhecimento de microbiologia que me foi transmitido e por acreditar sempre no meu potencial. A Universidade Federal de Pernambuco, em especial ao Departamento de Nutrição pela oportunidade de realizar meu curso de Mestrado nesta renomada instituição. Aos professores Dr. José Almiro da Paixão, Drª. Janete Magali de Araújo e Drª. Erilane C. L. Machado pela disponibilidade e colaborações proporcionadas. Ao Departamento de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco por todo auxílio e atenção prestados, durante a fase experimental desta pesquisa, em especial aos professores doutores Petrus Santa Cruz e André Galembeck e suas equipes. Ao Magnífico Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Pe. Pedro Rubens Ferreira Oliveira, S.J., pelo acesso aos laboratórios do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais para realização deste trabalho. A minha turma de mestrado, Amanda, Daniela, Emmanuela e Teresa pela amizade, apoio e saudável convivência durante o curso.


A Aline, Amanda, Claudinha, Deborah, Gustavo, Janaína, Jay, Lely, Paulo Henrique, Rafael, Suelen, Tatty, Victor e Vladimir pelo convívio e amizade. Sinceramente, muito obrigada! Aos colegas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco pela troca de experiências e convívio agradável durante a fase experimental deste trabalho, e em especial a Marta Cristina Freitas da Silva pela amizade, apoio e auxílio na produção de quitosana microbiana. Aos técnicos Salatiel José de Santana e Severino Humberto de Almeida pela amizade e colaboração durante a fase experimental dessa pesquisa. A Neci Nascimento, secretária da Pós-Graduação em Nutrição, pelo auxílio, presteza e amizade durante o curso de Mestrado e a Girleide Lopes pela disponibilidade e assistência. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, pela bolsa de Mestrado concedida. A todos que de alguma maneira, direta ou indireta, contribuíram para a realização deste trabalho, os meus mais sinceros agradecimentos.


RESUMO

Recentemente, a quitosana vem despertando bastante interesse em relação às suas aplicações em produtos alimentícios e farmacêuticos. Entre outras, a atividade antimicrobiana deste biopolímero tem sido apontada como uma das suas mais interessantes propriedades. O objetivo deste estudo foi extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP 050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos. Quitosana proveniente de caranguejo foi utilizada para comparação. A fim de determinar as concentrações mínimas bacteriostáticas e bactericidas das quitosanas foi realizado o teste de Heilman. Foi utilizada fermentação submersa para produção de quitosana por Mucor circinelloides (UCP 050) utilizando como substrato meio de cultura alternativo a partir de Jacatupé (Pachyrhizus erosus, (L) URBAN). Avaliou-se, ainda, o crescimento de M. circinelloiodes em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 horas), incubado a 28ºC e 150 rpm. Quitina e quitosana foram extraídas por tratamento álcali-ácido e a quitosana caracterizada por espectroscopia ao raio de Infravermelho, viscosidade, análise térmica e difração de raio X. M. circinelloides crescido em meio de cultura jacatupé apresentou rendimento de biomassa máximo (20.7 g.L-1) em 96 horas, enquanto a maior produção de quitosana (64 mg.g-1) e quitina (500 mg.g-1) foram observadas em 48 e 72 horas de crescimento, respectivamente. A quitosana caracterizada apresentou grau de deacetilação de 83% e massa molecular de 2,6 x 104 g/mol. A difração de raio X apresentou um pico de maior intensidade próximo ao angulo de 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) e a análise termogravimétrica demonstrou um processo de desidratação, seguido da decomposição do polímero, com geração de material carbonizado. As curvas de calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo demonstraram concentração mínima inibitória idênticas para todas as bactérias ensaiadas, de 1,50 mg.mL-1 para Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli e Yersinia enterocolitica e 0,625 mg.mL-1 para Pseudomonas aeruginosa. Nenhuma concentração de ambas quitosanas demonstrou ação bactericida para a cepa de S. entérica. A quitosana microbiológica apresentou menor concentração mínima bactericida frente P. aeruginosa quando comparada com a quitosana de crustáceo, sendo de 2,5mg.mL-1 -1 e 5,0 mg.mL , respectivamente. Os resultados obtidos destacam a quitosana como um promissor agente de conservação de alimentos de origem natural. Palavras-chave: quitosana; patógeno alimentar; propriedade antibacteriana; conservante de alimentos.


ABSTRACT

Chitosan has recently gained more interest due to its applications in food and pharmaceutics. Among others, the antimicrobial activity of chitosan has been pointed out as one of its most interesting properties of chitosan. The purpose of this study was to extract and characterize chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050) and evaluate the in vitro antibacterial activity of chitosan against food pathogenic and spoilage bacteria. Chitosan from crabs was used to comparison. The antibacterial activity was carried determining the minimum inhibitory and bactericidal concentration by Heilman test. Submerged fermentation was carried for chitosan productions by M. circinelloides (UCP 050) in an economic culture medium, Yam Bean (Pachyrhizus erosus L. Urban). The assay also evaluate the growth of M. circinelloiodes in different times of growth (24, 48, 72 and 96 hours), incubated at 28ºC in an orbital shaker at 150 rpm. Chitin and chitosan were extracted by alkali-acid treatment. Fungi chitosan was characterized by infrared spectroscopy, viscosity, thermal analysis and X-ray diffractometry. M. circinelloides grown in the yam bean medium produced higher yields of biomass (20.7 g.L-1) in 96 hours. The high level of chitosan (64 mg.g-1), and chitin (500mg.g-1) were produced at 48 and 72 hours of growth, respectively. Chitosan showed degree of deacetilation and viscosimetric molecular weight as: 83% and 2.70 104

x g/mol, respectively. X-ray diffraction showed strong Bragg refractions at an angle 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) and thermal analyses demonstrated a process of dehydration, followed of the polymer decomposition, with generation of carbonized material. DSC curves showed two thermal events; the first was a wide endothermic peak, and the second event was an endothermic peak. Both chitosan had identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed, which was 1,50 mg.mL-1 for Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia enterocolitica and 0,625 mg.mL-1 for Pseudomonas aeruginosa. Neither concentration of both chitosan showed bactericide effect against S. enterica strain. Microbiological chitosan showed lower minimum bactericide concentration against P. aeruginosa than crustacean chitosan, which was 2,5 mg.mL-1 and mg.mL-1, respectively. The results obtained in this study demonstrate the potential of chitosan as a novel food preservative of natural origin. Keywords: chitosan; foodborne pathogen; antibacterial property; food preservative.


Sumário

1.0 INTRODUÇÃO 15 2.0 REVISÃO DE LITERATURA 17 2.1 Quitina e Quitosana 17 2.1.1 Considerações gerais 17 2.1.2 Produção de quitina e quitosana 19 2.1.3 Biossíntese de quitina e quitosana 21 2.1.4 Ciclo biológico de quitina e quitosana 22 2.1.5 Aplicações quitina e quitosana 23 2.2 Quitosana: promissor agente conservante de alimentos 26 2.2 .1 Atividade antimicrobiana 28 2.2.2 Atividade antioxidante 34 2.2.3 Biofilmes 36 3.0 OBJETIVOS 39 4.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40

Primeiro artigo Título - Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production

and physico-chemical characterization Abstract 53 1. Introduction 54 2. Materials and methods 55 2.1 Microorganisms 55 2.2 Culture medium 56 2.3 Growth profile 56 2.4 Glucose and nitrogen consumption and pH determination 57 2.5 Chitin and Chitosan Extraction 57 2.6 Chitin and chitosan characterization 57 2.6.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%) 57 2.6.2 Molecular weight 58 2.6.3 Thermal analysis 58 2.6.4 X-ray diffraction 59 2.7 Statistic analysis 59 3. Results and discussion 59 4. Conclusion 65 5. Acknowledgements 66 6. References 66


Figures 69

Segundo artigo Título - Microbiological chitosan potentiates the antibacterial

activity against food and spoilage bacteria Abstract 75 1. Introduction 76 2. Materials and Methods 79 2.1 Bacterial strains and culture conditions 79 2.2 Chitosan preparation 79 2.3 Chitosan from M. circinelloides extraction 80 2.4 Chitin and chitosan characterization 80 2.4.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%) 80 2.4.2 Molecular weight 81 2.5 Antimicrobial activit 81 3. Results and discussion 82 4. Conclusion 86 5. Acknowledgements 86 6. References 86 Figures 91 Tables 92 CONCLUSÕES 93 ANEXOS 94


Lista de figuras

Revisão de literatura Figura 1- Estrutura química (a) quitina, (b) quitosana 17 Figura 2- Arranjo das cadeias de α e ß quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b)

19

Figura 3- Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales

21

Figura 4- Ciclo biológico de quitina 23 Figura 5- Esquema das aplicações da quitosana na indústria de alimentos

25

Primeiro artigo

Título: Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production and physico-chemical characterization

Figure 1- Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 28ºC, 150rpm, during 96h of cultivation 69

Figure 2- Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M. circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of cultivation

70

Figure 3- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050

71

Figure 4- X-ray diffraction of chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050)

72

Figure 5- DSC and TGA termograms of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050, under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C min-1)

73

Segundo artigo Título - Microbiological chitosan potentiates the antibacterial

activity against food and spoilage bacteria Figure 1- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050. 91

Figure 2- Infrared spectra of chitosan from crabs (Sigma®). 91


Tabelas

Segundo artigo Título: Microbiological chitosan potentiates the antibacterial

activity against food and spoilage bacteria Table 1-Minimum inhibitory concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria 92

Table 2-Minimum bactericidal concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria

92


1.0 Introdução

A exigência por alimentos seguros, com uma vida útil prolongada e de alta

qualidade nutritiva e sensorial é crescente (CHI et al., 2006). Os consumidores e os

próprios órgãos de saúde pública estão especialmente preocupados com os efeitos

decorrentes do uso de vários aditivos químicos em produtos alimentícios e sua

relação com a saúde (RHOADES & ROLLER, 2000; BARRETEAU et al., 2006).

Este cenário tem incentivado a pesquisa de novos agentes naturais que

possam ser empregados de forma a complementar os métodos de preservação de

alimentos que se dispõe atualmente (SOUZA et al. 2005; DEVLIEGHERE et al.,

2004a; KANATT, 2008a).

Destaca-se, entre estes, a quitosana, heteropolimero composto por unidades

repetidas de β-1,4 N-acetilglucosamina e β (1-4)-D-glicosamina, encontrada na

parede celular de fungos sendo a Classe Zygomycetes, e em particular a Ordem

Mucorales, a que apresenta maior quantidade de quitina e quitosana (CAMPOS-

TAKAKI, 2005; FRANCO et al., 2005; STAMFORD et al., 2007). A quitosana

também pode ser obtida através da deacetilação da quitina, podendo o grupo N-

acetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados

(OKAWA et al., 2003; SANTOS et al., 2003).

A literatura atual é vasta em material sobre quitina e quitosana, podendo-se

encontrar várias revisões que abordam diferentes aspectos destes polímeros

(TSIGOS et al., 2000; KIM & RAJAPAKSE, 2005; RINALDO, 2006; NO et al.,

2007).

A quitosana apresenta um amplo espectro de possíveis aplicações em

biomedicina (MARTINO et al., 2005), produtos farmacêuticos, biotecnologia


(COSTA SILVA et al., 2006), nanotecnologia (MURUGADOSS &

CHATTOPADHYAY, 2008) e ciência de alimentos (SHAHIDI et al., 1999; LIU et

al., 2008).

As características físico-químicas deste biopolímero, derivadas de sua

capacidade de formação de complexos polieletrolíticos e propriedades de

biodegradabilidade, biocompatibilidade aos tecidos e bioatividade, justificam a

razão pela qual o modo de obtenção e produção deste polissacarídeo tem sido

extensivamente estudado na atualidade (HARISH PRASHANTH &

THARANATHAN, 2006; YEN & MAU, 2007).

Na indústria alimentícia, a quitosana também oferece um amplo espectro de

possíveis aplicações, como seja, formação de filmes biodegradáveis (MENG et al.,

2008) recuperação de sub-produtos, imobilização de enzimas (KUMAR,2000),

purificação de água (ZENG et al., 2008), clarificação de sucos de frutas

(CHATTERJEE et al., 2005), agente antioxidante (SHAHIDI et al., 2002;

KANATT et al., 2004), destacando-se sua eficácia quanto à preservação da

qualidade microbiológica do alimento (QUIN et al., 2006; NO et al., 2007;

KANATT et al., 2008b).

Neste sentido, frente ao reconhecido potencial antimicrobiano da quitosana e

considerando a obtenção deste polímero a partir de fungos como uma alternativa

rentável e promissora, esta pesquisa teve como objetivo extrair e caracterizar a

quitosana da biomassa de Mucor circinelloides e avaliar a eficácia desta na inibição

do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse

em alimentos.


2.0 Revisão de Literatura

2.1 Quitina e Quitosana

2.1.1 Considerações gerais

A quitina é um polímero natural, álcali-ácido insolúvel, linear que apresenta

unidades repetidas de β-1,4 N-acetilglucosamina e β (1-4)-D-glicosamina (figura

1a) e com exceção da celulose é o polissacarídeo mais abundante e largamente

distribuído na natureza (CANELLA & GARCIA, 2001; MUZZARELLI, 2001). A

quitina é encontrada no exoesqueleto dos crustáceos, insetos e, em especial, na

parede celular de fungos. A quitosana (figura 1b) é um heteropolimero natural,

amino catiônico, composto por unidades β-1,4 D-glucosamina ligadas a resíduos de

N-acetilglucosamina, sendo encontrada na parede celular de fungos. A quitosana

também pode ser obtida através da deacetilação da quitina, podendo o grupo N-

acetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados (KHAN

et al., 2002; ANDRADE et al., 2003; OKAWA et al., 2003).

(a) (b)

Figura 1- Estrutura química (a) quitina, (b) quitosana Fonte: Craveiro et al., 1999.


A quitina foi isolada pela primeira vez em 1881 por Braconnot, quando

trabalhava com Agaricus volvaccus e outros fungos, recebendo a denominação

inicial de fungina (CAMPANA-FILHO et al., 2007). Odier em 1823 isolou um

resíduo insolúvel de insetos, chamando-o de quitina, nome derivado da palavra

grega Chiton, que significa carapaça ou caixa protetora. Contudo, Odier relatou que

havia isolado a quitina mediante vários tratamentos de soluções de hidróxido de

potássio concentrado. Isto, o levou a um equívoco, pois na realidade ele isolou a

quitosana. A quitosana, por sua vez, foi descoberta em 1859 por Rouget e seu nome

foi proposto em 1894 por Hoope-Seyler devido ao fato desta substância possuir a

mesma quantidade de nitrogênio que a quitina original (CRAVEIRO et al., 1999;

CAMPOS-TAKAKI, 2005).

Polissacarídeos conhecidos por apresentarem polimorfismo, quitina e

quitosana podem assumir três diferentes arranjos de suas cadeias nas regiões

cristalinas as quais são dependentes da polaridade adquirida pelas cadeias de açúcar.

As formas são denominadas α, ß e γ (Figura 2) e podem ser evidenciadas através do

estudo de difração de raios-x. A conformação polimérica α apresenta uma

disposição alternada de cadeias paralelas e antiparalelas que é dominante sobre as

demais, além de ser mais estável e resistente. Esta forma é encontrada em

crustáceos, cutícula de artrópodes, parede celular de fungos e insetos, estando

geralmente associada a proteínas e materiais inorgânicos. As conformações ß e γ

estão relacionadas à flexibilidade e dureza, ressaltando-se que estas podem ser

convertidas à forma α através de tratamentos químicos adequados. A ocorrência de

forma ß é evidenciada em organismos marinhos como lulas e algas microscópicas e

possui um arranjo de cadeias dispostas em paralelo. A forma γ todavia não foi

completamente caracterizada, embora haja sugestões de que tenha duas cadeias


paralelas e uma antiparalela (CAMPOS-TAKAKI, 2005; RINALDO, 2006; YEN &

MAU, 2007).

Figura 2 - Arranjo das cadeias de α e ß quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b) Fonte: Tharanathan & Kittur, 2003

2.1.2 Produção de quitina e quitosana

Exoesqueletos de crustáceos constituem a fonte tradicional para obtenção de

quitina e quitosana. O conteúdo de quitina nos crustáceos varia de acordo com a

espécie estando o rendimento entre 2 a 12% da massa corpórea total, e de 13 a 42%

na casca. A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina utilizando NaOH 50% e

temperatura em torno de 110ºC (SYNOWIECHI & AL-KHATEEB, 2003).

Existem várias limitações em relação à viabilidade do processo de obtenção da

quitina e quitosana proveniente de crustáceos, tais como: adaptação ao clima,

sazonalidade, locais de confinamento e o processamento em larga escala associado

com a conversão química de quitina em quitosana pela quitina deacetilase

(POCHANAVANICH & SUNTORNSUUK, 2002; AMORIM et al., 2005;

FRANCO et al., 2005; SILVA et al., 2006a).

Utilização de massa micelial de fungos como fonte alternativa de quitina e

quitosana tem demonstrado grandes vantagens, tais como: extração simultânea de

quitina e quitosana, independência dos fatores de sazonalidade, produção em larga


escala (AMORIM et al., 2001; AMORIM, et al., 2006; STAMFORD, et al., 2007).

A quantidade destes polissacarídeos extraídos da biomassa varia de acordo com a

espécie de fungo e condições nutricionais, principalmente, a fonte de carbono

utilizada.

Fungos da Divisão Zygomycotina apresentam quitina e quitosana

simultaneamente em sua parede celular (TSIGOS et al., 1999; FRANCO et al.,

2005; AMORIM, et al., 2006).

Várias pesquisas utilizando fungos como fonte alternativa de quitina e

quitosana relatam rendimentos iguais ou superiores, destes polímeros, aos obtidos

quando utilizadas fontes tradicionais (ANDRADE et al., 2003; AMORIM et al.,

2005).

Estudos utilizando biomassa de Mucor rouxii e M. javanicus obtiveram

rendimento de quitosana em torno de 8% e de quitina entre 8,9% e 23,9%

(SYNOWIECK & AL-KHATEEB, 1997; ANDRADE et al., 2003). Em recentes

estudos, tem se estabelecido métodos de otimização para processos de produção de

quitina e quitosana a partir de massa micelial de Cunninghamella elegans, assim

como a utilização de meios de cultura alternativos e de baixo custo econômico,

sendo relatados rendimentos de quitosana entre 5% e 8%, e de quitina em torno de

23% a 40% (ANDRADE et al., 2000, AMORIM et al., 2001; FRANCO et al.,

2005, STAMFORD et al., 2007).

Nwe et al. (2001) avaliando a produção de quitosana por vários

Zygomycetes, utilizando batata doce como meio de cultura básico, obtiveram os

melhores resultados com Gongronella butleri apresentando rendimento de

quitosana entre 7,9 a 11,6% e 8,2 a 12,7% em fermentação submersa e sólida,

respectivamente.


2.1.3 Biossíntese de quitina e quitosana

A biossíntese de quitina difere significativamente em fungos e crustáceos,

contudo, etapas da via de produção e maquinaria enzimática para regulação

catalítica são similares, como observado na figura 3.

Figura 3 - Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales Fonte: Stamford, 2006

Nos crustáceos a síntese inicia-se pela conversão de glicose-6-fosfato em N-

acetilglicosamina- 1-fosfato, envolvendo uma série de etapas que requerem várias

reações enzimáticas. A N-acetilglicosamina-1-fosfato reage com a UTP formando a

UDP-NAcetilglicosamina, que finalmente, transfere a N acetilglicosamina para a

polimerização de cadeias de quitina em um processo mediado pela enzima quitina-

sintetase e íons Mg+2 , como catalisador, resultando na formação de uma longa

cadeia de sub-unidades monossacarídicas unidas por ligações β-1→4 (CABIBI,

1987). A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina mediante tratamento


químico com NaOH em alta temperatura (DAVIS & BARTINICK, 1984;

BARTNICKI-GARCIA, 1989).

Nos fungos a síntese de quitina e de quitosana ocorrem simultaneamente. A

síntese de quitina é altamente compartimentalizada. A enzima quitina sintetase

ocorre na forma de zimógeno, sendo distribuída em regiões específicas da superfície

celular, em vesículas especializadas chamadas quitossomas (BARTNICKI-

GARCIA, 1989). A montagem macromolecular inicia-se fora do citoplasma, onde a

enzima protease atua na superfície celular ativando o zimogêno. Desta forma a

UDP-N acetilglicosamina é produzida a partir da glicose, e a quitina sintetase

catalisa a transferência do N-acetilglicosamina para polimerização da cadeia

formando quitina. A quitosana presente na parede celular de alguns fungos da

Ordem Mucorales, é formada a partir da deacetilação da cadeia de quitina nascente,

pela ação da quitina deacetilase, durante a biossíntese de quitina. As sínteses de

quitina e de quitosana são realizadas pela organização espacial da síntese de quitina

na superfície celular (DAVIS & BARTNICKI-GARCIA, 1984; STAMFORD,

2006).

2.1.4 Ciclo biológico de quitina e quitosana

De acordo com Craveiro et al. (1999), quitina e quitosana são

biologicamente sintetizadas em um total de, aproximadamente, um bilhão de

toneladas anualmente, sendo biodegradadas sem acúmulo excessivo na natureza,

através do “ciclo da quitina” (figura 4). As enzimas hidrolíticas envolvidas nesse

processo (lisoenzima, quitinase, quitina desacetilase e quitosanase) estão largamente

distribuídas nos tecidos e fluídos corporais dos animais e plantas, bem como no solo


impedindo naturalmente o excesso destes polímeros, contribuindo para a

preservação do ambiente.

QUITINA QUITOSANA

Quitina oligossacarídeos

Quitosana oligossacarídeos

N-acetil-D-glicosamina D-glicosamina

Quitina desacetilase

Quitinase Lisozima

Quitosanase

N-acetil-ß-D-glicosaminidase

QUITINA QUITOSANA

Quitina oligossacarídeos

Quitosana oligossacarídeos

N-acetil-D-glicosamina D-glicosamina

Quitina desacetilase

Quitinase Lisozima

Quitosanase

N-acetil-ß-D-glicosaminidase

Figura 4 - Ciclo biológico de quitina Fonte: Craveiro et al, 1999

2.1.5 Aplicações quitina e quitosana

O interesse comercial nas aplicações de quitosana e derivados aumentou

vertiginosamente nas últimas três décadas, o que pode ser constatado pelo depósito

de patentes no Japão, Europa, China, Coréia e, principalmente, nos EUA. Assim,

conforme o “United States Patent and Trademark Office”, foram registradas 5946

patentes patentes relacionadas à quitosana no período 1976-2006 apenas nos EUA

(CAMPANA-FILHO et al., 2007).

A literatura apresenta uma grande diversidade de fontes para produção de

quitina e quitosana, as quais influenciam as diferentes propriedades destes

polímeros e derivados, possibilitando o aumento do potencial biotecnológico e

aplicações comerciais (HARISH PRASHANTH & THARANATHAN, 2006;


MAIA et al., 2006; YEN & MAU, 2007). As principais propriedades deste

polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade, biocompatibilidade,

reatividade do grupo amino deacetilado, permeabilidade seletiva, ação

polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e

capacidade adsortiva (SYNOWIECKI & AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN

& KITTUR, 2003).

A quitosana vem sendo extensivamente estudada devido às suas

propriedades peculiares que lhe conferem um aproveitamento bastante versátil, tais

como: carreador de fármacos de liberação controlada e DNA (MITRA et al., 2001;

KATO et al., 2004; KIM et al., 2004; SUNIL et al., 2004), regeneração de tecidos

epiteliais (KARIMAN, 2007; LI et al., 2007a; NIEKRASZEWICZ et al., 2007),

confecção de membranas artificiais (DUREJA et al., 2001; COSTA et al., 2006),

promotor de osteogênese (MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2002; MURUGAN

& RAMAKRISHNA, 2004; MARTINO et al., 2005; PARK et al., 2005;

HAMILTON et al., 2007), antibacteriano (MUZZARELLI et al., 1990; CHUNG et

al., 2004; YADAV & BHISE, 2004; JING et al., 2007), coadjuvante da higiene oral

(ENEL et al., 2000; SANO et al., 2002; SANO et al., 2003; HAYASHI et al.,

2007), absorção de gordura e redução do colesterol sérico (KIM et al., 2005;

RODRÍGUEZ & ALBERTENGO, 2005; FEOFILOVA, 2007; LIU et al, 2008),

componente de cosméticos (MASATO, 2002; KOHEI & MAKI, 2006), remoção e

recuperação de diferentes resíduos (VIVEK & TORRES, 2000; LIMA et al., 2006),

biotransformação e detecção de pesticidas (DU et al., 2007; YOSHIZUKA et al.,

2007), recobrimento de sementes na agricultura (VELÁSQUEZ, 2003), remoção de

corantes, aminoácidos e proteínas (CRAVEIRO et al., 1999; BORDERÍAS et al.,


2005), como agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos (DÍAZ et al.,

2007; ZENG et al., 2008).

As possibilidades de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato da

quitosana poder ser preparada em diferentes formas, tais como soluções de

viscosidade controlada, géis, filmes e membranas, microesferas e nanopartículas

(CAMPANA-FILHO et al., 2007; MURUGADOSS & CHATTOPADHYAY,

2008).

Na indústria alimentícia, a quitosana oferece um amplo espectro de

aplicações (SHAHIDI et al., 1999; KUMAR, 2000; JIANG & LI, 2001; AGULLÓ

et al., 2003; THARANATHAN & KITTUR, 2003; BORDERÍAS et al., 2005;

BAUTISTA-BAÑOS et al., 2006; BORGOGNI et al., 2006; Li et al., 2007b),

conforme esquematizado na figura 5.

Quitosana

FUNÇÃO DE ADITIVO OUTRAS FUNÇÕESEMBALAGENS ATIVAS

Emulsificante

Antioxidante

Conservante

Estabilizante

Controle da oxidação lipídica

Prevenção do escurecimento

enzimático

Formação de biofilmes

Antibacteriano e antifúngico

Barreira à perda de umidade

Redução da produção de

etileno e poligalacturonase

em frutos

Manutenção da cor por mais

tempo

Redução da taxa respiratória em

frutos

Recuperação de subprodutos

Encapsulação de aromas

Clarificação de sucos de frutas

Purificação de água

Quitosana

FUNÇÃO DE ADITIVO OUTRAS FUNÇÕESEMBALAGENS ATIVAS

Emulsificante

Antioxidante

Conservante

Estabilizante

Controle da oxidação lipídica

Prevenção do escurecimento

enzimático

Formação de biofilmes

Antibacteriano e antifúngico

Barreira à perda de umidade

Redução da produção de

etileno e poligalacturonase

em frutos

Manutenção da cor por mais

tempo

Redução da taxa respiratória em

frutos

Recuperação de subprodutos

Encapsulação de aromas

Clarificação de sucos de frutas

Purificação de água

Figura 5 - Esquema das aplicações da quitosana na indústria de alimentos


2.2 Quitosana: promissor agente conservante de alimentos

Atualmente, a qualidade é um componente fundamental dos alimentos,

como a segurança alimentar (inocuidade) é componente indispensável da qualidade

(SILVA et al., 2006b). No entanto, a manutenção da qualidade de diversos produtos

alimentícios durante sua vida útil só é possível graças à atuação dos conservantes

químicos, tornando a produção de alimentos um tanto complexa, uma vez que, os

consumidores exigem alimentos seguros para o consumo, com mínimo de aditivos

químicos e que apresentem a conveniência de possuir uma extensa vida de

prateleira, estabelecendo-se, assim, um paradoxo.

No Brasil, o uso de aditivos alimentares é norteado pelo Ministério da Saúde

e regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),

considerando aditivo alimentar qualquer ingrediente adicionado intencionalmente

aos alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de modificar as

características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, durante a fabricação,

processamento, preparação, tratamento, embalagem, acondicionamento,

armazenagem, transporte ou manipulação de um alimento, de acordo com as

diretrizes preconizadas pela Portaria nº 540 (BRASIL, 1997). De acordo com esta

mesma Portaria os aditivos são classificados quanto à função, sendo classificados

como agentes conservantes as substâncias que têm a finalidade de impossibilitar ou

retardar a deterioração microbiana ou enzimática dos alimentos. A quitosana

apresenta-se perfeitamente compatível com esta definição, considerando suas

propriedades físico-químicas e o reconhecido potencial antimicrobiano e

antioxidante.


O uso de aditivos químicos é, no entanto, uma das práticas mais discutidas e

polêmicas. Se por um lado seu uso é imprescindível, por outro a debilidade e

incertezas de ambos os estudos negativos e positivos relacionados à toxicidade dos

aditivos químicos gera controvérsias. Dessa forma, justifica-se a atual tendência

adotada pela indústria de alimentos de uma política decrescente do uso de aditivos

químicos.

A toxicidade da quitosana é menor do que a glicose ou sacarose. A dose letal

de glicose em mamíferos é da ordem de 8 a 12 gramas enquanto que 18 gramas de

quitosana por quilograma de massa corporal em mamíferos não apresenta qualquer

sinal de toxicidade ou mortalidade (CRAVEIRO et al. 1999, YADAV & BHISE,

2004). Estudos indicam que a quitosana é benéfica e segura para o consumo

humano. Entretanto, como qualquer outra substância, se utilizada de forma

inadequada ou em excesso pode ser nociva ao organismo.

Os problemas referidos, decorrentes de doses excessivas da quitosana, foram

causados por desidratação gástrica e pelo impacto em decorrência do aumento do

volume da mesma uma vez que esta consiste em uma fibra natural que em meio

ácido se expande para formar um gel no estômago (COSTA SILVA et al., 2006).

A quitosana vem sendo utilizada na indústria de alimentos nos Estados

Unidos, Alemanha e Japão, sendo reportado neste último, como agente conservante

em: macarrão, molho de soja, sardinha, entre outros; contudo, dados quanto às

condições de processamento/formulação, todavia são escassas (ROLLER &

COVILL, 1999; RODRÍGUEZ et al., 2002).


2.2 .1 Atividade antimicrobiana

Com o intuito de evitar ou retardar a deterioração microbiana de alimentos a

quitosana e seus derivados têm sido amplamente pesquisados como agentes

antimicrobianos, e nos últimos anos têm recebido uma atenção especial, graças aos

resultados promissores neste âmbito de aplicação (TIKHONOV et al., 2006;

QIUPING & WENSHUI, 2007).

Pesquisas têm demonstrado que a quitosana apresenta ser eficiente como

antimicrobiano contra vários microrganismos como Staphylococcus aureus,

Escherichia coli (ZHENG & ZHU, 2003; LI et al., 2007b), Salmonella.

typhimurium, Streptococcus faecalis (CHUNG et al., 2004), Salmonella entérica, S.

paratyphi, Pseudomonas aeruginosa (YADAV & BHISE, 2004), Listeria

monocytogenes (COMA et al., 2002), Bacillus. cereus, Shigella dysenteriae,

Aeromonas hydrophila, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium (COSTA SILVA

et al., 2006), Sacharomyces cerevisiae, S. ludwigii, Zygosaccharomyces baillii,

Cryptococcus albidus, Candida sp., Rhodotorula sp. (WANG, 1992; RHOADES &

ROLLER, 2000; SAGOO et al., 2002).

O mecanismo de ação da quitosana sobre os microrganismos não está

completamente elucidado, mas várias propostas são sugeridas (NO et al., 2007).

Estudos mais recentes revelam que o mecanismo da atividade

antimicrobiana da quitosana está intimamente relacionado às propriedades físico-

químicas da solução de quitosana (grau de deacetilação e massa molar),

concentração utilizada e tempo de exposição, além das características inerentes à

membrana do microrganismo (COSTA SILVA et al., 2006; KANATT et al.,

2008b).


Alguns pesquisadores correlacionam a atividade antimicrobiana da

quitosana à formação de complexos polieletrolíticos, uma vez que seus grupos

amínicos protonados provavelmente se ligam seletivamente à superfície celular

carregada negativamente dos microrganismos, alterando a atividade celular e a

permeabilidade da membrana, resultando na perda de componentes intracelulares e

conseqüente inibição microbiana (AVADI et al., 2004; TSAI & HWANG, 2004;

YADAV & BHISE, 2004; CHEN et al., 2006).

Pesquisas demonstram que o efeito antimicrobiano da quitosana é distinto

em bactérias Gram-positivas e negativas (LIU et al., 2004). A atividade

antimicrobiana da quitosana em bactérias Gram-negativas tem sido associada à

natureza catiônica da quitosana que permite a interação e formação de complexos

polieletrólitos com os polímeros aniônicos presentes na superfície do

microrganismo pertubando a integridade da membrana. Em bactérias Gram-

positivas a hipótese é de que a quitosana forma filmes ao redor da célula, inibindo a

absorção de nutrientes (HELANDER et al., 2001; DEVLIEGHERE et al., 2004b;

HARISH PRASHANTH & THARANATHAN, 2006; KANATT et al., 2008a).

Estudos recentes relatam que a quitosana induz à desorganização molecular

e mudanças morfológicas em fungos fitopatógenos como: Fusarium oxysporum,

Sclerotio sclerotiorum, Rhizopus stolonifer, Penicillium digitatum, Colletotrichum

gloesporioides (BAUTISTA-BAÑOS et al., 2004), Aspeegillus niger

(PLASCENCIA-JATOMEA et al., 2003), entre outros.

A quitosana também apresenta a função de agente quelante de íons

metálicos. Dessa forma é sugerido ainda que este polissacarídeo poderia interferir

na produção de toxinas no crescimento microbiano (BORDERÍAS et al., 2005).


Altieri et al. (2005) estudando a eficiência antibacteriana da quitosana em

queijo muzarela mantido sob temperatura de refrigeração, constataram que a

quitosana inibiu o crescimento de microrganismos do grupo Coliforme e de

Pseudomonas spp. Inferiram ainda, que a presença deste polissacarídeo não afetou a

viabilidade e crescimento das bactérias ácido láticas, ao contrário, observou-se um

sutil estímulo com relação à sua multiplicação, de forma a não comprometer a

funcionalidade tecnológica que esta classe de microrganismos exerce sobre este

produto, demonstrando assim, que o uso de quitosana seria uma opção vantajosa

para estender a vida de prateleira deste alimento em termos tecnológicos e

econômicos.

Lee et al. (2002) e Barreteau et al. (2006) sugerem que oligossacarídeos de

quitosana e a própria quitosana de baixa massa molecular exerceriam um efeito

benéfico seletivo sobre o crescimento e atividade biológica de bactérias probióticas

tais como Bifidobacteria e Lactobacillus.

Martinez-Castellanos et al. (2007) reportaram que Lactobacillus

acidophillus, L. plantarum e Lactobacillus spp. podem ser impregnados em

películas de quitosana conservando sua viabilidade mesmo em concentrações

elevadas deste polissacarídeo (20g/L). Dentro do conceito de tecnologia de barreiras

de proteção o uso de biofilmes de quitosana associado a bactérias láticas é de

grande potencialidade, visto que lactobacilos produzem ácido lático, bacteriocinas e

outros compostos que inibem o desenvolvimento de patógenos e deteriorantes de

alimentos, além de serem importantes probióticos (SAAD, 2006).

Tsai & Hwang (2004) examinando a atividade antibacteriana in vitro frente

a algumas bactérias patógenas e probióticas relataram que para a quitosana com

grau de deacetilação entre 70 e 95%, a concentração mínima letal para Escherichia


coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, V. parahemoliticus, Listeria

monocytogenes e Shigella dysenteriae foi de 50 a 200 p.p.m., enquanto para

Clostridium perfrigens e bactérias probióticas dos gêneros Lactobacillus e

Bifidobacterium foi de 250, 500 e 1000 p.p.m., respectivamente. Fica evidente que a

resistência destas espécies probióticas testadas é mais elevada, quando comparada

às patógenas alimentares e intestinais, o que leva a crer que superfície celular destes

microrganismos é distinta, fazendo-se necessárias mais pesquisas acerca das

mesmas para se alcançar uma explicação conclusiva.

Outra constatação interessante destes mesmos autores refere-se à baixa

eficiência antibacteriana da quitosana frente C. perfrigens testada in vivo após a

ingestão na forma de pó em animais de laboratório, atribuindo-se este fato

fundamentalmente às diferenças de pH (nas condições do intestino o pH é maior

que 7,0, estando acima do pKa da quitosana), havendo portanto menos grupos

amínicos protonados desfavorecendo a interação com a superfície celular, e à

própria conformação da molécula que quando in vitro (pH<7) poderia estar mais

disponível devido ao desdobramento da cadeia por conta de uma maior repulsão

eletrostática dos grupos positivamente carregados.

Juneja et al. (2006) demonstraram que a adição de quitosana (concentração

3% p/p) em carne bovina e de peru cozidos foi eficiente para reduzir

significativamente o risco potencial de germinação de esporos de Clostridium

perfrigens durante a etapa de resfriamento de 54,4 ºC a 7,2ºC por até 18h.

É valido ressaltar que não obstante a quitosana apresente potencial para ser

utilizada como agente antimicrobiano natural é imprescindível que sejam estimadas

as características da matriz alimentar em questão, considerando-se os efeitos dos


próprios constituintes, o pH do produto, a combinação de procedimentos a que este

é submetido, as propriedades reológicas e demais aspectos físicos-químicos.

Devlieghere et al. (2004b) estudaram a ação antimicrobiana da quitosana in

vitro frente a alguns constituintes alimentares, constatando que há interferência do

NaCl devido à interação eletrostática derivada da dissociação desta molécula, sendo

que no caso das proteínas esta ação seria mais dependente do pH do meio às

próprias cargas aminoacídicas, visto que se estas estiverem abaixo do ponto

isoelétrico não haverá perda de atividade antimicrobiana, enquanto a gordura não

apresentou nenhum efeito adverso quanto a esta propriedade da quitosana.

Rodriguez et al. (2003) demonstrou que o uso de quitosana como biofilme

para revestir pizzas pré-cozidas (0,079g/100g pizza) foi eficiente para estender a

vida de prateleira durante o armazenamento devido sua ação antifúngica, reduzindo

o crescimento de Alternaria sp, Penicillium sp e Cladosporium sp. No entanto, após

o processamento térmico parte desta atividade antimicrobiana foi perdida

justificando-se tal fato, em razão da reação de Maillard visto que o grupamento

amínico comprometido com o açúcar redutor nesta reação, em temperatura elevada,

não é mais disponível para a formação de complexos polieletrolíticos,

desprendendo-se, portanto, que o uso de quitosana incorporado como agente

antimicrobiano em massas alimentícias fermentadas perde parte de sua propriedade

funcional se submetido a tratamento térmico (RODRÍGUEZ et al., 2002).

Vale ressaltar que alguns estudos revelam que os produtos resultantes da

reação de Maillard (PRM) apresentam ação antibacteriana (EINARSSON et al.,

1983; NAKAMURA et al., 1991; CHUYEN, 1998; CHEVALIER et al., 2001;

USUI et al., 2004; CHUNG et al, 2006), sendo inclusive sugerida, sua aplicação

como um aditivo conservante de alimentos (GOULD, 1995; LEISTNER, 2000).


Contudo, a literatura ainda é restrita em relação aos efeitos deletérios dos

PRM sobre microrganismos patógenos alimentares.

Neste sentido, Huang et al. (2007) estudaram a eficácia antibacteriana de

uma solução de quitosana antes, durante e depois da reação de Maillard induzida

pela adição de xilose e aquecimento a 95º/60horas. Examinaram, ainda, o efeito da

adição de quitosana e dos PRM sobre a vida de prateleira de macarrão de massa

fresca armazenado a 4ºC. Os autores verificaram que a atividade antibaceriana da

quitosana aumentou na fase inicial da reação de Maillard, observando que, a

atividade mínima inibitória para Bacillus subtilis decaiu de 250mg/mL para

50mg/mL. Constataram também que bactérias Gram-positivas são mais sensíveis

aos PRM que Gram-negativas. Por fim, concluíram que a adição de 0,05mL/100mL

de solução de quitosana e de PRM na formulação de macarrão de massa fresca

resultou em extensão de vida de prateleira de 6 e 14 dias, respectivamente.

Chi et al. (2006) relataram efeito sinérgico sobre a propriedade bactericida

de filmes de quitosana enriquecidos com extrato puro de óleo de orégano,

incorporadas em fatias de mortadela armazenada a 10ºC/5 dias, observando-se uma

redução do número de células de Listeria monocytogenes e Escherichia coli

O157:H7 de aproximadamente 4 logs decimais, comparada com 1 a 3 logs quando

aplicado somente o filme de quitosana, constatando ainda que este tipo de processo

é aceito em termos sensoriais.

Greco et al. (2007) reportaram que baixa concentração de quitosana (0,015%

p/v) com grau de deacetilação de 90% e PM de 300KDa é eficiente para inibir o

crescimento de Candida krusei em suco de maçã. Agregar a quitosana em uma

etapa prévia à pasteurização dos sucos, diminuiria a carga microbiana inicial,


permitindo tratamentos térmicos menos enérgicos, fazendo-se necessários mais

estudos a este respeito.

Não obstante sua comprovada eficiência antimicrobiana vale ressaltar que a

quitosana aplicada como um aditivo natural, complementar aos processos de

conservação tradicionais, não deve ser vista como um incentivo para o descuido das

boas práticas higiênico-sanitárias durante a fabricação de alimentos, uma vez que

esta ação configura na verdade, em mais uma etapa neste processo, ou seja,

aumentam-se os pontos críticos de controle. Neste sentido, um passo adicional,

como a incorporação de quitosana, requer um estrito cumprimento das “Boas

Práticas de Fabricação” para que os produtos cheguem às etapas finais com o maior

nível de qualidade possível.

2.2.2 Atividade antioxidante

Os processos de preservação de alimentos são determinados primeiramente

pelo controle do desenvolvimento microbiano. Contudo, outros fatores devem ser

controlados tais como a ocorrência de reações químicas e enzimáticas que

comprometem a qualidade sensorial do produto.

Diversos estudos têm reportado a habilidade antioxidante da quitosana,

tendo sido avaliado seu uso em carnes e derivados e frutos do mar que contém

quantidades significativas de ácidos graxos insaturados, particularmente

susceptíveis à oxidação lipídica durante seu processamento e armazenamento

(KANATT et al., 2004). Shahidi et al. (2002) verificaram que a adição de quitosana

mostrou-se eficiente como agente de controle da oxidação lipídica em bacalhau


(Gadus morhua), enquanto Darmadji & Izumimoto (1994) verificaram o efeito

antioxidante da quitosana em carne picada.

Kanatt et al. (2004), por sua vez, estudaram o efeito da adição de quitosana

em carne de cordeiro submetida a processo de irradiação, constatando que este

polissacarídeo minimizou os efeitos deste processo sobre a peroxidação lipídica,

uma vez que esta reação é justamente o fator limitante ao uso da irradiação em

carnes.

O mecanismo de ação antioxidante da quitosana nestes produtos é atribuído

à sua capacidade de quelar íons metálicos, tais como o ferro, ligado às moléculas de

hemoglobina e mioglobina, o qual age como catalisador desta reação (KAMIL et

al., 2002; BARRETEAU et al., 2006).

Em função da habilidade de se complexar a íons metálicos a quitosana é

também um promissor agente de controle do escurecimento enzimático em vegetais,

visto que a polifenoloxidase, enzima responsável por este fenômeno, possui cobre

no seu centro ativo e funciona como oxidase de função mista, atuando na

hidroxilação de monofenóis para diidroxifenóis e em seguida oxidando estes

últimos para o-quinonas. No caso dos vegetais, poder-se-ia sugerir, assim, o uso

da quitosana como biofilme de revestimento, visto que esta agiria como fator de

duplo impacto haja vista sua habilidade de bloquear dois componentes essenciais à

reação: o oxigênio (atmosfera modificada) e a própria enzima. Ressalta-se que neste

caso este método de preservação seria eficaz somente no início do processo uma

vez que a formação da quinona é dependente do oxigênio e da polifenoloxidase,

porém, uma vez formadas, as reações subseqüentes ocorrem espontaneamente sem a

dependência destes elementos para formação de melanina (ARAÚJO, 1999; ASSIS

& LEONI, 2003).


2.2.3 Biofilmes

Usar revestimentos e coberturas em frutas e vegetais com o objetivo de

aumentar seu período de preservação não consiste em prática recente. No entanto,

as coberturas denominadas “comestíveis” como hoje conhecemos datam das

décadas finais do século passado. Este renovado interesse deve-se à demanda dos

consumidores por alimentos de alta qualidade, preocupações ambientais em relação

ao acúmulo de embalagens não biodegradáveis e a oportunidade de se criar

alternativas de mercado para a produção de filmes de fontes renováveis

(FRANCHETTI & MARCONATO, 2006; BOTREL et al., 2007; MENG et al,

2008).

A quitosana destaca-se por sua capacidade de atuar como uma barreira à

perda de umidade, controlar a respiração do fruto e apresentar alto potencial

antimicrobiano, além de prevenir o escurecimento enzimático, ressaltando-se que

esta é biodegradável o que a torna “ambientalmente correta” (ASSIS & LEONI,

2003; BORDERÍAS et al., 2005; GALLETI et al., 2006; CHIEN et al., 2007a).

Neste âmbito de aplicação pode-se considerar, na realidade, os biofilmes a

base de quitosana como embalagens ativas, pois além de atuarem como uma

barreira a agentes externos, apresentam uma série de funções desejáveis à

manutenção da qualidade do vegetal ou fruto revestido. Apresenta como uma das

vantagens, sobre a embalagem convencional, o fato da quitosana apresentar

propriedades como agente antimicrobiano e antioxidante atendendo a atual

demanda por alimentos minimamente processados e livres da incorporação de

conservantes químicos (COMA et al., 2002; OLIVEIRA & OLIVEIRA, 2004).


Botrel et al. (2007) desenvolveram um revestimento antimicrobiano para

alho minimamente processado constituído de amido de mandioca adicionado de

quitosana, constatando que este foi viável para reduzir significativamente a

microbiota presente durante 20 dias de estocagem.

Qiuping & Wenshui (2007) pesquisando novas técnicas de preservação e

manutenção da qualidade de cerejas da Índia (Ziziphus mauritina, cv. Cuimi), à

temperatura ambiente, constataram que o uso de biofilme combinando quitosana e

1-metilciclopropeno foi eficaz para incrementar a vida útil deste fruto em oito dias.

Observaram diminuição da sua taxa respiratória e de produção de etileno e

poligalacturonase, pelas cerejas, observando também redução da perda de peso,

maior conservação da coloração verde e níveis mais altos de ácido ascórbico e

sólidos solúveis totais.

Chien et al. (2007b) reportaram a eficiência do biofilme de quitosana para

retardar o escurecimento, a deterioração e a perda de água em pitayas vermelhas

(Hylocereus undatus) fatiadas, mantendo o conteúdo de sólidos solúveis totais,

acidez titulável e ácido ascórbico. Verificaram, ainda, que este revestimento não

influenciou na qualidade sensorial de pitayas vermelhas, sugerindo assim, o uso de

coberturas de quitosana para preservar frutos minimamente processados de forma

geral.

Têm sido conduzidas, ainda, análises detalhadas dos filmes de quitosana por

microscopia eletrônica de varredura e de força atômica indicando estrutura

descontínua, que caracteriza certa porosidade residual no filme formado,

apresentando, de forma geral, espessura extremamente fina, não superior a 1,5 mm.

Essas características são desejáveis para coberturas de frutos, visto que, apesar de se

almejar baixar a taxa respiratória com vistas a retardar o amadurecimento, é


necessário que haja nos revestimentos a manutenção de uma respiração mínima,

evitando a ocorrência de processo fermentativo (ASSIS et al. 2002).

Contudo, observa-se, todavia, grande distância entre pesquisa e realidade

comercial, evidenciando-se que um dos aspectos que têm dificultado o uso da

quitosana na indústria alimentícia é a falta de padronização da mesma. As

quitosanas disponíveis, principalmente no Brasil, são de procedências diversas e

apresentam diferentes graus de pureza e densidade molar, além de não seguirem

industrialmente um procedimento comum de deacetilação, tornando os materiais

comerciais consideravelmente diferentes entre si, dificultando, dessa maneira, o

estabelecimento de um processamento padrão de géis e a obtenção de filmes e

revestimentos com características reprodutíveis (ASSIS & LEONI, 2003). Ressalta-

se a primazia da quitosana extraída de fungos quanto à aplicação deste biopolímero

no segmento alimentício, visto que a derivada de crustáceos é considerada

relativamente inconsistente quanto às suas propriedades físico-químicas devido à

variação da própria matéria-prima, contaminação por proteínas, carbonato de cálcio

e efeitos cáusticos dos produtos químicos necessários à síntese em altas

temperaturas resultando em hidrólise da cadeia (NADARAJAH et al., 2001).


3.0 Objetivos

3.1. Geral

Extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP

050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de

bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos.

3.2. Específicos

Investigar a eficiência do meio de cultura produzido a partir de Jacatupé

(Pachyrhizus erosus L. Urban) para o crescimento de Mucor circinelloides e

produção de quitina e quitosana;

Extrair e caracterizar quitosana da biomassa de Mucor circinelloides;

Verificar a sensibilidade de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de

interesse em alimentos frente à ação da quitosana;

Verificar a concentração inibitória mínima e máxima da quitosana sobre as

cepas ensaiadas.


4.0 Referências Bibliográficas

AGULLÓ, E.; RODRÍGUEZ, M. S.; RAMOS, V.; ALBERTENGO, L. Present and future role of chitin and chitosan in food. Macromolecular Bioscience, v.3, n.10, p.521-530, 2003.

ALTIERI, C.; SCROCCO, C.; SINIGAGLIA, M.; DEL NOBILE. Use of chitosan to prolong mozzarella cheese shelf life. Journal Dairy Science, v. 88, p.2683-2688, 2005.

AMORIM, R. V. S.; PEDROSA, R. P.; KAZUTAKA, F.; MARTÍNEZ, C. R.; LEDINGHAM, W. M.; CAMPOS-TAKAKI,G. M. Alternative carbon sources from sugar cane process for submerged cultivation of Cunninghamella bertholletiae to produce chitosan. Food Technology Biotechnology, v.44, n.4, p.519-523, 2006.

AMORIM, R.V.S.; CAMPOS-TAKAKI, G.M.; LEDINGHAM, W.M. et al. Screening of chitin deacetylase from Mucoralean strains (Zygomycetes) and its relationship to cell growth rate. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v.31, p. 19-23, 2005. AMORIM, R.V.S.; SOUZA, W.; FUKUSHIMA, K.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Faster chitosan production by mucoralean strains in submerged culture. Brazilian Journal of Microbiology, v.32, p.20-23, 2001.

ANDRADE, V.S.; NETO, B.B.; SOUZA, W.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. A factorial designs analysis of chitin production by Cunninghamella elegans. Canadian Journal of Microbiology, v.46, n.11, p.1042-1045, 2000.

ANDRADE, V.S; NETO, B.B; FUKUSHIMA, K.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Effect of medium components and time of cultivation on chitin production by Mucor circinelloides (Mucor javanicus IFO 4570)- A factorial study. Revista Iberoamericana de Micologia, v.20,p.149-153, 2003.

ARAÚJO, J. M. A. Química de Alimentos: Teoria e prática. 2ed. Viçosa: UFV.1999. 416p. ASSIS, O. B. G.; LEONI, A. M. Filmes comestíveis de quitosana. Biotecnologia Ciência e desenvolvimento, v.30, p. 33-38, 2003.

ASSIS, O. B. G.; VIEIRA, D. C.; BERNARDES-FILHO, R.; CAMPANA-FILHO, S. P. AFM characterization of chitosan self-assembled films. The International Journal of Polymeric Materials, v.51, n.7, p. 633-638, 2002.

AVADI, M.R.; SADEGHI, A.M.M.; TAHZIBI, A.; BAYATI, K.H.; POULADZADEH, M., ZOHURIAAN-MEHR, M.J.; RAFIEE-TEHRANI, M. Diethylmethyl chitosan as an antimicrobial agent: Synthesis, characterization and antibacterial effects. European Polymer Journal, v.40, p.1355-1361, 2004.


BARRETEAU, H.; DELATTRE, C.; MICHUD, P. Production of oligosaccharides as promising new food additive generation. Food Technology and Biotechnology, v.44, n.3, p.323-333, 2006. BARTNICKI-GARCIA, S. The biochemical cytology of chitin and chitosan synthesis in fungi In: BRACK,G.S.; ANTHONSEN, T.; SANDFORD, P. (Eds.), Chitin and Chitosan. New York: Elsevier Applied Science,1989, p.23 .35. BAUTISTA-BAÑOS, S.; HERNÁNDEZ- LÓPEZ, M.; BOSQUEZ-MOLINA, E. Growth inhibition of selected fungi by chitosan and plants extracts. Journal of Phytopathology, v.22, p.178-186, 2004. BAUTISTA-BAÑOS, S.; HERNÁNDEZ-LAUZARD, A.N.; VELÁZQUEZ-DEL-VALLE, M.G.; HERNÁNDEZ- LÓPEZ, M.; AIT BARKA, E.; BOSQUEZ-MOLINA, E.; WILSON, C.L. Chitosan as a potencial natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities. Crop Protection, v.25, p.108-118, 2006.

BORDERÍAS, A.J.; SÁNCHEZ-ALONZO, I.; PÉREZ-MATEOS, M. New applications of fibres in foods: Addition to fishery products. Trends in Food Science & Technology, v.16, p.458-465, 2005.

BORGOGNI, C. F.; POLAKIEWICZ, B.; PITOMBO, R. N. M. Estabilidade de emulsões de D-limoneno em quitosana modificada. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.26, n.3, p.502-508, 2006. BOTREL, D.A.; SOARES, N.F.F.; GERALDINE, R.M.; PEREIRA, R.M.; FONTES, E.A.F. Qualidade de alho (Allium sativum) minimamente processado envolvido com revestimento comestível antimicrobiano. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.27, n.1. p.32-38, 2007.

BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria, nº. 540, de 27 de outubro de 1997. Aprova o Regulamento Técnico de Aditivos Alimentares – definições, classificação e emprego. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 1997.

CABIBI, E. The synthesis and degradation of chitin, Advanced Enzymology, v.59, p.59-101, 1987.

CAMPANA-FILHO, S.P.; BRITTO, D.; CURTI, E.; ABREU, F.R.; CARDOSO, M.B.; BATTISTI, M.V.;SIM, P.C.; GOY, R.C.; SIGNINI, R.; LAVALL, R.L. Extração, estruturas e propriedades de α- e β-quitina. Química Nova, v.30, n.3, p.644-650, 2007.

CAMPOS-TAKAKI, G.M. The fungal versatility on the copolymers chitin and chitosan production. In: Chitin and chitosan opportunities and challenges. Dutta, PK. editor. India: International Publication, 2005.

CANELLA, K.M.N.C; GARCIA, R.B. Caracterização de quitosana por cromatografia de permeação em gel - influência do método de preparação e do solvente. Química Nova, v.24, n.1, p.13-17, 2001.


CHATTERJEE, S.; ADHYA, M.; GUAH, A. K.; CHATTERJEE, B. P. Chitosan from Mucor rouxii: production and physico-chemical characterization. Process Biochemistry. v.40, p.395-400, 2005. CHEN, S.; WU, G.; LONG, D.; LIU, Y. Preparation, characterization and antibacterial activity of chitosan–Ca3V10O28 complex membrane. Carbohydrate Polymers, v.64, p.92-97, 2006. CHEVALIER, F.; CHOBERT, J.M.; GENOT, C.; HAERTLÉ, T. Scavenging of free radicals, antimicrobial, and cytotoxic activities of the Maillard reaction products of beta-lactoglobulin glycated with several sugars. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.49, n.10, p.5031- 5038, 2001. CHI, S., ZIVANOVIC, S. PENFIELD, M. P. Application of chitosan films with oregano essential oil on bologna- active compounds and sensory attributes. Food Science and Technology International, v.12, n.2, p.111-117, 2006. CHIEN, P-J.; SHEU, F.; LIN, H-R. Coating citrus (Murcott tangor) fruit with low molecular weight chitosan increases postharvest quality and shelf life. Food Chemistry, v. 100, p. 160-164, 2007a. CHIEN, P. -J.; SHEU, F.; LIN, H.R. Quality assessment of low molecular weight chitosan coating on sliced red pitayas, Journal of Food Engineering, v.79, p.736-740, 2007b.

CHUNG Y. C.; TSAI, C. F.; LI, C. F. Preparation and characterization of water-soluble chitosan produced by Maillard reaction. Fisheries Science, v.72, p. 1096–1103,2006.

CHUNG, Y.-C.; SU, Y. -A.; CHEN, C. –C.; JIA, G.; WANG, H. -L.; WU, J. C. G.; LIN, J. G. Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall. Acta Pharmacologica Sinica, v.25, n.7, p.932-936, 2004.

CHUYEN, N.V. Maillard reaction and food processing. Application aspects. Advances in Experimental Medicine and Biology., v.434, p.213-235,1998.

COMA, V.; MARTIAL-GROS, A.; GARREAU, S.; COPINET, A.; SALIN, F.; DESCHAMPS, A. Edible antimicrobial films base don chitosan matrix. Journal of Food Science, v.67, n.3, p.1162-1169, 2002.

COSTA SILVA, H. S. R.; SANTOS, K.S.C.R.; FERREIRA, E.I. Quitosana: Derivados hidrossolúveis, aplicações farmacêuticas e avanços. Química Nova, v.29 n.4, p.776-785, 2006.

COSTA, T.A.C,; ANDRADE, A.L.; BINOTTO, T.E.; PLEPSIS, A.M.G.; BEVILACQUA, L.; SOUZA, W.M. Avaliações clínica e morfométrica da capacidade angiogênica da membrana de quitosana em córneas de coelhos. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, v.69, n.6, p.817-21, 2006.


CRAVEIRO, A.A.; CRAVEIRO, A.C.; QUEIROZ, D.C. Quitosana: A fibra do futuro. Fortaleza: PADETEC – Parque de Desenvolvimento Tecnológico. 1999. 124p. DARMADJI, P.; IZUMIMOTO, M. Effect of chitosan in meat preservation. Meat Science, v.38, p.243-254, 1994.

DAVIS, L.L.; BARTNICKI-GARCIA, S. The coordination of chitosan and chitin synthesis in Mucor rousii. Journal of General Microbiology,v.130, p.400-408, 1984.

DEVLIEGHERE, F.; VERMEIREN, A.; DEBEVERE, J. Chitosan: antimicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruits and vegetables. Food Microbiology, v.21, p.703-714, 2004b.

DEVLIEGHERE, F.; VERMEIREN, L.; DEBEVERE, J. New preservation technologies: possibilities and limitations. International Dairy Journal, v.14, p.273-285, 2004a.

DÍAZ, E.D.A.; VELASCO, M.C.V.; PÉREZ, F.R.; LÓPEZ, C.A.R.; IBARRETA, L.L. Utilización de adsorbentes basados en quitosano y alginato sódico para la eliminación de iones metálicos: Cu2+ 2+ 3+, Pb , Cr , y Co2+. Revista Iberoamericana de Polímeros, v.8, n.1, p. 20-37, 2007.

DU, D.; DING, J.; CAI, J.; ZHANG, A. Determination of carbaryl pesticide using amperometric acetylcholinesterase sensor formed by electrochemically deposited chitosan. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v.58, p.145–150, 2007. DUREJA, H.; TIWARY, A.K.; GUPTA, S. Simulation of skin permeability in chitosan membranes. International Journal of Pharmaceutics, v.213, p.193–198, 2001. EINARSSON, H.; SNYGG, B.G.; ERIKSSON, C. Inhibition of bacterial growth by maillard reaction products. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.31, p.1043-1047, 1983. ENEL, S.; IKINCI, G.; KAS, S.; YOUSEFI-RAD, A.; SARGON, M.F.; HINCAL, A.A. Chitosan films and hydrogels of chlorhexidine gluconate for oral mucosal delivery. International Journal of Pharmaceutics, v.193, p.197–203, 2000.

FEOFILOVA, E.P. Modern Perspectives in Chitin and Chitosan Studies. Applied Biochemistry and Microbiology, v.43, n.4, p. 473–4732, 2007.

FRANCHETTI, S. M. M., MARCONATO, J. C. Polímeros biodegradáveis: Uma solução para diminuir a quantidade dos resíduos plásticos, Química Nova, v.29, n.4, p. 811-816, 2006. FRANCO, L.O.; STAMFORD, T.C.M.; STAMFORD, N.P.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Cunningamella elegans (IFM 46109) como fonte de quitina e quitosana. Revista Analytica, n, 14, p. 40-44. 2005.


GALLETI, L.; BERGER, H.; DROUILLY, D.; ANTONIO LIZANA, L. Atmósfera modificada en fruto de pepino dulce. Idecia, v.24, n.2, p. 35-40, 2006. GOULD, G.W. New methods of food preservation, London: Chapman & Hall, 1995, 324p.

GRECO, F.A.; CUBITTO, M.A.; RODRÍGUEZ, M.S. Evaluación de la actividad antimicrobiana del quitosano sobre Candida Krusei en jugo de manzana. In: Livro de Resumos do IV Simposio Íbero-americano de Quitina; 2007 mai; Brasil, Natal; 2007. Resumo II-10-C.

HAMILTON, V.; YUAN, Y.; RIGNEY, D. A.; CHESNUTT, B. M; PUCKETT, A. D.; ONG, J. L.; YANG, Y.; HAGGARD, W. O.; ELDER, S. H.; BUMGARDNER, J. D. Bone cell attachment and growth on well-characterized chitosan films. Polymer International, v.56, n.5, p. 641-647, 2007.

HARISH PRASHANTH, K.V.; THARANATHAN, R.N. Chitin/chitosan: modifications and their unlimited application potential-an overview. Trends in Food Science & Technology, doi: 10.1016/j.tifs.2006.10.022. 2006. HAYASHI, Y.; OHARA, N.; GANNO, T.; YAMAGUCHI, K.; ISHIZAKI, T. NAKAMURA, T.; SATO, M. Chewing chitosan-containing gum effectively inhibits the growth of cariogenic bacteria. Archives of oral biology, v.52, p. 290-294, 2007. HELANDER, I.M.; NURMIAHO-LASSILA, E.L.; AHVENAINEN, R.; RHOADES, J.; ROLLER, S. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria. International Journal of Food Microbiology, v.71, p. 235-244, 2001. HUANG, J.R.; HUANG, C.Y.; HUANG, Y.H.; CHEN, R.H. Shelf-life of fresh noodles as affected by chitosan and its Maillard reaction products. LWT- Food Science and Technology, v.40, p.1287-1291, 2007.

JIANG, Y.; LI, Y. Effects of chitosan coating on postharvest life and quality of longan fruit. Food Chemistry, v.73, p.139-143, 2001.

JING, Y.J.; HAO, Y.J.; QU, H.; SHAN, Y.; LI, D.S.; DU, R.Q. Studies on the antibacterial activities and mechanisms of chitosan obtained from cuticles of housefly larvae. Acta Biologica Hungarica, v.58, n.1, p.75-86, 2007.

JUNEJA, V. K.; THIPPAREDDI, H.; BARI, L.; INATSU, Y.; KAWAMOTO, S.; FRIEDMAN, M. Chitosan protects cooked ground beef and turkey against Clostridium perfrigens spores during chilling. Journal of Food Science, v.71, n.6, p.236-240, 2006.

KAMIL, J. Y. V. A.; JEON, Y.J.; SHAHIDI, F. Antioxidative activity of chitosans of different viscosity in cooked comminuted flesh of herring (Clupea harengus), Food Chemistry, v.79, p. 69-77, 2002.


KANATT, S. R.; CHANDER, R.; SHARMA, A. Effect of irradiated chitosan on the rancidity of radiation-processed lamb meat. International Journal of Food Science and Technology, v.39, p. 997-1003, 2004. KANATT, S.R.; CHANDER, R. SHARMA, A. Chitosan glucose complex – A novel food preservative. Food Chemistry, v.106, p.521–528, 2008a. KANATT,S.R.; CHANDER, R.; SHARMA, A. Chitosan and mint mixture: A new preservative for meat and meat products. Food Chemistry, v.107, p. 845-852, 2008b. KARIMAN, M. E.S. Gamma Radiation-Induced Crosslinked PVA/Chitosan Blends for Wound Dressing. Journal of Macromolecular Science, v.44, n.5, p. 541-545, 2007. KATO, Y.; ONISHI, H.; MACHIDA, Y. N-succinyl-chitosan as a drug carrier: water-insoluble and water-soluble conjugates. Biomaterials, v.25, p. 907–915, 2004. KHAN, T.A.; PEH, K.K.; CHENG, H.S. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, v.5, n.3, p.205-212, 2002.

KIM, S.-K.; RAJAPAKSE, N. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review. Carbohydrate Polymers, v.62, p. 357-368, 2005. KIM, T.H.; PARK, I.K.; NAH, J.W.; CHOI, Y.J.; CHO, C.S. Galactosylated chitosan/DNA nanoparticles prepared using water-soluble chitosan as a gene carrier. Biomaterials, v.25, p. 3783-3792, 2004.

KOHEI, H.; MAKI, O. Application of Carboxymethyl Chitin for Cosmetics. Chitin and Chitosan Research, v.12, n.2, p. 86-87, 2006.

KUMAR, M. N. V. R. A review and chitosan applications. Reactive and Functional Polymers, v.46, p.1-27, 2000.

LEE, H. W.; PARK, Y.S.; JUNG, J. S.; SHIN, W. S. Chitosan oligosaccharides, dp 2-8, have prebiotic effect on the Bifidobacterium bifidium and Lactobacillus sp. Anaerobe, v.8, n.6, p. 319-324, 2002. LEISTNER L. Basic aspects of food preservation by hurdle technology. International Journal of Food Microbiology, v.55, p. 181-186, 2000.

LI, Q.L.; HUANG, N.; WAN, G.J.; ZHAO, L.S.; TANG, X.Y. Ultra-thin film of chitosan and sulfated chitosan coating on titanium oxide by layer-by-layer self-assembly method. Key Engineering Materials, 2007a; 330-332: 645-648.


LI, Y.; CHEN, X. G.; LIU, N.; LIU, C. S.; LIU, C. G.; MENG, X. H.; YU, L. J.; KENEDY, J. F. Physicochemical characterization and antibacterial property of chitosan acetates. Carbohydrate Polymers, v. 67, p.227-232, 2007b.

LIMA, I. S.; RIBEIRO, E. S.; AIROLDI, C. O emprego de quitosana modificada com anidrido succínico na adsorção de azul de metileno. Química Nova, v.29, n.3, p.501-506, 2006. LIU, H.; DU, Y.; YANG, J.; ZHU, H. Structural characterization and antimicrobial activity of chitosan/betaine derivative complex. Carbohydrate Polymers, v.55, p. 291-297, 2004. LIU, J.; ZHANG, J. XIA, W. Hypocholesterolaemic effects of different chitosan samples in vitro and in vivo. Food Chemistry, v.107, p.419-425, 2008. MAIA, R.C.C.; FRANCO, L.O.; STAMFORD, T.C.M.; FUKUSHIMA, K.; PORTO, A.L.F.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Chitin producted by cunnunghamella elegans (IFM 46109) and applied to wound healing. Asian Chitin Journal, v.2, p.11-20, 2006. MARTINEZ-CASTELLANOS, G.; DIAZ-SOBAC, R.; PEREZ FLORES, L.; SHIRAI, K. Viabilidad de bacterias lacticas en peliculas de quitosano para su aplicación en alimentos. In: Livro de Resumos do IV Simposio Íbero-americano de Quitina; 2007 mai; Brasil, Natal; 2007. Resumo II-11-C.

MARTINO, A.D.; SITTINGER, M.; RISBUD, M.V. Chitosan: A versatile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering. Biomaterials, v.26, p. 5983-5990, 2005.

MASATO, I. Recent research on glycolipid. A novel application of chitin and chitosan to the cosmetics. Fragrance Journal, v.30, n.5, p. 44-49, 2002.

MENG, X.; LI, B.; LIU, J.; TIAN, S. Physiological responses and quality attributes of table grape fruit to chitosan preharvest spray and postharvest coating during storage. Food Chemistry, v.106, p.501-508, 2008.

MITRA, S.; GAUR, U.; GHOSH, P.C.; MAITRA, A.N. Tumour targeted delivery of encapsulated dextran–doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier. Journal of Controlled Release, v.74, p. 317–323, 2001. MURUGADOSS, A.; CHATTOPADHYAY, A. A ‘green’ chitosan–silver nanoparticle composite as a heterogeneous as well as micro-heterogeneous catalyst. Nanotechnology, doi:10.1088/0957-4484/19/01/015603. 2008. MURUGAN, R., RAMAKRISHNA, S. Bioresorbable composite bone paste using polysaccharide based nanohydroxyapatite. Biomaterials, v.25, n.17, p.3829-3835, 2004. MUZZARELLI, C.; MUZZARELLI, R.A.A. Natural and artificial chitosan–inorganic composites. Journal of Inorganic Biochemistry, v.92, p. 89-94, 2002.


MUZZARELLI, R. A. A. Chitin Enzimology. Italy: Atec, 2001. 614p. MUZZARELLI, R.; TARSI, R.; FILIPPINI, O.; GIOVANETTI, E.; BIAGINI, G.; VARALDO, PE. Antimicrobial properties of N-carboxybutyl chitosan. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.34, p. 2019-2023, 1990. NADARAJAH, K.; KADER, J.; MOHD, M.; PAUL, D. C. Production of chitosan by fungi, Journal of Biological Sciences, v.4, n.3, p.263-265, 2001. NAKAMURA, S.; KATO, A.; KOBAYASHIT, K. New Antimicrobial Characteristics of Lysozyme-Dextran Conjugate. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.39, p.647-650, 1991. NWE, N.; CHANDRKRACHANG, S.; STEVENS, W.F.; MAW, T.; TAN, T.K.; KHOR, E.; XONG, S.M. Production of fungal chitosan by solid state and submerged fermentation. Carbohydrate Polymers, v.49, n.2, p.235-237, 2002. NIEKRASZEWICZ, A.; LEBIODA, J.; KUCHARSKA, M.; WESOŁOWSKA, E. Research into developing antibacterial dressing materials. Fibres & Textiles in Eastern Europe, v.15, n.1, p.101-105, 2007

NO, H.K.; MEYERS, S.P.; PRINYAWIWATKUL, W.; XU, Z. Applications of Chitosan for Improvement of Quality and Shelf Life of Foods: A Review. Journal of Food Science, v.72, n.5, p. 87-100, 2007. OKAWA, Y.; KOBAYASHI, M.; AB.; SUZUKI, S.; SUZUKI, M. Comparative Study of Protective Effects of Chitin, Chitosan, and N-Acetyl Chitohexaose against Pseudomonas aeruginosa and Listeria monocytogenes Infections in Mice. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v.26, n.6, p.902-904, 2003.

OLIVEIRA, L.M.; OLIVEIRA, P.A.P.L.V. Revisão: Principais agentes antimicrobianos utilizados em embalagens plásticas. Brazilian Journal of Food Technology, v.7, n.2, p.161-165. 2004. PARK, D.-J.; CHOI, B.-H.; ZHU, S.-I.; HUH, J.-Y.; KIM, B.-Y.; LEE, S.-H. Injectable bone using chitosan-alginate gel/mesenchymal stem cells/bmp-2 composites. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery, v.33, p. 50-54, 2005. PLASCENCIA-JATOMEA, M.; VINIEGRA, G.; OLAYO, R.; CASTILLO-ORTEGA, M.M.; SHIRAL, K. Effect of chitosan and temperatura on spore germination on Aspergillus niger. Macromolecular Bioscience, v.3, p.582-586, 2003.

POCHANAVANICH, P.; SUNTORNSUUK, W. Fungal quitosan production and its characterization. Letters in Applied Microbiology, n.35, p.17-21, 2002.

QIUPING, Z.; WENSHUI, X. Effect of 1-methylcyclopropene and/or chitosan coating treatments on storage life and quality maintenance of Indian jujube fruit, LWT- Food Science and Technology, v. 40, p. 404-411, 2007.


QUIN, C.; LI, H.; XIAO, Q.; LIU, Y.; ZHU, J.; DU, Y. Water-solubility of chitosan and its antimicrobial activity. Carbohydrate Polymers, v.63, p.367-374, 2006.

RHOADES, J.; ROLLER, S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Applied and Enviromental Microbiology, v.66, n.1, p. 80-86, 2000. RINALDO, M. Chitin and chitosan: properties and applications. Progress in Polymer Science, v. 31, p.603-632, 2006. RODRIGUEZ M. S.; RAMOS V.; ANULLO E. Antimicrobial action of chitosan against spoilage organisms in precooked pizza. Journal of Food Science, v.68, n.1, p. 271-274, 2003.

RODRÍGUEZ, M. S.; CENTURIÓN, M.E.; AGULLÓ, E. Chitosan-yeast interaction in cooked food: influence of the Maillard reaction. Journal of Food Science, v.67, n.7, p. 2576-2578, 2002. RODRÍGUEZ, M.S.; ALBERTENGO, L.E. Interaction between chitosan and oil under stomach and duodenal digestive chemical conditions. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, v.69, n.11, p. 2057-2062, 2005. ROLLER, S.; COVILL, N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice. International Journal of Food Microbiology, v.47, p.67-77, 1999. SAAD, S.M.I. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v.42, n.1, p.1-16, 2006. SAGOO, S. K.; BOARD, R.; ROLLER, S. Chitosan potentiates the antimicrobial action of sodium benzoate on spoilage yeasts. Letters in Applied Microbiology, v.34, p.168-172, 2002.

SANO, H.; SHIBASAKI, K.; MATSUKUBO, T.; TARAESU, Y. Effect of chitosan rinsing on reduction of dental plaque formation. The Bulletin of Tokyo Dental College, v.44, n.1, p. 9-16, 2003. SANO, H.; SHIBASAKI, K.; MATSUKUBO, T.; TARAESU, Y. Effect of molecular mass and degree of deacetylation of chitosan on adsorption of Streptococcus sobrinos 6715 to saliva treated hydroxyapatite. The Bulletin of Tokyo Dental College, v.48, p.75-82, 2002. SANTOS, J.E.; SOARES, J.P.; DOCKAL, E.R.; CAMPANA FILHO, S.P.; CAVALHEIRO, E. T.G. Caracterização de quitosanas comerciais de diferentes origens. Polímero: Ciência e Tecnologia, v.13, n.4, p.242-249, 2003. SHAHIDI, ARACHCHI, J. K. V.; JEON, Y. -J. Food applications of chitin and chitosans. Trends in Food Science & Technology, v.10, p. 37-51, 1999.


SHAHIDI, F. KAMIL, J., JEON, Y. -J., KIM, S. K. Antioxidant role of chitosan in a cooked cod (Gadus Morhua) model system. Journal of Food Lipids, v.9, p.57-65. 2002. SILVA, M.C.F.; STAMFORD, T.C.M.; FRANCO, L.O.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Effects of salinity and glucose on chitin and chitosan production by Cunninghamella elegans. Asian Chitin Journal, v.2, p.29-38, 2006a. SILVA, A. B. P.; COUTO, S. M.; TÓRTORA, J. C.O. O controle microbiológico dos manipuladores, como indicativo da necessidade de medidas corretivas higiênico-sanitárias, em restaurante comercial. Higiene Alimentar, v.20, n.145, p. 36-39, 2006b. SOUZA, E. L.; STAMFORD, T. L. M.; LIMA, E. O.; TRAJANO, V. N.; FILHO, J.M.B. Orégano (Origanum vulgare L., Lamiaceae): uma alternativa como potencial fonte de compostos antimicrobianos. Higiene Alimentar v.19, n.132, p.40-45, 2005. STAMFORD, T.C.M. Produção, caracterização e atuação anticariogênica da quitosana extraída de Cunningamella elegans UCP 542. Recife, 2006. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas), Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, 2006. 143 f. STAMFORD, T.C.M., STAMFORD, T.L.M., STAMFORD, N.P., NETO, B.B., CAMPOS-TAKAKI, G.M. Growth of Cunninghamella elegans UCP 542 and production of chitin and chitosan using yam bean medium. Electronic Journal of Biotechnology, v.10, n.1. Disponível em: < http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/1/>. Acesso em: 27 de fevereiro de 2007. SUNIL A. A.; NADAGOUDA N. M.; TEJRAJ M. A. Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery. Journal of Controlled Release, v.100, p.5-28, 2004. SYNOWIECKI, J.; AL-KHATTEB, N. A.A. Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.43, n.2, p.144-171, 2003.

SYNOWIECHI, J., AL-KHATTEB, N.A.A.Q. Mycelia of M. rouxii as a source of chitin and chitosan. Food Chemistry, v.60, n.4, p.605-610, 1997. THARANATHAN, R, N.; KITTUR, F. S. Chitin-the undisputed biomolecule of great potential. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.43, n.1, p.61-87, 2003.

TIKHONOV, V.E.; STEPNOVA, E.A.; BABAK, V.G.; YAMSKOV, I.A.; PALMA-GUERRERO, J.; JANSSON, H.B.; LOPEZ-LLORCA, L.V.; SALINAS,J.; GERASIMENKO, D.V.; AVDIENKO, I.D.; VARLAMOV, V.P. Bactericidal and antifungal activities of a low molecular weight chitosan and its N-

http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/1/


/2(3)-(dodec-2-enyl) succinoyl/-derivatives. Carbohydrate Polymers, v.64, p. 66-72, 2006. TSAI, G. –J.; HWANG, S. –P. In vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some intestinal bacteria. Fisheries Science, v.70, p. 675-681, 2004. TSIGOS, I.; ZYDOWICZ, N.; MARTINOU, A.; DOMARD, A.; BOURIOTIS, V. Mode of action of chitin deacetylase from Mucor rouxii on N-acetylchitooligosaccharides. European Journal of Biochemistry, v.261, p.698-705, 1999. TSIGOS, I.; MARTINOU, A.; KAFETZOPOULOS, D.; BOURIOTIS, V. Chitin deacetylases: new versatile tools in biotechnology. Trends in Biotechnology, v.18, p.305-312. 2000. USUI, M.; TAMURA, H.; NAKAMURA, K.; OGAWA, T.; MUROSHITA, M.; AZAKAMI, H.; KANUMA, S.; KATO, A. Enhanced bactericidal action and masking of allergen structure of soy protein by attachment of chitosan through maillard-type protein-polysaccharide conjugation. Nahrung/Food, v.48, n.1, p. 69-72, 2004.

VELÁSQUEZ, C.L. Algunos usos del quitosano en sistemas acuosos. Revista Iberoamericana de Polímeros, v.4, n.2, p. 91-109, 2003. VIVEK D. S.; TORRES, J.A. Chitosan-based coagulating agents for treatment of cheddar cheese whey. Biotechnology Progress, v.16, p. 1091-1097, 2000. WANG, G. Inhibition of five species of foodborne pathogens by chitosan. Journal of Food Protection, v. 55, n. 11, p. 916-925, 1992. YADAV, A.V.; BHISE, S.B. Chitosan: a potencial biomaterial effective against typhoid. Current Science, v. 87, n. 9, p.1176-1178, 2004.

YEN, M. -T.; MAU, J. -L. Phisico-chemical characterization of fungal chitosan from shiitake stipes. LWT- Food Science and Technology, v.40, p. 472-479, 2007. YOSHIZUKA, K.; LOU, Z.; INOUE, K. Silver-complexed chitosan microparticles for pesticide removal. Reactive & Functional Polymers, v.44, p. 47-54, 2007. ZENG, D.; WU, J.; KENNEDY, J.F. Application of a chitosan flocculant to water treatment. Carbohydrate Polymers, v. 71, p. 135–139, 2008. ZHENG, L. –Y.; ZHU, J. –F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights. Carbohydrate Polymers, v.54, p.527-530, 2003.


Primeiro artigo

CHITOSAN FROM Mucor circinelloides: GROWTH, PRODUCTION

AND PHYSICO-CHEMICAL CHARACTERIZATION

Trabalho submetido para publicação ao periódico indexado

CARBOHYDRATE POLYMERS


CHITOSAN FROM Mucor circinelloides: GROWTH, PRODUCTION AND

PHYSICO-CHEMICAL CHARACTERIZATION

Ana Elizabeth Cavalcante Fai

Nutrition Pos-Graduatin coursin, Federal University of Pernambuco

Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, 50 670-901 Recife, PE, Brazil

E-mail: [email protected]

Thayza Christina Montenegro Stamford

Nucleous of Health Research, Integrated College of Patos-PB Av. s/n, Belo Horizonte, 58 700-300Patos, PB, Brazil

Nucleous of Research in Environmental Sciences, Catholic University of Pernambuco

Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50 050-590 Recife, PE, Brazil E-mail: [email protected]

Petrus D´Amorim Santa-Cruz Oliveira

Department of Chemistry, Federal University of Pernambuco Av. Professor Moraes Rego s/n,

Cidade Universitária, 50 670-901 Recife, PE, Brazil E-mail: [email protected]

Galba Maria de Campos-Takaki

Universidade Católica de Pernambuco, Department of Chemistry and Nucleous of Research in Environmental Sciences,

Catholic University of Pernambuco Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50 050-590 Recife, PE, Brazil.

E-mail: [email protected]

Tânia Lucia Montenegro Stamford

Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco Av. Professor Moraes Rego s/n,

Cidade Universitária, 50 670-901 Recife, PE, Brazil E-mail: [email protected]

Tel.: +55-81-21268471 Fax: +55-81-21268474.

mailto:[email protected]






Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production and physico-chemical

characterization

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a1Ana Elizabeth Cavalcante Fai , Thayza Christina Montenegro Stamfordb,d,

Petrus D´Amorim Santa-Cruz Oliveirac d,e, Galba Maria de Campos-Takaki ,

Tânia Lúcia Montenegro Stamfordf

a Pos-graduate student in the Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil;

b Nucleus of Health Research, Integrated College of Patos, Patos, Brazil;

c Department of Chemistry, Federal University of Pernambuco

d Nucleus of Research in Environmental Science, University Catholic of Pernambuco, Recife, Brazil;

e Department of Biology, University Catholic of Pernambuco, Recife-PE, Brazil

f Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil.

Abstract

Microbiological processes were used for chitin and chitosan productions by Mucor

circinelloides (UCP 050) grown in Yam Bean (Pachyrhizus erosus L. Urban). The

polysaccharides were extracted by alkali-acid treatment and chitosan characterized

by infrared spectroscopy, viscosity, thermal analysis and X-ray Diffractometry.

Highest yield of biomass (20.7mg/mL) was found in 96 hours. The high level of

chitosan (64mg/g), and chitin (500mg/g) were produced at 48 and 72 hours of

growth, respectively. It was demonstrated that Yam Bean showed a great potential

as an economic medium and can reach a good yield of chitosan with chemical

properties that enable it to be used in biotechnological applications.

1 Corresponding author E-mail address: [email protected] (FAI, A.E.C.)



Key words: Biopolymers, Zygomycetes, Crystallographic properties;

Deacetylation; Thermal analysis

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1. Introduction

Chitosan is a cationic, biodegradable, biocompatible and bioactivity, amino

polysaccharide, essentially composed of β-1,4 D-glucosamine (GlcNAc) linked to

N-acetyl-D-glucosamine residues. This polymer hold a great economic value as due

to their versatile biological activities and chemical applications (Andrade et al.,

2000; Synowiecki & Al-Khatteb, 2003; Amorim et al., 2005; Campos-Takaki,

2005).

Chitosan is a common constituent of fungal cell walls, particularly the class

of Zygomycetes, it is produced by the chemical or spontaneous deacetylation of

chitin, an insoluble linear β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc). Commercially,

chitosan is obtained by chemically deacetylating crustacean chitin with strong alkali

(Santos et al., 2003; Chatterjee et al., 2005; Silva et al., 2006; Silva et al., 2007).

The crustacean chitosan is inconsistent in its physico-chemical properties due to the

variability in raw materials, the harshness of the isolation and conversion processes,

caustic effects of the chemicals used in the isolation process, variability in the levels

of deacetylation and protein contamination (Nadarajah, et al., 2001; Tharanathan &

Kittur, 2003; New et al., 2002).

In order to obtain chitosan of a more consistent quality, filamentous fungi

have been considered an attractive source for industrial applications because their

specific products can be manufactured under standardized conditions (Tan, et al.,

1996; Synowiecki & Al-Khatteb, 1997; Pochanavanich & Suntornsuk, 2002;

Nemtsev et al., 2004; Amorim et al., 2006). This is achieved by careful

manipulation of the growth parameters such as pH and composition during the


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fermentation process. These manipulations result in chitosan of a varying molecular

weight and degree of deacetilation, which influence various properties, application

and biological response of the polymer (Kittur et al., 2002; Jaworska et al., 2003).

The use of biomass from fungi has demonstrated great advantages, such as:

independence of seasonal factor, wide scale production, simultaneous extraction of

chitin and chitosan, extraction process is simple and cheap resulting in reduction in

time and cost required for production, and also absence of proteins contamination,

mainly the proteins that could cause allergy reactions in individuals with shellfish

allergies (Andrade et al., 2000; Amorim et al., 2001; Andrade et al., 2003; Franco et

al., 2005; Stamford et al., 2007). However, to optimize the production of chitin and

chitosan from fungi, it's usually used complex or synthetics cultures media, which

are expensive. It’s becomes necessary to obtain economic culture media that

promote the growth of fungi and stimulate the production of the polymers

(Stamford et al., 2007).

The present paper aims to investigate chitin and chitosan production using

the Mucoralen fungi Mucor circinelloides (UCP 050), grown by submerse

fermentation in economic culture medium, yam bean (Pachyrhizus erosus L.

Urban), as substrate, and describe the physico-chemical properties of chitosan.

2. Materials and methods

2.1 Microorganisms

Mucor circinelloides UCP 050 (Culture Collection of Catholic University of

Pernambuco, Recife, Brazil) isolated from mangrove sediment from Rio Formoso,

PE, Brazil. The strain was maintained at 4°C on Potato Dextrose Agar (PDA)

slants.


2.2 Culture medium 74

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M. circinelloides was grown, for chitin and chitosan production, in Yam

Bean Medium (Pachyrhizus erosus L. Urban)- basic chemical composition [total

protein (8.72g), starch (40.9g) and glucose (11.14g) per liter of distilled water, pH

7.0]. Tuberous roots of yam bean were provided by the Department of Agronomy

at Federal Rural University of Pernambuco (Northeast Brazil). The tuberous roots

surface were washed with water and soap, for withdrawal of impurities. The Yam

Bean Medium was prepared from tuberous roots peeled, rounded sliced (±1,5cm)

and boiled in distilled water in the ratio of 1:2 (w/v) for 45 minutes (after initiate the

boil). The broth was cooled, filtered in filter of paper and autoclaved at 121,5°C, 15

minutes (Stamford et al., 2007).

2.3 Growth profile

The spores of M. circinelloides were harvested from cultures grown for

seven days at 28ºC on Petri dishes containing PDA medium. A suspension was

prepared and adjusted to 108 spores /mL, using a hematocytometer for counting. For

fungal submerse cultivation, 10mL spores suspension (108 spores/mL) was

inoculated in Erlenmeyers flasks of 1000mL containg 290mL of culture medium,

and the flasks were incubated at 28ºC in an orbital shaker at 150 rpm, during 96

hours. The mycelia was harvested, washed twice in destilled and deionoized water

by filtration, utilizing a silkscreen nylon membrane (120 F), and were submitted to

lyophilization process. After lyophilization the biomass was mantained in a vacuum

dissecator until constant weight. During M. circinelloides submerse cultivation in

yam bean medium, aliquots were collected every 24 hours for biomass, pH, glucose

and total nitrogen determination (Stamford et al., 2007).


2.4 Glucose and nitrogen consumption and pH determination 99

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The glucose consumption was determined by the enzymatic colorimetric

method (Labtest® Kit - Glucose oxidase). A standard curve was made by using a

range of glucose solutions (0.5 to 10.0 g/L). Colorimetric method Labtest® Kit for

protein was utilized for the nitrogen consumption determination, using a

spectrophotometer Spectronic Genesys 2. Changes in pH were measured using a

potentiometer (Digital Pontentiometer Quimis Mod. 400 A). All assays were

performed twice.

2.5 Chitin and Chitosan Extraction

The process of extraction involved deproteination with 2% w/v sodium

hydroxide solution (30:1 v/w, 90ºC, 2 h), separation of alkali-insoluble fraction

(AIF) by centrifugation (4000 rpm, 15 min.), extraction of chitosan from AIF under

reflux (10% v/v acetic acid 40:1 v/w, 60ºC, 6 h), separation of crude chitin by

centrifugation (4000 xg, 15 min.) and precipitation of chitosan from the extract at

pH 9.0, adjusted with a 4 M NaOH solution. Crude chitin and chitosan were washed

on a coarse sintered-glass funnel with distilled water, ethanol and acetone and air-

dried at 20ºC (Franco et al., 2004).

2.6 Chitin and chitosan characterization

2.6.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%)

The degree of deacetylation for microbial chitin and chitosan were

determined using the infrared spectroscopy according to Baxter et al. (1992), using

the absorbance ratio A1655/A3450. Two milligrams sample of fungal chitin and


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chitosan, which had been dried overnight at 60°C under reduced pressure were

thoroughly blended with 100mg of KBr, to produce 0.5mm thick disks. The disks

were dried for 24h at 110°C under reduced pressure. Infrared spectrometer was

recorded with a Bruker 66 Spectrometer, using a 100mg KBr disks for reference.

The intensity of maximum absorption bands were determined by the baseline

method.

2.6.2 Molecular weight

The molecular weights of chitin and chitosan were determined by viscosity,

using the procedure described by Santos et al. (2003). The viscosity of chitosan was

determined using an AVS-350 viscometer (Schott-Geräte), type/capillary: Cannon-

Fenske dinside= 1.01mm, at 25C. After getting the intrinsic viscosity from tables K

and a, were obtained for HAc/NaAc. K = 0.076, a = 0.76. The flow time was

determined in seconds. Using Mark-Houwinks equation the average viscosimetric

molecular weight expressed in g/mol.

2.6.3 Thermal analysis

The Thermogravimetric Analysis (TGA) and the Differential Scanning

Calorimetry (DSC) were carried out using the thermal analysis instrumentation

Shimadzu, model 50WS, and Shimadzu, model DSC-50WS, respectively.

Accurately weighed (10mg) chitosan sample was placed into aluminum cup and

sealed. The experiment consisted of a heating the samples from 0 to 400°C up to a

under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C

min-1).


2.6.4 X-ray diffraction 149

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The X-ray diffraction patterns were determined using a wide-angle X-ray

SIEMENS D5000 diffractometer and the Ka, Cu radiation, with λ = 1.5406 Aº. The

voltage was 40kV and the intensity 40mA. The 2θ angle was scanned between 3°

and 80°, and the counting time was 1s at each angle (0.02°) (Chatterjee et al., 2005).

2.7 Statistic analysis

The data were analyzed for significance using the Student´s t-test and chi-

square test using STATISTICA program version 6.0 of Statsolt Inc., USA. All

experiments were carried out in triplicate and the results are expressed as mean ±

S.D.

3. Results and discussion

The profile of growth of M. circinellooides (UCP 050) and chitin /chitosan

production using yam bean medium is showed in figure 1 and 2. Biomass

production increase rapidly within 48 h of growth, and reached a higher production

of biomass, statistically significant (p=0.003), in 72 hours of cultivation, with

average dry weight corresponding to 20.7g/L (Figure 1). This result is in agreement

with Stamford et al., (2007) using C. elegans growth in Yam Bean medium, which

reported best yield of biomass (24.3g/L), with 48 hours of cultivation time. Silva et

al. (2006) investigated the effect of NaCl, glucose and sucrose concentration on

C.elegans growth in mucorales medium, reported best yield of 24.4g/L biomass

with 4% of glucose, after 96 hours of growth. The results obtained in the present

study are superior to the reported by Amorim et al. (2006) and Pochanavanich &

Suntornsuk (2002) described highest biomass production, respectively by


Cuninghalemlla bertholletiae and Aspergillus niger of 9g/L. Synowiecki & Al-

Khatteb (1997) reported maximum yield of biomass by Mucor rouxii grown in yeast

extract and glucose 2% medium, for 48 hours, to the 4g, per liter of medium. On

the other hand, New & Stevens (2004) described best yield of biomass from

Gongronella butleri grown on sweet potato supplied with urea, after 7 days of

cultivation of 40g/Kg. M. circinelloides growth curve for biomass, pH, nitrogen

content and glucose consumption was analyzed in figure 1, demonstrating the

residual glucose and nitrogen were 3.16g/L and 0.01g/L respectively. Similar

results were reported by Andrade et al. (2000) and Franco et al. (2004). Amorim et

al. (2001) suggested that the remaining glucose and nitrogen as due to nitrogenous

compounds like secondary metabolites present at the end of growth of the fungi

metabolism and excess of carbon source in the medium.

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The pH of yam bean medium oscillates between 7 and 4, during the culture

time (Figure 1). The values of pH decreased during the exponential phase, probably,

by pyruvic acid formation, as due to the high glucose and starch concentration in

yam bean medium. Amorim et al. (2006) and Stamford et al. (2007) described

constant values of pH during the “lag” phase and pH decreased during the

exponential phase. That information of higher amount of the yam bean glucose and

starch was previously mentioned by Sarangbin & Watanapokasin (1999), during the

citric acid production. Amorim et al. (2001), Amorim et al. (2006) reported that

during growth of C. elegans and Cunninghamella bertholletiae, respectively, the pH

of the media drops in the first 24h and remained low (between 5 and 3) during the

first 96 h of cultivation, probably because of the interaction between the medium

substrate and the release of ions from the cell.


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Figure 2 shows chitin and chitosan yield extracted, to each 24 hours, from

M.circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium during 96 hours of

cultivation. The best yields of the polysaccharides (mg per gram of dry mycelia

biomass) are obtained with 48 hours of culture for chitosan (64mg/g or 6.4%) and

with 72 hours for chitin (500mg/g or 50%). These results are in agreement with

Stamford et al. (2007), that investigated the production of chitin and chitosan from

C. elegans growth in Yam Bean medium, obtained best yield chitin (440mg/g) and

chitosan (66mg/g) with 72 and 48 hours of cultivation time, respectively. Similar

results were reported by Tan et al. (1996), which studied different Zygomycetes

strains and observed that Cunninghamella echinulata was the best chitosan

producing strain, with a yield of approximately 7.0% of chitosan per mycelia dry

weight. According to Chatterjee et al. (2005) production of chitosan from fungi was

influenced by composition of the growth medium, and obtained highest amount of

chitosan from Mucor rouxii 7%.

Chitosan production stabilize after 48 hours of culture, although, chitin

production increase up to 72 hours of culture, and decrease at 96 hours. The higher

chitosan yields in 48 hours of growth suggest that during initial growth chitin is less

crystalline and thus more susceptible to chitin deacetylase, and the chitosan formed

by this enzime prevails in acid pH (Figure 2). According to Amorim et al. (2005)

optimum pH for chitin deacetylase activity from Zygomycetes is pH 4.5. During M.

circinelloides growth the pH of the yam bean medium drops to 5-4 in the first 48h,

and stabilize around 4 (Figure 1), stowing high metabolic interchange between the

medium substrate uptake and the release of ions from the cells. Amorim et al.

(2001) reported higher yields of chitosan were found within 24 hours of cultivation


of M. racemosus and C. elegans at pH 3.5, which seems to be also a stimulating

agent for production of this biopolymer.

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The data in the present work are in agreement with Nadarajah et al. (2001),

Pochanavanich & Suntornsuk (2002), Amorim et al. (2006) and Stamford et al.

(2007) that chitosan production by the microorganisms is strongly dependent of the

culture conditions, including cultivation time. Chung et al. (2004) demonstrated that

chitin and chitosan content in the cellular wall of fungi change according to the

species and these polymers usually show higher values in Zygomycetes.

The decline in the amount of extractable chitosan seen in the time-culture

curve may be due to physiological changes in the cell wall of the fungi. Chitosan is

produced in the fungal cell wall by deacetylating its precursor, nascent chitin.

During the exponential phase, the ratio of free chitosan molecules is relatively high,

due to the active growth. Once the culture enters the stationary growth phase, more

of the chitosan is anchored to the cell wall of the Zygomycetes binding to chitin and

other polysaccharides and extraction becomes more difficult (Tan et al., 1996;

Nadarajah et al., 2001; Nwe et al., 2002).

The characterization of chitin and chitosan obtained from M. circinelloides

in yam bean medium by infrared spectra (Figure 3) are similar to those reported in

the literature (Amorim et al., 2001; Andrade et al., 2000; Franco et al., 2005). The

most significant parts of chitin and chitosan spectra are those showing the amide

bands at approximately 1665, 1555 e 1313 cm-1, which could be assigned to the

C=O stretching, the N– H deformation in the CONH plane and the CN bond

stretching plus CH2 wagging. In a similar way, chitin from C. elegans shows bands

in the amide II region, which were 1153, 1378 and 1558 cm-1. The results are in

agreement with Shigemasa et al. (1996). Andrade et al. (2003) and Franco et al.


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(2005) which reported that chitin structure containing two types of amide group and

both form C=O….N-H intermolecular bonds, but one is also an acceptor for the

CH OH group. 2

According to Santos et al. (2003) the deacetylation and the regeneration

process, cause disturbance in the initial crystalline reticulum of chitin, inducing a

reordering of the hydrogen linking of chitosan. This can be observed in the central

band at approximately 3483 cm-1 e 3305 cm-1, in the region of the axial deformation

of OH, which appears overlapping the band of axial deformation of NH indicating

the intermolecular hydrogen linking formation, and at the displacement of the

higher frequency band indicating an increase in the structural order. The data are in

accordance with the reported in literature when comparing both chitin and chitosan

infrared spectra obtained by microbiological methods (Amorim et al., 2001;

Andrade et al., 2000; Pochanavanich & Suntornsuk, 2002; Santos et al., 2003;

Franco et al., 2005).

Deacetylation degree (%DD) is an important parameter associated with the

physical-chemical properties of chitosan, because it’s linked directly to the chitosan

cationic properties (Pochanavanich & Suntornsuk, 2002). In the present study

chitosan from M. circinelloides grown in yam bean medium presents 83% DD.

Amorim et al. (2001), Pochanavanich & Suntornsuk (2002); Chatterjee et al. (2005)

and Franco et al. (2005), reported deacetylation degree of chitosan from fungi

between 80 to 90% DD.

The average viscosimetric molecular weight (MV) of chitosan from M.

circinelloides obtained in the present research is 2.70 104x g/mol, which is

considered relatively low (Pochanavanich & Suntornsuk, 2002). The result is in

agreement with the literature, which reports molar weights ranged between 1,0 x


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to 9,0 x 10 g/mol (Nadarajah et al., 2001; Santos et al., 2003; Chatterjee et al.,

2005). Chitosan with a low molecular weight was reported to reduce the tensile

strength and elongation of the chitosan membrane but to increase its permeability.

Thus, fungal chitosan could have potential medical and agricultural applications

(Pochanavanich & Suntornsuk, 2002).

X-ray diffraction is commonly used to determine the polymorphic forms of a

compound having different crystalline structures for which distinct powered X-ray

diffraction patterns are obtained. These patterns are indicative of different spacing

of the crystal planes, which provide strong evidence for polymorphic differences. In

addition, it provides accurate measurements of crystallinic contents, which greatly

affects physical and biological properties of the polymer (Liu et al., 2004;

Chatterjee et al., 2005; Rinaudo, 2006). Figure 4 shows the powder diffraction

pattern of chitosan from M. circinelloides grown in yam bean medium. Strong

Bragg refractions was observed at an angle 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å). From the above

result it can be concluded that fungi chitosan shows organized reticular structure.

This is consistent with previous results from Chatterjee et al. (2005). In addition,

Francis Suh (2000) reports that chitosan crystallinity is a function of the degree of

deacetylation.

Polymers usually have a strong affinity for water and in the solid state these

macromolecules may have disordered structure which can be easily hydrated (Qin

et al., 2004). As is known the hydration properties of chitosan depend on the

primary and supramolecular structure (Kittur et al., 2002). Figure 5 shows TGA

and DSC curve of microbiological chitosan under N2 atmosphere between 25 -

400ºC. From TGA curve it is observed that chitosan degraded in three stages. The

first degradation stage was explained as the loss of water. The second stage, which


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initiate at 170ºC, was due to the decomposition temperature of this polymer, with

carbonized residue formation, and the third weight loss point was at 335ºC

correspond to the initial of carbonized material consumption. These results are in

agreement with Liu et al. (2004).

From DSC curve it is observed two peaks (figure 5). The first registered

thermal event was a wide endothermic peak between 26 and 182ºC. According to

Kittur et al. (2002), the endotherm peak related to the evaporation of water is

expected to reflect physical and molecular changes during N-deacetilation and

carboxymethylation. The second thermal event registered, related to the polymer

decomposition was an endothermic peak. Similar results were obtained by Santos et

al. 2003. According to Kittur et al. (2002) endothermic effect of fungi chitosan is

associated to the elevated enthalpy, due to the presence of weak intramolecular

hydrogen bond. This event is coherent with the observed in TGA curve and agrees

with Kittur (2002) and Santos et al. (2003) studies. This last author suggest that

there is an inverse relationship between thermal stability and deacetilation degree,

however, no evidences of molecular weight influence in thermal stability were

found.

4. Conclusion

Based on these results, we concluded that mycelium of Mucor circinelloides

is a good source of chitosan production production. Yam bean (Pachyrhizus erosus

L. Urban) showed a great potential as an economic medium and can reach a good

yield of chitosan within two days of submerse culture with chemical properties that

enable it to be used in biotechnological applications. Microbiological chitosan


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extraction and processing can be optimized to improve yield in large-scale

production.

5. Acknowledgements

The work was financed by Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

and Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP).

6. References

Amorim, R. V. S., Pedrosa, R. P., Kazutaka, F., Martínez, C. R., Ledingham, W. M. & Campos-Takaki, G. M. (2006). Alternative carbon sources from sugar cane process for submerged cultivation of Cunninghamella bertholletiae to produce chitosan. Food Technology Biotechnology, 44, 519-523. Amorim, R.V.S., Ledingham, W.M., Fukushima, E.K. & Campos-Takaki, G.M. (2005). Screening of chitin deacetylase from Mucoralean strains (Zygomycetes) and its relationship to cell growth rate Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 31, 19-23. Andrade, V.S., Neto, B.B., Souza, W. Campos-Takaki, G.M. (2000). A factorial designs analysis of chitin production by Cunninghamella elegans. Canadian Journal of Microbiology, 46, 11-1042-1045. Andrade, V.S, Neto, B.B, Fukushima, K. & Campos-Takaki, G.M. (2003). Effect of medium components and time of cultivation on chitin production by Mucor circinelloides (Mucor javanicus IFO 4570)-A factorial study. Revista Iberoamericana de Micologia, 20, 149-153. Baxter A., Dillon, M., Taylor, K.D.A., Roberts, G.A.F. (1992). Improved method for i.r. determination of the degree of N-acetylation of chitosan. International Journal of Biological Macromolecules,14-166-169. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for quantitaion of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248–54. Campos-Takaki, G.M. (2005). The fungal versatility on the copolymers chitin and chitosan production. In: Chitin and chitosan opportunities and challenges. Dutta, P.K. editor. India: International Publication.


360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400

Chatterjee, S., Adhya, M., Guah, A. K. & Chatterjee, B. P. (2005). Chitosan from Mucor rouxii: production and physico-chemical characterization. Process Biochemistry., 40, 395-400. Chung, Y.-C., Su, Y. -A., Chen, C. –C., Jia, G., Wang, H. -L., Wu, J. C. G. & Lin, J. G. (2004). Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall. Acta Pharmacologica Sinica, 25, 7, 932-936. Franco, L.O., Maia, R. C. G., Porto, A. L. F., Messias, A. S., Fukushima, K., Campos-Takaki, G. M. (2004). Heavy metal biosorption by chitin and chitosan isoleted from Cunninghamella elegans IFM 46109. Brazilian Journal of Microbiology, 35, 243-247. Franco, L.O., Stamford, T.C.M., Stamford, N.P. & Campos-Takaki, G.M. (2005). Cunningamella elegans (IFM 46109) como fonte de quitina e quitosana. Revista Analytica, 14, 40-44. Francis Suh, J.-K., Matthew, H.W.T. (2000). Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review, Biomaterials, 21, 2589-2598. Jaworska, M., Sakurai, K., Gaudon, P.G.E. (2003). Influence of chitosan characteristics on polymer: Crystallographic properties. Polymer International, 52, 198–205. Kato, Y., Onishi, H., Machida, Y. (2003). Application of chitin and chitosan derivatives in the pharmaceutical field. Current Pharmaceutical Biotechnology, 4, 5, 303-309. Kittur, F.S., Prashanth, K.V.H., Sankar, K.V., Tharanathan, R.N. (2002). Characterization of chitin, chitosan and their carboxymethyl derivatives by differential scanning calorimetry. Carbohydrate Polymer, 49, 185–193. Liu, H., Du, Y., Yang, J. & Zhu, H. (2004). Structural characterization and antimicrobial activity of chitosan/betaine derivative complex. Carbohydrate Polymers, 55, 291–297. Nadarajah, K., Kader, J., Mohd, M. & Paul, D. C. (2001). Production of chitosan by fungi, Journal of Biological Sciences, 4 (3), 263-265. Nemtsev, S.V., Zueva, O.I.U., Khismatullin, M.R., Al'bulov, A.I., Varlamov, V.P. (2004). Isolation of chitin and chitosan from honey bees. Applied Biochemistry and 401 Microbiology402

403 404 405 406 407 408 409

., 40, 1, 39-43. Nwe, N., Chandrkrachang, S., Stevens, W.F., Maw, T., Tan, T.K., Khor, E., Xong, S.M. (2002). Production of fungal chitosan by solid state and submerged fermentation. Carbohydrate Polymers, 49, 2, 235-237. Pochanavanich, P. & Suntornsuk, W. (2002). Fungal chitosan production and its characterization. Letters in Applied Microbiology,. 35, 17–21.

http://www.ingentaconnect.com/content/maik/abim

http://www.ingentaconnect.com/content/maik/abim


Qin, C.Q., Xiao, Q. Li, H.R., Fang, M., Liu,Y., Chen, X., Li, Q. (2004). Calorimetric studies of the action of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride on the growth of microorganisms, International Journal of Biological Macromolecules,

410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440

34, 121–126. Rinaldo, M. Chitin and chitosan: properties and applications. (2006). Progress in Polymer Science, 31, 603-632. Santos, J.E., Soares, J.P., Dockal, E.R., Campana Filho, S.P., Cavalheiro, E. T.G. (2003). Caracterização de quitosanas comerciais de diferentes origens. Polímero: Ciência e Tecnologia, 13, 4, 242-249. Sarangbin, S., Watanapokasin, Y. (1999).Yam bean starch: a novel substrate for citric acid production by the protease-negative mutant strain of Aspergillus niger. Carbohydrate Polymers, 38, 3, 219-224. Shigemasa, Y., Minami, S. (1996). Applications of chitin and chitosan for biomaterials. Biotechnol. Genetic Engineer Review,17, 383-420. Silva, M. C. F.; Barros Neto, B.; Stamford, T. C. M.; Campos-Takaki, G. M. (2007). Effect of enviromental conditions on chitin and chitosan production by Cunninghamella elegans UCP 542 Using factorial design. Asian Chitin Journal, 3, 15-22. Silva, M.C.F., Stamford, T.C.M., Franco, L.O. & Campos-Takaki, G.M. (2006). Effects of salinity and glucose on chitin and chitosan production by Cunninghamella elegans. Asian Chitin Journal., 2, 29-38. Stamford, T.C.M., Stamford, T.L.M., Stamford, N.P., Neto, B.B. & Campos-Takaki, G.M. (2007). Growth of Cunninghamella elegans UCP 542 and production of chitin and chitosan using yam bean medium. Elect. J. Biotechn.,10, 1. Disponível em: < 441

442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457

http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/1/>. Access in: 01/05/2008. Synowiecki, J., Al-Khatteb, N.A.A.Q. (1997). Mycelia of M. rouxii as a source of chitin and chitosan. Food Chemistry, 60, 4, 605-610. Synowiecki, J., Al-Khatteb, N. A.A. (2003). Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43, 2, 144-171. Tan, S. C., Tan, T. K; Wong, S. M., Khor, E. (1996). The chitosan yield of zygomycetes at their optimum harvesting time. Carbohydrate Polymers, 30, 4, 239-242. Tharanathan, R, N., Kittur, F. S. (2003). Chitin-the undisputed biomolecule of great potential. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43, 1, 61-87.



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Figure 1. Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 28ºC, 150rpm, during 96h of cultivation.


Chitin Chitosan

Mean±SD

10 20 30 40 50 60 70 80 90 A 110

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Yie

ld (m

g)

Figure 2. Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M. circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of cultivation.


Figure 3. Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050. Degree of

acetylation (DD) was determined according to Baxter et al. (1992)


Figure 4. X-ray Diffraction of chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050)


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Figure 5.Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Thermogravimetric Analysis (TGA) termograms of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050, under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C min-1)


Segundo artigo

MICROBIOLOGICAL CHITOSAN POTENTIATES THE

ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST FOOD AND SPOILAGE

BACTERIA

Trabalho submetido para publicação ao periódico indexado

FOOD CONTROL


Microbiological chitosan potentiates the antibacterial activity against food and

spoilage bacteria

Ana Elizabeth Cavalcante Faia2, Thayza Christina Montenegro Stamfordb,c, ,

Marta Cristina de Freitas da Silvac,d, Galba Maria de Campos-Takakic,e Tânia

Lúcia Montenegro Stamfordf

a Pos-graduate student in the Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil;

b Nucleus of Health Research, Integrated College of Patos, Patos, Brazil;

c Nucleus of Research in Environmental Science, University Catholic of Pernambuco, Recife, Brazil;

d Pos-graduate student in the Department of Fungi Biology, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil

e Department of Biology, University Catholic of Pernambuco, Recife-PE, Brazil

f Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil.

Abstract

Chitosan was extracted from M. circinelloides biomass by alkali-acid treatment and

was compared with chitosan from crabs (Sigma®). The chemical characterization was

done by infrared spectroscopy (Deacetilation degree) and viscosity (Molecular

weight). Effectiveness of chitosan isolated from Mucor circinelloides UCP 050 in

inhibiting the growth of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia

enterocolitica was evaluated. Chitosan from crabs was used to comparison. The

antibacterial activity was carried determining the minimum inhibitory and bactericidal

concentration by Heilman test. The polysaccharides showed degree of deacetilation

and viscosimetric molecular weight respectively of 83% and 2.70 104 g/mol for x 2 Corresponding author E-mail adress: bethfai@yahoo. (A.E.C. FAI)


microbiological chitosan, and 80% and 7.59 104x g/mol for chitosan from crabs. Both

chitosan had identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed.

Neither concentration of both chitosan showed bactericide effect against Salmonella

enterica strain. Microbiological chitosan showed lower minimum bactericide

concentration against Pseudomonas aeruginosa than crustacean chitosan, which was

2,5mg/mL and 5,0mg/mL, respectively.

Keywords: chitosan; foodborne pathogen; antibacterial property; food preservative.

1. Introduction

Among the desirable qualities that should be associated with foods is freedom

from spoiling and pathogenic microorganisms. However, foodborne disease continues

to be a common and serious threat to public health all over the world (Samuel et al.,

2007).

Recently, the ban of chemical additives by some consumers has driven

researches for food preservatives of natural origin since chemical additives are still

indispensable, considering food preservation techniques disposable nowadays

(Devlieghere, Vermeiren & Debevere, 2004a; Devlieghere, Vermeiren & Debevere,

2004b).

In this context, considerable attention has been paid to chitosan, a cationic

amino polysaccharide, essentially composed of β-1,4 D-glucosamine (GlcNAc) linked

to N-acetyl-D-glucosamine residues (Amorim, Ledingham, Fukushima & Campos-

Takaki, 2005; Andrade, Neto, Fukushima & Campos-Takaki, 2003). This

polysaccharide is naturally present in the cell wall of certain fungi, and can also be

obtained by chitin deacetylation from exoskeleton of crustacean, insects and


arthropods (Amorim, Pedrosa, Kazutaka, Martínez, Ledingham & Campos-Takaki

2006; Campos- Takaki, 2005; Silva, Stamford, Franco & Campos-Takaki 2006)

The use of biomass from fungi has demonstrated great advantages, such as:

independence of seasonal factor, wide scale production, simultaneous extraction of

chitin and chitosan, extraction process is simple and cheap resulting in reduction in

time and cost required for production, and also absence of proteins contamination,

mainly the proteins that could cause allergy reactions in individuals with shellfish

allergies (Silva, Barros Neto, Stamford & Campos-Takaki, 2007; Stamford, Stamford,

Stamford, Neto & Campos-Takaki, 2007).

Due to the unique polycation nature and biodegradable characteristic, chitosan

and its derivates have been proposed for various applications in biomedicine (Martino,

Sittinger & Risbud, 2005), pharmaceutics, biotechnology (Costa Silva, Santos &

Ferreira, 2006) nanotechnology (Murugadoss & Chattopadhyay, 2008) and food

science (Liu, Zhang & Xia, 2008; Shahidi, Arachchi & Jeon, 1999). Chitosan hold a

great economic value as due to its peculiar properties, such as: biodegradability,

biocompatibility, bioactivity, selective permeability, polieletrolic action, chelation, ion

exchange properties, antitumor and antimicrobial activity and adsorption capacity

(Chung et al., 2004; Santos, Soares, Dockal, Campana Filho & Cavalheiro, 2003;

Yadav & Bhise, 2004).

In food technology chitosan is readily seen due to its several functional

properties and can be used as biodegradable films (Meng, Li, Liu & Tian, 2008),

recovery of waste material from industrial processing discards, enzymes

immobilization (Kumar,2000), antioxidant (Kamil, Jeon & Shahidi, 2002; Kanatt,

Chander & Sharma 2004; Shahidi, Kamil, Jeon & Kim, 2002), emulsifying (Li et al.,

2007), fruit juice clarification compounds (Chatterjee, Adhya & Guah, 2005),


antibacterial and antifungal agent (Quin, Li, Xiao, Liu, Zhu & Du, 2006; No, Meyers,

Prinyawiwatkul & Xu, 2007).

Chitosan from crustacean has been shown antimicrobial activity against

Staphylococcus aureus, Escherichia coli (Li et al., 2007; Zheng & Zhu, 2003),

Salmonella typhimurium, S. faecalis (Chung et al., 2004), S. entérica, S. paratyphi,

Pseudomonas aeruginosa (Yadav & Bhise, 2004), Listeria monocytogenes (Coma,

Martial-Gros, Garreau, Copinet, Salin & Deschamps, 2002), Bacillus. cereus, Shigella

dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium (Costa

Silva et al, 2006), Sacharomyces cerevisiae, S. ludwigii, Zygosaccharomyces baillii,

Cryptococcus albidus, Candida sp., Rhodotorula sp. (Rhoades & Roller, 2000; Sagoo,

Board & Roller, 2002).

The broad spectrum of antimicrobial activity and low toxicity towards

mammalian cells make chitosan a potential source of food preservative of natural

origin (Helander, Nurmiaho-Lassila, Ahvenainen, Rhoades & Roller, 2001; Li et al.,

2007; Shahidi et al, 1999; Rhoades & Roller, 2000; Roller & Covill, 1999).

Chitosan is not yet accepted as a food additive in South America, but it is

employed in food manufacture in countries such as Japan, the United States, and

Germany (Rodríguez, Centurión & Agulló, 2002; Rodríguez & Agulló, 2003; Roller &

Covill, 1999). It has been approved as a food additive in Korea and Japan since 1995

and 1983, respectively (No et al, 2007).

In the United States, upon receiving the US FDeA approval for GRAS status,

chitosan as a food additive and its applications in food systems will certainly be in

more demand in the near future (Sagoo et al, 2002).


The aim of this study was to investigate the antimicrobial activity, in vitro, of

chitosan from Mucor circinelloides UCP 050 against six foodborne pathogens and

spoilage bacteria and compare with commercial chitosan from crab (Sigma®).

2. Materials and Methods

2.1 Bacterial strains and culture conditions

Listeria monocytogenes ATCC 7664, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,

Salmonella entérica ATCC 6017 and Yersinia enterocolítica ATCC 9610 for

antimicrobial assay were provided by FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil.

Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Escherichia coli ATCC 8739 were donated

by Antibiotics Institute, UFPE (Recife, Brazil). Stock cultures were kept on Muller

Hinton agar slants added of blood (5% v/v) at 4 ºC. Inocula used in the experimental

assays were obtained from overnight cultures grown (18 h) in Brain Heat Infusion

broth (DIFCO Laboratories, Detroit, MI, USA) at 37 °C. After incubation the bacteria

cells were separated from the growth medium by centrifugation at 10.000 xg for 15

minutes at 4°C, washed three times in buffer KCl (0.05M KCl, 1mM KH PO2 4, 1Mm

CaCl , 0.1mMMgCl2 2, pH 6.0), and resuspended in buffer KCl. Suspensions were

adjusted so that the optical density (OD) at 660nm was 1.5 which provided a bacterial

inoculum of approximately 5 x 108 Colony Forming Unity/mL (CFU/mL).

2.2 Chitosan preparation

Chitosan obtained from biomass of Mucor circinelloides UCP 050 grown in

yam bean medium according to procedure described by Stamford et al (2007) was used

in this study. Chitosan solutions at concentration ranging from 10.0 to 0.025 mg/mL


prepared in acetic acid 1% (v/v), according to Shigemasa & Minami (1996), were

assayed in pH 5.8, which were adjusted using HCl and NaOH.

2.3 Chitosan from M. circinelloides Extraction

The process of extraction involved deproteination with 2% w/v sodium

hydroxide solution (30:1 v/w, 90ºC, 2 h), separation of alkali-insoluble fraction (AIF)

by centrifugation (4000 rpm, 15 min.), extraction of chitosan from AIF under reflux

(10% v/v acetic acid 40:1 v/w, 60ºC, 6 h), separation of crude chitin by centrifugation

(4000 xg, 15 min.) and precipitation of chitosan from the extract at pH 9.0, adjusted

with a 4 M NaOH solution. Crude chitin and chitosan were washed on a coarse

sintered-glass funnel with distilled water, ethanol and acetone and air-dried at 20ºC

(Stamford et al, 2007)

2.4 Chitin and chitosan characterization

2.4.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%)

The degree of deacetylation for microbial chitin and chitosan were determined

using the infrared spectroscopy according to Roberts (1992), using the absorbance

ratio A1655/A3450 and calculated according to the following equation:

A (%) = (A1655/A3450) x 100 / 1.33

Two milligrams sample of fungal chitin and chitosan, which had been dried

overnight at 60°C under reduced pressure were thoroughly blended with 100mg of

KBr, to produce 0.5mm thick disks. The disks were dried for 24h at 110°C under

reduced pressure. Infrared spectrometer was recorded with a Bruker 66 Spectrometer,


using a 100mg KBr disks for reference. The intensity of maximum absorption bands

were determined by the baseline method.

2.4.2 Molecular weight

The molecular weights of chitin and chitosan were determined by viscosity,

using the procedure described by Santos et al (2003). The viscosity of chitosan was

determined using an AVS-350 viscometer (Schott-Geräte), type/capillary: Cannon-

Fenske dinside= 1.01mm, at 25C. After getting the intrinsic viscosity from tables K and

a, were obtained for HAc/NaAc. K = 0.076, a = 0.76. The flow time was determined in

seconds. Using Mark-Houwinks equation the average viscosimetric molecular weight

expressed in g/mol.

2.5 Antimicrobial activity

Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal

concentration (MBC) of chitosan on the assayed bacteria was carried out using broth

macrodilution method (Heilman test) as described by Chambrevil & Marmonier

(1987). For this a 0.1 mL aliquot of bacterial inoculum was inoculated to screw-capped

13 x 130 mm sterile tubes containing 0.9 mL of BHI broth containing the wished

chitosan concentration (10 to 0.3125 mg/mL) followed for shaking using Vortex for

30s. The system was incubated at 37 ° C for 24 hours and the MIC was defined as the

lowest chitosan concentration providing no visible growth (turbidity) and the MBC

was the lowest chitosan concentration able to cause a 99.9 % killing rate of the initial

inoculum. MBC was found by inoculating a 25 µL aliquot of the chitosan treated assay

in sterile Muller Hinton agar Petri dishes added of blood (5% v/v) and followed by


incubation at 37 oC for 48 h. For positive control chitosan was replaced by sterile

distilled water and acetic acid 1 %. The assays were made in triplicate and the results

expressed as average values. Also, the viability of the bacterial strains was assessed by

verifying their capacity to grow in Muller-Hinton agar without adding chitosan.

3. Results and discussion

In this study was reported for the first time the antibacterial activity of chitosan

from Mucor circinelloides UCP 050 towards foodborne pathogens and spoilage

bacteria and compared with commercial chitosan from crabs (Sigma®).

In the present research, chitosan was produced and extracted from biomass of

Mucor circinelloides, and was characterized to determinate the degree of deacetilation

(DD) and molecular weight; for comparison chitosan from crabs was used. Infrared

spectra of fungi and crustacean chitosan are shown in figures 1 and 2, respectively.

Chitosan from M. circinelloides and crabs (Sigma®) present 83% DD and 80% DD,

respectively. Papers report deacetylation degree of chitosan from fungi between 80 to

90% DD (Amorim et al, 2005; Silva et al, 2006; Silva et al, 2007; Stamford, Stamford,

Stamford, Neto & Campos-Takaki, 2007). Deacetylation degree (%DD) is an

important parameter associated with the physical-chemical properties of chitosan,

because it’s linked directly to the chitosan cationic properties (Pochanavanich &

Suntornsuk, 2002).

The average viscosimetric molecular weight (MW) of chitosan obtained in the

present research are 2.70x104 and 7.59x104g/mol, for chitosan from M. circinelloides

and crabs, respectively. The results are in agreement with the literature which reports

molar weights between 1.0 x 104 to 9.0 x 105 g/mol (Nadarajah, Kader, Mohd & Paul,

2001; Pochanavanich & Suntornsuk, 2002; Santos et al, 2003; Stamford et al, 2007).


The effectiveness of chitosan from M. circinelloides and crabs to inhibit the

growth of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia enterocolitica by determining the

minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, was

showed in table 1 and 2.

As demonstrated in table 1 and 2, fungi and crustacean chitosan showed

identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed, and identical

minimum bactericidal concentration for Listeria monocytogenes,Staphylococcus

aureus, and Yersinia enterocolitica. These results are in agreement with those reported

by Avadi et al. (2004) and Kanatt, Chander and Sharma (2008 a, b). The antimicrobial

activity of chitosan is well documented against a number of food spoilage and

pathogenic microorganisms with MIC varying from 0.01% to 1% (Kanatt et al, 2008 b;

Sagoo et al, 2002). However, it is important to stand out that comparing MIC values of

different chitosan studies is difficult, because of possible differences in chemical and

structural properties of the chitosan used in these studies, experimental circumstances,

chitosan solvent, MIC definition, genera, species, strains and even the same strains

under different environmental conditions. (Devlieghere, Vermeiren & Debevere, 2004;

Tikhonov et al., 2006).

Regarding to the minimum bactericidal concentration, towards Pseudomonas

aeruginosa, microbiological chitosan showed lower MBC value than crustacean

chitosan, which was 2,5mg/mL and 5,0mg/mL, respectively. Neither concentrations, of

both chitosan, showed bactericide effect against Salmonella enterica.

The antibacterial activity of chitosan in vitro depends on the

physicochemical characteristics of chitosan and the specie, or even the strain of

bacteria tested (Tsai & Hwang, 2004). In addition, Chung et al., 2004 demonstrated


that although cell wall hydrophilicity is similar among Gram-negative bacteria, the

distribution of negative charge on their cell surfaces can be quite different. More

negatively charged cell surfaces have a greater interaction with chitosan. This could

explain why the susceptibility of Salmonella enterica to chitosan in this study, was

different from the others Gram-negative bacteria tested.

Chitosan exhibited antibacterial activity only in an acidic medium, which was

usually attributed to the poor solubility of chitosan above pH 6.5 and more positively

charged polycation with stronger affinity for cells (Quin et al, 2006). Hence, for the

antimicrobial activity chitosan was dispersed in a solution of acetic acid 1%. Since

acetic acid itself has antibacterial activity, a positive control, where chitosan was

replaced by sterile distilled water and acetic acid 1 %, was used for each

microorganism to assure that the antimicrobial activity evidenced is attributed to

chitosan. Microbial growth was observed in all positive control. Also, the viability of

the bacterial strains was confirmed by verifying their growth in Muller-Hinton agar

without adding chitosan.

The exact mechanism of the antimicrobial action of chitosan is still unknown,

but different mechanisms have been proposed, considering its chemical and structural

properties (No et al, 2007).

As a polymeric macromolecule, chitosan cannot directly access to the

intracellular parts of the cells. A key feature of chitosan antimicrobial activity is its

positive charge of the amino group at C-2 below its pKa (pH 6.3). This creates a

polycationic structure which can be expected to interact with anionic components of

cell surface (Liu, Du, Yang & Zhu, 2004). The inhibitory activity of chitosan towards

Gram-negative bacteria has been reported to be due to the interaction of its


polycationic molecules with the predominant anionic components of the Gram-

negative surface, resulting in changes in its permeability (Kanatt et al, 2008a).

Interaction of diffused hydrolysis products with microbial DNA, which leads to

the inhibition of the mRNA and protein synthesis and the chelation of metals and spore

elements have also been suggested for the antimicrobial action of chitosan (Chen, Wu,

Long & Liu, 2006). In addition, chitosan can bind on the cell surface to form a film

around the cells, so the transport of nutrient into cells is disturbed. This mechanism has

been postulated to be the main antibacterial action of chitosan on Gram-positive

bacteria (Helander et al, 2001).

According to Muzzarelli (1999) autolysing enzymes, which normally control

bacteria division, become lethal substances when cationic compounds are present; thus

it is possible that a similar mechanism is promoted by the strongly cationic chitosan.

On the other hand, it has been reported that the hydrolytic susceptibility of chitosan to

a wide range of enzymes derived from various bacterial, fungal and plant sources is

significant. So there is a possibility that when the concentration of chitosan is

insufficiently high to inhibit growth of bacteria, chitosan could be being hydrolyzed by

some enzymes in the bacteria and used as a kind of energy (Li et al, 2007; Steinbüchel

& Rhee, 2005).

The antimicrobial activity of chitosan has been pointed out as one of its most

interesting properties of chitosan to food industry, since food preservation is a

continuous fight against microorganisms spoiling the food or making it unsafe

(Devlieghere et al, 2004). The successful application of any novel antimicrobial agent

in food preservation depends on a number of factors. The antagonistic action of

chitosan is often directed against a select group of organisms and can vary

considerably between species and strains. As with traditional preservatives, target


organisms may develop resistance or tolerance to the new antimicrobial agent upon

prolonged exposure. Adequate control of microbial growth in foods using chitosan

would require extensive additional knowledge of the factors that determine chitosan

performance (Roller & Covill, 1999).

Hence, more research on the surface charges and residues of foodborne bacteria

and how they interact to chitosan in vitro and in food matrices are essential to

subsidize the potential of chitosan in the creation of better quality foods.

4. Conclusion

The results obtained in this study demonstrate the antibacterial potential of

chitosan, from fungi and crab shell, against foodborne pathogens and spoilage bacteria.

More research is required to evaluate chitosan’s antimicrobial effectiveness in

combination with other interfering substances in food materials. Evaluations on

sensory quality and economic feasibility also should be carried out. This in turn can

provide a focus for effective use of chitosan as a novel food preservative.

5. Acknowledgements

The work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) and

Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP).

6. References

Amorim, R. V. S., Pedrosa, R. P., Kazutaka, F., Martínez, C. R., Ledingham, W. M. & Campos-Takaki, G. M. (2006). Alternative carbon sources from sugar cane process for submerged cultivation of Cunninghamella bertholletiae to produce chitosan. Food Technology Biotechnology, 44, 519-523.


Amorim, R.V.S., Ledingham, W.M., Fukushima, E.K. & Campos-Takaki, G.M. (2005). Screening of chitin deacetylase from Mucoralean strains (Zygomycetes) and its relationship to cell growth rate Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 31, 19-23. Andrade, V.S, Neto, B.B, Fukushima, K. & Campos-Takaki, G.M. (2003) Effect of medium components and time of cultivation on chitin production by Mucor circinelloides (Mucor javanicus IFO 4570)- A factorial study. Revista Iberoamericana de Micologia, 20, 149-153. Avadi, M.R., Sadeghi, A.M.M., Tahzibi, A., Bayati, K.H., Pouladzadeh, M., Zohuriaan-Mehr, M.J. & Rafiee-Tehrani, M. (2004). Diethylmethyl chitosan as an antimicrobial agent: Synthesis, characterization and antibacterial effects. European Polymer Journal, 40, 1355-1361. Campos-Takaki, G.M. (2005). The fungal versatility on the copolymers chitin and chitosan production. In: Chitin and chitosan opportunities and challenges. Dutta, P.K. editor. India: International Publication. Chambrevil, G. & Marmonier, A.A. (1987).Contrôle de la thérapeutique antibiotique. In: Bactériologie médicale, Carbonnelle, B; Denis, F; Mormonier, A.; Pinon, G.; Vargues, R., authors. Paris:SIMEP.

Chatterjee, S., Adhya, M., Guah, A. K. & Chatterjee, B. P. (2005). Chitosan from Mucor rouxii: production and physico-chemical characterization. Process Biochemistry., 40, 395-400. Chen, S., Wu, G., Long, D. & Liu, Y. (2006). Preparation, characterization and antibacterial activity of chitosan–Ca3V10O28 complex membrane. Carbohydrate Polymers, 64, 92-97. Chung, Y.-C., Su, Y. -A., Chen, C. –C., Jia, G., Wang, H. -L., Wu, J. C. G. & Lin, J. G. (2004). Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall. Acta Pharmacologica Sinica, 25, 7, 932-936. Coma, V., Martial-Gros, A., Garreau, S., Copinet, A., Salin, F. & Deschamps, A. (2002) Edible antimicrobial films base don chitosan matrix. Journal of Food Science, 67, 3, 1162-1169.

Costa Silva, H. S. R., Santos, K.S.C.R. & Ferreira, E.I. (2006). Quitosana: Derivados hidrossolúveis, aplicações farmacêuticas e avanços. Química Nova, 29, 4, 776-785, 2006. Devlieghere, F., Vermeiren, A. & Debevere, J. (2004). Chitosan: antimicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruits and vegetables. Food Microbiology, 21, 703-714.


Franco, L.O., Stamford, T.C.M., Stamford, N.P. & Campos-Takaki, G.M. (2005). Cunningamella elegans (IFM 46109) como fonte de quitina e quitosana. Revista Analytica, 14, 40-44. Helander, I.M., Nurmiaho-Lassila, E.L., Ahvenainen, R., Rhoades, J. & Roller, S. (2001). Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria. International Journal of Food Microbiology, 71, 235-244. Jollès, P., Muzzarelli, R.A.A. (1999). Chitin and chitinase. Basel: Birkhäuser. Kamil, J. Y. V. A., Jeon, Y.J. & Shahidi, F. (2002) Antioxidative activity of chitosans of different viscosity in cooked comminuted flesh of herring (Clupea harengus), Food Chemistry, 79, 69-77. Kanatt, S. R., Chander, R. & Sharma, A. (2004). Effect of irradiated chitosan on the rancidity of radiation-processed lamb meat. International Journal of Food Science and Technology, 39, 997-1003. Kanatt, S.R., Chander, R. & Sharma, A. (2008a). Chitosan glucose complex – A novel food preservative. Food Chemistry, 106, 521–528. Kanatt, S.R., Chander, R. & Sharma, A. (2008b). Chitosan and mint mixture: A new preservative for meat and meat products. Food Chemistry, 107, 845–852. Kumar, M. N. V. R. (2000). A review and chitosan applications. Reactive and Functional Polymers, 46, 1-27. Li, Y., Chen, X. G., Liu, N., Liu, C. S., Liu, C. G., Meng, X. H., Yu, L. J. & Kenedy, J. F. (2007). Physicochemical characterization and antibacterial property of chitosan acetates. Carbohydrate Polymers, 67, 227-232. Liu, H., Du, Y., Yang, J. & Zhu, H. (2004). Structural characterization and antimicrobial activity of chitosan/betaine derivative complex. Carbohydrate Polymers, 55, 291–297. Liu, J., Zhang, J. & Xia, W. (2008). Hypocholesterolaemic effects of different chitosan samples in vitro and in vivo. Food Chemistry, 107, 419–425. Martino, A.D., Sittinger, M. & Risbud, M.V. (2005). Chitosan: A versatile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering. Biomaterials, 26, 5983–5990. Meng, X., Li, B., Liu, J. & Tian, S. (2008). Physiological responses and quality attributes of table grape fruit to chitosan preharvest spray and postharvest coating during storage. Food Chemistry, 106, 501-508. Murugadoss, A. & Chattopadhyay, A. (2008). A ‘green’ chitosan–silver nanoparticle composite as a heterogeneous as well as micro-heterogeneous catalyst. Nanotechnology, doi:10.1088/0957-4484/19/01/015603.

http://books.google.com/books?q=inpublisher:


Nadarajah, K., Kader, J., Mohd, M. & Paul, D. C. (2001). Production of chitosan by fungi, Journal of Biological Sciences, 4 (3), 263-265. No, H.K., Meyers, S.P., Prinyawiwatkul, W. & Xu, Z. (2007). Applications of Chitosan for Improvement of Quality and Shelf Life of Foods: A Review. Journal of Food Science, 72, 5, 87-100. Pochanavanich, P. & Suntornsuk, W. (2002). Fungal chitosan production and its characterization. Letters in Applied Microbiology, 35, 17–21. Quin, C., Li, H., Xiao, Q., Liu, Y., Zhu, J. & Du, Y. (2006). Water-solubility of chitosan and its antimicrobial activity. Carbohydrate Polymers, 63, 367-374. Rhoades, J. & Roller, S. (2000). Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Applied and Enviromental Microbiology, 66, 1, 80-86. Roberts G.A.F. (1992). Chitin Chemistry. London: The Macmillan Press. Rodriguez M. S., Ramos V. & Anullo, E. (2003). Antimicrobial action of chitosan against spoilage organisms in precooked pizza. Journal of Food Science, 68, 1, 271-274. Rodríguez, M. S., Centurión, M.E. & Agulló, E. (2002). Chitosan-yeast interaction in cooked food: influence of the Maillard reaction. Journal of Food Science, 67, 7, 2576-2578. Roller, S. & Covill, N. (1999). The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice. International Journal of Food Microbiology, 47, 67-77. Sagoo, S. K., Board, R. & Roller, S. (2002). Chitosan potentiates the antimicrobial action of sodium benzoate on spoilage yeasts. Letters in Applied Microbiology, 34,168-172. Samuel, C. M., Vugia, D.J., Koehler, K.M., Marcus, R., Dennen, V., Damaske, B., Shiferaw, B., Hadler, J., Henao, O.L & Angulo, F.J. (2007). Consumption of risky foods among adults at high risk for severe foodborne diseases: room for improved targeted prevention messages. Journal of Food Safety, 27, 219–232. Santos, J.E., Soares, J.P., Dockal, E.R., Campana Filho, S.P. & Cavalheiro, E. T.G. (2003). Caracterização de quitosanas comerciais de diferentes origens. Polímero: Ciência e Tecnologia, 13, 4, 242-249. Silva, M. C. F.; Barros Neto, B.; Stamford, T. C. M.; Campos-Takaki, G. M. (2007). Effect of enviromental conditions on chitin and chitosan production by Cunninghamella elegans UCP 542 Using factorial design. Asian Chitin Journal, 3, 15-22.


Silva, M.C.F., Stamford, T.C.M., Franco, L.O. & Campos-Takaki, G.M. (2006). Effects of salinity and glucose on chitin and chitosan production by Cunninghamella elegans. Asian Chitin Journal, 2, 29-38. Shahidi, F., Arachchi, J. K. V. & Jeon, Y. -J. (1999). Food applications of chitin and chitosans. Trends in Food Science & Technology, 10, 37-51. Shahidi, F. Kamil, J., Jeon, Y. -J. & Kim, S. K. (2002). Antioxidant role of chitosan in a cooked cod (Gadus Morhua) model system. Journal of Food Lipids, 9, 57-65. Shigemasa, Y. & Minami, S. (1996). Applications of chitin and chitosan for biomaterials. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 17, 383-420. Stamford, T.C.M., Stamford, T.L.M., Stamford, N.P., Neto, B.B. & Campos-Takaki, G.M. (2007). Growth of Cunninghamella elegans UCP 542 and production of chitin and chitosan using yam bean medium. Elect. J. Biotechn.,10, 1. Disponível em: < http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/1/>. Access in: 01/05/2008. Steinbüchel, A. & Rhee, S.K. (2005). Polysaccharides and Polyamides in the Food Industry. Weinheim: Wiley-VCH. Tikhonov, V.E., Stepnova, E.A., Babak, V.G., Yamskov, I.A., Palma-Guerrero, J., Jansson, H.B., Lopez-Llorca, L.V., Salinas, J., Gerasimenko, D.V., Avdienko, I.D. & Varlamov, V.P. (2006). Bactericidal and antifungal activities of a low molecular weight chitosan and its N-/2(3)-(dodec-2-enyl) succinoyl/-derivatives. Carbohydrate Polymers, 64, 66–72. Tsai, G. –J. & Hwang, S. –P. (2004). In vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some intestinal bacteria. Fisheries Science, 70, 675-681. Yadav, A.V. & Bhise, S.B. (2004). Chitosan: a potencial biomaterial effective against typhoid. Current Science, 87, 9, 1176-1178. Zheng, L. –Y. & Zhu, J. –F. (2003). Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights. Carbohydrate Polymers, 54, 527-530.


http://books.google.com/books?q=inpublisher:


4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

Tran

smita

nc (%

)

Wavenumber cm-1

Figure 1- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP050.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

0,95

Tran

smita

nc (%

)

Wavenumber (cm-1)

Figure 2- Infrared spectra of chitosan from crabs (Sigma®).


Table 1- Minimum inhibitory concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria

-1Minimum inhibitory concentration (mg.mL ) Bacteria Chitosan

Fungi Crustacean Listeria monocytogenes 1.250 1.250 Staphylococcus aureus 1.250 1.250 Pseudomonas aeruginosa 0.625 0.625 Escherichia coli 1.250 1.250 Salmonella enterica 1.250 1.250 Yersinia enterocolitica 1.250 1.250

-1Table 2- Minimum bactericidal concentration (mg.mL ) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria

Minimum bactericidal concentration (mg.mL-1) Bacteria Chitosan

Fungi Crustacean Listeria monocytogenes 2.500 2.500 Staphylococcus aureus 5.000 5.000 Pseudomonas aeruginosa 2.500 5.000 Escherichia coli 5.000 5.000

a aSalmonella enterica NBE NBEYersinia enterocolitica 5.000 5.000 a NBE: no bactericide effect


Conclusões PRIMEIRO ARTIGO

A massa micelial de Mucor circinelloides UCP 050 pode ser considerada uma fonte alternativa para obtenção de quitina e quitosana;

O meio de jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban) demonstrou grande

potencial como um meio de cultura econômico para a produção de quitina e quitosana;

As propiedades físico-químicas da quitosana produzida por M. circinelloides

em meio jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban) as tornam adequada para diversas aplicações biotecnológicas;

A produção e extração de quitina e quitosana microbiana podem ser otimizadas

para obtenção destes biopolímeros em larga escala. SEGUNDO ARTIGO

Os resultados obtidos demonstram a eficácia antibacteriana da quitosana microbiana e de caranguejo, frente a bactérias patógenas/deteriorantes em alimentos;

A atividade antimicrobiana da quitosana sugere sua potencialidade como um

agente conservante de alimentos de origem natural, visando a redução de aditivos químicos;

Mais estudos são necessários para avaliar a efetiva ação antimicrobiana de

diferentes tipos de quitosana in vitro e em sistema alimentícios reais;


Anexos

QUITOSANA: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS

Ana Elizabeth Cavalcante Fai1*; Thayza Christina Montenegro Stamford2; Tânia Lúcia Montenegro Stamford1.

1 Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco Av. Professor Moraes Rego 1235 – Cidade Universitária – 50670901. Recife, PE.

2 Coordenação de Pesquisa e Extensão, Faculdades Integradas de Patos Rua Horácio Nóbrega, s/n- Belo Horizonte-58704-000 Patos, PB

*Correo electrónico: [email protected]

RESUMEN

La exigencia por alimentos seguros, con una vida útil prolongada y de alta cualidad nutritiva y sensorial es creciente. Los consumidores y los propios órganos de salud pública están especialmente preocupados con los efectos decurrentes del uso de varios adictivos químicos en productos alimenticios y su relación con la salud. Ese escenario tiene incentivado las pesquisas de nuevos agentes naturales que puedan ser empleados de forma a complementar los métodos de preservación de alimentos que se disponen actualmente. Destaca-se entre estos el quitosano, polisacárido compuesto por unidades repetitivas de β (1-4)-D-glicosamina, encontrada en la naturaleza en la pared celular de algunos hongos, y que todavía puede ser obtenida por la deacetilación de la quitina presente en lo exoesqueleto de crustáceos, insectos y artrópodos. El quitosano presenta características peculiares derivadas de su capacidad de formación de complexos polielectrolíticos, con propiedades de biodegradación, biocompatibilidad y bioactividad. En la industria alimenticia este polímero ofrece un amplio espectro de posibles aplicaciones, destacando-se como agente antimicrobiano, antioxidante y como embalaje activamente funcional. El presente trabajo aborda aspectos que caracterizan el quitosano por su potencial como conservante natural y perfil atóxico como una prominente opción para obtener alimentos con bajos niveles de adictivos químicos.

Palabras claves: adictivos químicos, quitosana, preservación de alimentos.

Introdução

As mudanças nos padrões nutricionais e os benefícios creditados a uma alimentação

saudável dinamizaram intensamente todos os setores responsáveis pela produção de alimentos

levando à busca por alternativas de transformação, conservação e alteração química destes

produtos.


Redação: Rua das Gardênias, 36 (Mirandópolis) - 04047-010 - São Paulo,SP Fone (11) 5589-5732 - Fax (11) 5583-1016 - E-mail: [email protected]

DECLARAÇÃO Declaro, para os fins e efeitos de direito, que o trabalho intitulado ASPECTOS LEGAIS DO USO DE ADITIVOS QUÍMICOS EM ALIMENTOS, de autoria de Ana Elizabeth Cavalcante Fai, Amanda de Morais Oliveira, Emmanuela Prado de Paiva, Daniela de Souza Soares, Teresa Cristina Caheté Mitchell e Tânia Lúcia Montenegro Stamford foi aprovado para publicação na Revista Higiene Alimentar.

São Paulo, 19 de julho de 2007

Sílvia Panetta Nascimento Coordenadora Científica

ASPECTOS LEGAIS DO USO DE ADITIVOS QUÍMICOS EM ALIMENTOS

Ana Elizabeth Cavalcante Fai Amanda de Morais Oliveira Emmanuela Prado de Paiva

Daniela de Souza Soares Teresa Cristina Caheté Mitchell

Tânia Lúcia Montenegro Stamford _______________________________________________________________

Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Recife. [email protected]

Resumo Os produtos industrializados ocupam uma parcela cada vez maior do mercado de alimentos haja vista, principalmente, a mudança dos hábitos alimentares nos últimos anos. Sem o uso de aditivos químicos, a variedade destes alimentos disponíveis e seu tempo de vida em manter-se em condições de consumo seriam muito reduzidos. Contudo, o uso de aditivos é um tema controverso, com alegações de que estes são tóxicos e que podem desencadear reações adversas nos consumidores. Entretanto, todos os aditivos permitidos no Brasil são considerados seguros, de acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária se utilizados nas quantidades estabelecidas pela mesma. Não obstante ao cumprimento das recomendações da legislação, ressalta-se que a indústria de alimentos deve estar sempre atenta às constantes investigações e descobertas nesta área, de forma a fornecer ao mercado alimentos sempre seguros. Este trabalho teve o intuito de abordar os aspectos legais vigentes no Brasil quanto à regulamentação do uso de aditivos químicos em alimentos. Palavras chave: aditivos alimentares, legislação, classificação. Summary Day by day, industrialized products occupy a larger portion in the food market, especially due to the alimentary habits change in the last years. Without the use of chemical addictive, foods variety and shelf-life would be much reduced. On the other hand, the use of addictive is a controversial subject, with allegations that they are toxic and might cause adverse reactions in consumers. However, all the addictive allowed in Brazil are considered safe, according to the National Agency of Sanitary Surveillance norms if they are used in the established amounts. In spite of following legislation recommendations food industry should be attempts to the constants investigations and discoveries in this area, in order to always provide safe foods. This work has as objective approaching the effective legal regulation aspects of food chemical addictive in Brazil. Keywords: food addictive, legislation, classification. Introdução

II-02-C

GROWTH AND PRODUCTION OF CHITIN AND CHITOSAN BY Mucor circinelloides UCP 050

USING YAM BEAN MEDIUM A.E.C. FAI1; A.S. ASSIS1; T.C.M.STAMFORD2,3; G.M.CAMPOS-TAKAKI3 ; T.L.M.STAMFORD4

1 Univ. Fed. Pernambuco, Recife-PE,Brasil 2 Faculdade Integrada de Patos-PB 58700-300 Brasil E-mail: [email protected] NPCAMB, Univ. Católica 50050-590, Recife-PE, Brasil. E-mail: [email protected] Univ. Fed. Rural PE, 50050-590,Brasil E-mail: [email protected] Chitin is an linear β1,4- linked homopolymer of N-acetyl-D-glucosamine, and chitosan is essentially composed of β-1,4 D-glucosamine (GlcNAc) residues [1]. Commercially, chitin and chitosan were obtained from exoskeletons of crustaceans, but chitosan is a product derived from de-N-acetylating of chitin [2,3]. Recent advances in fermentation technologies suggest that the cultivation of selected fungi can provide an alternative source of chitin and chitosan [1,4,5]. The present paper aims to investigate the chitin and chitosan production by Mucor circinelloides (UCP 050), grown on submerse fermentation using yam bean (Pachyrhizus erosus L. Urban) medium. A suspension of 108 spores/mL of M. circinelloides was inoculated in Erlenmeyers flasks containing 50 mL of yam bean medium, incubated at 28ºC, 150 rpm, during 96 hours[2]. Aliquots were collected each 24 hours, and biomass, pH, glucose and total nitrogen were determined. The mycelia was harvested, washed in deionizer water, and submitted to lyophilization process. The glucose and the nitrogen consumption were evaluated by spectrophometer method, and the changes of pH were measured [2]. The process of extraction of chitin and chitosan involved deproteinization with sodium hydroxide solution, and extraction of chitosan by acetic acid [4]. The degree of deacetilation for chitin and chitosan were determined by infrared spectroscopy, and the molecular weights were determined by viscosity [3]. The data were analyzed by the Students t-test and chi-square test, using the Statistic program, version 6.0 of Stat soft Inc., USA. All experiments were carried out in triplicate and the results are expressed as mean ± S.D. M. circinelloides growth curve for biomass, pH, nitrogen content and glucose consumption was analyzed (Fig.1). Biomass production increase rapidly within 48 h of growth, and reached the maximum dry weight (20.7g/L) at 96 h. The pH of the culture medium was 7 to 4, during the time of cultivation. These results are in agreement with the literature [3,4].

02468

1012141618

0 24 48 72 96

Time (h)

Biom

ass

(g/L

) Glu

cose

(g

/L)

012345678910

Nitr

ogen

(g/L

) pH

biomass glucose nitrogen pH

Fig. 1- Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 280C, 150rpm,

during 96h of cultivation. M. circinelloides grown in yam beam showed the best yields of chitosan (64mg/g), and chitin (500mg/g) with 48 and 72 hours, respectively (Fig.2), and similar results are obtained by Stamford et al. [2] using C. elegans.

Chitin Chitosan

Mean±SD 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A 110

Time (hour)

0

100

200

300

400

500

600

Yie

ld (m

g)

Fig.2. Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M.

circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of

cultivation. In the present study chitin and chitosan from M. circinelloides grown in yam bean medium present 22% DD and 83% DD, and molecular weight (MV) of 3.09 x 104g/mol and 2.7 x 104g/mol, respectively. ACKNOWLEDGEMENT The authors are thankful to CNPq, CAPES, and UNICAP. REFERENCES 1. Campos-Takaki GM. In: Chitin and chitosan opportunities

and challenges. Dutta, PK. editor. SSM International Pub., 2005, p.69-94

2. Stamford TCM, Stamford TLM, Stamford NP, Neto BB, Campos-Takaki GM. Elect. J. Biotechn., 10(1), (2007) on-line: http://www.ejbiotechnology.info/..

3. Santos JE, Soares JP, Dockal ER, Filho SC, Cavalheiro ETG. Polím.: Ciência e Tecnologia, 13(4), (2003), 242

4. Franco LO., Stamford TCM, Stamford NP, Campos-Takaki GM. Rev. Analyt., 3(10), (2005), 40.

5. Freitas Silva MC, Stamford TCM, Franco LO, Campos-Takaki GM. Asian Chitin J. 2 (2006), 29

IV SIAQ (NATAL, BRASIL 2007)__________________________________________




http://www.ejbiotechnology.info/content/vol9/issue5/full/16/index.html

Documents

ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI - repositorio.ufpe.br · calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo