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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM TRÊS ESPÉCIES DO GÊNERO Deltochilum (COLEOPTERA:
SCARABAEIDAE)
DIOGO CAVALCANTI CABRAL-DE-MELLO
RECIFE, PE FEVEREIRO, 2008
DIOGO CAVALCATI CABRAL-DE-MELLO
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM TRÊS ESPÉCIES DO GÊNERO Deltochilum (COLEOPTERA:
SCARABAEIDAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Genética. Orientador: Profa. Dra. Maria José de Souza Lopes, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE. Co-Orientador: Profa. Dra. Rita de Cássia de Moura, Depto. de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, UPE.
RECIFE, PE FEVEREIRO, 2008
Cabral-de-Mello, Diogo Cavalcanti Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
(Coleoptera: Scarabaeidae). / Diogo Cavalcanti Cabral-de-Mello. – Recife: O Autor, 2008.
101 folhas : il.,fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Citogenética – análise 2. Coleóptera 3. Cromossomos I. Título. 575 CDU (2.ed.) UFPE 576.5 CDD (22.ed.) CCB – 2008-011
A minha mãe Tereza, minha avó
Hilda e às minhas estimadas orientadoras Maria José e Rita Moura, com amor dedico.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus por me dar o dom da vida e guiar meu caminho ao longo dessa jornada profissional. À minha orientadora Mazé (Maria José), por seus ensinamentos, disponibilidade, confiança e por ter contribuindo significativamente em minha formação profissional, além mesmo da dissertação. À minha co-orientadora Rita Moura, a quem eu devo maior parte da minha formação, por ter me iniciado na citogenética desde a graduação, sendo uma pessoa accessível, confiante, ultra profissional e ao mesmo tempo uma grande amiga para todos os momentos. Aos meus amigos e colegas de Laboratório por suas companhias e tolerância no ambiente de trabalho. Cibele, Pollyanna, Sárah, Jéssica, Fernando, Amanda, Cris, Maria Clara, Celso, Mônica, Guilherme, Meri, Marcela, Adriana, Ituza, Jefferson, Carol, Iane, Dani, Thati, Nara, Cybelle, Angélica, Graciela, Thiago, Sérgio, Bárbara, Bel, Fabi, Clausio, Cirlene e Fran.
Ao pessoal do Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica (UFPE), em especial à Ana Emília pelo apoio em parte do desenvolvimento do trabalho e disponibilidade para ajudar no laboratório. À Isabel do Laboratório de Bioquímica e Sequenciamento de DNA (UFRPE) por ter me ensinado a desenvolver a técnica de FISH durante as inúmeras vezes que freqüentei o Laboratório da rural. Aos colegas de turma, Cybelle, Cibele, Alexandre, Camilla, Edilene, Fernanda, Neto, Carlos, Isaac, Sárah, Angélica, Meri, Rodrigo, André, Cariri, Pollyanna e Mariana.
Aos professores com quem tenho convivido durante minha formação. Em especial as professoras Neide, Vilma e Marília por acompanharem e contribuírem com minha formação com seus conselhos e ensinamentos; Ana Benko, por ter me orientado no estágio à docência e ter sido uma pessoa sempre disponível; Marcelo Guerra, por disponibilizar o uso de equipamentos em seu Laboratório, por ter me dado a oportunidade de trabalhar com algo diferente dentro da citogenética, além de ter sido um conselheiro e ter aberto portas em minha vida profissional; Reginaldo por aceitar o desenvolvimento de parte de minha dissertação utilizando a estrutura disponível no Laboratório do qual faz parte.
Aos meus amigos “não profissionais” Maria Carolina, Pedro, Daniela, Carol Reis, Jimmy, Elzinha, Léo pelo companheirismo por boa parte de minha vida.
A toda minha família, em especial, a minha mãe, minha avó e meu avô, por seus
conselhos, interesse, preocupação e efetiva contribuição em minha formação. Às agências de fomento, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos e à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), pelos auxílios concedidos durante a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
7
Lista de Tabelas
8
Lista de Abreviações
9
Resumo
10
1. Introdução
11
2. Revisão Bibliográfica
13
2.1. Considerações gerais sobre a família Scarabaeidae (Coleoptera)
13
2.2. Rearranjos cromossômicos e variabilidade cariotípica em Coleoptera
16
2.3. Heterocromatina
28
2.3.1. Características e funções da heterocromatina como material genômico
28
2.3.2. Regiões heterocromáticas em Coleoptera
31
2.4. Padrões de distribuição das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) e sítios de DNAr em Coleoptera
42
3. Referências Bibliográficas 49
4. Manuscrito de Artigo Científico 66
Evolução cromossômica em três espécies do gênero Deltochilum (Coleoptera: Scarabaeidae: Scarabaeinae)
66
5. Conclusões 90
6. Abstract 91
7. Anexos 92
7.1. Instruções para autores: Chromosome Research
93
8. Apêncices
99
8.1. Fotografias das espécies analisadas 100
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
Manuscrito
Figura 1. Coloração convencional de células mitóticas e meióticas em espécies do gênero Deltochilum. (a) cariótipo de D. irroratum; (c) cariótipo de D. morbillosum; (b,d,e) metáfases I de D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum, respectivamente; (f) metáfase II com o cromossomo X de D. verruciferum. Observar em (e) as diferentes conformações do XYp na metáfase I de D. verruciferum. Setas indicam os bivalentes sexuais. Barra=5μm.
85
Figura 2. Bandeamento C e coloração com nitrato de prata nas três espécies estudadas. (a,b) banda C no cariótipo e em metáfase I de D. irroratum; (d,f) metáfases I de D. morbillosum e D. verruciferum coradas através do bandeamento C, respectivamente; Coloração com nitrato de prata, evidenciando as seqüências de HC em metáfases I de (c) D. irroratum, (e) D. morbillosum e (g) D. verruciferum. Note em (c) a ausência de marcação das seqüências de HC pelo nitrato de prata nos pares 5, 6 e no neo-XY de D. irroratum, bem como em (g) a marcação do lúmen do bivalente sexual XYp de D. verruciferum; Barra=5μm.
86
Figura 3. Dupla coloração com fluorocromos base específicos CMA3/DA e DA/DAPI em metáfases I de três espécies de Deltochilum, mostrando regiões de HC ricas em GC. (a,c,e) coloração CMA3/DA em (a) D. irroratum, (c) D. morbillosum e (e) D. verruciferum; (b,d,f) coloração DA/DAPI neutra em (b) D. irroratum, (d) D. morbillosum e (f) D. verruciferum; Em (c) ocorrência de heteromorfismo no bivalente sexual neo-XY de D. morbillosum, com bloco CMA3
+ apenas no cromossomo X; Em (e) o asterisco indica o bivalente 7 com bloco proximal no braço longo CMA3
+, em destaque o cromossomo 7 em metáfase II. Setas indicam os bivalentes sexuais; Barra=5μm.
87
Figura 4. Hibridização in situ Fluorescente, evidenciando sítios de DNAr em bivalentes meióticos, (a) D. morbillosum, (b) D. irroratum e (c) D. verruciferum; as setas indicam os bivalentes sexuais com sítios de DNAr no cromossomo X; Barra=5μm.
88
Figura 5. Idiogramas mostrando o padrão de distribuição e qualificação da HC, a marcação da HC pelo nitrato de prata e os sítios de DNAr em D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum.
89
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
Revisão da Literatura
Tabela 1. Padrão de distribuição, qualificação e afinidade do nitrato de prata pela heterocromatina constitutiva em representantes de Scarabaeidae.
39
Tabela 2. Padrões de distribuição de RONs em representantes de Scarabaeidae.
46
Manuscrito
Tabela 1. Espécimes de D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum analisadas, locais de coleta e coordenadas geográficas.
84
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AgNO3 – Nitrato de prata
AT – Adenina e Timina
bl – Bloco
bl.C – Bloco(s) centromérico(s)
bl.I – Bloco(s) intersticial(ais)
bl.Pa – Bloco(s) paracentromérico(s)
bl.Pe – Bloco(s) pericentromérico(s)
bl.St – Bloco(s) subtelocêntrico(s)
bl.T – Bloco(s) terminal(ais)/ telomérico(s)
CG – Corpo granular
CMA3 – Cromomicina A3
DA – Distamicina A
DAPI – 4’-6-diamidino-2-fenilindol
DFC – Centro fibrilar denso
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DNAr – Ácido desoxirribonucléico ribossomal
FC – Centro fibrilar
FISH – Hibridização in situ fluorescente
GC – Guanina e Citosina
HC – Heterocromatina constitutiva
PEV – Variegação por efeito de posição
RNA – Ácido ribonucléico
RNAr – Ácido ribonucléico ribossomal
RONs- Regiões organizadoras de nucléolos
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi analisar citogeneticamente três espécies de coleópteros pertencentes
ao gênero Deltochilum (Scarabaeidae), D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum, através
da coloração convencional, bandeamentos cromossômicos e hibridização in situ fluorescente
(FISH). Deltochilum irroratum e D. morbillosum apresentaram número diplóide 2n=14 e
mecanismo sexual neo-XY enquanto D. verruciferum possui cariótipo 2n=20,XYp. As três
espécies possuem cromossomos meta-submetacêntricos. O bandeamento C revelou
predominantemente cromossomos difásicos, com os braços longos heterocromáticos em D.
irroratum e D. morbillosum e curtos heterocromáticos em D. verruciferum. A coloração com
nitrato de prata marcou as seqüências correspondentes à heterocromatina constitutiva (HC) em D.
morbillosum e D. verruciferum. Nesta última o lúmen do bivalente sexual também foi marcado.
Em D. irroratum esta coloração evidenciou a HC dos cromossomos autossômicos difásicos. A
coloração com fluorocromos CMA3 e DAPI revelou blocos CMA3+ na HC da espécie D.
verruciferum e nos autossomos difásicos e bivalente sexual de D. irroratum. Em D. morbillosum
as sequências CMA3+ estão restritas às regiões terminais do braço longo dos pares 1, 2 e do X.
Nas três espécies a FISH identificou sítios de DNAr em dois pares autossômicos e no
cromossomo X. A utilização destas técnicas permitiu a localização de marcadores citogenéticos e
a análise dos possíveis rearranjos envolvidos ao longo da diferenciação cariótipica destas
espécies.
Palavras-chave: Cariótipo, Coleoptera, Deltochilum, DNAr, heterocromatina, rearranjos
cromossômicos.
10
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
1. INTRODUÇÃO
Os representantes da ordem Coleoptera, popularmente conhecidos como besouros,
representam o grupo animal com maior diversidade biológica do planeta. Encontram-se divididos
em quatro subordens, Archostemata, Adephaga, Myxophaga e Polyphaga. Dentre estas,
Polyphaga é a mais numerosa com aproximadamente 90% dos representantes da ordem
(Lawrence e Newton 1995). Em Polyphaga destaca-se a família Scarabaeidae devido à
importância ecológica de seus representantes, a sua ampla radiação adaptativa e à diversidade.
Possui cerca de 2.000 gêneros e 25.000 espécies, com 12 subfamílias e diversas tribos ocorrentes
no mundo. Na região Neotropical, são registrados 362 gêneros e 4.706 espécies, enquanto no
Brasil ocorrem 204 gêneros e 1.777 espécies (Costa 2000; Vaz-de-Mello 2000).
Apesar desta ampla diversidade, estudos citogenéticos em Scarabaeidae são escassos e
apenas cerca de 380 espécies foram analisadas, das quais somente 60 foram estudadas por
técnicas citogenéticas diferenciais. Seu cariótipo modal e ancestral é 2n=20,Xyp, com
cromossomos meta-submetacêntricos (Smith e Virkki 1978; Yadav et al. 1979; Vidal 1984;
Moura et al. 2003; Bione et al. 2005a). Entretanto, ocorre variação no número diplóide de 2n=8 a
2n=30, além de diferentes mecanismos sexuais, devido à ocorrência de rearranjos cromossômicos
dos tipos fusão, fissão, perdas cromossômicas e aumento do y (Smith e Virkki 1978; Yadav e
Pillai 1979; Bione et al. 2005a,b; Cabral-de-Mello et al. 2007).
O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) nesta família é
predominantemente pericentromérico nos cromossomos autossômicos e no X, podendo ocorrer
também HC nas regiões intersticiais, teloméricas, além da presença de cromossomos difásicos em
algumas espécies (Moura et al. 2003; Wilson e Angus, 2004; Bione et al. 2005a,b; Angus et al.
11
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
2007). A utilização dos fluorocromos base específicos CMA3 e DAPI tem revelado ampla
heterogeneidade na composição da HC nos representantes deste grupo, com algumas espécies
apresentando blocos ricos em pares de bases AT, GC e AT/GC ou neutros (Moura et al. 2003;
Bione et al. 2005b; Colomba et al. 2006). Em relação às regiões organizadoras de nucléolos
(RONs), estas estão localizadas preferencialmente no cromossomo X ou em um par autossômico,
porém variações, tais como, a ocorrência de vários sítios de DNAr têm sido descritas em algumas
espécies (Moura et al. 2003; Bione et al. 2005a,b; Colomba et al. 2006).
O uso de técnicas citogenéticas diferenciais e moleculares tem contribuído para
caracterização citogenética de Scarabaeidae, auxiliando na localização de marcadores
citogenéticos que são importantes para sua análise cariotípica. Dessa forma tem contribuído para
melhor compreensão dos padrões cromossômico-evolutivos desta família.
No presente trabalho foram analisados através de técnicas citogenéticas convencional,
diferenciais e moleculares os cariótipos das espécies Deltochilum irroratum, D. morbillosum e D.
verruciferum, com objetivo de descrever suas características cromossômicas, realizar uma análise
comparativa com outras espécies de Scarabaeidae, bem como inferir sobre os padrões de
evolução cromossômica para o grupo.
12
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Considerações gerais sobre a família Scarabaeidae (Coleoptera)
A ordem Coleoptera é considerada megadiversa dentro da classe Insecta, estando
representada por aproximadamente 357.899 espécies distribuídas mundialmente. Na região
Neotropical são registradas cerca de 127 famílias, 6.703 gêneros e 72.476 espécies (Costa 2000).
Essa ampla diversidade tem sido atribuída à efetiva participação de características morfológicas
tais como, os élitros, par de asas anterior enrijecido, que permitem a esses organismos explorar
diversos nichos ecológicos (Costa 1999). Coleoptera está dividida em quarto subordens,
Archostemata, Adephaga, Myxophaga e Polyphaga, sendo esta última representada por 90% das
espécies do grupo (Lawrence e Newton 1995). As relações filogenéticas entre as quatro
subordens são controversas, entretanto é consenso a monofilia para a ordem (Crownson 1981;
Wheeler et al. 2001; Vanin e Ide 2002).
Dentro da subordem Polyphaga são encontradas 16 superfamílias, das quais
Scarabaeoidea merece destaque por ter sofrido grande radiação adaptativa. Segundo Crownson
(1981), o ancestral de Scarabaeoidea era pequeno, com corpo convexo, adaptado a viver sob o
solo e se alimentar de fungos subterrâneos. Atualmente, Scarabaeoidea é representada por 13
famílias: Glaressidae, Passalidae, Lucanidae, Diphyllostomidae, Trogidae, Bolboceratidae,
Plecomidae, Geotrupidae, Hybosoridae, Ochodaidae, Ceratocanthidae, Glaphyridae e
Scarabaeidae (Crownson 1981; Browne e Scholtz 1999; Vanin e Ide 2002).
Scarabaeidae constitui a maior família dentro de Scarabaeoidea. Possui cerca de 2.000
gêneros e 25.000 espécies com 12 subfamílias e diversas tribos ocorrentes no mundo. Na região
13
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Neotropical são registrados 362 gêneros e 4.706 espécies, enquanto no Brasil ocorrem 204
gêneros e 1.777 espécies (Costa, 2000; Vaz-de-Mello, 2000). São besouros de corpo robusto,
ovais ou alongados, usualmente convexos e com antenas lameladas. Variam consideravelmente
em hábitos, se alimentando de esterco, matéria vegetal, carniça, podendo estar associados a
formigueiros e cupinzeiros, além de se alimentarem de fungos. A maioria das espécies tem
habitos noturnos e apresentam atração pela luz, entretanto espécies diurnas podem ser
encontrados em tecidos vegetais como flores (Lawrence e Newton 1995; Marioni et al. 2001;
Ratcliffe et al. 2002).
A subfamília Scarabaeinae é um grupo cosmopolita, que apresenta grande diversidade,
com mais de 5.000 espécies, cerca de 12 tribos e 234 gêneros descritos em todo o mundo. Para a
região Neotropical, tem-se registro de aproximadamente 9 tribos, 70 gêneros e 1.250 espécies. No
Brasil, há registros de 618 espécies, das quais 323 são endêmicas, entretanto devido à carência de
dados em diversas regiões do país acredita-se que este número seja superior a 1200 espécies
(Hanski e Cambefort 1991; Vaz-de-Mello 2000).
Os besouros pertencentes à Scarabaeinae são popularmente conhecidos como “rola-
bosta”, devido ao hábito de rolarem bolas com matéria orgânica em decomposição para
realizarem suas posturas (Halffter e Mattheus 1966). Alimentam-se principalmente de matéria
orgânica em decomposição, como fezes de mamíferos, frutos apodrecidos, carcaça e fungos.
Dessa maneira, são importantes dentro do funcionamento de ecossistemas, atuando como
eficientes recicladores da matéria orgânica (Halffter e Mattheus 1966; Halffter e Favila 1993).
Em geral, os escarabeíneos são mais diversos em áreas com ecossistemas associados a
temperaturas quentes, com médias anuais de precipitação chuvosa acima de 250 mm. Outro fator
importante na distribuição das espécies deste grupo é a cobertura vegetal, que pode influenciar a
14
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
oferta de alimento, temperatura, umidade e a incidência solar (Halffter e Edmons 1982; Halffter
1991). Nas regiões tropicais as comunidades destes organismos são bastante estruturadas,
podendo ser divididas em guildas, que constituem agrupamentos de espécies com atributos
ecológicos semelhantes (Halffter 1991; Louzada e Lopes 1997).
No caso dos representantes de Scarabaeinae as guildas são estruturadas em relação à
estratégia de alocação de recurso, grau de generalização da dieta e período de atividade (Louzada
e Lopes 1997). Quanto à alocação de recursos as espécies podem ser roladoras, escavadoras ou
residentes. As roladoras (telecoprídeas) retiram o recurso alimentar do local encontrado, formam
uma bola e rolam a mesma até outro local distante cerca de 5 a 18 m. Na América do Sul, esta
guilda é representada pelas tribos Canthonini, Eucranini e Sisyphini. As espécies escavadoras
(paracoprídeas) escavam túneis embaixo ou ao lado do local onde o recurso alimentar é
encontrado e pertencem às tribos Dichotomini, Phaneini e Onthophagini. Enquanto as residentes
(endocoprídeos) vivem diretamente dentro da área do recurso alimentar, como as espécies da
tribo Eurysternini (Hanski e Cambefort 1991; Louzada e Lopes 1997).
Em relação ao tipo de dieta, podem ser coprófagos, necrófagos, copro-necrófagos ou
generalistas. Os coprófagos se alimentam de fezes, os necrófagos utilizam como recurso
alimentar cadáveres frescos e em decomposição nos estágios de larva e de adulto, enquanto os
copro-necrófagos utilizam tanto as fezes como carcaças. Escarabeíneos generalistas se alimentam
além de carcaça e fezes de matéria vegetal em decomposição e fungos (Halffter e Mattheus 1966;
Halffter 1991).
Os representantes de Scarabaeinae podem ser utilizados em estudos para indicação de
qualidade ambiental. Isto se deve ao fato de constituirem comunidades bem estruturadas
formando guildas, por terem alguns grupos taxonomicamente bem estudados e por apresentarem
15
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
facilidade de coleta em campo, e elevada densidade de indivíduos para as espécies comuns além
disso são sensíveis aos efeitos da devastação (Halffter e Edmons 1982; Hanski e Cambefort 1991;
Halffter e Favila 1993).
2.2. Rearranjos cromossômicos e variabilidade cariotípica em Coleoptera
Os cromossomos não são estruturas estáveis e estão em constante processo de
modificação ao longo das gerações nos diferentes organismos. Os rearranjos cromossômicos
podem envolver apenas um cromossomo ou afetar diferentes cromossomos do cariótipo. Esses
mecanismos dependem basicamente de eventos de quebra e reunião de partes cromossômicas em
organização diferente do cariótipo original. As principais alterações cromossômicas estudadas
que contribuem para diferenciação de espécies e na geração de polimorfismos intra ou
interpopulacionais são: translocações, inversões, duplicações, fusões e fissões (White 1973; King
1993).
Os rearranjos cromossômicos estão diretamente relacionados com o processo de geração
de polimorfismos e de especiação. Entretanto, para que estes tenham algum significado evolutivo
é preciso que os mesmos se fixem dentro das populações e sejam passados ao longo das gerações.
Podem ser observados nos indivíduos, em decorrência das alterações cromossômicas, efeitos
positivos, neutros ou negativos para os mesmos. Os rearranjos que geram efeitos positivos para
adaptabilidade ou os que são neutros tem maior probabilidade de se estabelecem nas populações,
são passados para os gametas e consequentemente para as próximas gerações e são os principais
responsáveis pela geração de polimorfismos cromossômicos. Por outro lado, os rearranjos que
geram efeitos negativos podem ser eliminados por interferirem na segregação meiótica,
16
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
ocasionando a geração de gametas aneuplóides e consequentemente reduzindo a fertilidade do
indivíduo que o possui (White 1973; King 1993).
Para a fixação de rearranjos cromossômicos em nível populacional, é necessário que a
fertilidade dos organismos não seja diminuída, permitindo a fixação do mesmo e a sua
transmissão para outras gerações. A ocorrência de muitos rearranjos cromossômicos em uma
população diminui a chance de fixação dos mesmos devido à geração de gametas aneuplóides
(King 1993). O processo de fixação de um novo rearranjo cromossômico depende principalmente
de quatro eventos: possível direcionamento da divisão celular, vantagem seletiva do novo
cariótipo, endogamia e deriva genética (White 1973).
Dentro da ordem Coleoptera diversos tipos de rearranjos cromossômicos têm sido
observados, como fusões, fissões, inversões e translocações. Estes rearranjos têm contribuído
para o processo de diferenciação cariotípica dos autossomos e cromossomos sexuais nas diversas
famílias, tais como Buprestidae (Karagyan e Kuznetsova 2000), Chrysomelidae (Gómez-Zurita et
al. 2004), Cicindelidae (Galián et al. 2002), Elateridae (Ferreira et al. 1984; Schneider et al.
2007), Scarabaeidae (Bione et al. 2005a,b) e Tenebrionidae (Pons, 2004), dentre outras.
Os estudos citogenéticos dentro de Coleoptera são escassos e apenas cerca de 1% das
espécies catalogadas tiveram seus cariótipos descritos, predominando o uso de técnicas
convencionais, com descrição de número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de
determinação sexual (Smith e Virkki 1978; Vidal 1984; Virkki e Santiago-Blay 1993; Moura et
al. 2003; Karagyan et al. 2004; Pons 2004; Schneider et al. 2007). O pequeno número de estudos
neste grupo se deve principalmente ao pequeno tamanho de seus cromossomos e a diferenças nas
fases de maturação da espermatogênese, o que dificulta a análise de algumas espécies (Smith e
Virkki 1978).
17
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
A subordem Polyphaga engloba mais de 90% das espécies de coleópteros, concentrando
nesta subordem a maioria dos estudos citogenéticos. O cariótipo considerado modal e primitivo
para a ordem é 2n=20, mecanismo sexual Xyp, com cromossomos autossômicos contendo dois
braços, além do cromossomo X metacêntrico e y puntiforme (Smith e Virkki 1978). Entretanto,
devido aos diferentes rearranjos cromossômicos ocorridos no grupo, tem sido observado variação
do número diplóide de 2n=4 (Chalcolepidius zonatus, Elateridae, Polyphaga) a 2n=69 (Dixus
capito, Carabidae, Adephaga), mecanismos sexuais diversos (Xyp, XYp, Xnyp, nXyp, Xyc, XYc,
X0, Xy, XY, Xyr, nXnY) e morfologia cromossômica variável com presença de cromossomos
metacêntricos, submetacêntricos e acrocêntricos (Takenouchi 1970; Smith e Virkki 1978;
Ferreira et al. 1984; Serrano e Galián 1998; Moura et al. 2003).
Nas subordens Archostemata e Myxophaga, os estudos cariotípicos são muito escassos,
com apenas três espécies estudadas até o momento, sendo uma pertencente à Myxophaga e duas a
Archostemata (Smith e Virkki 1978; Mesa e Fontanetti 1985; Galián e Lawrence 1993).
Micromalthus debilis (Archostemata) apresenta número diplóide 2n=20 nas fêmeas e 2n=10 nos
machos, com sistema sexual haplo-diplóide. Enquanto Distocupes varians, apresenta 2n=19,X0 e
meiose aquiasmática. O número diplóide 2n=20 é considerado ancestral para o grupo, entretanto
a ancestralidade do mecanismo sexual Xyp tem sido questionada (Smith e Virkki 1978; Galián e
Lawrence 1993).
Na subordem Myxophaga, a espécie Ytu zeus apresenta 2n=20 e mecanismo sexual Xyp.
O cromossomo sexual y é grande, entretanto, o comportamento de associação dos cromossomos
sexuais é igual ao comportamento do sistema sexual pára-quedas (Mesa e Fontanetti 1985).
Segundo estes autores um sistema sexual Xyp com o cromossomo y grande pode ser um passo
anterior à origem do sistema sexual pára-quedas típico a partir de um sistema XY ancestral com
18
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
cromossomos de tamanhos similares. Também foi proposto que um pára-quedas com a presença
do cromossomo y grande pode ser originado a partir de um sistema Xyp típico pelos processos da
adição de heterocromatina no cromossomo y e posterior ausência de associação do braço
heterocromático deste cromossomo com o X.
Na subordem Adephaga, a característica cromossômica considerada ancestral é a presença
de grande número de cromossomos, como observado em representantes das famílias Carabidae e
em Cicindelidae com números diplóides 2n=12, 22, 27, 30, 31, 35, 36, 37, 39, 55, 57, 59, 69,
entre outros (Serrano e Galián 1998; Martinez-Navarro et al. 2004). Dentre seus representantes, a
família com maior número de estudos citogenéticos é Cicindelidae, com mais de 80 espécies
analisadas. O número diplóide nesta família varia de 2n=12, observado em Megacephala
brasiliensis, a 2n=44 descrito para representantes do gênero Amblycheila, considerado primitivo
para o grupo. Quanto aos mecanismos sexuais são observados sistemas simples e múltiplos
(Galián et al. 2002; Proença et al. 2002a).
Cicindelidae compreende seis tribos, das quais três são consideradas mais primitivas,
Manticorini, Omini e Megacephalini. Os representantes destas tribos primitivas possuem
mecanismos sexuais simples quiasmático e aquiasmático como XY e X0, respectivamente, e
números diplóides altos. Por outro lado, números diplóides mais baixos e mecanismos sexuais
múltiplos XnY (n=2-4) aquiasmáticos são observados nas tribos mais derivadas Cicindelini,
Ctenostomini e Collyrini (Galián et al. 2002; Proença et al. 2002b; Zacaro et al. 2004; Proença et
al. 2005).
Dados da literatura indicam que os maiores números diplóides ocorrem nos gêneros mais
basais, incluindo Amblycheila (2n=44), Manticora (2n=38) e três representantes de Megacephala
(2n=26 e 2n=31), decrescendo em representantes mais derivados como os pertencentes à tribo
19
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Cicindelini, com 11 ou menos pares autossômicos e diferentes números de cromossomos sexuais
em sistemas múltiplos (Serrano e Galián 1998; Pearson e Vogler, 2001; Galián et al. 2002;
Proença et al. 2002a). Em relação aos mecanismos de determinação do sexo, diversos autores
propõem que a origem do mecanismo sexual múltiplo nas tribos derivadas Cicindelini e Collyrini
ocorreu antes da separação destes grupos, sendo considerado uma autapomorfia para os mesmos
(Galián e Hudson 1999; Galián et al. 2002; Zacaro et al. 2004).
A plotagem de dados cromossômicos em filogenias propostas para Cicindelidae permite
apontar os possíveis processos de modificações cromossômicas que ocorreram ao longo da
evolução das diferentes tribos da família. No processo de diferenciação dos grupos basais e mais
derivados ocorreram redução do número diplóide, origem e fixação do mecanismo sexual
múltiplo a partir de um sistema simples quiasmático seguida de restrição dos quiasmas nos
cromossomos sexuais. O sistema múltiplo aquiasmático observado nos representantes de
Cicindelidae forma em metáfase I uma estrutura em roseta, ligada através de proteínas
teloméricas que difere de outros sistemas múltiplos observados em Coleoptera (Vitturi et al.
1996; Pearson e Vogler 2001; Galián et al. 2002; Proença et al. 2002a,b).
Os padrões de evolução cromossômica de autossomos e sexuais em Cicindelidae é
bastante variável. Existem exemplos de gêneros como Cicindela, que apresenta espécies com o
mesmo número de autossomos e variação no número de cromossomos sexuais de 2 a 4. Enquanto
resultados obtidos em outras espécies da tribo Cicindelini mostram diferentes quantidades de
pares autossômicos (10, 11 e 12) e o mesmo número de sexuais (Galián e Hudson 1999; Proença
et al. 1999). Devido a esta variabilidade de padrões entre os autossomos e cromossomos sexuais
atualmente é defendida a teoria de evolução independente destes cromossomos, reforçada pela
20
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
ausência de quiasmas entre os cromossomos sexuais que pode consistir numa barreira para o
processo de translocação entre os mesmos (Galián et al. 1990; Proença et al. 2004).
Dentro de Polyphaga os estudos relacionados à evolução cromossômica estão
concentrados nas famílias Buprestidae (Karagyan et al. 2004), Chrysomelidae (Petitpierre e
Elgueta 2006), Tenebrionidae (Pons 2004), Elateridae (Schneider et al. 2007) e Scarabaeidae
(Bione et al. 2005b). Esta subordem apresenta uma variação no número diplóide de 2n=4
(Chalcolepidius zonatus - Elateridae) a 2n=64 (Disonycha bicarinata - Chrysomelidae), tendo
como número mais freqüente 2n=20, sistema sexual Xyp e cromossomos com dois braços
(Kacker 1976; Smith e Virkki 1978; Ferreira et al. 1984; Virkki, 1988; Maffei et al. 2000; Bione
et al. 2005b; Schneider et al. 2007).
Em Buprestidae a variação do número diplóide é de 2n=12 em Melanophila acuminata a
2n=46 em Sphenoptera scovitzi, espécie que apresenta polimorfismo de número cromossômico
com variação de 2n=38-46 (Karagyan 2001). O número diplóide mais comum para esta família é
2n=22, descrito em 36 espécies estudadas, seguido de 2n=20, observado em 15 representantes
deste grupo. A família apresenta seis tipos de mecanismos sexuais diferentes, X0, Xyp, Xyr, neo-
Xy, XY e sistema múltiplo. O sistema Xyp é o mais comum, em contraste com os sistemas X0 e o
sistema múltiplo que são os mais raros, ocorrendo apenas em representantes da subfamília
Chrysochoinae. O sistema X0 foi descrito apenas para a espécie Chalcophora lacustris, enquanto
o sistema múltiplo, X1X2X3/Y1Y2Y3 foi relatado na espécie Euchroma gigantea (Mesa e
Fontanetti 1984; Karagyan e Kuznetsova 2000; Karagyan et al. 2004). Segundo Karagyan et al
(2004), não é possível inferir o cariótipo ancestral para Buprestidae, entretanto, estes autores
propõem que o mesmo provavelmente corresponde a 2n=20,Xyp como observado para a ordem
Coleoptera.
21
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Na família Chrysomelidae, os gêneros Timarcha, Chrysolina e Cyrtonus representam os
grupos mais bem estudados quanto à evolução cariotípica (Petitpierre et al. 1993; Petitpierre
1999; Petitpierre e Garnería 2003; Gómez-Zurita et al. 2004; Petitpierre e Elgueta 2006). Em
Timarcha, dentre as 37 espécies analisadas, ocorre uma variação de número diplóide de 2n=18-
44 sendo a condição cariotípica 2n=20 (9II+Xyp) considerada ancestral para o gênero (Petitpierre
1976; Gómez-Zurita et al. 2004). Segundo Petitpierre (1970), o padrão de evolução
cromossômica em Timarcha revela a ocorrência de aumento do número diplóide. Dados recentes
de Gómez-Zurita et al. (2004) contrapõem esse modelo de evolução e propõem que as fusões são
mecanismos representativos dentro do gênero. Na espécie T. aurichalcea, ocorre redução do
número diplóide de 2n=20 para 2n=18 e geração do mecanismo sexual neo-XY, devido a uma
fusão entre um par autossômico com o par sexual Xyp. Nas espécies T. marginicollis e T. rugosa,
ocorre a redução de 2n=28 para 2n=20 e 2n=26, respectivamente.
O gênero Chrysolina, com 400 espécies, representa o maior dentro da família
Chrysomelidae e possui 52 espécies estudadas citogeneticamente revelando o cariótipo modal
2n=24, Xyp e variação de 2n=20 a 2n=47 (Petitpierre e Segarra 1985; Petitpierre e Juan 1994;
Petitpierre 1999). Segundo Petitpierre (1983), as espécies com 2n=20 e 22 representam uma
condição apomórfica para o grupo, gerado por fusões cêntricas a partir de um cariótipo com
2n=24. Por outro lado, os números cromossômicos maiores que 24 descritos em C. sanguinolenta
(2n=34), C. gypsophilae (2n=32) e C. helopioides (2n=47) foram gerados a partir de fissões de
cromossomos grandes com dois braços gerando pares acrocêntricos (Petitpierre 1981; Petitpierre
1999).
Em espécies do gênero Cyrtonus, prevalece o número diplóide 2n=28, considerado
ancestral, sendo descrito em nove espécies estudadas. Nestas espécies com 28 cromossomos têm
22
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
sido observados apenas cromossomos metacêntricos. Apesar desta conservação cariotípica
descrita no gênero, foram relatadas espécies com 2n=40 (C. arcasi, C. fairmairei e C. puncticeps)
e uma espécie com 2n=46 (C. pardoi) que representa o maior numero diplóide para o grupo. O
cariótipo destas espécies com número diplóide superior a 2n=28 foram gerados a partir de fissões
cêntricas de cromossomos autossômicos com dois braços. Este modelo tem sido comprovado a
partir da observação de cromossomos telocêntricos/subtelocêntricos nas espécies com números
diplóides altos (Petitpierre et al. 1988; Petitpierre et al. 1993; Petitpierre e Garnería 2003).
Na família Tenebrionidae, com cerca de 200 espécies estudadas, predomina o número
diplóide 2n=20 e o mecanismo de determinação sexual Xyp, sendo observado em 65% das
espécies estudadas. Entretanto, algumas tribos desta família apresentam cariótipos modais
diferentes, como descrito nas tribos Akidini com 2n=16, neo-XY, Pimeliini com 2n=18, Xyp e
Blaptini com 2n>30 e mecanismos sexuais múltiplos (Juan e Petitpierre 1991). Em Blaptini, o
gênero Blaps possui 14 espécies estudadas e apresenta variação de 2n=19 (B. judeorum) a 2n=38
(B. gibba) e todos seus representantes possuem mecanismos sexuais múltiplos. As espécies B.
gigas e B. gibba possuem mecanismo sexual múltiplo com quatro e sete cromossomos X,
respectivamente (Vitturi et al. 1996). Foi proposto que a origem deste mecanismo múltiplo com
diversos cromossomos X ocorreu devido a translocações de seqüências de DNAr entre o
cromossomo Y e cromossomos autossômicos. Outro exemplo de diferenciação cromossômica em
Tenebrionidae foi relatado por Pons (2004) para o gênero Pimelia. Dados cromossômicos de 30
espécies revelaram alta conservação cariotípica para o gênero com 2n=18 (8II+Xyp), exceto para
quatro espécies, P. cribra, P. elevata e P. interjecta com 2n=20 (9II+Xyp) e P. sparsa com
2n=18,neo-XY. Estes dados sugeriram que o número diplóide 2n=18,Xyp seria modal para o
23
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
gênero e que a condição com 2n=20,Xyp seria derivada, contrapondo o cariótipo modal para
família Tenebrionidae (2n=20,Xyp).
Schneider et al. (2007) realizaram um estudo reunindo dados cariotípicos descritos na
literatura de 88 espécies pertencentes a quatro subfamílias de Elateridae (Agrypninae,
Cardiophorinae, Denticollinae, Elaterinae) e dados cromossômicos de mais cinco espécies
pertencentes à Agrypninae (Conoderus fuscofasciatus, C. rufidens e Conoderus sp) e Elaterinae
(Cardiorhinus rufilateris e Pomachilius sp). Estes dados permitiram traçar as principais
estratégias da diferenciação cariotípica para essa família. O cariótipo considerado primitivo para
Elateridae proposto por Smith e Virkki (1978) foi 2n=20,Xyp. A partir deste cariótipo rearranjos
dos tipos fusões e fissões entre autossomos, inversões pericêntricas e perda do y foram
responsáveis pela variação cariotípica dentro do grupo. Ocorre variação desde 2n=4
(Chalcolepidius zonatus) a 2n=23 (Dicrepidius), sendo 2n=4 o menor número diplóide observado
para a ordem Coleoptera (Ferreira et al. 1984; Schneider et al. 2007).
Em Elateridae a redução do número diplóide é um mecanismo comum. Entretanto nas
quatro subfamílias os padrões de diferenciação cromossômica são heterogêneos (Schneider et al.
2007). Na subfamília Agrypninae, redução do número diplóide foi observada em 97% das
espécies estudadas, decorrente de rearranjos do tipo fusão entre autossomos ou entre autossomos
e cromossomos sexuais. Na tribo Conoderini, têm sido observados rearranjos do tipo fusão,
inversões pericêntricas e perda do y, como descrito para as espécies Conoderus rufidens, C.
fuscofasciatus e Conoderus sp., assim como outras espécies do gênero e da tribo Conoderini com
2n=17,X0 (Smith e Virkki 1978; Schneider et al. 2006; Schneider et al. 2007). Cardiophorinae
apresenta padrões de evolução distintos de Agrypninae, possuindo espécies com números
diplóides maiores que 2n=20 e mecanismo sexual X0, decorrentes de fissão de pares
24
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
autossômicos e perda do cromossomo y. Fissão e fusão cêntricas, bem como perda do y também
foram relatados para a subfamília Denticollinae. Em Elaterinae, 85% das espécies estudadas
possuem cariótipo 2n=19,X0, sendo a perda do y a modificação cariotípica mais comum para o
grupo (Yadav e Vayas 1993; Schneider et al. 2007).
Para a família Scarabaeidae, cerca de 380 espécies foram estudas citogeneticamente,
predominando a descrição de número diplóide, mecanismo sexual e em menor escala morfologia
cromossômica. Dentre as 12 subfamílias de Scarabaeidae, as melhores caracterizadas são
Dynastinae, Melolonthinae, Rutelinae e Scarabaeinae. Esta família é considerada conservada
cariotipicamente, predominando o número diplóide primitivo de 2n=20 e o mecanismo sexual
Xyp que ocorrem em mais de 50% das espécies estudadas (Smith e Virkki 1978; Yadav e Pillai
1977, 1979; Moura et al. 2003; Bione et al. 2005a). Apesar desta conservação cariotípica em
Scarabaeidae, muitas espécies com cariótipos derivados foram descritas. Com relação ao número
diplóide ocorre uma variação de 2n=8 (Eurysternus caribaeus) a 2n=30 (Autoserica assamensis)
e diferentes mecanismos sexuais quiasmáticos (neo-XY, XY, Xy, Xyr) e aquiasmáticos (Xyp,
XYp, X0). Dentre estes mecanismos sexuais, merecem destaque o Xyp e o neo-XY que tem sido
encontrado em representantes pertencentes às quatro subfamílias melhor estudadas de
Scarabaeidae (Dasgupta 1977; Smith e Virkki 1978; Cabral-de-Mello et al. 2007). Para essa
família foram destacados cinco diferentes rearranjos cromossômicos envolvidos na sua
diferenciação cariotípica. Fusão autossomo-autossomo (A-A), fusão autossomo-cromossomo X
(A-X), perda do cromossomo y, fissão de autossomos e inversões pericêntricas (Yadav e Pillai
1979).
As fusões são responsáveis pela diminuição do número diplóide e também modificação
do mecanismo sexual quando este processo envolve os cromossomos sexuais. Dentre as
25
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
diferentes espécies que apresentam fusões do tipo A-A em Scarabaeidae destacam-se Macraspis
festiva (2n=18,Xyp), Isocopris inhiata (2n=18,Xyp), Oryctes nasicornis (2n=18,Xyp) e Autoserica
sp. (2n=18, Xyp). Nestas espécies, o número diplóide foi reduzido para 2n=18, entretanto, o
mecanismo sexual primitivo (Xyp) foi conservado (Smith e Virkki 1978; Bione et al. 2005a,b).
Nos casos de fusão do tipo A-X além da redução do número diplóide ocorre alteração do
mecanismo sexual como relatado em Haplidia etrusca (2n=18,neo-XY). Em geral, espécies que
apresentam fusão do tipo A-X também possuem fusões do tipo A-A, observado no gênero
Phanaeus como por exemplo em P. mexicanus e P. vindex (2n=12,neo-XY) e Deltochilum
valgum (2n=14,neo-XY) (Smith e Virkki 1978; Vidal 1984).
A perda do cromossomo y ocasiona a diminuição do número diplóide e a geração do
mecanismo sexual X0. Este processo de perda pode se dar a partir da translocação do
cromossomo y com algum elemento autossômico do cariótipo ou por eliminação deste
cromossomo ao longo das divisões celulares devido ao seu tamanho diminuto. As espécies
Aserica sp., Apogonia sp. e Pentodon Bidens punctatum sofreram este tipo de rearranjo e
apresentam cariótipos 2n=19,X0. A perda do cromossomo y não ocasiona irregularidades no
processo de segregação cromossômica, pois nas espécies com X0 o cromossomo X tem
mobilidade independente (Smith e Virkki 1978; Vitturi et al. 2003).
Por outro lado, as fissões cêntricas também observadas na família Scarabaeidae, resultam
em um aumento do número diplóide. Espécies com números diplóides maiores que 2n=20
provavelmente passaram por este processo de fissão, sendo geralmente possível observar em seus
cariótipos a presença de cromossomos autossomos com morfologia acrocêntrica como em
Aphodius moestus com 2n=22,Xyp e espécies do gênero Adorrhinyptia (2n=22,Xyp) (Yadav et al.
1979). A espécie Copris fricator apresenta cariótipo 2n=21,X0, decorrente provavelmente de
26
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
rearranjos cromossômicos do tipo fissão gerando o número diplóide 2n=22 e posteriormente a
perda do cromossomo y (Smith e Virkki 1978).
Inversões pericêntricas têm papel importante na variação da morfologia cromossômica em
diferentes grupos de insetos (White 1973; King 1993). Em Scarabaeidae, por exemplo, esse
rearranjo alterou a predominante morfologia meta e submetacêntrica, gerando cromossomos
acrocêntricos tanto no complemento autossômico como no par sexual (Yadav e Pillai 1979). Este
tipo de rearranjo foi observado por Bione et al. (2005a) nas espécies Diabroctis mimas e
Isocopris inhiata que apresentam cromossomos com morfologia acrocêntrica.
Em Isocopris inhiata, as inversões pericêntricas, além de gerarem cromossomos
acrocêntricos, representaram passos inicias para o processo de redução do número diplóide. Esta
redução provavelmente ocorreu a partir da fusão entre dois pares de autossomos originalmente
com dois braços, que passaram por processos incluindo inversões e posterior fusão entre os
mesmos (Bione et al. 2005a). Outras espécies pertencentes à Scarabaeidae, que apresentam
números diplóides reduzidos, sofreram inversões pericêntricas anteriores as fusões, como
observado em Macraspis festiva (2n=18,Xyp), Philerus sp. (2n=14,Xyp), Eurysternus caribaeus
(2n=8,XY) e Pelidnota sumptuosa (2n=18,Xyr). Além de estarem envolvidas no processo de
redução do número diplóide, em diferentes espécies, as inversões pericêntricas precedem a
formação de mecanismos sexuais derivados, como o neo-XY que é resultante de fusão entre
cromossomos autossomos e sexuais com morfologia acrocêntrica (Martins 1994; Bione et al.
2005b; Cabral-de-Mello et al. 2007).
27
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
2.3. Heterocromatina
2.3.1. Características e funções da heterocromatina como material genômico
Os genomas dos eucariotas superiores encontram-se empacotados em dois principais
componentes cromossômicos, a eucromatina e a heterocromatina. A eucromatina é composta pela
maioria dos genes estruturais e inclui seqüências de cópia única de poucas cópias e DNA
moderadamente repetitivo, micro e minisatélites. Ao longo das divisões celulares, este material
genômico sofre ciclos de condensação e descondensação, estando mais condensado nas metáfases
e menos nas intérfases, quando ocorre a expressão gênica (Wallrath 1998).
A heterocromatina por sua vez foi classificada em facultativa e constitutiva (Brown
1966). A heterocromatina facultativa corresponde a um estado de condensação do genoma de
algumas espécies apresentando diferenciação picnótica de condensação e ativação entre os
homólogos. Este tipo de comportamento tem sido observado em cromossomos X de mamíferos,
estando associado à ativação/ inativação diferencial do cromossomo X como mecanismo de
compensação de dose gênica neste cromossomo entre machos e fêmeas. Em algumas espécies de
homópteros, a heterocromatinização facultativa é responsável pela determinação do sexo, onde
nos indivíduos machos todo o complemento cromossômico de origem paterna é
heterocromatinizado (Lyon 1999; Cowell et al. 2002; Sumner 2003).
A heterocromatina constitutiva (HC) corresponde ao material genômico rico em
seqüências moderadamente e altamente repetitivas, pobre em genes estruturais e que permanece
condensada ao longo de todo o ciclo celular, replicando tardiamente na fase S (John 1988). Sua
localização preferencial dentro dos genomas é nas regiões pericentroméricas e teloméricas dos
28
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
cromossomos, estando relacionada com a correta segregação dos homólogos e consequentemente
da informação genética nas divisões celulares (Wallrath 1998; Le et al. 2004).
São diversas as funções realizadas pela HC dentro dos diferentes genomas, tais como
pareamento e segregação de cromossomos homólogos, regulação da expressão gênica, repressão
da recombinação além de proteger o genoma de “elementos parasitas” como os retrotransposons
(Henikoff 2000; Hall et al. 2002). A regulação da expressão gênica relacionada à HC ocorre em
nível transcricional. Este fenômeno tem sido observado em diversos organismos, desde leveduras
de brotamento a mamíferos, sendo denominado de variegação por efeito de posição (PEV)
(Henikoff 2000; Dillon 2004). No gênero Drosophila o PEV foi descrito pela primeira vez por
Muller (1930) relacionado à coloração do olho. Este fenótipo é controlado pelo gene white que
perde sua expressão gênica quando localizado próximo a seqüências de HC pericentroméricas,
gerando indivíduos mosaicos (Wallrath 1998; Henikoff 2000; Dillon e Festenstein 2002; Dillon
2004).
A capacidade de defesa da HC em relação a elementos transponíveis foi observada em
Drosophila miranda. A invasão de retrotransposons em um cromossomo X ativo desta espécie,
faz com que o mesmo seja heterocromatinizado, inativando genes e gerando um cromossomo
neo-Y (Steinemann e Steinemann 1997; Henikoff 2000).
Defeitos na organização da HC pericentromérica ocasionam mau pareamento e
segregação entre cromossomos homólogos, devido à ausência das coesinas, proteínas que
estabelecem ligações entre os cromossomos (Dernburg et al. 1996; Peters et al. 2001; Grewal e
Jia 2007). Dernburg et al. (1996) realizaram um estudo relacionado à segregação de
cromossomos que não apresentam quiasmas em fêmeas de D. melanogaster. Neste estudo foi
observado que mesmo quando os cromossomos X e 4 não possuíam quiasmas entre seus
29
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
homólogos estes segregavam perfeitamente, evidenciando o papel da HC na segregação
cromossômica.
Quanto à sua composição a HC é formada por seqüências de DNA repetidas in tandem
que podem variar enormemente em composição (apresentando-se ricas em pares de bases A+T ou
G+C) e em quantidade de repetições (mostrando desde duas repetições a milhares). O processo
de diferenciação e aumento ou diminuição da quantidade de HC em um genoma está diretamente
relacionado à evolução do DNA satélite (DNAsat) (Hancock 1999; Sumner 2003). São
basicamente três os mecanismos relacionados à diferenciação do DNAsat: crossing over desigual
e conversão gênica, que ocasionam aumento ou diminuição da quantidade de DNAsat e também
sua homogeneização e replicação slippage, que ocorre devido a erros da polimerase no processo
de replicação, ocasionado aumento na quantidade de DNAsat. Além destes mecanismos o
DNAsat pode ser produzido e diferenciado através de mutações e posterior amplificação através
dos processos citados acima (Charlesworth et al. 1994; Hancock 1999; Ugarkovic e Plohl 2002).
Outros componentes essenciais na estruturação molecular da HC são as proteínas. Até o
momento foram identificadas mais de 30 proteínas que estão diretamente associadas à HC, das
quais a HP1 e suas homólogas merecem destaque por serem as melhores estudadas e encontradas
em diferentes organismos (Sumner 2003; Maison e Almouzni 2004). Esta proteína foi
primeiramente identificada em Drosophila apresentando-se em alta concentração nas regiões
centroméricas e de HC, enquanto as regiões eucromáticas são pobres da mesma. A HP1 é
formada por dois domínios, chromo domain, que é a região responsável por se ligar às regiões
heterocromáticas e chromo shadow domain, que se ligam proporcionando a formação de dímeros
desta proteína (Wallrath 1998; Sumner 2003; Maison e Almouzni 2004).
30
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Diversos estudos têm mostrado a importância da HP1 juntamente com as proteínas
histônicas, que compõem os nucleossomos, na montagem e funcionalidade da HC a partir da
interação com outros fatores protéicos. Um estudo realizado por Lohe e Hilliker (1995)
demonstrou que em embriões de Drosophila com HP1 não funcionais os cromossomos não
condensam perfeitamente e a segregação dos mesmos apresenta erros. Além disso HP1 contribui
diretamente no processo de silenciamento gênico e está ligada as regiões promotoras destes genes
(Nielsen et al. 2001; Huisinga et al. 2006; Grewal e Jia 2007).
Proteínas histônicas H1, H2, H3 e H4 e suas modificações pós-transcricionais são cruciais
na biologia da HC. As modificações mais comuns são a metilação e acetilação dos resíduos de
lisina das regiões amino terminais das histonas H3 e H4. A metilação das histonas atua no
recrutamento de diferentes proteínas que são essenciais para a HC e que promovem o
silenciamento gênico. A inatividade transcricional da HC também está relacionada à baixa
acetilação dos resíduos de histonas, que atuam no remodelamento da molécula de DNA
impedindo a acessibilidade dos fatores de transcrição (Grewal e Moazed 2003; Sumner 2003;
Martin e Zhang 2005).
2.3.2. Regiões heterocromáticas em Coleoptera
A heterocromatina constitutiva (HC) é um componente cariotípico bastante dinâmico,
variando em quantidade, localização e composição de pares de bases nos cromossomos (Wallrath
1998). Segundo King (1993), esta alta variabilidade está relacionada com o fato de que a adição
ou diminuição da HC nos cariótipos não reduz a fertilidade de indivíduos dentro de populações,
estando incluído nos rearranjos cromossômicos neutros ou adaptativos que são capazes de gerar
31
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
polimorfismos intraespecíficos. A variação genômica da HC, em geral, não está envolvida com o
processo de especiação, entretanto pode facilitar a fixação de rearranjos estruturais que são os
principais fatores no isolamento reprodutivo. De maneira geral a HC encontra-se localizada nas
regiões centroméricas e teloméricas dos cromossomos (King 1993; Wallrath 1998; Le et al.
2004).
Em Coleoptera, as técnicas mais utilizadas na caracterização da heterocromatina são o
bandeamento C, que permite identificar o padrão e a localização dos blocos de HC (Sumner,
1972); coloração com fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI), capaz de qualificar a HC
quanto à riqueza de pares de bases em AT (DAPI) ou GC (CMA3) (Schweizer, 1983); e em
menor escala a hibridização in situ fluorescente (FISH), que localiza famílias específicas de DNA
satélite componentes da HC (Moscone et al. 1996; Mravinac et al. 2004).
Na ordem Coleoptera tem-se registrado diversas famílias com pouca quantidade de HC
como Cerambycidae, Anthicidae, Chrysomelidae, Attelabidae e Curculionidae. Em contraste,
Elateridae, Cantharidae, Scarabaeidae e Tenebrionidae possuem espécies que apresentam grandes
blocos de HC no cariótipo (Pons 2004; Rozék et al. 2004; Bione et al. 2005a,b). Em geral,
representantes desta ordem apresentam predominantemente HC localizada na região
pericentromérica dos autossomos e em menor escala em regiões teloméricas ou intersticiais. No
cromossomo X a HC pode estar localizada na região centromérica ou distribuída ao longo do
cromossomo, enquanto o cromossomo y é frequentemente eucromático (Juan e Petitpierre 1989;
Rozék e Lachowska 2001; Rozék et al. 2004; Wilson e Angus 2005). Quanto à riqueza de pares
de bases, a HC neste grupo de organismos é bastante diversificada, apresentando espécies com
predominância de blocos ricos em AT, GC ou ainda ricos em AT e GC e também neutros
(Ugarkovic et al. 1996; Moura et al. 2003; Mravinac et al. 2004; Bione et al. 2005b).
32
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Dentro de Polyphaga cerca de 13 famílias possuem espécies estudadas em relação à
distribuição ou qualificação da HC. Dentre estas merecem destaque Curculionidae,
Tenebrionidae e Scarabaeidae por serem melhores caracterizadas (Juan e Petitpierre 1989;
Holecová et al. 2002; Pons 2004; Rozék et al. 2004; Bione et al. 2005b; Lachowska et al. 2006).
Segundo Holecová et al. (2002), a pequena quantidade de informações neste grupo está
relacionada à dificuldade de análise dos resultados, devido à alta condensação cromossômica nas
fases avançadas tornando os blocos de HC pouco visíveis ou não detectáveis.
Rozek et al. (2004) apresentaram dados cromossômicos de bandeamento C de 32 espécies
pertencentes a diferentes famílias como Elateridae, Cantharidade, Oedemeridae, Cerambycidae,
Anthicidae, Chrysomelidae, Attelabidae e Curculionidae. Dentre estas, as espécies pertencentes
às famílias Cerambycidae, Anthicidae, Chrysomelidae, Attelabidae e Curculionidae apresentaram
pequenos blocos de HC em regiões centroméricas de autossomos. Enquanto as espécies das
famílias Elateridae, Cantharidae e Oedemeridae mostraram grandes blocos de HC localizados em
regiões pericentroméricas dos autossomos. Em relação aos cromossomos sexuais o padrão nestas
três famílias foi mais variável, com as espécies, Adelocera murina (Elateridae) e Oedemera
podagrariae (Oedemeridae) apresentando bloco centromérico no X e y eucromático e Cantarsius
fusca (Cantharidae) com X e y completamente eucromático.
Os dados de bandeamento C descritos para Curculionidae apontam para uma pequena
quantidade de HC presente no genoma de representantes desta família, frequentemente não
detectável em fases avançadas das divisões celulares (Rozék et al. 2004; Lachowska et al. 2005).
Dentre as 40 espécies desta família analisadas através do bandeamento C, apenas 12 revelaram
blocos de HC pericentroméricos visíveis em cromossomos condensados. As tribos Cionini
(Cionus), Peritelini (Centricnemus), Phyllobiini (Phyllobius), Polydrusini (Liophloeus), Sitonini
33
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
(Sitona), Tanymecini (Tanymecus), Hyperini (Hypera viciae), Lixini (Larinus), Molytini
(Liparus) e Pissodini (Pissodes) têm como característica pequena quantidade de HC, geralmente
de difícil detecção. Em Ceutorhynchini (Nedyus), Cryptorhynchini (Acalles, Ruteria),
Otiorhynchini (Otiorhynchus), Polydrusini (Polydrusus), Brachyderini (Strophosoma),
Sciaphilini (Barypeithes) e Hyperini (Hypera postica) os blocos de HC tem tamanhos
relativamente maiores (Hsiao e Hsiao 1984; Holecová et al. 1997; Rozék e Holecová 2000;
Lachowska et al. 2004; Rozék et al. 2004; Lachowska et al. 2006). Segundo Lachowska et al.
(2004), os padrões de distribuição de HC encontrados em Curculionidae são características
particulares de cada gênero ou de tribos, sendo necessários mais estudos para elucidar padrões
evolutivos claros da HC na família como um todo.
Em Tenebrionidae, têm sido descritas diversas espécies com grande quantidade de HC nas
regiões cromossômicas pericentroméricas exceto do y (Juan e Petitpierre 1989). A porcentagem
de HC no genoma das espécies deste grupo varia de 20% a mais de 50% e os estudos com
enzimas de restrição e hibridização in situ têm mostrado que os blocos são compostos
principalmente de DNA satélite rico em AT (Juan et al. 1993; Pons et al. 2002). Segundo Pons
(2004) a grande quantidade de HC neste grupo pode ser um dos fatores que explica a baixa
variação do número diplóide devido à redução do processo de recombinação cromossômica.
A família Scarabaeidae possui 60 espécies estudadas através do bandeamento C e nove
através do uso de fluorocromos base-específicos (Tabela 1). A heterocromatina tem localização
preferencial em regiões pericentroméricas, entretanto, tem sido descritas espécies com blocos
intersticiais, teloméricos e com cromossomos difásicos apresentando um braço completamente
heterocromático e o outro eucromático. Em relação à riqueza de pares de bases esta família é
bastante heterogênea, com espécies mostrando blocos ricos em AT, GC e AT/GC ou neutros
34
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
(Moura et al. 2003; Wilson e Angus 2004; Bione et al. 2005a,b; Wilson e Angus 2005; Colomba
et al. 2006).
Dentre as subfamílias, Scarabaeinae é a melhor caracterizada com 30 espécies estudadas,
seguida de Aphodinae (16 espécies), Dynastinae (5 espécies), Cetoniinae, Melolonthinae e
Rutelinae cada uma com três espécies analisadas (Moura et al. 2003; Bione et al. 2005b; Wilson
e Angus 2005). Em Scarabaeinae o gênero Onthophagus é o melhor estudado até o momento com
11 espécies. Todas as espécies possuem cromossomos autossômicos com HC localizada na região
centromérica, apresentando variação apenas quanto ao tamanho do bloco. A espécie O. stylocerus
é a mais variável mostrando blocos centroméricos pequenos nos pares 1, 2, 4, 5, 6, 7 e 9, blocos
grandes no par 8 e o par 3 sem HC. Quanto aos cromossomos sexuais, no cromossomo X, em
geral, a HC está distribuída como pequenos blocos na região centromérica. Grandes blocos
centroméricos também têm sido detectados, como em O. hirtus, e blocos que se estendem ao
longo do braço curto, como observado em O. opacicollis. O cromossomo y apresenta blocos
centroméricos em dez das 11 espécies analisadas e apenas em D. gazella foi descrito um pequeno
bloco terminal (Wilson e Angus 2005).
Diabroctis mimas, Euoniticellus fulvus, Euonthophagus amyntas, E. atramentarius,
Helicopris gigas e Isocopris inhiata apresentam alguns de seus cromossomos difásicos, com um
braço totalmente heterocromático e o outro eucromático (Bione et al. 2005a; Wilson e Angus
2005; Angus et al. 2007). Na espécie E. atramentarius, a HC ocupa todo o braço curto dos
cromossomos 2 e 3 enquanto nas demais espécies a HC está no braço longo de diferentes
cromossomos (Wilson e Angus 2005). Blocos teloméricos foram relatados nas espécies Bubas
bison, Diabroctis mimas, Eucranium arachnoides e Isocopris inhiata e blocos paracentroméricos
35
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
ocorrem em Bolbites ornitoides, Bubas bubaloides, Diabroctis mimas e Isocopris inhiata (Vidal,
1980 apud Virkki, 1983; Bione et al. 2005a; Angus et al. 2007).
Polimorfismo interpopulacional quanto à localização de blocos de HC foi descrito em
Bubas bison. Uma população da Espanha estudada por Wilson e Angus (2005) apresentou
indivíduos com blocos apenas centroméricos enquanto nas populações da Sicília e Sardenha
blocos teloméricos adicionais foram observados em oito pares autossômicos (Colomba et al.
1996; 2006). A maior quantidade de HC descrita para Scarabaeidae ocorre em Helicopris gigas.
As seqüências eucromáticas ocorrem apenas em cerca de 20% dos cromossomos 1, 2, 4 e 8 e
10% dos cromossomos 3, 5, 6, 7 e 9. O cromossomo X é quase completamente heterocromático
mostrando uma porção de eucromatina semelhante a um gap no braço longo enquanto o y é
completamente heterocromático (Angus et al. 2007).
Estudos relacionados à qualificação da HC usando fluorocromos base específicos em
Scarabaeinae foram realizados em três espécies: Bolbites ornitoides, Bubas bison e
Gymnopleurus sturmi. Os padrões de riqueza de pares de bases foram contrastantes, enquanto G.
sturmi apresentou todos os blocos de HC CMA3+, B. ornitoides e B. bison possuem
predominância de pares de bases AT e apenas o cromossomo X de B. bison revelou dois
pequenos blocos no braço longo ricos em GC (Colomba et al. 1996; 2000; 2006).
Na subfamília Aphodinae apenas o genero Aphodius apresentou espécies analisadas onde
predominou localização da HC nas regiões centroméricas (Wilson e Angus, 2004; 2006).
Aphodius depressus e A. rufipes apresentaram blocos de HC nas constrições secundárias do
cromossomo 1 da primeira espécie e dos cromossomos 1, 2 e 5 da segunda. Cromossomos
difásicos foram descritos em Aphodius (Chilothorax) conspurcatus com braço longo totalmente
heterocromático nos pares 1, 5 e no X, enquanto os cromossomos 6-9 apresentaram HC ao longo
36
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
dos braços curtos. Na espécie Aphodius (Chilothorax) distinctus, o braço curto do par 5 foi
heterocromático, além disso os pares 1 e 2 não apresentaram blocos de HC (Wilson e Angus,
2004). Nas espécies pertencentes ao subgênero Agrilinus, predominou a HC centromérica e
paracentromérica. Blocos paracentroméricos foram observados em Aphodius (A.) ater, Aphodius
(A.) constans, Aphodius (A.) rufus e, variando de tamanho e localização nos diferentes
cromossomos (Wilson e Angus 2006).
Em Dynastinae, quatro espécies foram analisadas através do bandeamento C e duas com
uso dos fluorocromos base específicos. Lygirus ebenus, Pentodon Bidens punctatum e Strategus
Surinamensis hirtus apresentaram blocos pericentroméricos nos autossomos, e o X é quase
totalmente heterocromático em S. S. hirtus e em L. ebenus. Esta última espécie também
apresentou um pequeno bloco terminal em um par autossômico (Vituri et al. 2003; Bione et al.
2005b). Enema pan, estudada por Vidal e Giacomozzi (1978), possui blocos heterocromaticos
intersticiais e teloméricos. O CMA3 revelou blocos ricos em GC nas espécies Pentodon b.
punctatum e Strategus s. hirtus (Vituri et al. 2003; Bione et al. 2005b).
Blocos de heterocromatina constitutiva (HC) paracentroméricos e distais têm sido
observados em espécies pertencentes à subfamília Cetoninae. Grandes blocos foram descritos em
Jumnos ruckeri nos cromossomos 1-5 e no X, e em Epicometis hirta em todos os autossomos e
no X (Rozék e Lachowska 2001; Macaisne et al. 2006). Cetonia aurata, além de possuir blocos
pericentroméricos nos autossomos, possui HC distal nos cromossomos 1p, 1q, 2q, 3q, 5q, 6q, 7q,
8q e 9q, além do y completamente heterocromático (Dutrillaux et al. 2006).
As subfamílias Rutelinae e Melolonthinae representam grupos bastante conservados
quanto à distribuição da HC. Três espécies de Rutelinae analisadas, Geniates borelli, Macraspis
festiva e Pelidnota pallidipennis e três de Melolonthinae, Lyogenis fuscus, Phyllophaga
37
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
(Phyllophaga) prox. capillata e Phyllophaga (Phytalus) vestita apresentaram blocos
pericentroméricos de HC em todos os autossomos e os bivalentes sexuais foram quase totalmente
heterocromáticos (Moura et al. 2003; Bione et al. 2005b). Quanto à riqueza de pares de bases da
HC, estas duas subfamílias foram as melhores caracterizadas dentro de Scarabaeidae. Também
apresentaram maior variabilidade, com espécies mostrando todos os blocos de HC CMA3
positivos como em Geniates borelli (Bione et al. 2005b); blocos CMA3+ restritos a um bivalente
autossômico e ao par sexual tendo o restante do complemento com padrão neutro em
Phyllophaga (Phyllophaga) prox. capillata (Moura et al. 2003); DAPI positivo para todos os
blocos de HC em Lyogenis fuscus (Moura et al. 2003); Pelidnota pallidipennis apresentou blocos
ricos em GC (CMA3+) no bivalente sexual e em um par autossômico e blocos ricos em AT
(DAPI+) em oito pares autossômicos (Bione et al. 2005b); Phyllophaga (Phytalus) vestita possuiu
blocos de HC simultaneamente CMA3+ e DAPI+ (Moura et al. 2003).
Uma característica peculiar da HC descrita para algumas famílias de Coleoptera é sua
marcação diferencial quando submetida à coloração com nitrato de prata. Este fenômeno tem sido
descrito em representantes da família Chrysomelidae e superfamília Scarabaeoidea (Virkki e
Denton 1987; Moura et al. 2003; Bione et al. 2005a,b). Em Scarabaeidae 14 espécies
pertencentes à Dynastinae, Melolonthinae, Rutelinae e Scarabaeinae apresentaram blocos de HC
marcados pela prata, correspondendo ao mesmo padrão observado através do bandeamento C. Os
estudos têm mostrado que a afinidade dos sais de prata pela HC em Scarabaeidae não está
relacionada com a composição de pares de bases dos blocos heterocromáticos, ocorrendo em
espécies com blocos ricos em AT, Bubas bison e Pelidnota pallidipennis (Colomba et al. 1996;
Bione et al. 2005b), ricos em GC, Geniates borelli e Gymnopleurus sturmi (Colomba et al. 2000;
Bione et al. 2005b) e em espécies com HC neutra como Macraspis festiva (Bione et al. 2005b).
38
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Tabela 1. Padrão de distribuição e qualificação da heterocromatina constitutiva em representantes de Scarabaeidae.
Subfamília Espécie
2n Bandas C Fluorocromos Ref.
Aphodinae Aphodius depressus
20
bl.C em todos os cromossomos; bl.I adicional no par 1.
-
10
Aphodius luridus 20 bl.C nos autossomos e no X. - 10 Aphodius rufipes 20 bl.C nos autossomos e no X; bl.I
nos pares 1q, 2q e 5p. - 10
Aphodius (Nimbus) contaminatus
20 bl.C em todos os cromossomos. - 10
Aphodius (Chilothorax) conspurcatus
20 bl.C nos pares 2-4; cromossomos 1q, 5q, Xq, 6p, 9p e y totalmente heterocromáticos.
- 10
Aphodius (Chilothorax) distinctus
20 bl.C nos pares 3, 4, 6-9; par 5p totalmente heterocromático; pares 1 e 2 sem blocos de HC.
- 10
Aphodius (Chilothorax) lineolatus
20 bl.C nos pares autossômicos; X quase totalmente heterocromático.
- 10
Aphodius (Chilothorax) paykulli
20 bl.C grandes em todos os cromossomos.
- 10
Aphodius (Chilothorax) stricticus
20 bl.C pequenos nos autossomos e no X.
- 10
Aphodius (Agiolinus) lapponum
20 bl.C nos autossomos e no y; X quase totalmente heterocromático.
- 17
Aphodius (Agiolinus) ater 20 bl.Pa pequenos em todos os cromossomos; bl. grandes no braço longo dos cromossomos 1 e no X; cromossomo 1 polimórfico quanto ao tamanho da banda.
-
17
Aphodius (Agiolinus) constans 20 bl.C nos autossomos; bl.Pa ocupando metade do braço curto e do braço longo do cromossomo X.
- 17
Aphodius (Agiolinus) rufus 20 pares 3q-6q, 8q e 9q heterocromáticos; bl.Pa ocupando um terço dos pares 1p, 2p e 7p; bl.C no X; y totalmente heterocromático.
-
17
Aphodius (Planolinus) borealis 20
bl.C em todos os autossomos e no X; y totalmente heterocromático.
- 17
Aphodius (Planolinus) fasciatus
20 bl.C nos autossomos e no X; bl.Pa no Xq.
- 17
Aphodius (Planolinus) vittatus mundus
20 bl.C nos autossomos e no X. - 17
Cetoniinae Jumnos ruckeri
14 bl.Pa grandes nos pares 1-5 e no X; bl.C no par 6 e no Y.
-
16
39
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Cetonia aurata* 20 bl.Pe nos autossomos e no X; bl. distais em 1p, 1q, 2q, 3q, 5q, 5q, 7q, 8q e 9q; y totalmente heterocromático.
-
15
Epicometis hirta 20 bl.Pa nos autossomos e no X; y totalmente heterocromático.
- 7
Dynastinae Dynastes hercules hercules
18
19
Enema pan 18 bl.I e bl.T. - 1 Lygirus ebenus* 20 bl.Pe nos autossomos; bl.T em um
par autossômico; X quase totalmente heterocromático.
- 12
Pentodon bidens punctatum* 19 bl.Pe em todos os cromossomos. CMA3+; DAPI neutro. 9
Strategus surinamensis hirtus* 20 Bl. pericentroméricos em oito pares autossômicos; um par autossômico sem marcação; X quase completamente heterocromático.
CMA3+; DAPI neutro.
12
Melolonthinae Phyllophaga (Phytalus)vestita*
20 bl.Pe nos autossomos; bivalente sexual quase totalmente heterocromático.
CMA3
+; DAPI+; coloração DAPI mais intensa.
8
Phyllophaga (Phyllophaga) prox. capillata*
20 bl.Pe nos autossomos; bivalente sexual quase totalmente heterocromático.
CMA3+ no bivalente
sexual e num pequeno par autossômico; DAPI neutro.
8
Lyogenis fuscus* 20 bl.Pe nos autossomos; bivalente sexual quase totalmente heterocromático.
CMA3 neutro; DAPI+. 8
Rutelinae Geniates borelli*
20
bl.Pe nos autossomos; bivalente sexual quase totalmente heterocromático.
CMA3
+; DAPI neutro. 12
Macraspis festiva* 18 bl.Pe nos autossomos; bivalente sexual quase totalmente heterocromático.
- 12
Pelidnota pallidipennis* 20 bl.Pe nos autossomos; bivalente sexual quase totalmente heterocromático.
CMA3+ no bivalente
sexual e em um pequeno par autossômico; DAPI+ em oito pares autossômicos.
12
Scarabaeinae Bolbites ornitoides
20
bl.Pa em oito pares autossômicos; bl.Pe em um par autossômico.
DAPI+
2
Bubas bison* 20 bl.Pe em todos os cromossomos e teloméricos em 8 pares. (pop. da Sicília e Sardenha)/ bl.C pequenos em todos os cromossomos (pop. da Espanha).
DAPI+; X CMA3+.
5, 14/ 13
Bubas bubaloides 20 bl.C nos pares 1-4 e no X; bl.Pa nos pares 5-7; pares 8, 9 e y sem blocos de HC.
- 18
40
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Bubas bubalus 20 bl.C em todos os cromossomos; cromossomos B totalmente heterocromáticos.
- 18
Canthon muticus 20 Padrão complexo de distribuição. - 4 Copris hispanus 20 bl.C em todos os cromossomos. - 18 Copris lunaris 20 bl.C pequenos em todos os
cromossomos. - 18
Copris sinicus 14 bl.C nos autossomos e no X; y quase totalmente heterocromático.
- 18
Diabroctis mimas* 20 bl.Pa nos pares 2p, 4p e 7p; bl.T nos pares 1 e 3; X quase totalmente heterocromático.
- 11
Diginthophagus gazella 20 bl.C pequenos nos autossomos e no X; bl.T no cromossomo y.
- 13
Eucranium arachnoides 20 bl.Pe nos pares 2-8; bl.T nos pares 4, 6, 8 e no X; par 1 e y sem marcação.
- 3
Euoniticellus fulvus 20 bl.C em todos os cromossomos; par 6q totalmente heterocromático.
- 13
Euonthophagus amyntas 20 pares 4q, 5q,8q e Xq heterocromáticos.
- 13
Euonthophagus atramentarius 20 pares 2p e 3p heterocromáticos. - 13 Gymnopleurus geoffroyi 20 bl.C na maioria dos cromossomos. - 18 Glyphoderus sterquilinus 18 bl.Pe nos pares 1, 3-8; par 2 e
bivalente sexual sem marcação. - 3
Gymnopleurus sturmi* 20 bl.Pe nos pares 1, 2 e 4 e no cromossomo 3a; bl.St nos pares 6-9 e no X; bl.C em 5 e 3b.
CMA3+; DAPI neutro.
6
Helicopris gigas 20 cromossomos autossômicos e X quase totalmente heterocromáticos; y totalmente heterocromático.
- 18
Isocopris inhiata* 18 bl.Pa nos pares 3p-5p e 7p; bl.T no par 6; X quase totalmente heterocromático.
- 11
Onthophagus albicornis 20 bl.C grandes em todos os cromossomos.
- 13
Onthophagus hirtus 20 bl.C em todos os autossomos; X com bl.C maior que os autossomos.
- 13
Onthophagus joannae 20 bl.C nos autossomos e no X. - 13 Onthophagus lucidus 20 bl.C em todos os cromossomos. - 13 Onthophagus opacicollis 20 bl.C nos autossomos e no y; X com
bl.C se estendendo ao longo do braço curto.
- 13
Onthophagus ovatus 20 bl.C em todos os cromossomos. - 13 Onthophagus ruficapillus 20 bl.C pequenos em todos os
cromossomos. - 13
Onthophagus similis 20 bl.C nos autossomos e no X; pequeno bl. no cromossomo y.
- 13
Onthophagus stylocerus 20 bl.C pequenos nos pares 1, 2, 4-7 e 9; par 3 sem marcação; bl.C grande no par 8.
- 13
41
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Onthophagus vacca 20 bl.C pequenos nos pares autossômicos e no X; bl.C grande no cromossomo B.
- 13
Scarabaeus laticollis 20 bl.C em todos os autossomos e no X; y quase totalmente heterocromático.
- 18
bl.: bloco; HC: heterocromatina constitutiva; bl.C: bloco(s) centromérico(s); bl.I: bloco(s) interticial(is); bl.Pa: bloco(s) paracentromérico(s); bl.Pe: bloco(s) pericentromérico(s); bl.T: bloco(s) terminal(is)/telomérico(s); bl.St: bloco(s) subtelocêntrico(s); -: dados não descritos. Dados compilados de Vidal e Giacomozzi, 1978 (1); Vidal, 1980 apud Virkki, 1983 (2); Vidal e Nocera, 1984 (3); Vidal e Henerstrosa, 1984 (4); Colomba et al., 1996 (5); Colomba et al., 2000 (6); Rozek et al., 2001 (7); Moura et al., 2003 (8); Vituri et al., 2003 (9); Wilson e Angus, 2004 (10); Bione et al., 2005a (11); Bione et. al., 2005b (12); Wilson e Angus, 2005 (13); Colomba et al., 2006 (14); Dutrillaux et al., 2006 (15); Macaisne et al., 2006 (16); Wilson e Angus, 2006 (17); Angus et al., 2007 (18); Dutrillaux et al. 2007 (19). Nota: (*) espécies que apresentaram marcação da heterocromatina constitutiva através do nitrato de prata. 2.4. Padrões de distribuição das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) e sítios de
DNAr em Coleoptera
O nucléolo é uma estrutura subnuclear observada nas células de organismos eucariotas
sendo responsável pelo armazenamento do RNA ribossomal (RNAr) e pela biogênese dos
ribossomos (Busch e Smetana 1970; Hadjiolov 1985; Raska et al. 2004). Esta estrutura ocupa
porção considerável dentro do núcleo, sendo muito variável, dependendo da espécie, tipo de
célula e estado fisiológico da mesma (Gerbi 1997). O nucléolo é formado basicamente por duas
estruturas, o componente fibrilar denso (DFC) e o componente granular (CG). A primeira
estrutura contém os pré-RNAr e diversas proteínas, enquanto o CG é responsável pelo
armazenamento de ribonucleoproteínas que formam os ribossomos que irão migrar para o
citoplasma. Uma terceira estrutura, o centro fibrilar (FC), é geralmente observada em metazoários
superiores, tratando-se da zona de transcrição dos genes de pré-RNAr com localização entre o
DFC e o CG (Mosgoeller et al. 1998; De Cárcer e Medina 1999; Scheer e Hock 1999).
42
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Os genes necessários para a transcrição dos RNAr estão organizados em clusters de DNA
onde se localizam as seqüências 18S, 5.8S e 28S e espaçadores internos e externos. A transcrição
ocorre a partir da ação da enzima RNA polI, que sintetiza uma longa molécula, conhecida como
pré-RNAr, contendo informações do 18S, 5.8S, 28S e dos espaçadores. Esta molécula é
posteriormente clivada por ação de endonucleases e exonucleases antes e durante a formação das
subunidades do ribossomo (Xie e Rothblum, 1992; Tschochner e Hurt 2003; Raska et al. 2004).
As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) estão em geral localizadas nas constrições
secundárias dos cromossomos, que podem ser observadas a partir da coloração convencional.
Entretanto, esta técnica nem sempre é eficiente pelo fato deste marcador cromossômico poder se
encontrar localizado em regiões centroméricas, teloméricas ou em blocos de heterocromatina
constitutiva (HC) (Hsu et al. 1975; Sumner 1990). A presença das RONs associadas a seqüências
heterocromáticas tem sido relatada em diversas espécies, estando relacionada com a capacidade
das regiões ricas em HC de restringir a geração de quiasmas e conseqüente a recombinação (John
e King 1983; John et al. 1985). Além disso, a HC que flanqueia as RONs pode alterar a expressão
gênica ou facilitar a dispersão das mesmas (Arnold e Shaw 1985; Reed e Phillips 1995).
Em insetos, as RONs são importantes marcadores nos estudos de evolução cromossômica,
pois variam em número e localização, sendo estes padrões usualmente característicos de espécies
ou populações (Rufas et al. 1987; Bedo 1991; Bella et al. 1993). As técnicas mais utilizadas na
análise deste marcador citogenetico são a impregnação com nitrato de prata (AgNO3) e em menor
escala a hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNA ribossomal (DNAr). O
nitrato de prata identifica proteínas básicas, remanescentes da organização do nucléolo na
intérfase anterior dos clusters de DNAr transcricionalmente ativos (Rufas et al. 1987). Enquanto
a técnica de FISH, utiliza sondas de DNAr marcadas que são capazes de hibridizar com as
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
seqüências de DNA ribossomal, identificando todos os clusters de DNAr independente de sua
atividade trancricional (Moscone et al. 1996).
Na ordem Coleoptera os estudos relacionados às RONs com a coloração AgNO3 são
dificultados devido à rápida dissociação das proteínas remanescentes nucleolares. A ocorrência
de remanescentes nucleolares neste grupo de insetos tem sido observada no inicio da prófase
meiótica, entretanto, esta estrutura desintegra-se rapidamente e as proteínas se desagregam no
meio do diplóteno (Virkki et al. 1984; 1991). Além disso, a coloração com AgNO3 é capaz de
marcar regiões heterocromáticas em diferentes espécies de algumas famílias de Coleoptera, tais
como Scarabaeidae e Chrysomelidae (Virkki 1983; Drets et al. 1983; Virkki e Denton 1987;
Moura et al. 2003; Bione et al. 2005b). Tem sido também observada a afinidade dos sais de prata
pelo lúmen do bivalente sexual Xyp em representantes de Coleoptera, indicando a presença de
proteínas argirofílicas que, acredita-se, estão relacionadas com a “adesividade” entre os
cromossomos sexuais, sendo responsáveis por controlar a disjunção destes cromossomos (Virkki
et al. 1990; 1991).
Os estudos sobre localização de RONs em Coleoptera indicam que a presença de um
autossomo como organizador nucleolar é característico para a ordem (Virkki 1983; Virkki et al.
1984; Colomba et al. 2000; Moura et al. 2003; Bione et al. 2005a,b). Entretanto, estes estudos
ainda são escassos e restritos principalmente a poucos representantes das famílias Chrysomelidae,
Cicindelidae, Elateridae e Scarabaeidae (Bione et al. 2005b; Proença et al. 2005; Almeida et al.
2006; Schneider et al. 2006). Em Chrysomelidae sete espécies foram estudadas quanto
àlocalização das RONs e todas apresentaram localização autossômica, podendo ser o par 1 ou o
par 5, estando ou não associadas às constrições secundárias (Postiglioni et al. 1990; 1991;
Petitpierre 1996; Almeida et al. 2006). Almeida et al. (2006) realizaram um estudo em Paranaita
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
opima e observaram que a RON nesta espécie está localizada no par 6, sendo marcante a presença
de uma constrição secundária neste bivalente. Além disso, a RON encontrou-se fortemente
marcada pelo CMA3 indicando a riqueza em pares de bases GC nas regiões intergênicas desta
sequência.
Em Cicindelidae tem-se observado a presença de grande número de sítios de DNAr nas
linhagens mais basais (Manticorini, Omini e Megacephalini) com localização restrita em pares
autossômicos (três ou quatro pares). Nas linhagens derivadas, como os representantes de
Cicindelini, os sítios de DNAr ocorreram em menor quantidade, podendo estar localizados
apenas nos autossomos, apenas nos cromossomos sexuais ou em ambos. Acredita-se que nesta
família exista uma tendência de redução na quantidade de sítios de DNAr acompanhada pela
transferência dos mesmos para os cromossomos sexuais (Proença e Galián 2003; Zacaro et al.
2004; Proença et al. 2004; 2005).
Dentre os representantes de Elateridae apenas cinco espécies foram analisadas com a
coloração AgNO3 (Virkki et al. 1984; Schneider et al. 2006). Schneider et al. (2006) analisaram
quatro espécies de Conoderus e observaram RONs localizadas predominantemente no par 2;
entretanto, variabilidade interespecífica de número e localização das RONs foi observada dentre
as espécies estudadas. RONs adicionais foram descritas no par 4 de C. dimidiatus e C. scalaris,
enquanto em C. ternarius foi observada marcação no par 1. Foi sugerido que esta variabilidade
provavelmente decorre de translocação total ou parcial dos sítios de DNAr.
Na família Scarabaeidae, 16 espécies pertencentes às subfamílias Cetoninae, Dynastinae,
Melolonthinae, Rutelinae e Scarabaeinae foram analisadas quanto aos padrões de distribuição das
RONs, através da coloração AgNO3, FISH ou ambas (Tabela 2) (Colomba et al. 2000; 2006;
Moura et al. 2003; Vituri et al. 2003; Bione et al. 2005a,b; Macaisne et al. 2006; Dutrillaux et al.
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
2007). Foram observados cinco diferentes padrões de localização de RONs nesta família, restrita
a um par autossômico (Bione et al. 2005b); restrita ao bivalente sexual localizada no cromossomo
X (Moura et al. 2003); restrita ao bivalente sexual com sítios de DNAr no cromossomo X e no Y
(Macaisne et al. 2006); localizadas em mais de um par autossômico (Colomba et al. 2006); RONs
em autossomos e no cromossomo X (Bione et al. 2005b).
Tabela 2. Padrões de distribuição de RONs e sítios de DNA ribossomal (DNAr) em representantes de Scarabaeidae.
Subfamília Espécie
Prata FISH (DNAr 45S) Ref.
Rutelinae Geniates borelli
Xyp
crom X.
5
Macraspis festiva Xyp crom X. 5 Pelidnota pallidipennis Xyp crom X. 5 Dynastinae Dynastes hercules Hercules
neo-XY
-
9
Lygirus ebenus 1 par aut - 5 Pentodon bidens punctatum - crom X. 3 Strategus surinamensis hirtus Xyp - 5 Scarabaeinae Bubas bison
-
8 cromossomos.
6
Diabroctis mimas Xyp 2 pares aut; crom X. 4 Gymnopleurus sturmi - 4/5 sítios em crom médios. 1 Isocopris inhiata Xyp 1 par aut. 4 Melolonthinae Lyogenis fuscus
Xyp
crom X.
2
Phyllophaga (Phyllophaga) prox. capillata 1 par aut 1 par aut. 2 Phyllophaga (Phytalus) vestita Xyp crom X. 2 Cetoninae Cetonia aurata
1 par aut
-
8
Jumnos ruckeri neo-XY - 7 Protaecia (Potosia) opaca 1 par aut - 8
aut: autossomo; crom X: cromossomo X; -: dados não descritos. Dados de Colomba et al. 2000 (1); Moura et al. 2003 (2); Vituri et al. 2003 (3); Bione et al. 2005a (4); Bione et al. 2005b (5); Colomba et al. 2006 (6); Macaisne et al. 2006 (7); Dutrillaux et al. 2007 (8); Dutrillaux et al. 2007 (9).
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Na subfamília Cetoninae a análise das RONs se restringiram a utilização da técnica de
coloração com nitrato de prata (AgNO3) e apenas três espécies foram descritas até o momento.
Cetonia aurata e Protaecia (Potosia) opaca possuem RON localizada em um par autossômico,
entretanto, a localização deste marcador é distinta nestas espécies. Em Cetonia aurata a RON
está localizada no braço curto de um dos pares autossômicos, enquanto em Protaecia (Potosia)
opaca a RON ocupa região intercalar de um autossomo submetacêntrico (Dutrillaux et al. 2007).
Em contraste, com estas duas espécies, Jumnos ruckeri possui RON localizada no bivalente
sexual neo-XY, com duas seqüências em ambos os braços do cromossomo X e uma na região
proximal do braço longo do Y (Macaisne et al. 2006).
Em Dynastinae e Rutelinae, foram estudadas sete espécies, das quais seis foram
analisadas pela técnica com AgNO3 e quatro através da FISH. Bione et al. (2005b) analisaram
cinco espécies Geniates borelli, Macraspis festiva, Pelidnota pallidipennis (Rutelinae), Lygirus
ebenus e Strategus surinamensis hirtus (Dynastinae). Através da técnica de coloração com nitrato
de prata, todas apresentaram RONs localizadas no bivalente sexual, exceto em Lygirus ebenus
onde a RON ocupa um par autossômico. A técnica de FISH confirmou os resultados obtidos nas
espécies de Rutelinae, indicando o cluster de DNAr no cromossomo X. Pentodon bidens
punctatum, analisada através da FISH, também apresentou RON no cromossomo X (Vituri et al.
2003). Moura et al. (2003) analisaram três espécies de Melolonthinae Lyogenis fuscus e
Phyllophaga (Phytalus) vestita mostraram RON restrita ao par sexual com localização no
cromossomo X, enquanto Phyllophaga (Phyllophaga) prox. capillata revelou marcação em um
bivalente autossômico, tanto através da análise com nitrato de prata como através da FISH.
Apenas as espécies Bubas bison, Diabroctis mimas, Gymnopleurus sturmi e Isocopris
inhiata, pertencentes à Scarabaeinae possuem dados quanto à quantidade e à localização das
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
RONs. Os padrões observados nesta subfamília são os mais variáveis dentro de Scarabaeidae,
com as quatro espécies analisadas apresentando padrões distintos (Bione et al. 2005a; Colomba et
al. 2000, 2006). Bione et al. (2005a) estudaram as espécies Diabroctis mimas e Isocopris inhiata
através do nitrato de prata e da FISH. O nitrato de prata revelou massas amorfas correspondentes
a proteínas argirofílicas no bivalente sexual Xyp nas duas espécies, entretanto a FISH contrapôs
este resultado indicando a presença de clusters de DNAr em um bivalente autossômico de
Isocopris inhiata e de dois bivalentes autossômicos e no cromossomo X de Diabroctis mimas.
Gymnopleurus sturmi apresentou polimorfismo intrapopulacional quanto à quantidade e ao
tamanho dos clusters de DNAr, apresentando indivíduos com quatro ou cinco sítios de DNAr
com tamanhos distintos indicados pela FISH (Colomba et al. 2000). Colomba et al. (2006)
analisaram a espécie Bubas bison com a técnica de FISH e identificaram a presença de oito sítios
de DNAr, nas regiões heterocromáticas distais de oito cromossomos, sendo a espécie com maior
quantidade de RONs observadas para Scarabaeidae.
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO
EVOLUÇÃO CROMOSSÔMICA EM TRÊS ESPÉCIES DE DELTOCHILUM
(COLEOPTERA: SCARABAEIDAE: SCARABAEINAE)
Manuscrito a ser encaminhado a revista
CHROMOSOME RESEARCH
ISSN 1573-6849
66
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Evolução cromossômica em três espécies de Deltochilum (Coleoptera: Scarabaeidae:
Scarabaeinae)
D.C. Cabral-de-Mello1,2, R. Carvalho3, R.C. Moura2 & M.J. Souza1 *
1Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas/CCB, Universidade Federal de
Pernambuco/UFPE, Av. Professor Moraes Rego, s/n, CEP 50670-901, Recife, Pernambuco,
Brazil; (Phone: +55-81-21268520, e-mail: [email protected]);
2Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas/ICB, Universidade de
Pernambuco/UPE, Recife, Pernambuco, Brazil;
3Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco/UFRPE, Recife,
Pernambuco, Brazil.
Título resumido: Evolução cromossômica em Deltochilum
*Autor para correspondência: Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Av. Prof. Moraes do Rego S/N, Cidade Universitária, CEP: 50732 -970, Recife, Pernambuco, Brasil. Fone: +55 81 21268520; e-mail: [email protected]
67
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Resumo
Neste trabalho, foram analisados cromossomos mitóticos e meióticos das espécies Deltochilum
irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum (Scarabaeinae) através da coloração convencional,
bandeamento C, impregnação com nitrato de prata (AgNO3), fluorocromos base específicos e
FISH. Deltochilum irroratum e D. morbillosum apresentaram 2n=14,neo-XY, enquanto D.
verruciferum possui 2n=20,XYp. As três espécies apresentaram cromossomos meta-
submetacêntricos. A análise da heterocromatina constitutiva (HC) revelou predominantemente
cromossomos difásicos nas três espécies, com ocorrência de braços longos heterocromáticos em
D. irroratum e D. morbillosum e de braços curtos em D. verruciferum. A impregnação com
AgNO3 marcou as seqüências correspondentes a HC em D. morbillosum e D. verruciferum. Nesta
última espécie o lúmen do bivalente sexual também foi marcado. Em D. irroratum a impregnação
AgNO3 evidenciou apenas a HC dos autossomos difásicos. A coloração com CMA3 e DAPI
revelou blocos de HC ricos em GC na espécie D. verruciferum. Em D. irroratum apenas os
cromossomos difásicos mostraram blocos CMA3+, enquanto em D. morbillosum as sequências
ricas em GC estão restritas as regiões terminais do braço longo dos pares 1, 2 e do X. Em D.
morbillosum e D. verruciferum a FISH identificou sítios de DNAr em dois pares autossômicos e
no cromossomo X. A utilização destas técnicas permitiu a localização de marcadores
citogenéticos e a análise dos possíveis rearranjos envolvidos ao longo da diferenciação cariótipica
destas espécies.
Palavras-chave: cariótipo, heterocromatina constitutiva, DNAr, meiose, evolução cromossômica.
68
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Introdução
A subfamília Scarabaeinae pertencente à família Scarabaeidae representa um grupo
cosmopolita com 12 tribos, cerca de 234 gêneros e 5000 espécies, das quais 618 ocorrem no
Brasil. O gênero Deltochilum pertence à tribo Canthonini e possui 80 espécies ocorrentes no
mundo, das quais 52 foram registradas para o Brasil até o momento (Hansky & Cambefort 1991,
Vaz-de-Mello 2000).
Citogeneticamente 113 espécies pertencentes à subfamília Scarabaeinae foram analisadas,
sendo os estudos em geral restritos à utilização da coloração convencional, com descrição do
número diplóide, mecanismo de determinação sexual e, com menor freqüência, morfologia
cromossômica. O cariótipo mais comum para o grupo é 2n=20,Xyp com predominância de
cromossomos com dois braços. Apesar desta conservação cariotípica, foram observadas variações
do número diplóide de 2n=8 (Eurysternus caribaeus) a 2n=24 (Tiniocellus spinipes) e seis
mecanismos de determinação do sexo, Xy, Xyp, XY, Xyr, neo-XY e X0, devido a diferentes
rearranjos cromossômicos, tais como, fissões, fusões autossomo-autossomo, fusões autossomo-X,
perda do y e inversões (Smith & Virkki 1978, Yadav e Pillai, 1979; Yadav et al. 1979, Vidal
1984, Bione et al. 2005a, Wilson & Angus 2005, Angus et al. 2007, Cabral-de-Mello et al.
2007). Para a tribo Canthonini, apenas oito espécies foram descritas, com predominância do
número diplóide 2n=18 e mecanismo sexual Xyp, ocorrente nas quatro espécies dp gênero
Cantochilum estudadas. Por outro lado, a espécie Deltochilum valgum apresenta 2n=14,neo-XY
(Smith & Virkki 1978, Vidal 1984).
Técnicas citogenéticas diferenciais, tais como bandeamento C, coloração com nitrato de
prata (AgNO3), fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI) e hibridização in situ fluorescente
69
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
(FISH) foram utilizadas em 30 espécies de Scarabaeinae (Colomba et al. 1996, 2000, 2006,
Bione et al. 2005a, Wilson & Angus 2005, Angus et al. 2007). O padrão mais comum de
localização da heterocromatina constitutiva (HC) nesta subfamília, assim como em Scarabaeidae,
é a ocorrência de blocos pericentroméricos. Em menor escala tem sido descritos padrões de
distribuição da HC em regiões intersticiais, teloméricas e com cromossomos difásicos (Moura et
al. 2003, Wilson & Angus 2005, Bione et al. 2005a, b, Angus et al. 2007). A análise de três
espécies de Scarabaeinae com fluorocromos base específicos mostrou HC heterogênea quanto à
composição dos pares de bases AT e GC (Colomba et al. 1996, 2000, 2006). Quanto à
organização dos sítios de DNAr foram descritos dados de quatro espécies, com padrões bastante
heterogêneos, com variação de um a oito sítios localizados em cromossomos autossômicos ou no
cromossomo X (Colomba et al. 2000, 2006, Bione et al. 2005a).
No presente trabalho, foram analisadas citogeneticamente três espécies do gênero
Deltochilum através de técnicas citogenéticas convencionais, diferenciais e moleculares com o
objetivo de descrever suas características cromossômicas bem como realizar uma análise
comparativa com outras espécies de Scarabaeidae, buscando inferir sobre os padrões de evolução
cromossômica para o grupo.
Matérias e Métodos
Foram analisados 59 individuos machos de Deltochilum (Deltohyboma) irroratum
(Laporte, 1840), 24 de D. (Deltohyboma) morbillosum Burmeister, 1848 e seis de D.
(Calhyboma) verruciferum Felsche, 1911 coletados em diferentes áreas do estado de
Pernambuco, região Nordeste do Brasil (Tabela 1). As células analisadas foram obtidas a partir
70
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
de folículos testiculares fixados em Carnoy (3:1, etanol:ácido acético) e as preparações
citológicas foram feitas através da técnica clássica de esmagamento coradas com orceína lacto-
acética a 2%. O bandeamento C foi realizado a partir do método descrito por Sumner (1972), a
coloração com nitrato de prata foi realizada de acordo com Rufas et al. (1987) e a dupla
coloração com fluorocromos CMA3/DA e DA/DAPI seguiu o protocolo descrito por Schweizer et
al. (1983).
A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada segundo Moscone et al. (1996)
utilizando sonda de DNAr 45S de Arabidopsis thaliana, marcada atraves de nick translation com
digoxigenina e detectada com anticorpo anti-digoxigenina produzido em ovelha e ligado ao
fluorocromo FITC. O sinal de hibridização foi amplificado a partir do uso do anticorpo anti-IgG
de ovelha produzido em coelho FITC conjugado (Dako). As preparações foram contra coradas
com DAPI (2μg/ml) e montadas com Vectashield H-1000 (Vector). As células foram
fotografadas no sistema de captura de imagens Cytovision acoplado ao microscópio Olymplus
BX51 e as pranchas foram organizadas no programa Corel Photo-Paint 12.
Resultados
Coloração convencional
Deltochilum irroratum e D. morbillosum apresentaram cariótipos similares com 2n=14, sistema
sexual do tipo neo-XY e cromossomos meta-submetacêntricos (figura 1a-d). Os cariótipos são
simétricos com redução gradual do tamanho dos cromossomos, exceto para o X e o Y (figura
1a,c). Em D. verruciferum o cariótipo observado foi 2n=20,XYp com oito pares autossômicos
71
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
submetacêntricos, um metacêntrico e os sexuais X e Y submetacêntricos (figura 1e,f). Os
cromossomos sexuais desta espécie possuem tamanho similar e se associam nas metáfases I
através das regiões terminais dos dois braços do X e do braço curto do Y gerando o mecanismo
XYp (figura 1e).
Bandeamento C e Coloração com nitrato de prata
A análise da heterocromatina constitutiva (HC) revelou em D. irroratum e D. morbillosum os
quatro primeiros pares autossômicos e o cromossomo X difásicos, com blocos de HC se
distribuindo por todo braço longo. Os pares 5 e 6 apresentaram HC pericentromérica e o Y se
mostrou quase totalmente heterocromático (figura 2a,b,d e 5a,b). Em D. verruciferum, o padrão
de distribuição da HC observado foi mais complexo. Os pares de 1 a 6 foram difásicos, com a HC
localizada no braço curto; o par 7 mostrou blocos de HC no braço curto e na região proximal do
braço longo; o par 8 apresentou bloco centromérico e o par 9 ausência de HC. O cromossomo X
foi totalmente heterocromático e o Y difásico, com HC localizada no braço longo (figura 2f e 5c).
Células C-bandeadas foram utilizadas para análise da frequência de quiasmas. A observação de
35 células em metáfase I por espécie revelou a presença de apenas um quiasma nos cromossomos
difásicos. Os cromossomos com blocos de HC pericentroméricos em D. irroratum e D.
morbillosum apresentaram dois quiasmas. Em D. verruciferum, o par 8, com HC
pericentromérica, apresentou um quiasma em 43% das celulas analisadas e dois em 57%,
enquanto o par 9, sem HC, em 14% das células mostrou dois quiasmas e em 86% apenas um. A
coloração com nitrato de prata não foi eficiente na marcação das regiões organizadoras de
nucléolo (RONs), entretanto os sais de prata apresentaram afinidade pelos blocos de HC. Em D.
72
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
morbillosum e D. verruciferum a coloração com AgNO3 revelou o mesmo padrão observado
através do bandeamento C (figura 2e,g), enquanto em D. irroratum esta coloração marcou apenas
a HC localizada nos quatro pares autossômicos difásicos (figura 2c). Além disso, nas metáfases I
de D. verruciferum foi observada marcação do lúmen do bivalente sexual XYp, evidenciando a
presença de proteínas argirofílicas na associação deste bivalente (figura 2g).
Fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI) e Hibridização in situ Fluorescente (FISH)
Através da dupla coloração CMA3/DA foi possível identificar blocos de heterocromatina
constitutiva (HC) CMA3+ nas três espécies (figura 3a,c,e e 5a,b,c), enquanto a coloração com
DA/DAPI não revelou nenhuma marcação (figura 3b,d,f). Todos os blocos de HC de D.
verruciferum possuem seqüências ricas em GC (figura 3e e 5c). Em D. irroratum os
cromossomos difásicos e o X e Y também apresentaram blocos de HC ricos em GC (figura 3a e
5a). Enquanto em D. morbillosum, a coloração com CMA3 marcou apenas as regiões terminais de
dois pares autossômicos e do cromossomo X, não possuindo riqueza específica no restante da HC
(figura 3c e 5b). A FISH identificou sítios de DNAr 45S nos pares 1 e 2 e no cromossomo X das
três espécies (figura 4a-c e 5a-c). Em D. morbillosum e D. irroratum os sítios de DNAr estão
licalizados nas regiões terminais dos cromossomos e coincidem com os blocos CMA3+, revelando
que estes são ricos em seqüências GC (figura 4a, b e 5a, b). Enquanto em D. verruciferum os
sítios se localizam na região proximal do braço longo dos pares 1 e 2 e do braço curto do X
(Figura 4c e 5c).
73
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Discussão
As três espécies analisadas neste trabalho apresentaram cariótipos distintos do
considerado modal e primitivo para a família Scarabaeidae, 2n=20,Xyp. A presença de número
diplóide reduzido e do mecanismo de determinação sexual quiasmático neo-XY em Deltochilum
irroratum e D. morbillosum, surgiram provavelmente a partir de rearranjos cromossômicos do
tipo inversões pericêntricas, gerando cromossomos acrocêntricos, seguidas de fusões cêntricas
entre autossomos e fusão autossomo-X. A ocorrência de reduções cromossômicas devido à fusão
cêntrica tem sido observada em outras espécies de Scarabaeidae. Estes rearranjos podem envolver
os cromossomos sexuais gerando o mecanismo quiasmático neo-XY, como observado em D.
valgum (Vidal 1984) com 2n=14,neo-XY ou envolver apenas cromossomos autossômicos,
conservando o mecanismo primitivo Xyp, como em Isocopris inhiata (Bione et al. 2005a),
Macraspis festiva (Bione et al. 2005b) e algumas espécies do gênero Dichotomius, todas com
2n=18,Xyp (Vidal 1984). Segundo Yadav & Pillai (1979) além de fusões e inversões, as fissões
cêntricas e a perda do cromossomo y estão envolvidos na diferenciação cariotípica de diferentes
espécies desta família.
Deltochilum verruciferum possui o número diplóide modal descrito para Scarabaeidae,
assim como para ordem Coleoptera (2n=20); entretanto, o mecanismo sexual pára-quedas
registrado nesta espécie difere do mais comum para o grupo por apresentar os cromossomos
sexuais X e Y de tamanhos similares (XYp). Este mecanismo é incomum em Coleoptera, tendo
sido registrado em Scarabaeidae na espécie Phyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata (Moura et
al. 2003). Segundo Mesa & Fontanetti (1985) existem duas possibilidades para a ocorrência do
mecanismo XYp: (1) seria um estágio inicial na origem do Xyp no qual os cromossomos possuem
74
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
tamanhos similares ou (2) este sistema tem origem a partir de um Xyp por adição de HC no
cromossomo y.
A presença de cromossomos difásicos nas três espécies sugere a ocorrência de
amplificação da HC através de múltiplas duplicações de um pequeno segmento de DNA
repetitivo e/ou por transferência de heterocromatina entre os cromossomos não homólogos ao
longo da diferenciação cariotípica das mesmas. Este mecanismo de evolução de seqüências de
DNA repetitivo é comum em diversos grupos de organismos, gerando polimorfismos intra e
interespecíficos (White 1973, Schweizer & Loidl, 1987, Mantovani et al. 2000, Sumner 2003,
Loreto et al. 2005, Fregonrzi et al. 2006).
Grandes quantidades de HC nos genomas de coleópteros foram registradas em espécies
pertencentes à família Tenebrionidae e em algumas espécies de Scarabaeidae. Bione et al.
(2005a) relataram a presença de cromossomos difásicos nas espécies Isocopris inhiata e
Diabroctis mimas. Em Jumnos ruckeri, espécie que possui redução do número diplóide para
2n=14 e mecanismo sexual neo-XY, Macaisne et al. (2006) observaram grandes blocos de
heterocromatina representando cerca de 60% de todo seu cariótipo. Helicopris giga, estudada por
Angus et al. (2007), apresentou HC distribuída nos braços longos e parte dos braços curtos de
todos os autossomos, enquanto o cromossomo X é quase completamente heterocromático e o y é
inteiramente heterocromático. Apesar desta variabilidade quanto ao padrão, quantidade e
localização dos blocos de heterocromatina nas espécies relatadas acima, em Scarabaeidae, assim
como em Coleoptera, é comum a presença de blocos de HC restritos a regiões centroméricas dos
cromossomos (Juan & Petitipierre 1989, Moura et al. 2003, Wilson & Angus 2004, Rozek et al.
2004, Bione et al. 2005b, Angus et al. 2007).
75
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
A presença de apenas um quiasma no pareamento dos cromossomos autossômicos
difásicos na metáfase I das espécies analisadas neste trabalho pode estar diretamente relacionada
à presença de grandes blocos de HC em um dos braços cromossômicos. No gênero Chilocorus,
que também apresenta espécies com cromossomos difásicos, foi observada uma distribuição de
quiasma similar (Smith & Virkki 1978). Segundo John (1990) em geral o crossing-over é ausente
nas regiões de heterocromatina, estando esta ausência associada à não formação dos complexos
sinaptonêmicos nestas regiões. Virkki & Santiago-Blay (1993) sugeriram que em algumas
espécies de Oedionychina (Chrysomelidae) a ausência de quiasmas em um dos braços
cromossômicos ocorre devido a diferentes rearranjos estruturais nos mesmos.
A coloração com nitrato de prata em representantes de Scarabaeidae não tem sido
eficiente na identificação das RONs. Neste grupo de organismos o íon de prata marca seqüências
de HC, como descrito em representantes das subfamílias Rutelinae (Geniates borelli; Bione et al.
2005b), Dynastinae (Lygirus ebenus; Bione et al. 2005b), Melolonthinae (Lyogenes fuscus;
Moura et al. 2003) e Scarabaeinae (Bubas bison; Colomba et al. 1996, 2000). Além disso, em
Coleoptera, o lúmen do bivalente sexual Xyp é fortemente marcado pela coloração AgNO3,
mesmo após a desintegração do material remanescente nucleolar e independente da presença de
sítios de DNAr neste bivalente, como evidenciado em algumas espécies de curculionídeos
estudadas por Virkki et al. (1990, 1991). Foi proposto que esta marcação ocorre devido à
presença de proteínas semelhantes às presentes no citoesqueleto cromossômico, estando
relacionadas à associação e correta segregação do Xyp na meiose.
A marcação de seqüências de heterocromatina, assim como a marcação do bivalente
sexual XYp observados neste trabalho após a coloração com AgNO3 estão de acordo com
resultados descritos na literatura. Entretanto, em D. irroratum e D. morbillosum o padrão de
76
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
marcação distinto observado pelo nitrato de prata sugere a presença de blocos de HC com
estrutura molecular diferente no cariótipo das mesmas e, além disso, indica origem independente
do sistema sexual neo-XY nestas espécies. Em D. verruciferum a marcação do lúmen do XYp
juntamente com o braço longo do cromossomo Y totalmente heterocromático sugerem a origem
deste sistema sexual a partir do sistema pára-quedas primitivo (Xyp), no qual o cromossomo y é
puntiforme. Isto ocorreu provavelmente a partir da amplificação da HC neste cromossomo,
corroborando uma das hipóteses propostas por Mesa & Fontanetti (1985) para origem do sistema
sexual XYp.
O uso dos fluorocromos base específicos CMA3 e DAPI em representantes de
Scarabaeidae tem revelado ampla heterogeneidade da HC neste grupo de organismos. Têm sido
descritas espécies com blocos de HC ricos em AT, como em Bubas bison (Colomba et al. 2006),
GC em Geniates borelli (Bione et al. 2005b), AT e GC em Phyllophaga (Phytalus) vestita
(Moura et al. 2003) ou neutros em Macraspis festiva (Bione et al. 2005b). Apesar da
predominância de blocos de HC ricos em pares de bases GC em D. irroratum, D. morbillosum e
D. verruciferum os padrões de marcação são distintos nas três espécies. A presença de blocos de
HC neutros e ricos em GC nas espécies D. irroratum e D. morbillosum indicam a presença de
famílias de DNA satélite distintas em seus genomas. Estas seqüências podem ter se originado a
partir de uma seqüência única em uma espécie ancestral que se diferenciou a partir do acúmulo
de mutações, como proposto na Library hypothesis (Fry & Salser 1977, Ugarkovic and Plohl
2002). Em D. verruciferum a ocorrência de toda heterocromatina rica em pares GC não exclui a
possibilidade da presença de diferentes famílias de DNA satélite em seu genoma. Diferentes
espécies de tenebrionídeos possuem blocos de HC ricos em pares de bases AT com a presença de
77
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
diversos DNAs satélites, como em espécies dos gêneros Pimelia, Palorus, Tribolium e Tenebrio
(Juan et al. 1993, Mravinac et al. 2002, Pons 2004).
As três espécies analisadas apresentaram o mesmo padrão de quantidade de sítios de
DNAr observados através da FISH. Entretanto, apesar destes sítios estarem localizados nos pares
1, 2 e no X estes se encontram em posições distintas nos mesmos. Este padrão é diferente do mais
frequentemente encontrado em Coleoptera, que consiste em apenas um par autossômico
organizador nucleolar. Nas três espécies de Deltochilum analisadas, possivelmente ocorreram
processos de amplificação, fissão, translocação e inversão envolvidos na dispersão das seqüências
de DNAr. Este mecanismo pode ter sido favorecido pela formação de cromocentros nestas
espécies, assim como observado em Diabroctis mimas (Bione et al. 2005a).
Os resultados do presente estudo compreendem as primeiras análises detalhadas de
cariótipos de representantes de Deltochilum, os quais mostram que apesar de pertencerem ao
mesmo gênero às três espécies mostraram peculiaridades em seus cariótipos quando analisadas a
partir de diferentes marcadores cromossômicos, indicando a ocorrência de distintos mecanismos
de diferenciação cromossômica. Os padrões cromossômicos apresentados nestas espécies não são
frequentemente encontrados em representantes da familia Scarabaeidae. Entretanto a marcação da
HC através da coloração AgNO3 tem sido comumente relatada nos representantes da família,
indicando a presença de uma classe específica de heterocromatina. Portanto são necessários
estudos mais detalhados destas seqüências visando uma melhor compreensão de sua composição
molecular e dos processos envolvidos na origem e diferenciação deste componente genômico.
78
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Agradecimentos
Os autores são gratos ao Msc. Fernando Augusto Barbosa Silva, pela identificação
taxonômica das espécies analisadas neste trabalho. O estudo foi apoiado pelo Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo a Ciência e
Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE).
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Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Número de espécimes
D. irroratum D. morbillosum D. verruciferum
Localidade
Coordenadas
27 05 Caruaru 8o17’00”S:35o58’34”W
03 20 Paudalho 7o53’48”S:35o10’47”W
29 04 Igarassu 7o50’03”S:34o54’23”W
01 Serra Talhada 7o59’31”S:38o17’54”W
Tabela 1. Espécimes de D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum analisadas, locais de
coleta e coordenadas geográficas.
84
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Figura 1. Coloração convencional de células mitóticas e meióticas em espécies do gênero
Deltochilum. (a) cariótipo de D. irroratum; (c) cariótipo de D. morbillosum; (b,d,e) metáfases I
de D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum, respectivamente; (f) metáfase II com o
cromossomo X de D. verruciferum. Observar em (e) as diferentes conformações do XYp na
metáfase I de D. verruciferum. Setas indicam os bivalentes sexuais. Barra=5μm.
85
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Figura 2. Bandeamento C e coloração com nitrato de prata nas três espécies estudadas. (a,b)
banda C no cariótipo e em metáfase I de D. irroratum; (d,f) metáfases I de D. morbillosum e D.
verruciferum coradas através do bandeamento C, respectivamente; Coloração com nitrato de
prata, evidenciando as seqüências de HC em metáfases I de (c) D. irroratum, (e) D. morbillosum
e (g) D. verruciferum. Note em (c) a ausência de marcação das seqüências de HC pelo nitrato de
prata nos pares 5, 6 e no neo-XY de D. irroratum, bem como em (g) a marcação do lúmen do
bivalente sexual XYp de D. verruciferum; Barra=5μm.
86
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Figura 3. Dupla coloração com fluorocromos base específicos CMA3/DA e DA/DAPI em
metáfases I de três espécies de Deltochilum, mostrando regiões de HC ricas em GC. (a,c,e)
coloração CMA3/DA em (a) D. irroratum, (c) D. morbillosum e (e) D. verruciferum; (b,d,f)
coloração DA/DAPI neutra em (b) D. irroratum, (d) D. morbillosum e (f) D. verruciferum; Em
(c) ocorrência de heteromorfismo no bivalente sexual neo-XY de D. morbillosum, com bloco
CMA3+ apenas no cromossomo X; Em (e) o asterisco indica o bivalente 7 com bloco proximal no
braço longo CMA3+, em destaque o cromossomo 7 em metáfase II. Setas indicam os bivalentes
sexuais; Barra=5μm. 87
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Figura 4. Hibridização in situ Fluorescente, evidenciando sítios de DNAr em bivalentes
meióticos, (a) D. morbillosum, (b) D. irroratum e (c) D. verruciferum; as setas indicam os
bivalentes sexuais com sítios de DNAr no cromossomo X; Barra=5μm.
88
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
Figura 5. Idiogramas mostrando o padrão de distribuição e qualificação da HC, a marcação da
HC pelo nitrato de prata e os sítios de DNAr em D. irroratum, D. morbillosum e D. verruciferum.
89
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
5. CONCLUSÕES
• O número diplóide reduzido em D. irroratum e D. morbillosum, corrobora a proposta que
os rearranjos de fusão são predominantes na família Scarabaeidae.
• A ocorrência de HC no braço longo do cromossomo Y juntamente com a marcação do
lúmen deste bivalente pelo nitrato de prata em D. verruciferum, indicam que o mecanismo
XYp, nesta espécie, se originou de um Xyp ancestral a partir da adição de HC no Y.
• Os cromossomos difásicos observados nas três espécies analisadas apontam o processo de
amplificação da HC como um mecanismo importante ao longo da diferenciação das
espécies do gênero.
• O padrão de marcação da heterocromatina pelo nitrato de prata, nas três espécies
estudadas indica a presença de uma classe de heterocromatina peculiar dentro do grupo,
assim como em outros representantes da família.
• A riqueza dos blocos de HC predominantemente em pares de base GC apontam que estas
seqüências evoluem direcionalmente para se homogeniezarem, como proposto pela
hipótese de evolução em concerto.
• A presença de sítios de DNAr localizados em mais de um par autossômico difere do
padrão mais comum para ordem Coleoptera. Entretanto, estes padrões têm sido
registrados em Scarabaeidae, indicando a ocorrência de rearranjos dos tipos translocação,
fissão e fusão envolvidos na disperssão destas seqüências.
90
Cabral-de-Mello, D.C. Análise citogenética em três espécies do gênero Deltochilum
6. ABSTRACT
The aim of this work was to analyze three species of coleopterans belonging to the genus
Deltochilum (Coleoptera: Scarabaeidae), D. irroratum, D. morbillosum and D. verruciferum,
using convencional staining, chromosomes banding and fluorescent in situ hibridization (FISH).
D. irroratum and D. morbillosum 2n=14 and sexual mechanism neo-XY while D. verruciferum
possesses karyotype 2n=20,XYp. The three species presented meta-submetacentric chromosomes.
The C-banding revealed predominantly diphasic chromosomes, with the long arms
heterochromatics in D. irroratum and D. morbillosum and short in D. verruciferum. The silver
nitrate staining marked the sequences corresponding to constitutive heterochromatin (CH) in D.
morbillosum and D. verruciferum, in this last one the lumen of the sexual bivalent was also
marked. In D. irroratum this staining evidenced the CH of the diphasic autosomic chromosomes.
The fluorochromes staining CMA3 and DAPI revealed bloks of CH CMA3+ in the specie D.
verruciferum, in the diphasic autosomes and sexual bivalent of D. irroratum. While in D.
morbillosum the sequences CMA3+ were restricts to terminal regions of long arms of pairs 1, 2
and of X. In D. morbillosum and D. verruciferum the FISH identified sites of rDNA in two
autosomic pairs and in the X chromosome. The use of these techniques allowed the location of
cytogenetics markers and the analysis of the possible chromosome rearrangements involved in
the differentiation of the karyotype of these species.
Key-words: Coleoptera, chromosome rearrangements, Deltochilum, heterochromatin, Karyotype,
rDNA.
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7. ANEXOS
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7.1. ANEXO 1
INSTRUÇÕES PARA AUTORES
REVISTA
Chromosome Research
ISSN 1573-6849
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Manuscript Submission There are no page charges or charges for the publication of colour illustrations or administration charges for papers published in Chromosome Research. Manuscripts may be sent by e-mail to any of the Associate Editors or to the Editor-in-Chief (Please see addresses below). When submitting an article to one of the Associate Editors a copy of the covering letter, the title page and the abstract must be sent at the same time to the Editor-in-Chief, Professor Herbert Macgregor ([email protected]) The decision with regard to acceptance for publication is made by the Associate Editor/Editor to whom the manuscript is sent. North American authors are encouraged, but under no obligation, to send their manuscripts to one of our Associate Editors in that region. This often helps to speed up editorial processing and can lead to better communication and a faster decision on acceptance for publication. For the same reasons, Japanese authors are encouraged to submit their papers through our Associate Editor in Japan. It is understood that papers submitted for publication have not been published previously and are not simultaneously offered to any other journal. Before submission, the submitting author must ensure that the manuscript has been seen and approved by all other named authors. Editor−in−Chief: Professor Herbert Macgregor School of Biosciences Geoffrey Pope Building University of Exeter Stocker Road Exeter EX4 4QD England, UK Tel.+fax: (+44) (0)1392 879701 Email: [email protected] Associate Editors: Wendy Bickmore MRC Human Genetics Unit Western General Hospital NHS Trust Edinburgh EH4 2XU Scotland, UK Tel: (+44) (0) 131 332 2471 Fax: (+44) (0) 131 343 2620 Email: [email protected] Website: http://www.hgu.mrc.ac.uk/Users/Wendy.Bickmore/ Mary E. Delany 2131D Meyer Hall Department of Animal Science University of California Davis, CA 95616 USA Tel: +1-530-754-9343 office Tel: +1- 530-754-9404 lab Fax: +1-530-752-0175 E-mail:[email protected] http://animalscience.ucdavis.edu/AvianResources/ http://animalscience.ucdavis.edu/faculty/Delany J.S. (Pat) Heslop−Harrison Department of Biology University of Leicester Leicester LE1 7RH
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UK Tel: (+44) 116 2523381 Fax: + 44 116 2522791 Email: [email protected] Email: [email protected] Website: http://www.le.ac.uk/biology/staff/blphh4.htm Dr Jiming Jiang Department of Horticulture University of Wisconsin-Madison Madison, WI 53706 USA Fax: (+1) 608 262 4743 Email:[email protected] Professor Dr. Hans J. Lipps Institut für Zellbiologie Universität Witten/Herdecke Stockumer Str. 10 58448 Witten Germany Tel.: (49) 2302 669144 Fax.: (49) 2302 669220 Email: lipps@uni−wh.de Adrian Summer 7 Smileyknowes Court North Berwick East Lothian EH39 4RG Scotland Tel/Fax: (+44) (0) 1620 894 640 Email: [email protected] Nobuo Takagi Hokusei Gakuen University Atsubetsu−ku Sapporo, 004−8631 Japan Email: [email protected] Fengtang Yang The Wellcome Trust Sanger Institute Wellcome Trust Genome Campus Hinxton, Cambridge CB10 1SA UK Tel: (+44) (0)1223 494842 Fax: (+44) (0)1223 494919 Email: [email protected] How to Submit your Manuscript There are no page or administration charges for papers published in Chromosome Research. Manuscripts should be submitted by e-mail as PDF files with the illustrations integrated into the text or as Word files for the text and compressed JPEG files for the illustrations. Do not send very large files as email attachments by e-mail as they may not be accepted by the editors'
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and reviewers' Web servers or they may take a very long time to download. Receipt of your manuscript by the receiving editor will be acknowledged immediately. Style and Presentation The manuscript should be typed with double spacing throughout, allowing for ample margins. The first page should show the paper title, names and addresses of all authors, a short running title, and fax and telephone numbers and the e−mail address for the corresponding author. The second page should present a summary of less than 200 words, along with 3−5 key words, and should be followed by the text of the paper, arranged in the following sequence: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Informative legends should be provided for all illustrations and should be grouped together at the end of the paper, along with all tables. Subheadings may be inserted in the main text, but should not be numbered or lettered. Manuscripts should be written in clear, grammatical, idiomatic English. Spelling should conform to Webster's International Dictionary or The Concise Oxford English Dictionary and data should be presented simply and concisely, using Systeme International (SI) units. Abbreviations should be kept to a minimum and must be defined at their first occurrence. References References should be cited in the text using the Harvard (name−date) system. Where there are three or more authors, only the first author's name should appear, followed by et al. Where several references are cited at the same point in the text, these should be arranged in chronological order. The reference list should be typed with double spacing and arranged in alphabetical order. References should include: names and initials of all authors (unless there are more than six authors, when only the first three authors should be given, followed by et al.); year of publication; full title of the article; source using abbreviations for journals as shown in Index Medicus; volume number; and first and last page numbers. Abstracts should be identified as such. For citations from books, the chapter title should be followed by the names and initials of all editors, the title of the book, edition, place of publication, publisher and first and last page numbers. Examples: Thomas HM, Harper JA, Morgan WG (2001) Gross chromosome rearrangements are occurring in an accession of the grass Lolium rigidum. Chromosome Res 9: 585−590. Ohno S (2001) The one−to−four rule and paralogues of sex determining genes. In: Scherer G, Schmid M, eds. Genes and Mechanisms in Vertebrate Sex Determination. Birkhauser Verlag, pp 1−10. Engel E, Antonarakis SE (2002) Genomic Imprinting and Uniparental Disomy in Medicine. New York: Wiley−Liss. Only accepted papers should be referenced; all other material should be referred to in the text as 'in preparation', 'personal communication' 'unpublished observations' and should not be included in the reference list. Citing Internet References World Wide Web: All references should include the same information that would be provided for a printed source (or as much of that information as possible). The Web information is then placed at the end of the reference. It is important to use "Retrieved from" and the date because documents on the Web may change in content, move, or be removed from a site altogether. To cite a Web site in text (but not a specific document), it is sufficient to give the address (e.g., http://www.apa.org) there and no reference entry is needed. However, when citing a particular web page a citation in the text (e.g. Gaten 2000) and an entry in the reference list will be required. For example: Gaten E. (2000) Internet references. Retrieved from http://www.le.ac.uk/biology/teach/mod300/ecitations.html 19/9/2000 E−mail: E−mail communications from individuals should be cited as personal communications. The format in the text (personal communications are not cited in the reference list) is as follows: (E. Gaten personal communication, March 28, 2001). It is possible to send an e−mail note disguised as someone else. Authors − not journal editors or copy editors − are responsible for the accuracy of all references, which includes verifying the source of e−mail communications before citing them as personal communications in manuscripts. One of the most comprehensive guides to citing internet references is provided by the American
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Psychological Association: http://www.apastyle.org/elecref.html Tables and Illustrations All tables and illustrations should be referred to in the text, with appropriate locations indicated in the text margin. Tables should present new information and not duplicate data included in the text. Every table should have a descriptive title and, if numerical measurements are given, the units should be included in the column heading. Line drawings should be supplied in a form suitable for high−quality reproduction. Axes should be labelled clearly; other lettering should be kept to a minimum. Avoid the use of fine tints, especially as background to text. Photographs may be submitted either as electronic files or as glossy prints. One complete set of high quality glossy prints of all illustrations must be provided with the final revised and accepted manuscript. These should be supplied exactly as the author wishes to see them published with regard to layout, colour, resolution and contrast. Magnifications must be shown by scale bars and any lettering should be in lower case Helvetica bold type, approximately 3mm in height(12 or 14 point size type). Photographs should be cropped as close as possible to the area of interest. Where two or more photographs are mounted together on one page, they should be separated by 2 − 3mm of white space. If you send us your manuscript in electronic form and it is accepted for publication, we will invite you to send us high quality glossy prints of all your colour illustrations. This is not a requirement for publication in the journal but it does assist our production team in reproducing your pictures exactly as you would wish them to appear with regard to colour and definition. Colour figures There are no charges for the publication of colour illustrations, either in the online or in the printed version of Chromosome Research. Electronic Supplementary Material Electronic Supplementary Material (ESM) for a paper will be published in the electronic edition of this journal provided the material is: • submitted in electronic form together with the manuscript • accepted after peer review ESM may consist of: • information that cannot be printed: animations, video clips, sound recordings (use QuickTime, .avi, .mpeg, animated GIFs, or any other common file format) • information that is more convenient in electronic form: sequences, spectral data, etc. • large quantities of original data that relate to the paper, e.g. additional tables, large numbers of illustrations (colour and black & white), etc. Legends must be brief, self-sufficient explanations of the ESM. ESM is to be numbered and referred to as S1, S2, etc. After acceptance for publication, ESM will be published as received from the author in the online version only. Reference will be given in the printed version. Permission and Copyright It is the responsibility of the author to obtain written permission for a quotation from unpublished material, or for all quotations in excess of 250 words in one extract or 500 words in total from any work still in copyright, and for the reprinting of figures or tables from unpublished or copyrighted material. Copyright in articles published in this journal is the property of Springer to the extent transferable. Authors are themselves responsible for obtaining permission to reproduce copyright material from other sources. There are no page charges or administration charges for papers published in this journal. Springer Open Choice™ In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer now provides an alternative publishing option: Springer Open Choice™. A Springer Open Choice™ article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made available publicly through Springer’s online platform SpringerLink. To publish via Springer Open Choice™, upon acceptance please visit www.springer.com/openchoice to complete the relevant order form and provide the required payment information. Payment must be received in full before publication or articles will publish as regular subscription-model articles. We regret that Springer Open Choice™ cannot be ordered for published articles.
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Proofs Proofs will be sent to the corresponding author by email. Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours. Off-prints Fifty free off-prints of each paper are provided. Authors may order additional off-prints on the form which accompanies the proofs. Additional Information Peter Butler Editorial Director, Chromosome Research Springer P.O. Box 17 3300 AA Dordrecht The Netherlands E-mail: [email protected] www.springer.com/10577/ http://www.springer.com/journal/10577
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8. APÊNDICES
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8.1. APÊNDICE 1
FOTOGRAFIAS DAS ESPÉCIES ANALISADAS
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Fotografias de indivíduos macho das três espécies analisadas no trabalho. (a) Deltochilum irroratum, (b) D. morbillosum e (c) D. verruciferum.