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CC
O que é auto-imunidade?
O que é auto-anticorpos?
Quais doenças são produzidas?
Doadores de sangue?
Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
Brasília - DF 2012
ANÁLISE DE METODOLOGIAS LABORATORIAIS PARA
DIAGNÓSTICO DE ANEMIA FALCIFORME
Autor: Wellington Vali Duarte
Orientador: Prof. Esp. Fábio de França Martins
WELLINGTON VALI DUARTE
ANÁLISE DE METODOLOGIAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DE
ANEMIA FALCIFORME
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
curso de graduação em biomedicina da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito parcial para obtenção do título de
graduado em biomedicina.
Orientador: Prof. Esp. Fábio de França Martins
Brasília
2012
O trabalho de conclusão de curso, de autoria de Wellington Vali Duarte, intitulado
“ANÁLISE DE METODOLOGIAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DE
ANEMIA FALCIFORME”, apresentado como requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 20 de novembro de 2012,
defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
Prof. Esp. Fábio de França Martins
Orientador
Biomedicina – UCB
Profa. Esp. Simone Cruz Longatti
Biomedicina – UCB
_____________________________________________________________
Profa. MsC. Flávia Ikeda e Araújo
Biomedicina – UCB
Brasília
2012
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por me dar a oportunidade de me formar em um curso
em que poucos ingressam e sem ele nada seria possível; por me dar saúde, calma, sabedoria e
paciência.
Agradeço também ao meu pai, Amilton Vali Duarte e minha mãe, Maria de Lourdes
Goulart Duarte pelo apoio incondicional, compreensão, carinho, amor e com os quais sei que
posso contar a qualquer momento. Aos meus irmãos Amilton e Irvington pelo apoio.
Aos meus grandes e eternos amigos que me relacionei por toda minha vida assim
como aos amigos que fiz na graduação e que me proporcionaram momentos que ficarão para
sempre em minha memória. A todos os colegas de turma que compartilhei trabalhos,
aprendizado e conhecimento, o meu muito obrigado.
Ao meu orientador Fábio de França Martins que me guiou em tão pouco tempo para a
realização deste trabalho final. A todos os professores e funcionários, os quais respeito,
admiro e considero como profissionais cruciais para a minha graduação, deixo minha eterna
gratidão.
RESUMO
DUARTE, Wellington Vali. Análise de metodologias laboratoriais para diagnóstico de
anemia falciforme. 2012. 35 pag. Monografia (Biomedicina) - Universidade Católica de
Brasília, Brasília-DF, 2012.
A anemia falciforme é certamente um problema de saúde pública no Brasil. Presente em 4%
da população brasileira, a hemoglobina S é a origem desta classe de anemia e atinge até 10%
dos afrodescendentes com a média de nascimentos de 3.500 crianças portadoras da anemia
falciforme, por ano no Brasil.. Das complicações associadas aos portadores de doença
falciforme destaca-se: crises dolorosas, acidente vascular cerebral, síndrome torácica aguda,
osteonecrose e maior risco de infecções. Devido à expressão clínica da anemia falciforme, o
uso de metodologias laboratoriais adequadas é essencial. Atualmente, usam-se as seguintes
técnicas: Teste de solubilidade; Dosagem de hemoglobina Fetal; Dosagem de Hemoglobina
A2; Hemograma completo; Eletroforese de hemoglobinas em pH alcalino e também em pH
ácido; Cromatografia líquida de alta performance (HPLC); Focalização Isoelétrica; Teste de
falcização. Metodologias mais atuais vêm sendo desenvolvidas, permitindo que façamos
comparações entre técnicas laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme levando em
consideração variantes como: custo, economia de tempo, capacitação profissional,
sensibilidade e adequação à necessidade do paciente. Esta revisão de literatura compara as
técnicas laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme considerando as variantes
mencionadas e buscando determinar a mais eficiente. Se tratando de diagnóstico para anemia
falciforme torna-se difícil eleger uma das metodologias mencionadas neste trabalho, como a
melhor, sem que o contexto do diagnóstico seja levado em consideração. Se por um lado,
fatores como facilidade, praticidade, rapidez na execução, estabilidade, durabilidade dos
reagentes e a fácil capacitação de profissionais para execução da técnica justificam a
utilização de métodos com sensibilidade e especificidade boas para triagem, mas não ideais
para diagnóstico, por outro o uso de técnicas mais onerosas, que exijam maior capacitação dos
profissionais e investimento tecnológico retribuem ao serviço laboratorial uma melhor
confiabilidade, especificidade e sensibilidade no diagnóstico das anemias falciformes.
Palavras-chave: Pacientes, anemia falciforme, diagnóstico laboratorial
ABSTRACT
The sickle cell anemia is certainly a public health concern in Brazil. Present in 4% of the
Brazilian population, the hemoglobin S is the origin of this class of anemia, affecting up to
10% of the afrodescendants and is shown to be present in 3500 newborns a year in Brazil. Out
of the complications associated with the carriers of the sickle cell mutation, it is prominent to
highlight painful seizures, cerebral vascular accident, acute thoracic syndrome, ostenecrosis
and higher risk for infections. Due to the clinical expression of sickle cell anemia, the use of
suitable laboratorial methodologies is crucial. Currently, the following techniques have been
used: solubility test, fetal hemoglobin dosage, hemoglobin A2 dosage, complete blood count,
hemoglobin electrophoresis in alkaline or acid pH, high-performance liquid chromatography
(HPLC), isoeletric focusing and falcization test. More recent techniques have been developed,
allowing us to make comparisons with the ongoing laboratorial methods for sickle cell anemia
diagnosis, considering variants such as costs, time-saving strategies, professional
qualification, sensibility and suitability in accordance to patients’ needs. This literature review
compares the laboratorial techniques used for diagnosing sickle cell anemia, highlighting the
variants mentioned herein and looking forward to determining the most effective method.
When it comes to sickle cell anemia diagnosis, it has shown to be impossible to determine one
out of the methodologies mentioned as the most effective test without taking into account the
context in which the diagnosis takes place. On one hand, factors such as facility, practicality,
execution quickness, stability, durability of the reagents and professional qualification, live up
to the use of less sensitive methods during screening. On the other hand, the use of
burdensome techniques, which demand higher professional qualification, rewards the
laboratorial labor with better reliability and sensitivity.
Keywords: Patients, sickle cell anemia, laboratory diagnosis
LISTA DE ABREVIATURAS
cGMP: Guanosina Monofosfato Cíclica
CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
DHL: Desidrogenase Láctica
FE: Fase estacionária
FIE: Focalização Isoelétrica
GTP: Guanosina Trifosfato
Hb: Hemoglobina
HCM: Hemoglobina Corpuscular Média
HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Performance/Pressão/resolução/Eficiência
HU: Hidroxiuréia
ICAM: Molécula de Adesão Intercelular
IFN: Interferon
IL: Interleucina
NO: Óxido Nítrico
P.I.: Ponto Isoelétrico
pH: Potencial Hidrogeniônico
PS: Fosfatidilserina
RDW: Red cell Distribution Width (Variação de tamanho de eritrócitos)
RN: Recém Nascido
VCAM-1: Molécula de Adesão Celular Vascular
VCM : Volume Corpuscular Médio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 8
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................... 19
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 29
4 MATERIAL E MÉTODO ................................................................................................... 30
5 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 31
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 32
8
1 INTRODUÇÃO
O problema de saúde pública oriundo da presença da anemia falciforme em muitos
indivíduos no Brasil é uma realidade. Tendo a hemoglobina S como origem da doença, a
anemia falciforme está presente em 4% da população brasileira e até 10% dos
afrodescendentes com a média de nascimentos de 3.500 crianças portadoras da anemia
falciforme, por ano no Brasil1.
A doença falciforme representa um grupo de doenças oriundas da herança da
hemoglobina S, podendo ser em homozigose (SS), o que caracteriza a anemia falciforme;
duplas heterozigoses como hemoglobinopatias SC e SD ou juntamente com talassemias, tais
como S-talassemia e doença falciforme com -Talassemia1.
O gene da hemoglobina S é um gene que foi trazido para as Américas por meio da
migração forçada de escravos africanos a partir do século XVI. No Brasil a doença possui
maior presença nas regiões sudeste e nordeste2.
A doença falciforme apresenta suas raízes na síntese da hemoglobina. As
hemoglobinas ocupam grande parte do eritrócito e tem como principal papel o transporte de
oxigênio para os tecidos do organismo. Sua composição é basicamente de um tetrâmero com
duas cadeias alfa e duas cadeias não alfa, cada uma delas ligada com um grupo heme, este
último sendo a junção de ferro e protoporfirina1. A síntese das globinas alfa inicia-se no
cromossomo 16 e a das outras globinas, como beta e gama, no cromossomo 11. A
hemoglobina S resulta de uma troca de bases nitrogenadas que acabam codificando o
aminoácido valina ao invés do ácido glutâmico na globina beta. Na falta de oxigênio, a valina
agora presente interage com aminoácidos de outras globinas beta, o que caracteriza o processo
de polimerização, o que dá o formato de foice ao eritrócito1.
Das complicações associadas aos portadores de doença falciforme destacam-se: crises
dolorosas, acidente vascular cerebral, síndrome torácica aguda, osteonecrose e maior risco de
infecções. A raiz dessas complicações está no fato de que a polimerização da hemoglobina S
altera a morfologia eritrocitária e lesa a membrana, prejudicando a travessia dos eritrócitos
mal formados por vasos de pequeno calibre, que como consequência pode gerar vaso oclusão,
que por sua vez facilita o aparecimento das complicações citadas1.
9
Quando o indivíduo possui a hemoglobina SS, isto é, quando recebeu o gene para
hemoglobina S tanto do pai quanto da mãe, a condição é caracterizada como anemia
falciforme, onde o eritrograma se apresenta, geralmente, com índices hematimétricos
condizentes com uma anemia normocítica e normocrômica, podendo haver macrocitose de
acordo com a presença de reticulócitos. A citologia das hemácias na anemia falciforme
apresenta vários eritrócitos em forma de foice, evidenciando uma anisocitose. Por ser uma
doença hemolítica, comumente se observa policromasia e eritroblastos no sangue periférico.
Estes últimos acabam sendo contados como linfócitos na leucometria por contadores
automatizados1.
A seguir a figura de um eritrócito maduro, evidenciando drepanócitos em lâmina
microscópica. Estas células falciformes se apresentam alongadas devido à polimerização da
hemoglobina anormal, geralmente faltando a área pálida central3.
Figura 1 – Drepanócitos em lâmina
Fonte: ANDERSON, 2005.
A anemia falciforme é uma doença monogênica que possui diferentes níveis de
agravamento de acordo com os mecanismos moduladores. Devido ao volume eritrocitário
estar fatidicamente alterado na anemia falciforme a relação de hidratação e desidratação é
também alterada. As células com hemoglobina corpuscular média elevada têm pouca
afinidade pelo oxigênio, alta viscosidade, com provável polimerização quando em hipóxia4.
10
Em termos de características laboratoriais vários dados estão presentes na anemia
falciforme, assim como mostra a seguir1.
1- Hemoglobina S = 90 a 98%
2- Hemoglobina fetal = 2 a 10%
3- Anemia hemolítica com hemoglobina de 5 a 9g/dL, com VCM normal.
4- Morfologia eritrocitária representada por células falcizadas, anisocitose,
poiquilocitose, eritroblasto, células em alvo, esferócitos, corpos de Howell-Jolly.
5- Reticulócitos aumentados de 5 a 30% durante as crises
6- Plaquetas aumentadas com formas anormais
7- Fragilidade osmótica diminuída
8- Bilirrubina indireta elevada (aproximadamente 6mg/dL)
9- Urobilinogênio urinário e fecal elevados
10- Hematúria frequente
11- Ácido úrico sérico pode estar elevado
12- Fosfatase alcalina sérica elevada nas crises
13- Medula óssea com hiperplasia das células eritróides
A hemoglobinopatia S também pode possuir formas associadas. Por exemplo, é
possível que se tenha a hemoglobina S associada à talassemia (HbS/thal) tanto com o
genótipo homozigoto S
S quanto com o heterozigoto
A
S. No caso do primeiro genótipo, a
clínica é mais severa em relação as associações heterozigóticas. A seguir as combinações
genéticas possíveis para a associação de hemoglobina S e talassemia, uma vez que talassemias
podem ser alfa e beta5:
Hb S
S /
thal
normal ( homozigótico S)
11
Hb A
S / thal
normal ( heterozogoto S e thal )
Hb S
thal
o /
Hb S
thal
+ /
As formas heterozigóticas Hb A
S / thal
normal e
A
S normal
normal
apresentam evolução próxima de ser assintomática, mesmo apresentando hemácias falcizadas,
hemácias em alvo, hipocromia e microcitose5.
Outra possibilidade de heterozigose é a ocorrência do traço falciforme. Quando o
indivíduo herda o gene para a hemoglobina S e outro para a hemoglobina A. Esta associação
genética causa sintomas mais brandos nos portadores da condição, sendo geralmente
assintomáticos, sem alteração na expectativa de vida. O hemograma se apresenta normal. Os
sinais clínicos que podem estar presentes em pacientes com o traço falciforme aparecem
apenas se os portadores se submeterem a condições de hipóxia, desidratação ou acidez, que
propiciam o processo de falcização. Já foram relatados casos mais raros onde portadores do
traço apresentaram complicações como infarto esplênico, complicações renais e do trato
urinário, infecções e até morte6.
Para se ter o diagnóstico para o traço falciforme deve-se identificar a presença da
heterozigose AS da hemoglobina. Neste sentido, a eletroforese em pH alcalino, com o teste de
falcização, são opções, apesar de que atualmente a cromatografia líquida de alta resolução tem
substituído métodos anteriores6.
1.1 Fatores moduladores na anemia falciforme
A destruição das hemácias leva à liberação de hemoglobina no plasma sendo que esta
converte o NO em nitrato inativo. A lise de eritrócitos também libera arginase que destrói L-
arginina, cuja função é a produção de NO. O resultado dessas lises é a diminuição da
concentração de NO. Neste sentido é preciso lembrar que o NO é cofator da enzima
guanilato-ciclase, conversora de GTP (trifosfato de guanosina) em cGMP (monofosfato de
guanina cíclica), sendo que este último gera relaxamento dos músculos lisos vasculares e
vasodilatação. Deste modo, podemos entender como a baixa disponibilidade de NO é
12
importante, no sentido de que altera a homeostasia vascular, altera o equilíbrio entre vaso
constrição e relaxamento, o que aumenta o risco de vaso oclusão na anemia falciforme7.
Com o formato de foice, as hemácias se tornam rígidas e estagnadas em locais onde a
circulação sanguínea é lenta, o que pode levar a anóxia. Uma consequência deste fato é a
formação de trombos, e posteriormente enfarte do tecido desfavorecido pela presença de
trombo. Os próximos acontecimentos são a fibrose e até mesmo calcificações. Um exemplo é
o acometimento do baço, órgão com fluxo sanguíneo lento que na presença de trombo gera
dores intensas. As plaquetas também contribuem para a adesão de eritrócitos ao endotélio,
estando em atividade, elas liberam trombospondina. Este processo ativa a coagulação,
favorecendo a formação de trombos5.
Em nível de membrana celular, algumas alterações como fosforilação anormal,
anomalia da bomba Na/K e auto-oxidação gera fagocitose por macrófagos. Em ambientes
pobres em oxigênio a membrana é lesada, com perda de água e potássio, configurando uma
desidratação5.
A vasoclusão não se explica somente pelo fato de haver eritrócitos falcizados, mas por
fatores de aderência. Por exemplo, há um processo de aderência anormal de eritrócitos e
neutrófilos, anormalmente estimulados, durante as crises, contribuindo para a vasoclusão. As
crises intensificam a atividade moduladora de VCAM-1, ICAM-1, E e P-selectinas, que são
moléculas de adesão, assim como a citocina IL-6. O aumento de IFN-alfa, outro fator de
aderência, intensifica a atividade dos monócitos nas crises vasculares, sendo estas células as
produtoras de tal citocina. Infecções agudas e processos inflamatórios também são
contribuintes para crises vasoclusivas, estimulando a aderência de neutrófilos e eritrócitos ao
endotélio5.
Alguns fatores agravam as infecções, como por exemplo, a capacidade fagocítica,
sendo mediada por opsoninas, é afetada pela agressão ao baço causada pelas células
falcizadas ao passarem pelo órgão. Também se tem a produção de anticorpos afetada em
consequência do mesmo fato8.
A explicação para a agressão sofrida pelo baço em pacientes portadores da doença está
no fato de que na infância deve ocorrer esplenomegalia devido ao fato de que a polpa
vermelha se congestiona ao sequestrar eritrócitos falcizados, que leva para a evolução de
trombos podendo até gerar infarto no órgão, tendo a atrofia e a fibrose do órgão como
13
consequências do processo. Tal mecanismo é denominado auto-esplenectomia, ocorrendo na
infância geralmente até os 5 anos9.
Neste sentido a ocorrência de infecções é esperada, e pior, instala-se um ciclo onde
infecções originadas pelo processo de falcização desencadeiam processos trombóticos,
podendo gerar maior dano ao baço com consequente aumento de infecções, continuando o
ciclo. O que ratifica a periculosidade deste ciclo é que a infecção, por si, estimula a produção
de citocinas inflamatórias, aumentando assim, a expressão das moléculas de adesão
endoteliais e a adesão das células falciformes e dos polimorfonucleares no endotélio vascular,
como já comentado10
.
De acordo com Lorenzi (2006) podemos descrever o quadro clínico de um paciente
homozigoto para HbSS da seguinte forma:
- Tromboses desencadeadas por infecções, estresse, frio e desidratação que geram a
falcização de eritrócitos;
- Sintomatologia geralmente dolorosa devido a obstrução de pequenos vasos culminando na
necrose de dedos, cabeça do fêmur, ou até mesmo cegueira pela obstrução de vasos do olho;
- Possibilidade de enfarte de pulmão e de mesentério;
- Dores musculares, abdominais, dores no peito e priaprismo;
- Dactilite em crianças;
- Úlceras nas pernas;
- Anemia e icterícia;
- Crise de insuficiência renal;
- Leucopenia;
- Crise de sequestração
O tratamento da anemia falciforme se baseia no combate à dor, na hidratação e
oxigenoterapia. Aplica-se também a antibioticoterapia, uma vez que as crises hemolíticas são
geralmente desencadeadas por infecções. Aplica-se vacinas para S.pneumoniae, uma vez que
14
com o baço em funcionamento ineficaz, devido a vasoclusões durante as crises, se aumenta a
probabilidade de infecções por bactérias capsuladas, sendo adotado também o uso de
penicilina nos casos em que há ausência total de função esplênica5.
Na linha de tratamento faz-se o monitoramento de condições de acidose e
desidratação, a fim de evitá-las. Transfusões de hemocomponentes são recomendadas em
caso de aplasia medular, crises de hipersequestração esplênica ou hepática, e crises dolorosas
de peito. As úlceras de membros inferiores são tratadas com medicação tópica
antiinflamatória5.
Por fim, tem-se o transplante de medula óssea como opção para a cura. Mesmo assim
devem ser levados em consideração os riscos de mortalidade e de complicações oriundas do
procedimento 5.
Um medicamento que tem sido utilizado e recomendado para pacientes com um
quadro severo de anemia falciforme é a HU (hidroxiuréia). Este composto diminui a
expressão da fosfatidilserina (PS), que por sua vez reduz o número de neutrófilos e também o
número de moléculas de adesão em linfócitos e monócitos 5.
Juntamente com o teste de falcização, contribuem para o diagnóstico de anemia
falciforme os seguintes testes11
.
Eletroforese alcalina em acetato de celulose
Eletroforese ácida em agar ou agarose
Teste de solubilidade
Dosagem de Hemoglobina Fetal
Dosagem de Hemoglobina A2
Hemograma completo
Eletroforese de hemoglobinas em pH alcalino e também em pH ácido.
Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
Focalização Isoelétrica
Teste de falcização
15
1.2 Técnicas atualmente utilizadas
a) Eletroforese alcalina e Eletroforese para identificação de hemoglobina S:
Em termos de princípio metodológico, a eletroforese de hemoglobina em fita de
acetato de celulose, assim como a eletroforese em agarose, é uma técnica que permite a
migração de hemoglobinas, carregadas negativamente, em uma velocidade característica desta
molécula, para o pólo positivo. Desta forma, identificam-se diferentes tipos de hemoglobinas
de acordo com o padrão de suas migrações12
.
A seguir, figuras representando corridas eletroforéticas exibindo freqüentes alterações
em que poderiam ser identificados em neonatos e após o sexto mês de vida11
.
Figura 2 - Padrão de genótipos de recém nascidos em Eletroforese
Fonte: ANVISA, 2002
Figura 3 - Padrão de genótipos após 6 meses de vida em Eletroforese
Fonte: ANVISA, 2002
16
b) Teste de solubilidade:
O teste de solubilidade visa reduzir a hemoglobina S, pois esta é insolúvel em tampão
inorgânico. Considerando que outras hemoglobinas são solúveis, esta seria uma forma de
isolar a hemoglobina S. O princípio do teste se baseia no fato de que quando há
desoxigenação, ocorre o deslocamento lateral das cadeias beta, ao contrário do que ocorre na
oxigenação, com as cadeias beta retornando ao eixo. A lise dos eritrócitos, quando na mistura
de ditionito de sódio no teste de solubilidade, libera hemoglobina desoxigenada e a cadeia
beta de cada molécula se desloca lateralmente, causando “opacidade” na leitura do teste6.
c) Dosagem de Hemoglobina Fetal:
Teste realizado utilizando solução alcalina em concentração de hemolisado conhecido.
Aplica-se sulfato de amônio para bloquear a desnaturação, diminuindo o pH e precipitando a
hemoglobina,agora, desnaturada. Pelo processo de filtragem detecta-se a quantidade de
hemoglobina alterada, ou seja, a hemoglobina fetal13
.
d) Hemograma completo:
Teste de rotina para triagem e monitoramento. Realiza leitura de índices
hematimétricos, contagem diferencial para a linhagem branca, contagem de plaquetas14
. A
contagem diferencial para leucócitos possui grande importância para a clínica da anemia
falciforme, sendo comumente contados Leucócitos, Neutrófilos, Segmentados, Bastonetes,
Linfócitos, Monócitos, Eosinófilos e basófilos. Estes são liberados em valores absolutos e
percentual. Os valores de referência variam de acordo com idade, sexo e população. Para a
linhagem eritrocítica, são quantificados hemácias, hemoglobina, hematócrito, Volume
Corpuscular Médio, Hemoglobina Corpuscular Média e RDW ( Red cell distribution Width ),
para um hemograma completo. São realizados também exames correlacionados como
contagem de reticulócitos e capacidade de ligação do ferro 14
.
e) HPLC:
Técnica analítica utilizada por indústrias químicas e farmacêuticas. Utiliza-se
partículas de fases estacionárias (FE) e móveis que permitem gerar colunas seletivas e
17
estáveis química e mecanicamente. O desenvolvimento da cromatografia líquida de alta
performance, é boa alternativa devido à necessidade de análises mais rápidas,sem
comprometer o desempenho cromatográfico15
.
A HPLC é de cromatografia que utiliza um líquido como fase móvel, sendo este
injetado na coluna cromatográfica a altas pressões e diferentes tipos de fase estacionária. A
variação estará de acordo com aquilo que se quer analisar. Os elementos da fase estacionária,
em geral se encontram altamente particionados, o que gera uma separação mais eficiente. Os
reservatórios para os reagentes são basicamente bombas que propulsionam a fase móvel a
altas pressões, injetor de amostra, coluna cromatográfica e um detector acoplado a um
computador. A Cromatografia Líquida de Alta Performance é a base para o raciocínio da
realização de outras técnicas como a cromatografia gasosa e de troca iônica16
.
f) IEF:
A carga do composto anfotérico, durante o teste, permanece alterada e migra através
do gradiente de pH, alcançando sua posição de equilíbrio, ou seja, alcança sua posição de
equilíbrio, em outras palavras, alcança a região onde o PI (ponto isoelétrico) e pH (potencial
hidrogeniônico) são iguais17
.
g) Teste de falcização:
É um teste que utiliza meta bissulfito, cujo princípio baseia-se na polimerização da
hemoglobina sob hipóxia e hipertonicidade. O resultado prático deste fato é a cristalização da
Hb que falciza os eritrócitos, que são identificados microscopicamente. Destaca-se que o
processo de falcização deve ser confirmado com outros métodos, como HPLC, por exemplo14
.
Para a diferenciação dos tipos de hemoglobinas tem-se a eletroforese de hemoglobinas
em pH alcalino e também em pH ácido. Atualmente utiliza-se a cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) como alternativa eficiente para este fim18
.
Como já citado, a hemoglobina S pode estar associada a outras hemoglobinas, como
por exemplo, a Hb C. Neste sentido, o uso de técnicas eletroforéticas alcalina e ácida é
decisivo para o correto diagnóstico. Desaconselha-se o uso exclusivo de testes de
solubilidade, uma vez que não se pode diferenciar indivíduos AS, SS ou SC, podendo até
18
mesmo serem apresentados resultados negativos em neonatos devido à pequena concentração
da Hb S11
.
Neste Trabalho de Conclusão de Curso foi escolhido o tema “Análise de metodologias
laboratoriais para diagnóstico de Anemia falciforme”, devido à importância, abrangência do
assunto e o grau de acometimento da doença, aliando a área de diagnóstico laboratorial com o
caráter clínico. Neste Trabalho de Conclusão de Curso II espera-se elucidar qual é a melhor
metodologia para diagnóstico de anemia falciforme levando em considerações variáveis como
sensibilidade, tempo, investimento tecnológico, viabilidade econômica, confiabilidade,
adequação ao laboratório e ao paciente. Serão comparadas as técnicas de Hemograma, Teste
de Solubilidade, Teste de Falcização, Eletroforese alcalina, Eletroforese ácida, Teste do
Pezinho, PCR e enzimas de restrição, Focalização Isoelétrica e Cromatografia Líquida de Alta
Performance.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA
Para se diagnosticar hemoglobinopatias, variantes como dados clínicos, herança
genética, idade, tempo de estocagem da amostra, assim como condições de armazenamento da
mesma devem ser levadas em consideração. Estas duas últimas variantes, se não bem
controladas, podem interferir no exame devido a uma possível desnaturação da hemoglobina6.
A princípio, espera-se o seguinte padrão de evolução da hemoglobina.
Tabela 1 - Padrão de prevalência de hemoglobinas
Fonte: FERRAZ & MURAO, 2007
A anemia falciforme, por sua vez, apresenta a hemoglobina S prevalecendo na medida
em que a hemoglobina fetal vai desaparecendo. Para avaliar se há alguma hemoglobinopatia
vários testes podem ser empregados, porém, sempre deve-se fazer um teste confirmatório
após o sexto mês de vida, etapa na qual a HbS já pode ser identificada com mais clareza se
presente6.
Dentre os métodos para detecção de hemoglobinas anormais estão o teste de
solubilidade, eletroforese em p.H alcalino e ácido, focalização isoelétrica, eletroforese de
cadeias globínicas e (HPLC). Cada uma destas técnicas apresentam limitações e vantagens no
processo de determinação de hemoglobinas19
.
O procedimento para detecção de isoformas da hemoglobina em eletroforese em pH
alcalino é rotineiramente utilizado em laboratórios. Entretanto, esta técnica é um
procedimento de rastreamento inicial, uma vez que tal metodologia permite a migração de
hemoglobinas semelhantes. A eletroforese em pH alcalino pode diferenciar as hemoglobinas
A da F das variantes mais frequentes, como as hemoglobinas S e C, mas não faz a
diferenciação das hemoglobinas A2 da C, O e E. Desta forma, metodologias complementares
devem ser realizadas19
.
20
Em termos de diagnóstico deve-se levar em consideração que a eletroforese de pH
alcalino tem vantagens quando se lida com amostra de período neonatal. A hemoglobina é
uma proteína carregada negativamente, logo, o fato da migração ocorrer para o pólo positivo é
a base da eletroforese de hemoglobina em pH alcalino .Desta forma, a diferença no padrão de
migração é certamente resultado de uma diferente estruturação molecular da globina, que por
sua vez possui aminoácidos com diferentes posicionamentos20
.
Sabe-se que a grande presença de hemoglobina fetal prejudica a eficácia desta técnica,
por tal razão a eletroforese em pH ácido reduz este problema, uma vez que é capaz de separar
as frações S da D, e a C da E, que correm na mesma faixa na eletroforese em pH alcalino.20
.
O teste de solubilidade, baseado no uso de ditionito de sódio, assim como o teste de
falcização, que utiliza metabisulfito de sódio não são muito precisos na detecção de HbS no
período neonatal uma vez que a hemoglobina fetal, está presente em grande quantidade.
Neste sentido, a ocorrência de resultados falsos negativos é frequente. Portanto, um teste de
solubilidade negativo deve ser interpretado com cautela.
Devido à grande quantidade de Hb F no período neonatal, que funciona como “efeito
diluidor”, este teste pode se apresentar falso negativo. O mesmo pode ser dito em relação ao
teste de falcização. Entretanto, vale lembrar que o teste de solubilidade possui boa
sensibilidade para a triagem da Hb S de outras faixas etárias, além de ter um menor custo, se
comparado à eletroforese, e também oferece facilidade de execução20
.
O teste de solubilidade não é específico, uma vez que não diferencia anemia
falciforme, de traço falciforme, nem mesmo de outras variantes da HbS. Sua utilização se
baseia na aplicação de ditionito de sódio em eritrócitos lisados, visando reduzir a
hemoglobina S. A turvação da solução é consequência da presença da hemoglobina S, e a
ausência de turvação está presente tanto em negatividade quanto em outras hemoglobinas.
Apesar dos aspectos negativos citados, esta técnica ainda se faz muito útil na triagem14
.
Da mesma forma que outras metodologias, o teste de solubilidade pode apresentar
resultados falsos positivos, assim como falsos negativos. Os resultados falsos negativos são
devidos à hemoglobina a baixo de 7g/dL, presença de hemoglobina fetal em recém-nascidos,
baixa quantidade de hemoglobina S e uso de fenotiazina. Os falsos positivos decorrem de
amostras lipêmicas, gama globulinas anormais, policitemia, grande quantidade de corpúsculo
de Heinz e grande quantidade de eritrócitos nucleados14
.
21
Os métodos de eletroforese por focalização isoelétrica e cromatografia líquida de alta
resolução são boas alternativas de substituição de métodos convencionais para triagem
neonatal. São metodologias que proporcionam alta precisão. Mesmo assim, após um resultado
positivo uma repetição do teste é necessária. A sensibilidade e a especificidade devem sempre
ser almejadas de forma que se por algum motivo o resultado se mostre inconclusivo após a
realização de um teste, este deve ser confirmado com o uso de outra técnica cabível no
laboratório, sendo que resultado de ambas deve ser reportado no laudo6.
Segundo Liane Esteves Daudt et al,200221
quando comparada com a eletroforese em
acetato de celulose, a focalização isoelétrica se mostra superior no quesito resolução,
separação de HbS da HbF de forma mais evidente. Também menciona que mesmo que o
preço do equipamento para a análise por focalização isoelétrica seja caro, os seus reagentes
possuem o mesmo custo, com a vantagem de se realizar 72 testes a cada seis horas.
Atualmente, na avaliação laboratorial para identificação de diferentes hemoglobinas
são frequentemente utilizados os métodos de eletroforese de hemoglobinas em pH alcalino e a
cromatografia líquida de alta pressão. A seguir uma figura ilustrando a utilização da
eletroforese alcalina de hemoglobinas18
.
Figura 4 - Amostras para identificação de hemoglobinas em Eletroforese
Fonte: NAOUM, 2010
O pH nesta situação é de 9,0. O resultado da corrida eletroforética mostrou que a
amostra sete apresentou o genótipo SS, que corresponde a anemia falciforme. As outras
22
hemoglobinas puderam ser identificadas de acordo com a avaliação de seus posicionamentos
após a corrida. Os padrões encontrados foram AA, AA2 diminuída, AC, AGC, SC, SF,SS e
AS18
.
A identificação de hemoglobinas normais e anormais é rotineiramente realizada por
eletroforese, utilizando o acetato de celulose em pH alcalino.Poucos laboratórios utilizam
outros sistemas de auxílio a esta técnica, como géis de Agar, Agarose, mistura Agar-amido
em pH ácido, alcalino ou neutro. De fato, as metodologias normalmente utilizadas em
laboratório para diagnóstico de hemoglobinopatias nem sempre fornecem uma resolução
adequada para a avaliação das hemoglobinas. A seguir, algumas situações que podem
prejudicar a sensibilidade dos testes17
.
1- Frações com concentrações inferiores a 1%;
2- Frações que migram na mesma posição, quer seja em pH Alcalino, quer em p.H
ácido;
3- Frações de hemoglobinas instáveis que se desnaturam pelos métodos usuais de
obtenção do hemolisado com solventes orgânicos;
4- Frações que, em recém nascidos, apresentam concentrações ínfimas e de difícil
visualização;
5- Frações de mutantes de cadeia alfa que migram de forma rápida.
Se o laboratório puder contar com a metodologia de focalização isoelétrica (FIE),
certamente este terá boa confiabilidade no que diz respeito à interpretação, realização e
resolução na diferenciação do fenótipo das bandas de vários tipos de hemoglobinas de acordo,
claro, com o ponto isoelétrico P.I de cada fração. Este fato demonstra que a FIE tem alta
especificidade17
.
A técnica de focalização isoelétrica fornece também vantagens nos seguintes quesitos:
1- Possibilidade de se utilizar pouca quantidade e hemácias
2- Aplicação de muitas amostras concomitantemente (até 80)
3- Obter o hemolisado tanto do sangue total, como de cartões de papel de filtro
(Similar aos utilizados no teste do pezinho)
23
A cromatografia líquida automatizada de alta resolução, (HPLC), apresenta vantagens
bem relevantes sobre a eletroforese convencional. Primeiramente, temos que lembrar que o
analisador é automático, o que logo poupa trabalho manual assim como tempo. Assim sendo,
o processamento de amostras em número é aumentado em grandes proporções. Outra
vantagem está no fato de que a máquina consegue trabalhar com volumes ínfimos da amostra,
até cinco microlitros. Este fato torna interessante o uso da HPLC na Neotologia. Está técnica
também é capaz de identificar e quantificar hemoglobinas normais e variantes
simultaneamente22
.
Os métodos de imagem auxiliam o diagnóstico e principalmente a identificação de
complicações oriundas da condição clínica da anemia falciforme, com facilidade na percepção
das complicações musculoesqueléticas. Por exemplo, a radiografia simples revela aspectos
resultantes da condição, como estriações perpendiculares e vértebra em H, infartos ósseos em
estágios avançados. Também com suas vantagens, a ressonância magnética detecta alterações
osteoarticulares, além de ser boa ferramenta para monitorar infecções e infartos musculares23
.
De qualquer forma a análise citológica, com eletroforese de hemoglobinas e HPLC
formam um grupo efetivo de técnicas para o diagnóstico da anemia falciforme. Importante
lembrar também que testes usualmente utilizados para a identificação de anemias hemolíticas,
como é o caso da anemia falciforme, são a contagem de reticulócitos, bilirrubina indireta,
DHL e haptoglobina18
.
A eletroforese que utiliza como suporte o ágar em pH ácido ou procedimentos
semelhantes tem sido realizada apenas em alguns laboratórios e na diferenciação de
hemoglobinas que migram na mesma posição em pH alcalino, como é o caso das
hemoglobinas S e D e das C e E. Entretanto, na população brasileira, são mais freqüentes as
hemoglobinas S e C(1, 14, 24, 25), o que, de uma forma errônea, conclui-se que esse teste não
apresenta a validade devida no auxílio diagnóstico laboratorial17
.
Devido ao seu alto poder de resolução, a IEF tornou-se a mais promissora e versátil
metodologia para o estudo de sistemas polimórficos, incluindo-se as hemoglobinopatias,
como também para a descoberta de novas variantes genéticas17
.
Importante lembrar também que o hemograma é essencial no suporte do diagnóstico
da anemia falciforme. As características laboratoriais mais presentes na doença já foram
citadas neste trabalho1.
24
A metodologia laboratorial é certamente dependente do grupo populacional em
questão, sendo que as ferramentas fornecidas por cada método dependerá da combinação dos
métodos aplicados para triagem e confirmação dos suspeitos. A população brasileira
caracteriza–se por apresentar grande heterogeneidade genética, derivada da contribuição dos
seus grupos raciais formadores24
.
O teste do pezinho para Triagem neonatal, também conhecido como Teste de Guthrie,
é um método utilizado para a triagem de hemoglobinopatias, como a anemia falciforme e
apresenta vantagens como baixo custo e a simplicidade de realização. Porém, outros métodos
quantitativos possibilitam a automatização e têm a grande vantagem de ser mais sensíveis e
específicos, ou seja, produzem menos casos falsos positivos e negativos25
.
É importante lembrar que a prematuridade, assim como a ocorrência de transfusão de
sangue no recém-nascido pode influenciar os resultados do teste para hemoglobinopatias,
como é o caso da anemia falciforme. Portanto, recomenda-se uma coleta nos primeiros dias de
vida26
.
Segundo o Manual de Normas Técnicas e Rotinas Operacionais do Programa de
Triagem Neonatal do Ministério da Saúde27
, sempre que houver resultado inconclusivo na
técnica escolhida, técnicas complementares devem ser implementadas, com o objetivo de
melhorar a sensibilidade e a especificidade.
Quanto ao controle da doença, a divulgação da informação, o diagnóstico neonatal,
assim como o aconselhamento genético, desempenham papéis fundamentais. É importante a
utilização de uma tecnologia adequada que inclua testes laboratoriais seletivos e de
confirmação, estudo familial, assim como profissionais capacitados24
.
Orlando et al24
em um estudo comparativo entre as metodologias incluiu os testes de
solubilidade, de gel-centrifugação e eletroforese de hemoglobina, sendo a última capaz de
detectar o maior número de amostras positivas para o gene S. No estudo este teste não foi
capaz de detectar uma amostra positiva.
Orlando et al24
compararam o teste de solubilidade, o de falcização e o de gel-
centrifugação. Estes não mostraram evidente discrepância entre eles em 28 amostras de HbAS
analisadas de um total de 836 amostras de pacientes de pré-natal estudadas.
25
Em outro estudo comparativo entre as metodologias, Giovelli et al,201128
detectou,
utilizando o teste de solubilidade, uma sensibilidade de 93,8% e uma especificidade de 100%.
Com estes dados em vista, variáveis como facilidade, praticidade e rapidez na execução,
estabilidade e durabilidade dos reagentes e a fácil capacitação de profissionais para execução
da técnica justificam a utilização destes métodos menos sensíveis para triagem, contanto que
se utilizem testes sensíveis e quantitativos como confirmatórios. Esta necessidade é
certamente importante quando há procura de HbS no período neonatal, uma vez que a HbF
ainda em alto número diminuirá a eficiência da técnica de solubilidade.
Faz-se essencial considerar condições clínicas que podem gerar falsos positivos, como
policitemia, mieloma múltiplo, transfusão recente e insuficiência renal crônica. Da mesma
forma, resultados falsos negativos podem ser consequência de uma baixa quantidade de
hemoglobina29
.
Desta forma, a avaliação de custo-benefício deve ser levada em consideração. A
eletroforese de hemoglobinas exige maior tempo para a execução com um custo um pouco
mais elevado. Entretanto, Giovelli et al, 2011
28 enfatiza sua importância quando se trata de
diagnóstico para triagens em bancos de sangue, para impedir a ocorrência de resultado falsos.
O teste de falcização é uma técnica bastante utilizada devido ao seu baixo custo. Este
serve como metodologia para diagnóstico de doença falciforme, traço falciforme,
hemoglobinas não falciformes, heterozigose dupla de certas variantes, como HBS/HBD (Los
Angeles), entre outras. Apesar das vantagens mencionadas, há a possibilidade de resultados
falsos positivos e falsos negativos. Os falsos positivos podem decorrer de tranfusões de
eritrócitos com traço falciforme, concentração excessiva de metabissulfito de sódio,
poiquilocitose, entre outros. Os resultados falsos negativos podem acontecer devido a
transfusões de eritrócitos normais, aquecimento, contaminação bacteriana, lavagem
prolongada com salina, presença de hemoglobina fetal em recém-nascidos, baixa quantidade
de hemoglobina S ou reagentes fora da validade14
.
Outra técnica de alta relevância é a PCR (reação em cadeia da polimerase). Em
situações onde há presença de hemoglobinas semelhantes esta técnica é fundamental. Entre as
possíveis hemoglobinas semelhantes estão HbS/β-tal., HbS/βδ tal. e HbS/PHHF (Persistência
Hereditária de Hemoglobina Fetal)12
.
26
Em um de seus estudos Kangpu Xu et al,199930
demostraram o uso em conjunto de
PCR, enzimas e restrição e eletroforese em gel de acrilamida para diagnóstico de anemia
falciforme. A seguir, uma figura com as bandas relativas à presença de genótipo para anemia
falciforme (Bandas 7, 8, 9 e 10 são amostras)
Figura 5 - Identificação de genótipos para traço falciforme utilizando PCR e enzimas
de restrição.
Fonte: KANGPU XU et al, 1999
Primeiramente, foram analisados os genótipos de um casal com utilização de PCR e
enzimas de restrição, que confirmaram o traço falciforme para ambos após eletroforese. Em
seguida, após fertilização in vitro, seis embriões tiveram amostras de seus blastômeros
retiradas para processamento de PCR mais enzimas de restrição e leitura em eletroforese. O
resultado segue na figura 630
:
27
Figura 6 - Identificação de genótipos para anemia falciforme utilizando PCR e enzimas de
restrição.
Fonte: KANGPU XU et al, 1999
O embrião cujo genótipo se apresentou normal foi implantado no útero da mãe, sendo
este o primeiro caso relatado em que a fertilização in vitro com identificação de genótipo por
PCR, enzimas de restrição com posterior leitura em eletroforese, evoluiu para gravidez não
afetada por anemia falciforme, mesmo com pais portadores de traço falciforme.
O uso da PCR seguida do uso de enzimas de restrição e eletroforese se mostrou
eficiente, portanto, para o diagnóstico de anemia falciforme. Porém, estes métodos se
mostram caros e consomem bastante tempo para a rotina laboratorial30
.
De qualquer forma, é importante considerar medidas de controle, como o correto
aconselhamento genético e educacional, seguido de acompanhamento médico da condição a
fim de se diminuir a morbidade e a mortalidade11.
Baseado no fato de que neste trabalho foi estabelecido um total de nove metodologias
como suporte para comparações e análise, tem-se a seguir um quadro-resumo confeccionado
para resumir as vantagens e desvantagens mencionadas.
28
Tabela 2 - Resumo das metodologias revisadas neste trabalho
Técnicas Vantagens Desvantagens
Hemograma
Fundamental para triagem e
monitoramento.
Não é um exame exclusivo;
automação conta eritroblastos como
leucócitos.
Teste de Solubilidade
Menor custo; Consumo de tempo;
fácil preparação profissional.
Inespecífico durante o período
neonatal; falsos positivos e negativos;
Ineficaz para diferenciação para traço
falciforme.
Teste de Falcização
Baixo custo; fácil execução. Doença
falciforme; traço falciforme;
hemoglobinas não falciformes;
heterozigose dupla de certas
variantes.
Falsos positivos e falsos negativos.
HPLC
Analisador automático; trabalho
manual e tempo poupados;grande
número de amostras processadas
trabalha mesmo com volumes
ínfimos da amostra, até cinco
microlitros.
Alto custo com Equipamento.
IEF
Resolução superior; HbS da HbF de
forma mais evidente; alta
especificidade; reagentes com
mesmo preço para Eletroforese
Alcalina; 72 testes a cada seis horas.
Alto custo com equipamento;
consumo de tempo.
Teste do Pezinho
Teste de Guthrie; Triagem neonatal;
baixo custo; simplicidade de
realização.
Menos sensível e específico que a
automação; prematuridade, transfusão
de sangue no recém-nascido
influenciam resultados; falsos-
positivos e negativos.
PCR e Enzimas de
restrição
Para hemoglobinas semelhantes;
HbS/β-tal., HbS/βδ tal. e
HbS/PHHF;eficiência para
identificação de hemoglobinas em
embriões.
Alto custo; Consumo de tempo para a
realização.
Eletroforese Ácida
Diferenciação das hemoglobinas A2
da C, O e E.
Consumo de tempo; Migrações em
porções iguais.
Eletroforese Alcalina
Diferenciar hemoglobinas A da F
das variantes frequentes; como as
hemoglobinas S e C; eficaz no
período neonatal.
Não faz a diferenciação das
hemoglobinas A2 da C, O e E;
consumo de tempo.
29
3 OBJETIVOS
Realizar uma análise comparativa, por meio de revisão bibliográfica, de metodologias
laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme, estabelecendo, dentre os métodos
estudados, o melhor teste para diagnóstico da doença. Espera-se que este trabalho sirva como
fonte de aprendizado para estudantes, uma vez que as comparações aqui realizadas são
encontradas de uma forma dispersa na literatura.
30
4 MATERIAL E MÉTODO
Para a realização deste trabalho foram utilizados artigos e livros referenciados, assim
como sites reconhecidos pelo meio acadêmico, como SCIELO (Scientific Library Online),
ACT (Academia de Ciência e Tecnologia), ANVISA (Agência Nacional de Vigilância
Sanitária) e Ministério da Saúde.
Algumas referências serviram como fonte para ilustração, como ANDERSON,
Shauna C.; POULSEN, Keila, Atlas de hematologia, NAOUM, 2010, Doenças que alteram os
exames hematológicos, MANUAL de Diagnóstico e Tratamento de Doença Falciformes.
Brasília: ANVISA, 2002 e XU, Kangpu, 1999. First unaffected pregnancy using
preimplantation genetic diagnosis for sickle cell anemia.
A confecção do trabalho foi dividida em duas etapas:
1) Projeto de Trabalho de conclusão de curso;
2) Realização da revisão bibliográfica para comparações de técnicas laboratoriais
para diagnóstico de anemia falciforme.
O trabalho foi, portanto, estruturado por Introdução e Revisão bibliográfica
propriamente dita. Foram escolhidas as seguintes técnicas como fonte de comparação:
Hemograma
Teste de Solubilidade
Teste de Falcização
Eletroforese Ácida
Eletroforese Alcalina
Cromatografia Líquida de Alta Performance
Focalização Isoelétrica
Teste do Pezinho
PCR e enzimas de restrição
Foram procuradas fontes recentes para garantir que as informações apresentadas sejam
atuais, salvo algumas referências mais antigas de grande pertinência para este Trabalho de
Conclusão de Curso.
31
5 CONCLUSÃO
Cada metodologia laboratorial possui sua vantagem e desvantagem, de acordo com o
contexto em que o diagnóstico deverá ser realizado. Entretanto, atualmente, podemos
considerar algumas metodologias mais confiáveis e sensíveis do que outras quando o assunto
é a identificação de hemoglobina S para diagnóstico de anemia falciforme. Se por um lado o
teste de falcização e de solubilidade oferecem menor confiabilidade para tal diagnóstico, os
métodos de eletroforese por focalização isoelétrica e cromatografia líquida de alta resolução
são ótimas alternativas para confirmação.
É importante destacar que para avaliar se há alguma hemoglobinopatia vários testes
podem ser empregados, porém, sempre se deve realizar um teste confirmatório após o sexto
mês de vida. A análise citológica, com eletroforese de hemoglobinas e HPLC formam um
grupo efetivo de técnicas para o diagnóstico da anemia falciforme. Entretanto, não são
técnicas exclusivas e obrigatórias.
Em vista a esses fatos, cada laboratório deve avaliar seu potencial para manutenção
econômica da implementação e constante uso destas técnicas. Se tratando de diagnóstico para
anemia falciforme, torna-se difícil eleger uma das metodologias mencionadas neste trabalho
de conclusão de curso como a melhor sem que o contexto do diagnóstico seja levado em
consideração.
Se por um lado, fatores como facilidade, praticidade, rapidez na execução,
estabilidade, durabilidade dos reagentes e a fácil capacitação de profissionais para execução
da técnica justificam a utilização de métodos menos sensíveis para triagem, por outro o uso de
técnicas mais onerosas, que exijam maior capacitação dos profissionais, retribuem o serviço
laboratorial com melhor confiabilidade e sensibilidade.
32
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