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Velasco M. Ernesto y Ricci L. Joel BIOLOGÍA 208
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA DE LOS DISPENSADORES
UMAR PUERTO ESCONDIDO
INTRODUCCIÓN
El abastecimiento de agua potable para consumo humano con calidad adecuada es indispensable para prevenir y evitar enfermedades que dañan a la salud. En el agua podemos encontrar una gran variedad de microorganismos los cuales afectan a la potabilidad del agua. Además de la flora normal de Bacillus y pseudomanas, en el agua pueden existir microorganismos contaminantes coliformes, tales como la Escherichia coli. Una de las fuentes principales de contaminación del agua potable se da mediante la falta de técnicas adecuadas para el procesamiento del agua y la falta de higiene de quienes la procesan.
Para ello se han establecido normas que dictan los límites permisibles en cuanto a las características microbiológicas, físicas, químicas y radioactivas. Para realizar un análisis de agua potable se necesitan hacer pruebas o experimentos de laboratorio para confirmar su pureza. Esto se hace mediante sembrado de la muestra problema en placas de petri y tubos de ensaye para obtener crecimiento bacteriano y así tener una cepa problema para estudiar. Las técnicas que usualmente se utilizan para una preidentificación de microorganismos coliformes es la Tinción de Gram. Otra prueba que es indispensable para este tipo de análisis son las “pruebas bioqímicas”, muy importantes para una identificación confiable de microorganismos que pudieran existir en dicho líquido. Análisis bacteriológico
Hemos notado, gracias a prácticas realizadas durante el transcurso del semestre, que no sólo el diminuto tamaño de una bacteria dificulta su estudio, sabemos ahora que también lo hace el hecho de que en un diminuto espacio proliferen numerosos organismos con características relativamente distintas entre ellos. Así que la cuestión entonces está en cómo saber quienes son buenos y quienes malos para nuestra salud. Por ello los estudios relacionados con el análisis de muestras agua, alimentos, requieren de una enumeración cuantitativa de los microorganismos presentes en estos compuestos, ya que la calidad microbiológica de estos productos está en relación directa con la calidad sanitaria y la seguridad para el consumo de ellos (Adler, Carmona, & Bojalil, 2008). Ranganna (1986) nos dice que las evaluaciones llevadas a cabo para determinar la calidad del agua para consumo humano en un sentido bacteriológico son:
1. Conteo de placa 2. Conteo de coliformes
- Análisis presuntivo - De confirmación - Análisis completo
3. Evaluación de streptococos fecales
4. Evaluación de clostridium fecales
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Desde el punto de vista microbiológico el más resaltante de los indicadores bacteriológicos es la presencia de bacterias coliformes1. Las características generales que distinguen a éstas radican en su morfología y fisiología (Tabla 1). Dentro de este grupo se encuentran los coliformes fecales (Pascual & Calderón, 2000), que tienen un importante valor en la evaluación sanitaria tomando en cuenta que uno de los factores contaminantes mayormente presentes en el agua son los desechos fecales.
Los coliformes se encuentran generalmente en el tracto intestinal (la más
representativa es Escherichia coli), y se han ganado el puesto como uno de los indicadores más usados de contaminación debido a su frecuencia en heces, a su fácil detección en el laboratorio y a su semejanza con algunos miembros patógenos de la familia Enterobacteriaceae (Pascual & Calderón, 2000).
Existen muchos métodos para cuantificar la población microbiana los cuales incluyen métodos para contar células totales, tanto microorganismos vivos y muertos, también los microscópicos o directos, el uso de contadores electrónicos de células como el contador Coulter, estimación de biomasa celular, lecturas turbidimétricas que se relacionan con el aumento de la población y métodos para cuenta de células viables como son los de cuenta en placa de unidades formadoras de colonias, del número más probable y filtración en membrana (Adler, Carmona, & Bojalil, 2008).
Para realizar el análisis de una muestra de agua se debe de tener en cuenta la
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-127-SSA1-1994, "SALUD AMBIENTAL, AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO-LIMITES PERMISIBLES DE CALIDAD Y TRATAMIENTOS A QUE DEBE SOMETERSE EL AGUA PARA SU POTABILIZACION", que establece los límites permisibles de calidad del agua potable. El punto que nos interesa a nosotros son las siguientes.
1 Coliforme significa con forma de coli. La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies
bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos. 2 El Indol es un compuesto orgánico heterocíclico que puede ser producido por las bacterias al ser
degradado del triptófano, un amino ácido esencial en la nutrición humana.
Tabla 1.- Caracteristicas de los coliformes totales y coliformes fecales
CCoolliiffoorrmmeess:: CCaarraacctteerreess mmoorrffoollóóggiiccooss yy
ffiissiioollóóggiiccooss CCoolliiffoorrmmeess ffeeccaalleess::
PPrriinncciippaalleess ccaarraacctteerrííssttiiccaass
Aerobias o anaerobias facultativas Aptitud para desarrollarse entre 43,5-45, °C
Bacilos Gram negativos Capacidad para crecer en presencia de sales biliares. Aerobias o anaerobias
No esporógenas Facultad para producir indol2 en agua de peptona. Lactosa-positivos 35 °C en 48 horas
Fuente: Microbiología alimentaria: Metodología analítica para alimentos y bebidas (Pascual & Calderón, 2000)
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Límites permisibles de características bacteriológicas
El contenido de organismos resultante del examen de una muestra simple de agua, debe ajustarse a lo establecido en la Tabla 1.
Tabla 2.- Límites permisibles de características bacteriológicas
CARACTERÍSTICAS LÍMITE PERMISIBLE
Microorganismos coliformes totales 2 NMP/100 mL 2 UFC/100 mL
Microorganismos coliformes fecales
No detectable NPM/100 mL Cero UFC/100 mL
Los resultados de los exámenes bacteriológicos se deben reportar en unidades de NMP/100 ml (número más probable por 100 ml), si se utiliza la técnica del número más probable o UFC/100 ml (unidades formadoras de colonias por 100 ml), si se utiliza la técnica de filtración por membrana.
Existen otros límites permisibles de características del agua, pero para este caso no es de nuestro interés.
Agares diferenciales utilizados en la práctica y sus características
En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).
El agar EMB contiene colorantes de azul de metileno y eosina, que inhiben las bacterias gram-positivas en cierto grado. Los colorantes también actúan como indicadores diferenciales en respuesta a la fermentación de la lactosa o la sacarosa por parte de los microorganismos. Los coliformes producen colonias de color negro azulado, mientras que las colonias de Salmonella y Shigella son incoloras o de color ámbar transparente. Las colonias de Escherichia coli pueden exhibir un brillo verde metálico característico debido a la rápida fermentación de la lactosa. Este medio puede inhibir el crecimiento de las bacterias gram-positivas como los estreptococos fecales, estafilococos y levaduras, o bien favorecer su crecimiento con formación de colonias puntiformes.
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PRUEBAS BIOQUÍMICAS Una identificación bacteriana se puede realizar tras el estudio de las características tintoriales, morfológicas y bioquímica de los microorganismos. La identificación bioquímica se fundamenta en las características metabólicas específicas de cada microorganismo, en la detección de la actividad de ciertas enzimas (Gamazo, López, & Ramón, 2005). Las pruebas bioquímicas más utilizadas y de mayor alcance para nosotros son las siguientes: Fermentación de carbohidratos
Es realizada por bacterias facultativas bajo condiciones de anaerobiosis, es una oxidación incompleta. Un metabolito, derivado del sustrato que se fermenta, actúa como aceptor final de electrones. Los productos de fermentación son frecuentemente ácidos orgánicos, alcoholes y otras sustancias de bajo peso molecular, incluido gases como hidrógeno y CO2 (Rodríguez, 2005). Catalasa
En los ambientes acuosos, como el citoplasma de las células, aparecen formas toxicas derivadas del mismo. Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un equipo enzimático capaz de neutralizar estas formas toxicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa que convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular. Cuando se ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con peróxido de hidrógeno al 3% se producen burbujas de oxigeno. Esta prueba se puede emplear para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo) así como bacillus (catalasa positivo) de clostrudium (catalasa negativo) (Gamazo, López, & Ramón, 2005). Licuefacción de gelatina
La gelatina es una proteína fibrosa que se obtiene al hervir huesos, cartílagos y otros tejidos conectivos que al enfriarse forma un gel. Ciertos microorganismos tienen habilidad para romper la molécula mediante la exoenzima gelatinasa, liberando aminoácidos que se usan como nutrientes. La gelatina hidrolizada se vuelve líquido. Se siembra en tubos de ensaye con gelatina, y se siembra en el centro por picadura, se incuba a 37 °C durante 24 h (Roberto, 2004).
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Prueba de motilidad
Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo algunas formas de cocos son móviles. Las especies bacterianas pueden contener un flagelo o muchos; además su localización varía dependiendo de la especie bacteriana y con las condiciones de cultivo. A veces las variantes de motilidad producen variantes no móviles que parecen ser estables y raramente se invierten en formas móviles. Los organismos que no son móviles no presentan flagelos (Ruiz, 2010). Producción de H2S
Algunas especies bacterianas heterotróficas son capaces de liberar azufre enzimáticamente de los diferentes aminoácidos que lo contienen, produciendo gas, ácido sulfhídrico. La peptona, la cisteína y el tiosulfato son fuentes de azufre, la enzima responsable de esta actividad es la cisteinasa .Existen medios de cultivo que contienen peptona y hierro, que sirven para detectar la producción de ácido sulfhídrico entre las enterobacteriaceae, los indicadores del ácido sulfhídrico varían entre estos medios , hierro, sulfato ferroso, sulfato de amonio ferroso o férrico , tiosulfato de sodio o sulfito de bismuto, sin embargo el principio es el mismo (Ruiz, 2010).
Tabla 3.- Interpretación de Resultados para Pruebas Bioquímicas
PRUEBA POSITIVO NEGATIVO
Fermentacion De Carbohidratos
a) Ácido pH 6.8 b) Color amarillo c) Producción de gas variable Positivo para gas 1. Aerogénico: CO2 + H2 2. Se observan burbujas de gas en el tubo Durham, o el medio se halla completamente desplazado por el gas que deja una parte sin colorear en el tubo incluido.
a) Alcallina b) Color rosa-rojizo Negativo para gas 1. Anaerogénica 2. No se observan burbujas de gas y el medio del tubo de Durham se mantiene amarillo.
Catalasa Formación inmediata de burbujas (O2).
No forma burbujas.
Licuefaccion De Gelatina
a) Medio licuado b) Tubo control: medio sólido
a) El medio se mantiene sólido volver a incubar durante un periodo adicional. b) Tubo control: medio sólido
Los microorganismos móviles migran en la línea de siembra y se difunden en el medio,
Crecimiento microbiano acentuado siguiendo la línea de siembra, el medio
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Prueba De Motilidad provocando turbiedad, pueden mostrar un crecimiento en estrías vellosas.
circundante se mantiene claro.
Produccion De H2s
Se observan colonias negras rodeadas de una zona negro-parduzca en el medio. a) El diámetro de la zona puede ser varias veces el tamaño de la colonia. b) La superficie de la zona puede mostrar un reflejo metálico.
No se desarrolla ennegrecimiento ni reflejo Metálico.
OBJETIVO
Determinar el grado de contaminación bacteriológico al que están expuestos los consumidores de los distintos dispensadores de agua en la UMAR campus Puerto Escondido, para determinar si en realidad ésta es apta para su consumo. PROCEDIMIENTO
El procedimiento se desglosará de manera global en el siguiente diagrama de flujo enfocándonos a los pasos que se siguieron (sin anotación de materiales) desde la toma de muestra hasta las pruebas bioquímicas.
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SI
0.5 mL
Cantidad
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA DE LOS
DISPENSADORES UMAR
EVALUACIÓN DE MEDIOS A SEMBRAR
PREPARACIÓN DE MEDIOS
Agar MacConkey
Agar EMB
TOMA DE MUESTRA
Dispensador centro de idiomas UMAR
SIEMBRA 0.5 mL
100 mL de H20
Diluciones
1/10 1/100 En placas petri
RESIEMBRA
Caldo rojo fenol con manitol
Gelatina nutritiva
Agar nutritivo
Agar nutritivo semisólido
Agar sulfito de bismuto
Cepa puro
Crecimiento
RESIEMBRA
PREPARACIÓN DE MEDIOS
PARA PRUEBAS BIQUÍMICAS
Incubación a 37 °C/24h
Incubación a 37 °C/24 h
En agar nutritivo
¿Crecimiento?
Esterilizar
NO
Catalasa
Producción de H2O
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CORRESPONDIENTES
Tinción Gram
Prueba de motilidad
INCUBACIÓN A 37 °c/24-48 h Realizar
Fermentación de carbohidratos
Licuefacción de gelatina
Realizar
Placa Agar MacConkey
Tabla 5. Características macroscópicas de las colonias en medio diferencial MacConkey
Colonias Forma Elevación Borde Color
Irregular Umbilicada Lobulado Amarillo opaco
Irregular Planoconvexa Ondulado Morado metálico
Circular Convexa Redondo Rosa café
Resultados para la evaluación de coliformes en agua:
Dispensario del centro de idiomas
Resiembra en agar nutritivo para obtención de cepa pura.
Cepas útiles para realización de pruebas bioquímicas
Resiembra en agar nutritivo para obtención de cepa pura.
Resultados para la evaluación de coliformes en agua:
Dispensario del centro de idiomas
MovilidadBacilosGram Negativo
No se observó movilidad
CocosGram Positivo
Con tinción de Gram 100x Con tinción de Gram 100x
En fresco 100x En fresco 100x
De acuerdo con los resultados y la bibliografía
es posiblemente:Enterococcus faecalis
De acuerdo con los resultados y la bibliografía
es posiblemente:Klebsiella pneumoniae
Tabla 8. RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE COLIFORMES MEDIANTE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Prueba BQ Cepa A Resultado Cepa Z Resultado
Fermentación de carbohidratos
Medio con color naranja intenso, sin crecimiento.
Medio color naranja intenso, sin crecimiento.
Prueba de la catalasa
Sin producción de espuma (no hubo liberación de Oxígeno
gaseoso)
Sin producción de espuma (no hubo liberación de Oxígeno
gaseoso)
Prueba de motilidad
Sin crecimiento más allá de la región inoculada.
Con ligero crecimiento mostrando una región difusa
alrededor de la región inoculada.
Producción de H2S
Sin crecimiento en placas con agar sulfito de bismuto.
Sin crecimiento en placas con agar sulfito de bismuto.
Tabla 6. Características de las colonias en medios de cultivo diferenciales
Agar Colonia A Colonia Z Colonia X
Agar MacConkey
Color amarillo Color rosado-café
Color morado metálico
Agar EMB No se realizó resiembra
Color morado-rosado
No se realizó resiembra
Tabla 7. Resultados de tinción y observación microscópica
CepaResultado
GramMorfología
A Cocos
Z Bacilos (forma ovoide)
X Bacilos alargados
Nota: Las colonias en agar MacConkey A y Z fueron después resembradas para su evaluación
en medios de agar nutritivo y las cepas puras obtenidas fueron nombradas respectivamente de acuerdo al nombre de la colonia original.
Resultados para la evaluación de coliformes en agua:
Dispensario del centro de idiomas
Velasco M. Ernesto y Ricci L. Joel BIOLOGÍA 208
CONCLUSIÓN
Después de varias sesiones en donde se realizaron los distintos procedimientos para el análisis de agua, llegamos a la conclusión de que las dos cepas estudiadas son géneros distintos debido a las características morfológicas observadas. La cepa A se identificó como coco Gram positivo y la cepa Z como bacilo Gram negativos.
De a cuerdo a las características observadas y comparando con imágenes de libros, paginas científicas en internet se deduce que la cepa A posiblemente sea Estreptococo fecalis, actualmente conocido como Enteroccoccus faecalis, ya que las características que manejan los libros se asemeja mucho a la cepa estudiada tanto en las características tintoriales como a las características bioquímicas. La cepa Z de la misma manera recopilando información se deduce que posiblemente sea la especie Klebsiella sp. por la semejanza que presentan tanto en las características tintoriales como bioquímicas.
Bibliografía Adler, I., Carmona, G., & Bojalil, J. A. (Octubre de 2008). Manual de Capacitación de aguas de Lluvia para centros Urbanos. Recuperado el 19 de Mayo de 2010, de Programa de las Naciones Unidad para el medio ambiente: http://www.pnuma.org/recnat/esp/documentos/MANUALDECAPTACION%20oct%202008.pdf Gamazo, C., López, G. I., & Ramón, D. (2005). Manual práctico de MICROBIOLOGÍA (Tercera edición ed.). Barcelona, España: MASSON, S.A. Pascual, M. d., & Calderón, V. (2000). Microbiología alimentaria: Metodología analítica para alimentos y bebidas. Ediciones Díaz de Santos. Roberto, A. L. (2004). Manual de prácticas de Microbiologá básica y Microbiología de alimentos (Primera edición ed.). Ciudas Juarez, Chihuahua, México: editorial UACJ. Rodríguez, C. E. (2005). Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. Costa Rica: Editorial Universidad de Costa Rica. Ruiz, R. F. (01 de marzo de 2010). Biología de Procariotas. Recuperado el 23 de junio de 2010, de Pruebas bioquímicas: Prueba motilidad: http://biolprocariotas.files.wordpress.com/2010/03/pract-131.pdf
