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Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora ... · PDF file motor de actina / miosina, es conocido como motilidad de deslizamiento ( gliding motility ), y está situado

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  • UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRE TO

    Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora

    caninum

    Luciana Baroni

    Ribeirão Preto 2012

  • UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRE TO

    Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora

    caninum

    Dissertação de Mestrado Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia para obtenção do Título de Mestre em Ciências Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia. Orientada: Luciana Baroni Orientadora: Ana Patrícia Yatsuda Natsui

    Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia em 22/10/2012. A versão original encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP.

    Ribeirão Preto 2012

  • AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

    Baroni, Luciana

    Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora

    caninum, 2012.

    73p. : il. ; 30 cm

    Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências

    Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de Concentração:

    Biociências Aplicadas à Farmácia.

    Orientadora: Yatsuda, Ana Patrícia

    1. Neospora caninum. 2. Apicomplexa. 3. Actina.

  • FOLHA DE APROVAÇÃO

    Autora: Luciana Baroni Título : Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora caninum

    Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia para obtenção do Título de Mestre em Ciências Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia. Orientadora: Ana Patrícia Yatsuda Natsui

    Aprovado em:

    Banca Examinadora

    Prof.Dr._____________________________________________________________

    Instituição:___________________________Assinatura:_______________________

    Prof.Dr._____________________________________________________________

    Instituição:___________________________Assinatura:_______________________

    Prof.Dr._____________________________________________________________

    Instituição:___________________________Assinatura:_______________________

  • Aos meus pais,

    Arnaldo e Neide,

    e ao meu irmão, Leandro,

    pelo grande incentivo.

  • AGRADECIMENTOS

    À Profa. Dra. Ana Patrícia Yatsuda Natsui pela excelente orientação, pela confiança,

    pela oportunidade de realizar esse trabalho e pelo incentivo.

    À Profa. Dra. Maria Cristina Nonato e ao Prof. Dr. Sérgio Akira Uyemura pelas

    valiosas dicas que engrandeceram este trabalho.

    Aos docentes do Programa de Biociências Aplicadas à Farmácia pelos

    ensinamentos durante as disciplinas.

    Ao Maarten Altelaar, Ph.D e Albert Heck, Ph.D do Biomolecular Mass Spectrometry

    and Proteomics Group da Universidade de Utrecht pelas análises de espectrometria

    de massas.

    À funcionária técnica do laboratório de Parasitologia Molecular da FCFRP-USP

    Maraísa Palhão Verri por todo o auxílio e por levar tanta alegria ao laboratório.

    Ao Laboratório de Bioquímica da FCFRP-USP pelo uso da ultracentrífuga e,

    principalmente, às funcionárias técnicas Ana Cristina Morseli Polizello, Ana Elisa

    Caleiro Seixas Azzolini e Ieda Maria Razaboni Prado pelo auxílio.

    À colega e doutoranda Letícia Pollo de Oliveira pela gentileza de analisar as

    amostras de espectrometria de massas e, principalmente, pelo apoio e amizade

    dentro e fora do laboratório.

    Ao colega e doutorando Luiz Miguel Pereira (o Buda) pela valiosa ferramenta

    pGEM/pET e pelos inúmeros auxílios durante a execução do trabalho, além dos

    momentos de descontração e amizade.

    À colega Aline Bononi (iniciação científica) pela espontaneidade e pelos momentos

    divertidos no laboratório.

  • À Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Pessoal de Nível Superior (CAPES)

    pela bolsa de mestrado.

    À amiga Ana Beatriz Barbosa dos Santos por todos esses anos de amizade e,

    principalmente, pela companhia durante o período de mestrado.

    À todas as pessoas que fizeram parte da minha vida e, de alguma maneira,

    colaboraram para esse trabalho.

    Meu mais profundo agradecimento.

  • “Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre ombros de gigantes.”

    Isaac Newton

  • SUMÁRIO

    Resumo Abstract Resumen Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de Abreviaturas e Siglas

    i ii

    iii iv vi

    vii

    1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................1 1.1 Ciclo de vida.......................................................................................................2 1.2 O ciclo de invasão dos Apicomplexas ................................................................3 1.2.1 O modelo de motilidade por deslizamento dos Apicomplexas ........................4 1.3 Actina .................................................................................................................6 1.3.1 Actina nos parasitas Apicomplexas.................................................................8 1.3.2 Drogas com interferências na dinâmica da actina...........................................9 1.3.3 Actina em Neospora caninum e justificativa ...................................................10 2. OBJETIVOS....................................... .................................................................11 2.1 Gerais ...............................................................................................................11 2.2 Específicos .......................................................................................................11 3. MATERIAL E MÉTODOS .............................. .....................................................12 3.1 Manutenção do Parasita: cultura in vitro e purificação dos taquizoítas de N. caninum .........................................................................................................12 3.2 Seleção e análise da sequência NcAct .............................................................12 3.3 Clonagem .........................................................................................................13 3.3.1 Delineamento de oligonucleotídeos (primers) ................................................14 3.3.2 Clonagem da sequência NcAct-base ............................................................14 3.3.2.1 Isolamento do RNA total..............................................................................14 3.3.2.2 Síntese de cDNA.........................................................................................15 3.3.2.3 Reação de Polimerase em cadeia (PCR) ...................................................15 3.3.2.4 Ligação em vetor de clonagem e transformação em célula eletrocompetente ....................................................................................................16 3.3.3 Clonagem da sequência Ncct201-310 ............................................................................................. 16 3.3.3.1 Reação de polimerase em cadeia (PCR) ....................................................16 3.3.3.2 Ligação em vetor de clonagem e transformação em células eletrocompetentes ...................................................................................................17 3.3.3.3 Obtenção da sequência NcAct201-310 e do plasmídeo de Expressão .............................................................................................................17 3.3.3.4 Reação de ligação do vetor expressão com a sequência NcAct201-310.................................................................................................................................................................18 3.3.4 Purificação dos plasmídeos (minipreps).........................................................19 3.3.5 Eletroforese em gel de agarose .....................................................................20 3.3.6 Purificação em gel de agarose .......................................................................20 3.3.7 Preparação de células eletrocompetentes .....................................................21 3.3.8 Transformação em cepas de E. coli eletrocompetentes.................................21 3.4 Expressão, análise e purificação da proteína recombinante His-NcAct201-310 .......................................................................................................................................................22

  • 3.4.1 Extração total .................................................................................................22 3.4.2 Extração solúvel e insolúvel

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