UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRE TO
Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora
caninum
Luciana Baroni
Ribeirão Preto
2012
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRE TO
Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora
caninum
Dissertação de Mestrado Apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biociências Aplicadas à Farmácia para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Área de Concentração: Biociências
Aplicadas à Farmácia.
Orientada: Luciana Baroni
Orientadora: Ana Patrícia Yatsuda Natsui
Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia em 22/10/2012. A versão original
encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto/USP.
Ribeirão Preto
2012
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Baroni, Luciana
Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora
caninum, 2012.
73p. : il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de Concentração:
Biociências Aplicadas à Farmácia.
Orientadora: Yatsuda, Ana Patrícia
1. Neospora caninum. 2. Apicomplexa. 3. Actina.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Autora: Luciana Baroni
Título : Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora caninum
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em
Biociências Aplicadas à Farmácia para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Área de Concentração: Biociências
Aplicadas à Farmácia.
Orientadora: Ana Patrícia Yatsuda Natsui
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof.Dr._____________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:_______________________
Prof.Dr._____________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:_______________________
Prof.Dr._____________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:_______________________
Aos meus pais,
Arnaldo e Neide,
e ao meu irmão, Leandro,
pelo grande incentivo.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Ana Patrícia Yatsuda Natsui pela excelente orientação, pela confiança,
pela oportunidade de realizar esse trabalho e pelo incentivo.
À Profa. Dra. Maria Cristina Nonato e ao Prof. Dr. Sérgio Akira Uyemura pelas
valiosas dicas que engrandeceram este trabalho.
Aos docentes do Programa de Biociências Aplicadas à Farmácia pelos
ensinamentos durante as disciplinas.
Ao Maarten Altelaar, Ph.D e Albert Heck, Ph.D do Biomolecular Mass Spectrometry
and Proteomics Group da Universidade de Utrecht pelas análises de espectrometria
de massas.
À funcionária técnica do laboratório de Parasitologia Molecular da FCFRP-USP
Maraísa Palhão Verri por todo o auxílio e por levar tanta alegria ao laboratório.
Ao Laboratório de Bioquímica da FCFRP-USP pelo uso da ultracentrífuga e,
principalmente, às funcionárias técnicas Ana Cristina Morseli Polizello, Ana Elisa
Caleiro Seixas Azzolini e Ieda Maria Razaboni Prado pelo auxílio.
À colega e doutoranda Letícia Pollo de Oliveira pela gentileza de analisar as
amostras de espectrometria de massas e, principalmente, pelo apoio e amizade
dentro e fora do laboratório.
Ao colega e doutorando Luiz Miguel Pereira (o Buda) pela valiosa ferramenta
pGEM/pET e pelos inúmeros auxílios durante a execução do trabalho, além dos
momentos de descontração e amizade.
À colega Aline Bononi (iniciação científica) pela espontaneidade e pelos momentos
divertidos no laboratório.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela bolsa de mestrado.
À amiga Ana Beatriz Barbosa dos Santos por todos esses anos de amizade e,
principalmente, pela companhia durante o período de mestrado.
À todas as pessoas que fizeram parte da minha vida e, de alguma maneira,
colaboraram para esse trabalho.
Meu mais profundo agradecimento.
“Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre ombros de gigantes.”
Isaac Newton
SUMÁRIO
Resumo
Abstract
Resumen
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas e Siglas
i
ii
iii
iv
vi
vii
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................1
1.1 Ciclo de vida.......................................................................................................2
1.2 O ciclo de invasão dos Apicomplexas ................................................................3
1.2.1 O modelo de motilidade por deslizamento dos Apicomplexas ........................4
1.3 Actina .................................................................................................................6
1.3.1 Actina nos parasitas Apicomplexas.................................................................8
1.3.2 Drogas com interferências na dinâmica da actina...........................................9
1.3.3 Actina em Neospora caninum e justificativa ...................................................10
2. OBJETIVOS....................................... .................................................................11
2.1 Gerais ...............................................................................................................11
2.2 Específicos .......................................................................................................11
3. MATERIAL E MÉTODOS .............................. .....................................................12
3.1 Manutenção do Parasita: cultura in vitro e purificação dos taquizoítas
de N. caninum .........................................................................................................12
3.2 Seleção e análise da sequência NcAct .............................................................12
3.3 Clonagem .........................................................................................................13
3.3.1 Delineamento de oligonucleotídeos (primers) ................................................14
3.3.2 Clonagem da sequência NcAct-base ............................................................14
3.3.2.1 Isolamento do RNA total..............................................................................14
3.3.2.2 Síntese de cDNA.........................................................................................15
3.3.2.3 Reação de Polimerase em cadeia (PCR) ...................................................15
3.3.2.4 Ligação em vetor de clonagem e transformação em célula
eletrocompetente ....................................................................................................16
3.3.3 Clonagem da sequência Ncct201-310 ............................................................................................. 16
3.3.3.1 Reação de polimerase em cadeia (PCR) ....................................................16
3.3.3.2 Ligação em vetor de clonagem e transformação em células
eletrocompetentes ...................................................................................................17
3.3.3.3 Obtenção da sequência NcAct201-310 e do plasmídeo de
Expressão .............................................................................................................17
3.3.3.4 Reação de ligação do vetor expressão com a sequência
NcAct201-310.................................................................................................................................................................18
3.3.4 Purificação dos plasmídeos (minipreps).........................................................19
3.3.5 Eletroforese em gel de agarose .....................................................................20
3.3.6 Purificação em gel de agarose .......................................................................20
3.3.7 Preparação de células eletrocompetentes .....................................................21
3.3.8 Transformação em cepas de E. coli eletrocompetentes.................................21
3.4 Expressão, análise e purificação da proteína recombinante
His-NcAct201-310 .......................................................................................................................................................22
3.4.1 Extração total .................................................................................................22
3.4.2 Extração solúvel e insolúvel
