Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA

ELAINE FLAMIA TONIOLO

Ação da proteína-quinase ativada por RNA na

neurobiologia da dor crônica de origem inflamatória

RIBEIRÃO PRETO-SP

2010

Livros Grátis

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA




RIBEIRÃO PRETO-SP

2010




Dissertação

Ribeirão Preto

2010

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/Universidade de São Paulo como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Fisiologia Orientador: Prof. Dr. Guilherme A. Lucas

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICOVEÍCULO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Toniolo, Elaine Flamia.

Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia da dor crônica de origem inflamatória. Ribeirão Preto, 2010.

67 p.

Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ Universidade de São Paulo. Área de concentração: Fisiologia.

Orientador: Lucas, Guilherme.

1.Proteína-quinase dependente de RNA. 2. Dor crônica. 3. Dor inflamatória. 4. Gânglio da raiz dorsal. 5. Corno dorsal da medula espinhal.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Elaine Flamia Toniolo

Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia da dor crônica de

origem inflamatória.

Aprovado em: ___/___/___

Banca examinadora

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição: _____________________________Assinatura_________________

Prof. Dr. ________________________________________________________


Prof. Dr. ________________________________________________________


Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Fisiologia

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/

Universidade de São Paulo como requisito

para a obtenção do grau de Mestre em

Ciências.

Área de concentração: Fisiologia

Trabalho realizado no Laboratório de Neurofisiologia da Dor, do Departamento

de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de

São Paulo, com o auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP) processo 2007/06780-7 e 2008/04994-2;

Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(FAEPA) e Pró-Reitoria de Pesquisa da USP.

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação a quatro pessoas de fundamental importância em

minha vida. Aos meus pais, José Cleto e Maria Olinda que nunca mediram

esforços para que eu pudesse buscar todos meus objetivos, mesmo que para

isso fosse necessário passar por muitas privações. A minha irmã e grande

amiga Alessandra, que sempre me incentivou e acreditou que fosse capaz de

conquistar tudo o que desejasse. E ao meu companheiro Thiago, que esteve

ao meu lado me ajudando a superar todas as angustias e me proporcionando

muitas alegrias. Obrigada a todos e amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

Ao meu Orientador Guilherme Lucas por sua orientação e atenção no decorrer

do desenvolvimento de todo o trabalho.

Ao Prof. Dr. Fernando Luiz Lucca que cedeu seu laboratório para que

pudéssemos utilizá-lo para o desenvolvimento deste trabalho, juntamente com

o auxílio de suas técnicas Cacilda Dias Pereira e Zuleica Aparecida S. de

Morais e alunas de pós-graduação Thais e Vivi que sempre estavam dispostas

a ajudar.

Ao Dr. Luiz Carlos dos Reis do Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer de

São Paulo por fornecer os animais PKR+/+ e PKR +/-.

À Profª. Angela Kaysel Cruz por disponibilizar o aparelho de Real Time PCR.

Aos membros da banca Prof. Dr. Luiz Guilherme de Sirqueira Branco e a Prof.

Dra. Maria Inês Nogueira.

À Sônia Zanon, além de técnica do laboratório é uma grande amiga e

companheira de experimentos, que apenas tenho muito a agradecer.

Ao Ricardo e a Maria Ida, pessoas que tenho a agradecer pelos ensinamentos

e participação no desenvolvimento do projeto.

A Paula, pela sua participação sempre que necessária no desenvolvimento do

projeto e pelas conversas.

Ao Adriano que além da participação inicial no desenvolvimento do projeto e

ensinamentos, também tenho que agradecer pela amizade, apoio e pelas

muitas risadas. Valeu Brother!

Aos companheiros de laboratório pela colaboração sempre que necessário:

Flaviane, Maurício, Karina, Rodrigo (Mion), Carla, Pedro, Josi e Thiago.

Aos amigos e companheiros do Departamento de Fisiologia: Thiago, André,

Cadu, Pedro, Dani e Prof. Ricardo Leão.

Ao Thiago por toda sua paciência, compreensão, amor, carinho, por toda sua

dedicação durante todos esses anos, e acima de tudo pela sua amizade e

cumplicidade... Amo você!

Ao André e Adriano que sempre que necessário me deram o ombro amigo.

Muito obrigada pelas intermináveis conversas, por toda a atenção despendida,

por todas as risadas (e foram muitas), enfim por todo o companheirismo. O que

mais posso dizer... só que Adoro vocês!

A todos da minha família que sempre acreditaram na minha capacidade e

torceram por mim em todas as etapas, principalmente aos meus pais e meus

avós: Demétrio, Ignez, Nilson e Ana que sempre me deram todo apoio.

As minhas amigas Edinalva e Édina que mesmo longe continuam me dando

força.

A todos da secretaria do Departamento de Fisiologia: Elisa, Cláudia, Fernando

e Carlos, que sempre estavam dispostos a ajudar.

Aos bioteristas Leonardo e Eduardo.

A todos os demais funcionários do Programa de Pós-Graduação do

Departamento de Fisiologia e da Faculdade de Medicina.

Ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/

Universidade de São Paulo.

Ao auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP) e Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo (FAEPA) e Pró-Reitoria de Pesquisa da USP.

ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS

aCSF – Artificial cerebro spinal fluid / Fluido cerebrospinal artificial

BDNF – Brain-derived neurotrophic factor / Fator Neurotrófico derivado do cérebro

CETEA – Comissão de Ética em Experimentação Animal

CFA – Complete Freund’s Adjuvant /Adjuvante Complemento de Freund

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

Ct – Cycle threshold

DNA – Deoxyribonucleic acid / Ácido desoxirribonucléico

eIF2α – eukaryotic initiation factor 2 alpha

ERK – Extracellular signal-regulated kinase

ERK-2 – Extracellular signal-regulated kinase-2

GDR – Dorsal root ganglion / Gânglio da raiz dorsal

IFN – Interferon

IFN γ – Interferon γ

IKK – Ikappa kinase

IL– Interleucina

IL- 1ß – Interleucina 1ß

IL-6 – Interleucina 6

IL-8 – Interleucina 8

IRF-1 – Interferon regulatory factor-1

I.T. – Intra tecal

JNK – c-Jun N-terminal kinase

Kb – Kilobase

KDa – Quilodaltons

L4 – Vértebra lombar 4



Log – Logaritmo

LPS – Lipopolysaccharide

MAPK – Mitogen-activated protein kinases

mA – Miliampére

mL – Mililitro

nº – Número

NF-ҚB – Fator nuclear-ҚB

NGF – Fator de crescimento neural

NK-1 – Neuroquinina-1

NMDA – N-Methyl-D-Aspartate

NPY – Neuropeptídeo Y

NT-4 – Neurotrophin 4

PCR – Reação em cadeia da polimerase

PKR – Protein kinase – R / Proteína quinase – R

RNA – Ribonucleic acid / Ácido ribonucléico

RNAfd – Double-stranded-RNA / Ácido ribonucleico de fita dupla

RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro

RT – Real time / Tempo real

RT – Transcript reversal / Transcrição reversa

S – Segundos

SCI – Spinal Cord Injury / Injuria na medula espinal

Sham – Grupo controle

SNC – Sistema Nervoso Central

STAT – Signal transducers and activators of transcription

STAT-1– Signal transducers and activators of transcription-1

STAT-3 – Signal transducers and activators of transcription-3

TLR – Toll-like receptor

TLR 1 – Toll-like receptor 1



TLR 4– Toll-like receptor 4


TLR 6– Toll-like receptor 6


TRP – Transient receptor potential / Receptor de potencial transiente

TRPV 1 – Transient receptor potential vanilloid 1/ Receptor de potencial transiente vaniloide 1

TNFα – Fator α de necrose tumoral

µg – Micrograma

µL – Microlitro

V – Volt

VPL – Ventral posterior lateral

VPM – Ventral posterior medial

∆ – Delta

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Representação esquemática das principais vias ascendentes

ântero-laterais de transmissão da dor.................................................................6

FIGURA 2: Representação esquemática dos múltiplos fatores envolvidos na

transmissão e modulação da informação nociceptiva.........................................9

FIGURA 3: Mecanismo de interação PKR/RNAfd.............................................11

FIGURA 4: Mecanismos extra e intracelulares de ativação da PKR.................14

FIGURA 5: Mecanismo de ação de PKR sobre a atividade de NFB...............17

FIGURA 6: Fotografia representativa do teste de sensibilidade mecânica...... 26

FIGURA 7: Representação esquemática do gânglio da raiz dorsal e da coluna

dorsal da medula espinal entre L4 e L6.............................................................27

FIGURA 8: Fotografia representativa do equipamento para a realização do

teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico.....................................29

FIGURA 9: Caracterização dos mecanismos envolvidos na reação de

transcrição reversa e na reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real...31

FIGURA 10: Representação esquemática do protocolo experimental

empregado para a identificação do perfil de expressão do RNAm de PKR no

gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinal durante processo

inflamatório........................................................................................................33

FIGURA 11: Diagrama demonstrando a inserção da agulha no espaço

intervertebral entre L5 e L6, utilizado na técnica de injeção intratecal..............35

FIGURA 12: Representação esquemática do protocolo experimental do

monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico

antes e durante processo inflamatório; e antes e após injeção intratecal de

Inibidor de PKR e Controle Negativo de Inibidor de PKR..................................37

FIGURA 13: Representação esquemática do protocolo experimental

empregado para a imunodetecção das proteínas p38, JNK e p42/ p44 e seus

resíduos fosforilados no gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula

espinal durante processo inflamatório...............................................................40

FIGURA 14: Expressão relativa do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal e

no corno dorsal da medula espinal em animais submetidos a inflamação

crônica...............................................................................................................42

FIGURA 15: Imunohistoquímica para a proteína p-PKR no corno dorsal da

medula espinal.................................................................................................. 44

FIGURA 16: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais

PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação térmica.................................................46

FIGURA 17: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais

PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação mecânica.............................................47

FIGURA 18: Efeito da injeção intratecal (i.t) de inibidor de PKR sobre a

hipernocicepção térmica induzida pela administração subcutânea de CFA em

camundongos C57BL/6.....................................................................................49

FIGURA 19: Inflamação crônica induz a fosforilação de p38 na coluna dorsal

da medula espinal de camundongos C57BL/6/ JUnib...................................... 51

FIGURA 20: Inflamação crônica induz a fosforilação de JNK na coluna dorsal

da medula espinal de camundongos C57BL/6/ JUnib.......................................52

FIGURA 21: Inflamação crônica não induz a fosforilação de p42/44 na coluna

dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6/JUnib.............................53

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..........................................................................................3

1.1. Neurobiologia da dor....................................................................3

1.2. Plasticidade neural induzida por doença inflamatória

crônica...........................................................................................7

1.3. Proteína-quinase ativada por RNA (PKR)...................................9

1.3.1. Regulação da sinalização intracelular a partir da

fosforilação de PKR...........................................................11

2. OBJETIVOS............................................................................................18

3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................19

3.1. Animais........................................................................................19

3.2. Modelo experimental de dor crônica de origem inflamatória

periférica....................................................................................20

3.2.1. Grupos experimentais referentes à expressão do

RNAm do gene pkr......................................................20

3.2.2. Grupos experimentais referentes à

Imunohistoquímica...................................................... 21

3.2.3. Grupos experimentais referentes ao comportamento

dos animais PKR+/- e PKR+/+...........................................21

3.2.4. Grupos experimentais referentes à injeção intratecal

do inibidor de PKR.........................................................22

3.2.5. Grupos experimentais relacionados à imunodetecção

do estado de fosforilação das proteínas p38, JNK e

p42/44..............................................................................23

3.3. Monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo

mecânico antes e após a inflamação periférica gerada por

CFA e Óleo Mineral para o monitoramento de

alodínia.......................................................................................24


nociceptivo térmico..................................................................27

3.5. Extração de RNA total...............................................................29

3.6. Transcrição reversa....................................................................30

3.7. Reação em cadeia da polimerase em tempo real....................31

3.8. Imunohistoquímica.....................................................................33

3.9. Técnica de Injeção intratecal.....................................................34

3.10. Imunodetecção do estado de fosforilação da proteína PKR no

gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinhal

durante a doença inflamatória crônica.....................................37

4. RESULTADOS........................................................................................41

5. DISCUSSÃO...........................................................................................55

6. CONCLUSÃO.........................................................................................60

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................61

8. ANEXO I..................................................................................................67

i

Toniolo, E. F.

RESUMO

TONIOLO, E. Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia da

dor crônica de origem inflamatória. 2010. Dissertação (Mestrado) – Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto,

2010.

A proteína-quinase ativada por RNA de fita dupla (PKR) é uma proteína

quinase que foi caracterizada por induzir a síntese de interferon do tipo I (IFN),

tem um papel importante na regulação na translação, transcrição, e transdução

do sinal em inúmeras vias. PKR pode ser ativada por muitos fatores como

estímulos inflamatórios, fatores de crescimento, citocinas e estresse oxidativo.

Este trabalho teve como objetivos (1) identificar o perfil de expressão do RNAm

e da proteína PKR e na coluna dorsal da medula espinal durante processo

inflamatório crônico, (2) monitorar o efeito da inibição de PKR na medula

espinal sobre as alterações de sensibilidade induzidas por doença inflamatória

crônica e (3) investigar o efeito da inibição de PKR sobre a fosforilação das

proteínas p38, p42/44 e JNK na coluna dorsal da medula espinal durante

processo inflamatório crônico. Observamos que o RNAm para PKR está

presente em células, tanto do gânglio da raiz dorsal, quanto na coluna dorsal

da medula espinal e seu perfil de expressão e sua atividade aumentaram

durante processo inflamatório crônico. A administração subcutânea de CFA

induziu alodínia mecânica e hipernocicepção térmica ipsilateral a injeção

sendo que a administração intratecal do inibidor de PKR (5µM/10µL) reverteu

esta hipernocicepção, mas não teve efeito sobre a alodínia mecânica. Além

disso, animais PKR+/- injetados com CFA apresentaram uma redução na

hipernocicepção térmica quando comparados aos camundongos PKR+/+.

Nossos resultados indicam, ainda, que a atividade pró-nociceptiva de PKR está

associada a um aumento da fosforilação das MAPKs p38 e JNK, mas não de

p42/44, na coluna dorsal da medula espinal. Juntos estes resultados indicam

haver um potencial terapêutico antinociceptivo para compostos que sejam

capazes de inibir ou reduzir a atividade de PKR na medula espinal.

ii

Toniolo, E. F.

ABSTRACT

TONIOLO, E. Action of RNA-activated protein-kinase in neurobiology of

inflammatory chronic pain origin. 2010. Thesis (Master’s degree) – School of

Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo. Ribeirão Preto, 2010.

Double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR), is one of the most

characterized protein induced by type I interferon. PKR has been shown to play

a variety of important roles in the regulating translation, transcription, and signal

transduction pathways. PKR can be activated by many factors like inflammatory

stimulus, growth factors, cytokines and oxidative stress. This work aimed (1) to

identify the expression pattern of PKR mRNA in the dorsal root ganglion and the

spinal cord dorsal horn during chronic inflammatory process, (2) to investigate

the effect of spinal inhibition of PKR on sensory abnormalities induced by

chronic inflammatory disease and (3) to monitor the effect of spinal inhibition of

PKR on p38, JNK and p42/44 phosphorylation in the spinal cord dorsal

horn under chronic inflammation. Our data show that PKR mRNA is expressed

both in the dorsal hoot ganglion and the spinal cord dorsal horn. Its expression

profile and activity increased during chronic inflammation process.

Subcutaneous administration of CFA induced mechanical allodynia and thermal

hyperalgesia ipsilateral to the injected side. Intrathecal injection of PKR inhibitor

(5µM/10µL) reverted CFA-induced hypernociception. Moreover, PKR+/- mice

injected with CFA showed reduced thermal hypernociception as compared the

PKR+/+. Our results also indicate that PKR play a pro-nociceptive role in the

spinal cord associated to an increased phosphorylation of MAPKs p38 e JNK,

but not p42/44. Taken together this results, suggest a potential therapeutic

effect of compounds able to inhibit or reduce the activity the PKR in spinal cord.

Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP

3

Toniolo, E. F.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Neurobiologia da dor

Segundo o Comitê da Associação Internacional para o Estudo da Dor

(IASP), a dor pode ser definida como “uma experiência sensorial e emocional

desagradável associada à lesão tecidual real ou potencial ou ainda descrita em

termos de tal lesão” (IASP, 1994, Loeser, 2008). Dessa maneira a dor é

essencial para a sobrevivência dos indivíduos e, normalmente, serve como um

instrumento de advertência para a prevenção em respostas à agressão ao

organismo.

O gânglio da raiz dorsal (GRD) e a coluna dorsal da medula espinal são

formados por neurônios e células da glia, cujo sua função primordial está

relacionada ao controle e transmissão da informação sensorial da periferia para

o sistema nervoso central (SNC) (Zimmermann, 2001; Tsuda, Inoue et al.,

2005; Zieglgansberger, Berthele et al., 2005). Tais populações celulares são o

substrato para a transmissão da informação nociceptiva e sua reorganização

morfo-funcional representa a base das alterações em condições

fisiopatológicas em estados de dor crônica (Millan, 1999; Zimmermann, 2001;

Zieglgansberger, Berthele et al., 2005; Ueda, 2006).

As fibras que se projetam dos neurônios nociceptivos são classificadas

em dois tipos: fibras do tipo C, estas são amielínicas, de diâmetro pequeno, e

com velocidade de condução na faixa de 0,5 a 2,0 m/s, as quais respondem a


4

Toniolo, E. F.

estímulos térmicos, mecânicos e químicos, sendo, por isso, denominadas de

polimodais. Estas fibras correspondem a 80% do total e estão envolvidas na

condução da mensagem nociceptiva, são responsáveis pela dor de duração

lenta ou secundária, difusa e de difícil localização. Há também as fibras do tipo

Aδ, que são mielinizadas, de diâmetro médio, com velocidade de condução

entre 5 e 30 m/s, e correspondem a 20% do total de fibras. As fibras do tipo Aδ

são responsáveis pela dor rápida ou primária; trata-se da dor aguda, bem

localizada e discriminativa, que resulta do estímulo pontual (Millan, 1999; Julius

e Basbaum, 2001).

Os nociceptores são capazes de detectar estímulos nocivos e convertê-

los em sinais eletroquímicos na forma de potenciais de ação, que por sua vez,

será conduzido para o SNC (Calne et al. 1996; Purves et al. 2002). No interior

da medula espinal, as projeções aferentes dos neurônios sensitivos primários

fazem sinapses com os neurônios sensitivos secundários, os quais ascendem

para o encéfalo formando tratos aferentes, que transmitem a informação

nociceptiva para estruturas rostrais, incluindo a formação reticular, a substância

cinzenta periaquedutal, o tálamo, o hipotálamo e o complexo amigdalóide entre

outras (Almeida, 2004).

A via ascendente de maior relevância da dor é a espinotalâmica, que

compreende os tratos neoespinotalâmico e paleoespinotalâmico. O trato

neoespinotalâmico ascende pela substância branca do funículo ântero-lateral

da medula espinal e alcança os núcleos talâmicos ventral posterior lateral

(VPL) e núcleos talâmicos mediais (VPM), que por sua vez, se projetam para o


5

Toniolo, E. F.

córtex somatosensorial (Fig. 1) (Russo et al. 1998; Purves et al. 2002). Na

escala evolutiva, esse trato apareceu somente em mamíferos superiores e, por

apresentar poucas sinapses ao longo do trajeto ascendente, essa via, conduz

as informações nociceptivas com alta velocidade; estando envolvido na

transmissão da dor aguda relacionada com o componente sensorial-

discriminativo da dor (Menescal, 2008). O trato paleoespinotalâmico também

ascende pelo funículo ântero-lateral e seus axônios se projetam por meio de

colaterais para vários níveis do encéfalo como os núcleos da formação reticular

do tronco encefálico inferior (trato espinoreticular), do mesencéfalo, substância

cinzenta periaquedutal (trato espinomesencefálico) e do hipotálamo (trato

espino-hipotalâmico) antes de alcançar os núcleos mediais do tálamo . Assim,

o trato paleoespinotalâmico transmite informações nociceptivas para diversas

regiões supra-espinais relacionadas com diferentes funções. Nos núcleos

mediais do tálamo, ocorrem as sinapses com os neurônios de terceira ordem,

que se projetam para o córtex do cíngulo e da ínsula (Fig. 1). Assim, o trato

paleoespinotalâmico é multissináptico, conduzindo as informações nocivas à

baixa velocidade e está relacionado com a transmissão mais lenta do estímulo

nociceptivo (Russo et al., 1998).


6

Toniolo, E. F.

Dale Purves/Neurocience, p. 214 e 217, 2004

Figura 1: Representação esquemática das principais vias ascendentes ântero-laterais de transmissão da dor. Trato paleoespinotalâmico (em vermelho) e Trato neoespinotalâmico (em azul).


7

Toniolo, E. F.

1.2. Plasticidade neural induzida por doença inflamatória crônica

No processo inflamatório resultante da lesão tecidual ocorre inicialmente

recrutamento de células do sistema imune que liberam no tecido lesado, pelo

menos, três mediadores importantes: (1) Fator α de necrose tumoral (TNFα),

(2) a interleucina 1β (IL-1β) e (3) o Fator de crescimento neural (NGF). Todos

estes fatores são capazes de ativar e sensibilizar neurônios nociceptivos

periféricos e centrais, contribuindo, assim, para a manutenção da dor e da

hiperalgesia (Garcia, Meurs et al., 2007). Estudos realizados por Kim et al.,

relatam que o dano em neurônio sensorial induz a expressão de TNF-α, IL-1ß,

IL-6 (interleucina-6), e promove a síntese de genes para óxido nítrico em

células da glia na medula espinal.

Tais fatores mobilizam ainda, mediadores citoplasmáticos a partir de

receptores TLR (Toll- like receptor), promovendo a dimerização e

autofosforilação de PKR (Bennett, Blalock et al., 2006; Cole, 2007; Scheuner,

Davies et al., 2003; Williams, 1997). TLRs são proteínas transmembranas

sinalizadoras que são expressas por células do sistema imune inato, sendo

que há mais de dez diferentes TLRs com distintos ligantes específicos (Kim,

Lee, 2007). O SNC, microglia e astrócitos mostraram expressar vários TLRs,

incluindo TLR2 e TLR4, como sugerem o papel das células do sistema imune

inato no SNC. Em modelo de dor neuropática realizado em rato, foi reportado

que TLR4 é requerido para a indução máxima de hipersensibilidade dolorosa

sobre transecção de nervo espinal (Kim, Lee, 2007).


8

Toniolo, E. F.

Dados sugerem que moléculas não patogênicas liberadas por trauma

também podem desencadear inflamação via TLR2 e TLR4. Kigerl et al., 2007,

testaram se TLRs eram regulados após lesões na medula espinal e

examinaram os efeitos na recuperação funcional e anatômica. Estes autores

demonstraram que RNAm para TLR1, 2, 4, 5, e 7 estão aumentados após

lesão medular, bem como moléculas associadas com a sinalização TLR.

Ainda hoje há diversos moduladores e mediadores descritos nos

circuitos de transmissão da dor, evidenciando a complexidade do processo da

informação nociceptiva, tanto em neurônios periféricos primários, quanto em

neurônios centrais espinais e supra-espinais (Fig. 2) (Millan, 1999). Assim, é

cada vez mais claro que estes novos mediadores são produzidos e liberados

também por células não neuronais, predominantemente células da glia e do

sistema imune. Modelos experimentais têm revelado, ainda, que a dor crônica

de origem inflamatória é consequência, principalmente, de mudanças

neuroquímicas, fisiológicas e morfológicas nos neurônios sensoriais, tanto

periféricos, quanto centrais, alterando, dramaticamente, suas características

fenotípicas e sua atividade sináptica de forma crônica (Ji, Strichartz, 2005;

Ueda, 2005). Estas mudanças determinam redução da atividade inibitória e

aumento dos eventos excitatórios nos neurônios sensoriais da medula espinal,

reduzindo seus níveis de excitabilidade, resultando na hipersensibilização de

neurônios centrais (Millan, 1999; Moore, Baba et al., 2000; Lever, Cunningham

et al., 2003) e no aparecimento de uma forma de dor recorrente ou permanente

(Marchand, Perretti et al., 2005; Scholz, Woolf, 2002; Zimmermann, 2001; Lai,

Ossipov et al., 2001).


9

Toniolo, E. F.

Mark J. Millan/ Progress in Neurobiology, p. 361, 2002

Figura 2: Representação esquemática dos múltiplos fatores envolvidos na transmissão e modulação da informação nociceptiva.

1.3. Proteína-quinase ativada por RNA (PKR)

A proteína-quinase ativada por RNA de fita dupla (PKR) é uma proteína

constituída de 551 aminoácidos em humanos e 515 aminoácidos em

camundongos. Tal proteína é caracterizada por dois domínios distintos: um

segmento terminal dominante regulatório NH2, onde se encontram as

sequências de ligação de RNAdf, e um domínio catalítico serina/treonina na

terminação carboxílica (Gunnery, 1998; Kadereit, Galabru et al.,1994; Patel,

Sem, 1994; Williams, 1999; Zhang et al., 2001).


10

Toniolo, E. F.

Essa proteína é conhecida como uma quinase serina/treonina,

caracterizada por duas atividades catalíticas diferenciadas: a homodimerização

da proteína e autofosforilação intermolecular (Robertson, Mathews, 1996;

Zhang, Romano et al.,2001), que representa a reação inicial de ativação da

proteína e a fosforilação do Fator de Iniciação Translacional. Esta última,

impede a atividade da proteína eIF2α, resultando dessa forma na inibição da

síntese de proteínas (Cai, Williams, 1998; Taylor, Haste et al.,2005); entretanto

foi relatado recentemente que PKR também fosforila sítios de tirosina e que

este efeito pode influenciar, tanto a ligação com RNAfd, quanto a

autofosforilação e a ativação da proteína eIF-2 (Fig. 3) (Su, Wang et al.,2006;

Su, Wang et al.,2007).


11

Toniolo, E. F.

Adaptado de García et al., 2006

Figura 3: Mecanismo de interação PKR/RNAfd. PKR possui um domínio de ligação para RNAdf na sua porção N terminal e um domínio quinásico no terminal carboxílico. Em condições fisiológicas, PKR permanece em um estado latente monomérico, devido ao efeito inibitório dos seus domínios de ligação para o RNA, os quais ocluem o domínio quinásico, impedindo a ativação da enzima. Após sua ligação ao RNA de fita dupla, PKR é dimerizada e autofosforilada, permitindo que esta quinase ative outras proteínas (1). Entre os alvos celulares da PKR, destaca-se, principalmente, a fosforilação da subunidade α do fator 2 de iniciação da translação eucariótica (eIF-2). Esta fosforilação (2) causa o seqüestro do fator de troca do nucleotídeo guanina eIF-2B, impedindo a troca de GDP por GTP em eIF-2 e consequentemente, inibe o início da translação e de síntese proteica.

1.3.1. Regulação da sinalização intracelular a partir da

fosforilação de PKR


12

Toniolo, E. F.

Foi descoberto na última década que a ativação de PKR pode ocorrer,

não somente em resposta a inúmeros agentes tais como estímulos pró-

inflamatórios, fatores de crescimento, citocinas e estresse oxidativo (Carlson,

Stephens et al.,1992; Clemens, Hershey et al.,1993; Saunders, Barber, 2003;

Williams, 2001; Zang et al.,2001). Mas também é aceito que os principais

ativadores naturais de PKR são produzidos por células infectadas por vírus,

que produzem e liberam RNAdf como produto da replicação viral (Cai, Williams,

1998; Kaempfer, 2003). Por esta razão, reconhece-se que esta enzima

desempenhe papel essencial na resposta imune inata às infecções virais (Cai,

Williams, 1998; Garcia, Gil et al., 2006). Entretanto, esta quinase é também

fosforilada em resposta ao RNAdf de origem celular ou mesmo sintético

(Carlson, Stephens et al.,1992; Garcia, Meurs et al., 2007; Lemaire, Lary et

al., 2005). Phillip Marcus e Margaret Sekellick (Robertson, Mathews, 1996)

propuseram que, além de sua atividade bem estabelecida como regulador

translacional, PKR também desempenharia ação crucial na transdução de

sinais extracelulares. O primeiro indício de sua atividade como mensageiro

intracelular veio da observação de que a inibição química de PKR pela ação do

nucleosídeo 2-aminopirina interferiria na expressão gênica normalmente

ativada por Interferon (IFN) (Clemens, Hershey et al., 1993; Tanaka, Samuel,

1994). Um segundo passo importante foi à identificação de que o RNAdf seria

capaz de, pela ativação de PKR, fosforilar o fator de transcrição NF-κB (Kumar,

Haque et al., 1994; Zamanian-Daryoush, Mogensen et al., 2000).

Desta maneira, a atividade de PKR é associada à regulação de funções

celulares tão diferentes como diferenciação, transcrição, apoptose e


13

Toniolo, E. F.

crescimento celular (Carlson, Stephens et al., 1992; Garcia, Gil et al., 2006;

Williams, 1999). Assim, inúmeras vias de transdução são afetadas a partir da

ativação de PKR. (Fig. 4). Um dos primeiros alvos descritos para PKR foi o

fator de transcrição IRF-1, que vem a ser um supressor tumoral ausente em

pacientes com leucemia (Der, Yang et al., 1997; Garcia, Meurs et al., 2007;

Kadereit, Galabru, 1994; Niedner, Buzko et al., 2006; Rong, Woolf et al., 2002;

Scheuner, Gromeier et al., 2003), e que, aparentemente, mediaria

mecanismos apoptóticos desencadeados por PKR (Moore, Baba et al., 2000).

Outro alvo da PKR são proteínas da família STAT (signal transducers and

activators of transcription). Estas proteínas estão envolvidas em diversas

funções biológicas e participam ativamente das vias de sinalização intracelular

desencadeadas por interferons (IFN) e outras citocinas (Scheuner, Gromeier et

al., 2003; Rong, Woolf et al., 2002; Scumpia, Kelly et al., 2005). A

associação entre PKR e STAT pode, também, ocorrer de forma indireta, este

parece ser o caso de STAT-1 (Lu, Pang et al., 2005), cujo estado de

fosforilação permanece inalterado pela ação exclusiva de PKR (Lee et al.,

2005; Kaempfer, 1993; Marchand, Perretti et al., 2005; Obata, Noguchi et al.,

2008). Neste caso, PKR controlaria uma cascata de quinases na qual ERK2

estaria sendo responsável pela fosforilação de STAT-1. STAT-1 ainda é um

alvo de PKR em células da glia após estimulação com LPS (Der, Yang et al.,

1997; Rong, Woolf et al., 2002).


14

Toniolo, E. F.


Figura 4: Mecanismos extras e intracelulares de ativação da PKR. RNA de fita dupla, lipopolisacarídeos, citocinas e fatores de crescimento mobilizam mediadores citoplasmáticos a partir de receptores TRL, promovendo a dimerização e autofosforilação de PKR. A ativação desta quinase ocorre também pela ação da proteína citosólica PACT ou seu homólogo murino RAX. Uma vez ativada, PKR age direta ou indiretamente sobre diferentes vias de sinalização intracelular e fatores de transcrição (STAT-1, IRF-1, ATF-3 E NF-ҚB).


15

Toniolo, E. F.

Outro alvo de PKR são as MAPK (mitogen-activated protein kinases),

quinases serina/treonina que regulam vários eventos celulares. Em mamíferos,

MAPKs estão classificadas em várias famílias, sendo as principais ERK

(extracellular signal-regulated kinase), p38 e JNK (Scholz, Woolf et al., 2002).

Tanto p38, quanto JNK são dependentes da fosforilação de PKR para uma

efetiva resposta intracelular desencadeada pela ação de LPS ou citocinas do

tipo de IFN-γ, IL-1 ou TNF-α (Bonnet, Weil et al., 2000; Kadereit, Galabru et

al., 1994; Kaempfer, 2003; Marchand, Perretti et al., 2005; Scumpia, Kelly et

al., 2005).

Rong e colaboradores investigaram a ativação de ERK pela inflamação

periférica induzida por injeções de Complete Freund’s Adjuvant (CFA),

demonstrando que a inflamação persistente e consequente ativação

sustentada de ERK, ativam neurônios das camadas superficiais (lâminas I-II)

da medula espinal (Rong, Woolf et al.,2002). O mesmo grupo verificou que a

indução da inflamação periférica após 24 horas ativava p38 no soma de

nociceptores da fibra C. A inflamação também aumentou níveis de proteínas,

mas não níveis de RNAm, para canais iônicos TRPV1 (VR1) sensíveis ao calor

nessas células, onde eram transportado para periferia mas não para terminais

centrais da fibra C. Quando a ativação de p38 foi inibida no GRD, ocorreu

reduções no aumento de TRPV1. Além disso, a ativação de p38 no GRD é

secundária a produção periférica de NGF durante a inflamação e é requerido

para indução de NGF e aumento de TRPV1. A ativação de p38 no GRD

seguido do transporte de NGF retrógrado demonstrou aumento nos níveis de

TRPV1 nos terminais periférico dos nociceptores (Rong, Woolf et al.,2002).


16

Toniolo, E. F.

Outro importante fator pró-inflamatório é o Fator Nuclear-κB (NF-κB).

Esta proteína é um fator de transcrição que controla a expressão de uma

grande variedade de genes associados com respostas imunes e inflamatória,

como citocinas e fatores de crescimento, diferenciação celular e apoptose,

representando um dos alvos mais conhecidos de PKR (Lever, Cunningham et

al., 2003; Lu, Pang 2005; Su, Wang et al., 2007; Tanaka, Samuel, 1994) (Fig.

5). O principal mecanismo de regulação da atividade de NF-κB é sua interação

com moléculas inibitórias da família IκB (Su, Wang et al., 2007). Estas

proteínas são fosforiladas pelo complexo IKK, que as degrada, permitindo,

assim, a translocação de NF-κB para o núcleo, onde irá regular a transcrição

de diversos genes (Lever, Cunningham et al., 2003).

O NFkB, que é requerido para transcrição máxima de muitas citocinas,

incluindo TNF-α, IL-1, IL-6, e IL-8, assim como na geração de respostas

inflamatórias. Em geral, as citocinas não são armazenadas intracelularmente e

sua secreção culmina da síntese de novas proteínas, assim como na

consequente elaboração de estímulos inflamatórios que poderia regular a

transcrição de vários genes associados à citocinas (Timothy, Blackwell et

al.,1997; Zammanian, et al., 2002).

Assim este projeto buscou investigar uma possível participação de PKR

nos mecanismos neurobiológicos que contribuam para o entendimento da

fisiopatologia da dor crônica inflamatória para que possibilitem o

desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no tratamento de

condições tão debilitantes.


17

Toniolo, E. F.

PKR(fosforilada)

P

PKR(inativa)

IKK(inativa)

IKK(fosforilada)

P

NFB

IB

NFB

IBP P

NFBdegradação

de IB

núcleo

genelet-7a

miR-let-7a

11

citoplasma

Pol II


Figura 5: Mecanismo de ação de PKR sobre a atividade de NFB. A fosforilação de PKR (1) permite sua ação sobre o substrato IKK (2), que uma vez ativado (3) induz a fosforilação do fator inibidor IB (4 e 6). A PKR pode, também atuar diretamente sobre o complexo IB-NFB (5). A fosforilação de IB induz a sua degradação pelo sistema ubiquitina-proteasoma (7) deixando o NFB livre para migrar para o núcleo (8 e 9). Pela ligação com seus promotores (10), NFB participa da transcrição de diferentes genes (11).


18

Toniolo, E. F.

2. OBJETIVOS

I) Identificar o perfil de expressão do RNAm e da proteína PKR na coluna

dorsal da medula espinal durante processo inflamatório crônico.

II) Monitorar o efeito da inibição de PKR na medula espinal sobre as alterações

de sensibilidade induzidas por doença inflamatória crônica.

III) Investigar o efeito da inibição de PKR sobre a fosforilação das proteínas

p38, JNK e p42/44 na coluna dorsal da medula espinal durante processo

inflamatório crônico.


19

Toniolo, E. F.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6/ JUnib

pesando entre 25-30 gramas, sendo provenientes do Biotério Central da

Prefeitura do Campus da Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão

Preto e camundongos machos da linhagem PKR+/+ e PKR+/- pesando entre 25-

30 gramas, provenientes do Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer de

São Paulo. Ambas as linhagens foram acomodados no Biotério do

Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina do Campus da

Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão Preto onde permaneceram

por pelo menos cinco dias antes de serem utilizados em experimentos.

Os animais foram acomodados em gaiolas menores com 4 animais cada; e

mantidos em ambiente com temperatura (22 ± 1°C), sob luminosidade (ciclo

claro:escuro de 12:12 horas; período claro a partir das 6:00 horas), com livre

acesso a água e ração.

Os protocolos experimentais adotados neste projeto foram previamente

aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(Processo nº 138/2007) (Anexo I) e pelo Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal (COBEA).


20

Toniolo, E. F.

3.2. Modelo experimental de dor crônica de origem inflamatória

periférica

A doença inflamatória crônica foi induzida pela injeção unilateral na região

dorsal da pata esquerda posterior do animal com 20 µL de Adjuvante

Completo de Freund (CFA - fragmentos da forma inativa de microbactéria,

Mycobacterium tuberculosis), obtido da companhia Sigma. Enquanto que para

o grupo controle foi injetado 20µL de veículo (Óleo Mineral), também obtido da

companhia Sigma.

3.2.1. Grupos experimentais referentes à expressão do RNAm do

gene pkr

Foram feitos 11 grupos experimentais para os experimentos relacionados

à verificação da expressão do RNAm do gene pkr, seguiu-se a seguinte

divisão:

Grupo I: animais intactos;

Grupo II: animais injetados com óleo mineral e sacrificados (abater um animal

em experiências de laboratório (Bueno, 2000)) 3 horas após;

Grupo III: animais injetados com CFA e sacrificados 3 horas após;

Grupo IV: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 12 horas após;

Grupo V: animais injetados com CFA e sacrificados 12 horas após;

Grupo VI: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 1dia após;

Grupo VII: animais injetados com CFA e sacrificados 1dia após;


21

Toniolo, E. F.

Grupo VIII: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após;

Grupo IX: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após;

Grupo X: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 7 dias após; e

Grupo XI: animais injetados com CFA e sacrificados 7dias após.

3.2.2. Grupos experimentais referentes à Imunohistoquímica

Para os experimentos relacionados à Imunohistoquímica, foram realizados

6 grupos experimentais, seguindo a seguinte divisão:


Grupo II: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 1dia após;

Grupo III: animais injetados com CFA e sacrificados 1dia após;

Grupo IV: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após;

Grupo V: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção

intratecal do inibidor de PKR (5µM/10µL) e após 40 minutos foram

sacrificados;

Grupo VI: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção

intratecal do controle negativo de inibidor de PKR (5µM/10µL) e após 40

minutos foram sacrificados;

3.2.3. Grupos experimentais referentes ao comportamento dos

animais PKR+/- e PKR+/+


22

Toniolo, E. F.

Para os experimentos relacionados ao comportamento dos animais

heterozigotos, foram realizados 8 grupos experimentais, seguindo a seguinte

divisão:

Grupo I: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 1 dia após;

Grupo II: animais injetados com CFA e sacrificados 1 dia após;

Grupo III: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após;

Grupo IV: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após;

Grupo V: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 7 dias após;

Grupo VI: animais injetados com CFA e sacrificados 7dias após;

Grupo VII: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 14 dias após; e

Grupo VIII: animais injetados com CFA e sacrificados 14dias após.

3.2.4. Grupos experimentais referentes à injeção intratecal do

inibidor de PKR

Para os experimentos relacionados à técnica de injeção intratecal foram

feitos 6 grupos experimentais, seguindo a seguinte divisão:

Grupo I: animais injetados com óleo mineral e após 3 dias receberam injeção

intratecal do Inibidor de PKR na dose de 5µM/10µL;

Grupo II: animais injetados com óleo mineral e após 3 dias receberam injeção

intratecal de Inibidor de PKR na dose de 1µM/10µL;

Grupo III: animais injetados com óleo mineral e após 3 dias receberam injeção

intratecal de Inibidor de PKR na dose de 0.05µM/10µL;


23

Toniolo, E. F.

Grupo IV: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção

intratecal de Inibidor de PKR na dose de 5µM/10µL;;

Grupo V: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção

intratecal de Inibidor de PKR na dose de 1µM/10µL; e

Grupo VI: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção

intratecal de Inibidor de PKR na dose de 0.05µM/10µL

3.2.5. Grupos experimentais relacionados à imunodetecção do

estado de fosforilação das proteínas p38, JNK e p42/44

Já para os experimentos relacionados à imunodetecção do estado de

fosforilação das proteínas p38, JNK e p42/44, foi seguido a seguinte divisão:


Grupo II: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após com

posterior verificação do estado de fosforilação das proteínas;

Grupo III: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após com posterior

verificação do estado de fosforilação das proteínas;

Grupo IV: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após e com

injeção intratecal de inibidor de PKR com posterior verificação do estado de

fosforilação das proteínas;

Grupo V: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após e com injeção

intratecal de inibidor de PKR com posterior verificação do estado de

fosforilação das proteínas;


24

Toniolo, E. F.

Grupo VI: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após e com

injeção intratecal de controle negativo com posterior verificação do estado de

fosforilação das proteínas; e

Grupo VII: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após e com

injeção intratecal de controle negativo com posterior verificação do estado de

fosforilação das proteínas.


mecânico antes e após a inflamação periférica gerada por CFA

e óleo mineral para o monitoramento de alodínia

As avaliações da sensibilidade somática ao estímulo mecânico foram

realizadas com a utilização dos filamentos de von Frey, onde todas as

avaliações foram feitas entre 8:00 e 17:00 horas.

Os filamentos de von Frey consistem em filamentos de nylon de diferentes

diâmetros responsáveis por empregar diferentes intensidades de força. Tal

teste consiste em um conjunto de nove filamentos que foram aplicados sobre a

região plantar da pata posterior esquerda de cada animal, sendo que o limiar

de retirada da pata foi determinado pelo aumento ou diminuição seqüencial da

força (de 1,62 mN a 35,59 mN) de cada estímulo (Fig. 6).

O monitoramento da sensibilidade mecânica foi baseado no método de

Dixon (Chaplan, et. al., 1994) e os filamentos utilizados foram: 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12. O teste foi iniciado sempre com o filamento 8 e a contagem da


25

Toniolo, E. F.

série de respostas foi iniciada quando a primeira resposta foi negativa e a

segunda positiva. A partir desta resposta negativa/positiva, foram registradas

mais quatro respostas, respeitando-se sempre o princípio de que uma resposta

positiva é sempre seguida por um estímulo (filamento) inferior, enquanto que

uma resposta negativa é sempre seguida por um estímulo (filamento) superior.

Sendo que uma resposta é considerada positiva quando o animal retira a pata

ao estímulo mecânico, e negativa quando o animal não possuiu reação alguma.

O limiar de retirada da pata do animal foi analisado observando os padrões

de respostas, onde estes padrões foram inseridos no cálculo a seguir:

50% g = 10 [ Xf + K.γ]

Sendo que:

Xf é o valor do último filamento em gramas que é convertido em log de

base 10;

K: é o valor da seqüência de seis respostas as quais os dados foram

retirados da tabela (Chaplan, et. al., 1994); e

δ: é a média da diferença (em log) entre os filamentos apresentados.

Dessa maneira, o teste de von Frey foi realizado duas vezes em cada

animal, ou seja, antes de sofrer a intervenção que gerasse a dor inflamatória,

para o monitoramento do comportamento basal destes animais, e após o

período de tratamento. A resposta flexora ao estímulo mecânico foi então

monitorada antes do sacrifício e somente os animais com alodínia mecânica

participaram dos experimentos. A comparação entre os diferentes grupos foi

realizada pelo teste estatístico ANOVA de duas vias, seguido do teste de

Bonferroni e as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0.05.


26

Toniolo, E. F.

Sendo que após esse procedimento os animais foram sacrificados através do

deslocamento cervical para posterior extração dos tecidos de interesse (gânglio

da raiz dorsal e coluna dorsal da medula espinal entre L4 e L6) (Fig. 7), ambos

foram extraídos do lado esquerdo, onde foram realizadas as injeções de CFA

ou Óleo mineral.

Baseado no método de Dixon (Chaplan et al., 1994)

Figura 6: Fotografia representativa do teste de sensibilidade mecânica (A e B). Fotografia de um filamento de nylon utilizado na realização do teste de sensibilidade mecânica (C).

A B C


27

Toniolo, E. F.

Adaptado de Klusa ‘kova’ I. Dubovy P, Annais of Anatomy (2009) (A)

Figura 7: (A) Representação esquemática do gânglio da raiz dorsal e (B) da coluna dorsal da medula espinal entre L4 e L6.


nociceptivo térmico

Inicialmente os animais da linhagem C57BL/6/ JUnib passaram por

processo de habituação no compartimento em que os testes comportamentais

seriam realizados. Assim, os animais foram mantidos por 1 hora em

compartimentos de 15 cm2 com superfície de vidro transparente e temperatura

controlada (300 C) (Figura 8). Este procedimento se repetiu por 3 dias

consecutivos imediatamente anteriores à realização dos experimentos. O vidro

A B

Sural

Tibial Peroneal Comum


28

Toniolo, E. F.

permitia a passagem de feixe de luz, que era capaz de provocar o estímulo

doloroso térmico, esse feixe foi ajustado a 20% da intensidade máxima de

aquecimento. Após esse período de habituação os animais passaram por um

teste basal no qual o feixe de luz foi dirigido à superfície plantar da pata

posterior esquerda do animal por três vezes com intervalos de cinco minutos

(o estímulo nociceptivo foi aplicado por período máximo de 20 segundos para

evitar lesão na pata do animal). Após a realização do teste basal cada grupo

experimental foi submetido à injeção subcutânea unilateral na região dorsal da

pata esquerda de 20 µL de CFA ou 20µL Óleo Mineral e aguardado o período

respectivo do tratamento de cada grupo experimental. Os animais PKR+/- e

PKR+/+ passaram pelo mesmo processo descrito anteriormente, mas sem ser

necessário passar pelo teste de habituação.

Os animais foram colocados novamente nos compartimentos de 15 cm2

para o monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo

térmico após a indução de inflamação. Assim, foi possível monitorar o período

de latência para a retirada da pata para ser avaliado o aparecimento de

hipernocicepção. Os animais que não apresentaram hipernocicepção após

injeção de CFA foram retirados do experimento.


29

Toniolo, E. F.

Life Science, p. 53

Figura 8: Fotografia representativa do equipamento para a realização do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico (A), fotografia representando o momento do teste onde os animais são acomodados individualmente em compartimentos de 15 cm2. (B) Superfície do equipamento de vidro transparente que permite a passagem de feixe de luz.

3.5. Extração de RNA total

Após sacrificar por deslocamento cervical os animais, os gânglios da

raiz dorsal e o corno dorsal da medula espinal correspondentes aos segmentos

lombares de L4 a L6 foram rapidamente removidos e homogeneizados em

reagente Trizol® (Invitrogen) dando seqüência à extração de RNA total como

descrito em protocolo padrão deste fornecedor (Fig.10). O êxito da extração foi

verificado pela quantificação de RNA total da amostra em espectrofotômetro

A

B


30

Toniolo, E. F.

nos comprimentos de onda de 230, 260 e 280; onde foram observadas as

relações de absorbância 230/260 = 2,0 a 2,5 e 260/280 = 1,8 a 2,0 para a

certificação de que todas as amostras estavam livres de fenol e de proteínas,

respectivamente. As amostras que se apresentaram fora destes padrões foram

descartadas.

3.6. Transcrição reversa

Para a verificação da expressão do RNAm do gene pkr, foi utilizada a

técnica da reação da cadeia de polimerase (RT-PCR) a partir da reação de

transcrição reversa (RT) (Fig. 9) do RNA total dos tecidos em questão. A

reação de transcrição reversa foi realizada usando protocolo padrão do

TaqMan® RT Kit (Applied Biosystems). Foi utilizado 2,0 µL de RT primer do

TaqMan® Gene Expression Assays (AppliedBiosystems); 0,8 µL de dNTP

(100mM); 2,0 µL de RT Buffer 10x; 0,20µL de inibidor de RNAse (20U/µL);

1,0µL de Multiscribe RT enzima (50U/µL); 3,2 µL de água livre de nucleases e

10ng de RNA total com volume total de 2,0µL. A reação foi incubada por 30

minutos a 16ºC e 30 minutos a 42ºC. O produto final foi diluído em 4 vezes com

água livre de nucleases. Posterior a esse passo foi realizado a reação em

Cadeia de Polimerase em Tempo Real.


31

Toniolo, E. F.

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol–Applied Biosystems

Figura 9: Caracterização dos mecanismos envolvidos na reação de transcrição reversa e na reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real.

3.7. Reação em cadeia da polimerase em tempo real


32

Toniolo, E. F.

Para a reação de amplificação foi utilizado TaqMan® Universal PCR Master

Mix, No AmpErase UNG (Applied Biosystems) e o conjunto de primer e sonda

específicos para PKR (Applied Biosystem) seguindo o protocolo padrão. Todas

as reações foram feitas em duplicatas e normalizadas com a expressão do

controle endógeno. O controle endógeno utilizado foi o gene da β-actina cujos

primers e sondas utilizados foram os do Pré-Developed TaqMan® Assay

Reagents Mouse β-actin (Applied Biosystems). A reação de amplificação

utilizou os seguintes primers para PKR: sense 5-

GCAGTTAGTCCTTTATTATT-3′ e antisense 5-TTGTTCGCTTTCCATCATTT-3.

As amostras foram incubadas simultaneamente por 10 minutos a 95ºC

(1 ciclo); por 15 segundos a 95ºC e por 1 minuto a 60 ºC (40 ciclos). A

expressão relativa ao gene de PKR foi determinada utilizando o método 2-∆∆CT

(Livak e Schmittgen, 2001). O Ct (cycle threshold) foi definido como o número

fracionado de ciclos em que a fluorescência detectada passava pelo limiar

fixado dentro da fase exponencial da curva de amplificação (threshold).

Inicialmente calcularam-se as médias e o desvio padrão dos valores do Ct

obtidos nas duplicadas de cada amostra, sendo que foram consideradas

apenas as duplicatas com desvio padrão ≤ 0,2.

O Ct médio para cada amostra foi normalizado através da subtração do

Ct médio do controle endógeno correspondente (Ct= Ctamostra – Ctß-actina);

enquanto que o valor de Ct para cada amostra de PKR foi normalizado em

relação à amostra calibradora ou de referência (Ctamostra – Ctreferência), sendo que

a amostra referência foi representada pelos animais do grupo Intacto. Esses

valores foram utilizados na expressão 2∆∆CT, o que reflete a proporção da


33

Toniolo, E. F.

expressão do gene de cada amostra em relação à amostra referência (Figura

11). A análise estatística foi realizada por meio de teste estatístico ANOVA de

uma via seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett e as

diferenças foram consideradas significativas quando p < 0.05.

Teste basal de von Frey Injeção de CFA/ 3h 12h 24h 72h 7d

em todos os grupos Óleo mineral/ Intacto Após injeção de CFA/óleo Mineral

Realização novamente do teste de von Frey

Extração do tecido

Extração do RNA

Leituras Espectrofotométricas

Expressão do RNAm do gene pkr foi analisada pela reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Para a reação de transcrição reversa (RT) foi usando o protocolo padrão do TaqMan® RNA RT Kit (Applied Biosystems). Os resultados foram analisados pelo método 2-ΔΔCt Kenneth J. Livak e Thomas D. Schmittgen, 2001.

Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental empregado para a identificação do perfil de expressão do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinal durante processo inflamatório.

3.8. Imunohistoquímica


34

Toniolo, E. F.

Os camundongos foram perfundidos com tampão fosfato por um minuto

(5mL/min) e paraformaldeído (4%) por nove minutos (5mL/min). Após a

perfusão, o corno dorsal da medula espinal (L4-L6), foi dissecado e pós-fixados

na mesma solução de perfusão por 60 minutos, posterirmente os tecidos foram

tamponados com sacarose 30% por 24 horas para crioproteção. Os tecidos

foram cortados em criostato com uma espessura de 60 µm. Para a

imunodetecção por fluorescência, os tecidos foram incubados no anticorpo

primário anti-fosfoPKR na concentração de 1:100 por 24 horas a 40C e em

seguida passaram por 3 lavagens de 10 minutos cada em PBS 0.01M, pH 7.4 e

Triton X-100 0,3%. Posteriormente os tecidos foram incubados em anticorpos

secundários na concentração de 1:500 por 2 horas em temperatura ambiente.

Todos os anticorpos foram diluídos em tampão fosfato 0.01M, pH 7.4 e Triton

X-100 0,3%. Em seguida, os cortes foram montados sobre a as lâminas em

VECTASHIELD com DAPI (Vector) e examinadas em microscópio de

fluorescência convencional.

3.9. Técnica de injeção intratecal

O camundongo foi segurado na região pélvica com uma das mãos por

um experimentador, enquanto um outro experimentador segurava a seringa em

um ângulo de 200 acima da coluna vertebral. A agulha foi enserida entre o

processo espinhoso de L5 e L6, a agulha foi inserida cuidadosamente no

espaço intervertebral diminuindo o ângulo para 100 e por aproximadamente 0,5

cm (Fig. 11), seguindo assim o modelo embregado por Hylden. J e Wilcox. G


35

Toniolo, E. F.

em 1980. Tanto o inibidor de PKR, quanto seu controle negativo, foram

dissolvidos em aCSF (fluido cerebrospinal artificial) (NaCl-120mM, KCL-3mM,

NaH2PO4-0.6mM, MgSO4-0.8nM, NaHCO3-18mM, glucose 10mM e CaCl2-

1.1mM) e DMSO 5%. O Inibidor de PKR e o controle negativo de PKR foram

injetados intratecal com os volumes de 5µM/10µL, 1µM/10µL e 0.05µM/10µL.

Adaptado de Hylden e Wilcox, 1980

Figura 11: Diagrama demonstrando a inserção da agulha no espaço intervertebral entre L5 e L6, utilizado na técnica de injeção intratecal.

Inicialmente os animais da linhagem C57BL/6/ JUnib passaram por

processo de habituação no compartimento em que os testes comportamentais

seriam realizados. Assim, os animais foram mantidos por 1 hora em

compartimentos de 15 cm2 com superfície de vidro transparente e temperatura

controlada (300 C). Este procedimento se repetiu por 3 dias consecutivos

imediatamente anteriores à injeção i.t.. O vidro permitia a passagem de feixe

de luz, que era capaz de provocar o estímulo doloroso térmico, esse feixe foi

Processo espinhoso

Processo transverso

Medula espinhal Cauda equina


36

Toniolo, E. F.

ajustado a 20% da intensidade máxima de aquecimento do feixe luminoso.

Após esse período de habituação os animais passaram por um teste basal no

qual o feixe de luz foi dirigido à superfície plantar da pata posterior esquerda

do animal por três vezes com intervalos de cinco minutos (o estímulo

nociceptivo foi aplicado por um período máximo de 20 segundos para evitar

lesão na pata do animal). Após a realização do teste basal cada grupo

experimental foi submetido à injeção subcutânea unilateral na região dorsal da

pata esquerda de 20 µL de CFA ou 20µL Óleo Mineral e aguardado o período

respectivo do tratamento de cada grupo experimental.

Os animais foram colocados novamente nos compartimentos de 15 cm2

para o monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo

térmico após a indução de inflamação. Assim, foi possível monitorar o período

de latência para a retirada da pata para avaliar o aparecimento de

hipernocicepção. Os animais que não apresentaram hipernocicepção após

injeção de CFA foram retirados do experimento.

Posteriormente, foi feita a injeção intratecal com a administração de

Inibidor de PKR ou do seu Controle Negativo. O animal foi, então, novamente

colocado no equipamento para que se medisse a latência para a retirada da

pata após o estímulo nociceptivo térmico. O aparecimento de hipernocicepção

foi monitorado 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos após a injeção intratecal (Fig.

12). A comparação entre os diferentes grupos foi realizada pelo teste (ANOVA

de duas vias, seguido do teste de Bonferroni,e as diferenças foram

consideradas significativas quando p < 0.05.


37

Toniolo, E. F.

Injeção de CFA/ Intacto 1d 3d 7d 14d

Óleo mineral Após injeção de CFA/Óleo Mineral

Figura 12: Representação esquemática do protocolo experimental do monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico. Antes e durante processo inflamatório; e antes e após injeção intratecal de Inibidor de PKR e Controle Negativo de Inibidor de PKR.

3.10. Imunodetecção do estado de fosforilação das proteínas p38,

JNK e p42/44 na coluna dorsal da medula espinhal durante a

doença inflamatória crônica

Teste basal de monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico em todos os grupos

Realização novamente do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico

Injeção Intratecal (Inibidor de PKR (527450-MERCK) ou Controle Negativo de PKR (527455-MERCK)) e após 15/30/45/60 minutos realização do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico

Realização novamente do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico após 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção intratecal


38

Toniolo, E. F.

Os animais foram agrupados aleatoriamente e submetidos à injeção

subcutânea de 20 µL de CFA ou 20 µL de Óleo Mineral. Os tecidos foram

retirados 3 dias, após a injeção, a fim de se investigar a atividade das

respectivas proteínas durante o processo inflamatório periférico (Fig. 13). A

coluna dorsal da medula espinal entre os seguimentos L4-L6 foi dissecada para

extração de proteínas totais, para posterior quantificação das proteínas p38,

JNK e p42/44 em sua forma fosforilada por western blot.

O material coletado foi mantido em gelo-seco, até a adição do tampão de

lise contendo 137 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8, 1% de NP-40, 0,105% de SDS,

10% de glicerol e inibidores de proteases (PMSF, aprotinina e leupeptina) e

fosfatases (NaF, Na2VnO4). Foi então realizada a homogeneização do tecido,

onde o homogenato seguiu para agitação em câmara fria por 10 minutos e foi

então centrifugado a 40000 xg por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido

para dois novos tubos: um tubo contendo o volume de 3 µL que foi armazenado

a -20ºC e foi utilizado para quantificação de proteínas totais e outro tubo com o

restante da amostra foi mantido a -80ºC até a realização da eletroforese. A

quantificação de proteínas totais foi realizada com kit DC-ProteinAssay

(BioRad) baseado no método de Lowry, e a leitura realizada em

espectrofotômetro em 750 nm.

Os volumes de amostra, carregados em cada poço, foram ajustados (a

partir da quantificação) para que a mesma quantidade de proteína fosse

alcançada (20µg para p38 e JNK e 30µg para p42/44). Foi então adicionado

tampão de amostra (contendo 3-βmercaptoetanol como agente desnaturante),

agitado e aquecido a 95ºC por 5 minutos. O gel utilizado na eletroforese foi de


39

Toniolo, E. F.

10%. A eletroforese foi realizada com tampão Tris-Glicina, em câmara fria por

3 horas, 110 V e 400 mA. O gel, após ser retirado do aparato, foi mantido em

tampão de Towbin 10% Metanol por aproximadamente 30 minutos, juntamente

com a membrana de PVDF previamente ativada em metanol, afim de que

equilibrassem ao tampão e evitar distorções na transferência. A transferência

foi realizada também em câmara fria, por 01h30min a 100 V e 400 mA (para

p38, JNK e p42/44).

Após a transferência as membranas foram lavadas em tampão TBS por 5

vezes de 5 minutos e incubadas em solução de bloqueio (TBS 0,1% Tween 20

5% albumina bovina) por 1 hora em temperatura ambiente. Após o bloqueio, as

membranas foram lavadas em TBS 0,1% Tween 20 (TBS/T) por 5 minutos e

incubadas com anticorpo primário, para forma fosforilada da proteína, diluído

1:1000 (para p38, JNK e p42/44) em solução de bloqueio, mantido na câmara

fria, por 24 horas, sob agitação. Após a incubação no anticorpo primário, as

membranas foram lavadas em TBS/T por 5 minutos, cinco vezes, e então

incubadas com o anticorpo secundário diluído 1:2000 (para p38, JNK e p42/44)

em solução de bloqueio, por 1 hora à temperatura ambiente, sob agitação. As

membranas foram novamente lavadas por cinco vezes de 5 minutos em TBS/T

e a revelação realizada com substrato quimioluminescente (GE Lifesciences). A

intensidade das bandas foi quantificada em fotodocumentador acoplado à

câmera CCD (Kodak GelLogic 2200) e analisada em software do equipamento.

As membranas foram posteriormente lavadas em TBS/T por 5 minutos e

com tampão de remoção por 30 segundos a 50ºC para retirada do complexo de


40

Toniolo, E. F.

anticorpos. Em seguida, as membranas foram lavadas em água corrente por 1

hora, reidratadas em metanol por 1 minuto, lavadas em TBS/T por 5 minutos e

reiniciado o processo de bloqueio e incubação, desta vez com anticorpo

primário para a proteína total 1:1000 (para p38 e JNK), 1:2000 ( para p42/44) e

de anticorpo secundário na concentração de 1:2000 (para p38, JNK e p42/44).

Após a quantificação da proteína total, a intensidade da forma fosforilada foi

normalizada com relação a ela. A análise estatística foi feita por t teste, as

diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

Teste basal de Injeção de CFA/ Intacto 3 dias

sensibilidade térmica Óleo mineral/ Intacto Após injeção de CFA/Óleo Mineral

Realização novamente do teste de sensibilidade térmica

Extração do tecido

Extração dos extratos protéicos totais

Quantificação da proteína

Western Blot

Figura 13: Representação esquemática do protocolo experimental empregado para a imunodetecção das proteínas p38, JNK e p42/44 e seus resíduos fosforilados no gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinal durante processo inflamatório.


41

Toniolo, E. F.

4. RESULTADOS

4.1. Perfil de expressão do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal e

na coluna dorsal da medula espinal durante processo

inflamatório crônico

Durante a inflamação persistente, ocorreu aumento significativo do RNAm

de PKR, tanto no gânglio da raiz dorsal (Fig. 14A), quanto na coluna dorsal da

medula espinal (Fig. 14B). Entretanto, no gânglio este aumento foi observado

já nas primeiras 3 horas após a injeção de CFA e se manteve aumentado até o

7º dia após a injeção de CFA. Na medula espinal este aumento só foi

observado a partir do 3o dia de investigação e permaneceu elevado até 7 dias

após o início do processo inflamatório.


42

Toniolo, E. F.

CTL 3h 12h 24h 3 d 7 d0

2

4

6

8

1

*

* **

*Ex

pres

são

rela

tiva

CTL 3h 12h 24h 3 d 7 d0

1

2

3

4

5

* *

Expr

essã

o re

lativ

a

Figura 14: Expressão relativa do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal (A) e no corno dorsal da medula espinal (B) em animais submetidos a inflamação crônica. Grupo controle (CTL) com animais submetidos à injeção intraplantar de óleo mineral. (ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett, * p < 0,05, n=5).

Tais resultados sugerem que PKR pode desempenhar papéis

importantes nos mecanismos neurobiológicos de manutenção das alterações

de doença inflamatória crônica. Nossos dados indicam, claramente, que o

estímulo nociceptivo induz aumento na expressão de PKR e que as mudanças

A

B


43

Toniolo, E. F.

no perfil de expressão desta quinase apresentam grande especificidade

tecidual e temporal nos segmentos periférico e central do sistema nervoso.

4.2. Imunohistoquímica para a proteína p-PKR na coluna dorsal da

medula espinal durante processo inflamatório crônico

Podemos sugerir que a injeção de óleo mineral causou pequena alteração

na forma ativa da proteína PKR no corno dorsal da medula espinal quando

comparado com o animal intacto (Fig. 15A e 15B). Já quando foi realizada a

injeção de CFA por um dia (Fig. 15C) podemos observar uma marcação ainda

mais intensa da forma fosforilada de PKR e quando observado o corno dorsal

após o período de três dias de inflamação (Fig. 15D) notamos que há grande

presença da forma ativa da proteína PKR no corno dorsal.


44

Toniolo, E. F.

Figura 15: Imunohistoquímica para a proteína p-PKR no corno dorsal da medula espinal. (A) Podemos observar a forma ativa da proteína PKR em animal intacto no corno dorsal da medula espinal, já em B observamos que a injeção de óleo mineral causou pequena alteração na forma ativa da proteína PKR no corno dorsal da medula espinal quando comparado com o animal intacto. (C) Quando observado o animal que recebeu 1 dia de injeção de CFA nota-se que há uma marcação ainda mais intensa da forma fosforilada de PKR, e em (D) quando observado o corno dorsal após o período de três dias de inflamação observamos que há grande presença da forma ativa da proteína PKR no corno dorsal.

B

C D

Intacto Veículo 1 d

CFA 1 d CFA 3 d

A


45

Toniolo, E. F.

4.3. Monitoramento do efeito do estímulo mecânico e do estímulo

térmico sobre as alterações de sensibilidade induzidas por

doença inflamatória crônica em camundongos PKR+/- e PKR+/+

A injeção de CFA induziu inflamação na pata injetada provocando uma

redução, significativa (***p <0,0001), da latência de retirada da pata para o

estímulo térmico, tanto no animal PKR+/, quanto no PKR+/+, caracterizando

assim, o fenômeno de hipernocicepção (Fig. 16 B). Por outro lado, a injeção

de óleo mineral não exerceu qualquer efeito sobre a latência de retirada da

pata para o mesmo estímulo, tanto no PKR+/-, quanto no PKR+/+ (Fig. 16 A).

Entretanto, a redução do limiar de sensibilidade ao estímulo térmico foi

significativamente menor (**p < 0,01) nos animais PKR+/-, quando comparados

aos animais PKR+/+.

Nos animais PKR+/- e PKR+/+ a injeção de óleo mineral não exerceu

qualquer efeito sobre o limiar de retirada da pata após o estímulo mecânico.

Por outro lado, a injeção de CFA induziu inflamação na pata injetada,

provocando uma redução, significativa p < 0,0001, do limiar de retirada da

pata para o estímulo mecânico, tanto no animal PKR+/, quanto no PKR+/+ (Fig.

17 A e B).


46

Toniolo, E. F.

0

3

6

9

12

15

PKR+/-

PKR+/+

Tempo (dias)1 3 7 14

Latê

ncia

(s)

0

3

6

9

12

15

PKR+/-

PKR+/+

Tempo (dias)

*****

**

1 3 7 14

Latê

ncia

(s)

**

Figura 16: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação térmica. (A) A administração de óleo mineral não alterou a latência de retirada da pata após o estímulo térmico tanto para o animal PKR+/+ quanto para o PKR+/- no decorrer do tempo, enquanto que a administração de CFA reduziu, significativamente (***p < 0,0001), a latência de retirada da pata após a estimulação térmica tanto nos animais PKR+/+ quanto para os PKR+/-. Os animais PKR+/- apresentaram um aumento, significativo (**p < 0,01), na latência de retirada da pata quando relacionados com os animais PKR+/+ (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, **p < 0,01 e ***p < 0,0001, n= 8).

A

B


47

Toniolo, E. F.

0.0

0.4

0.8

1.2

PKR+/-

PKR+/+

0 1 3 7 14Tempo (dias)

50%

Lim

iar (

g)

0.0

0.4

0.8

1.2

PKR+/-

PKR+/+

0 1 3 7 14Tempo (dias)

50%

Lim

iar

(g)

Figura 17: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação mecânica. (A) Administração de óleo mineral não alterou o limiar de retirada da pata após a estimulação mecânica para os animais PKR+/+ e nem para os PKR+/-. (B) Já quando foi realizada a administração de CFA, ocorreu uma redução, significativa, onde o limiar de retirada da pata após a estimulação mecânica tanto nos animais PKR+/+ quanto para os PKR+/- perduraram durante os 14 dias que foram avaliados. (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, *** p < 0,0001, n= 8-11).

A

B

*** *** *** ***


48

Toniolo, E. F.

4.4. Monitoramento do efeito da inibição de PKR na medula espinal

sobre as alterações de sensibilidade induzidas por doença

inflamatória crônica

A injeção de CFA induziu inflamação na pata injetada provocando redução,

significativa (p < 0,0001), do limiar de retirada da pata para o estímulo térmico

(Fig. 18B). Por outro lado, a injeção de óleo mineral não exerceu qualquer

efeito sobre o limiar de retirada da pata para o mesmo estímulo (Fig. 18 A). A

administração i.t. do Inibidor de PKR na dose de 1µM/10µL reduziu

parcialmente a hipernocicepção térmica, enquanto que a dose de 5µM/10µL

provocou uma reversão total da hiperalgesia nos animais com inflamação

periférica (Fig. 18 B). Já quando foi administrada a dose de 0.05µM/10µL não

ocorreu alteração alguma. Além disso, os animais que receberam óleo mineral

com posterior injeção intratecal de inibidor de PKR nas doses de 5µM/10µL,

1µM/10µL e 0.05µM/10µL também não apresentaram alteração na latência de

retirada da pata (Fig. 18 A).

Nos animais que receberam a injeção com o controle negativo do inibidor

de PKR, não foi observada qualquer alteração no efeito hipernociceptivo

induzido por CFA. Além disso, a administração do controle negativo do

inibidor de PKR nos animais sem inflamação periférica, que receberam a

injeção de óleo mineral, também não demonstrou qualquer alteração da

latência de retirada da pata.


49

Toniolo, E. F.

-30 0 30 60 90 120

0

5

10

15

Óleo Mineral 3d + 5M/10L

Óleo Mineral 3d + 0.05M/10L

Óleo Mineral 3d + 1uM/10L

Tempo (min)

Latê

ncia

(s)

-30 0 30 60 90 120

0

5

10

15

CFA 3d + 5M/10L

CFA 3d + 0.05M/10L

CFA 3d + 1 M/10L

Tempo (min)

Latê

ncia

(s)

Figura 18: Efeito da injeção intratecal (i.t.) de inibidor de PKR sobre a hipernocicepção térmica induzida pela administração subcutânea de CFA em camundongos C57BL/6. (A) Três dias após a injeção de óleo mineral, a administração de inibidor de PKR nas diferentes concentrações não alterou a latência de retirada da pata após o estímulo térmico (n= 11). (B) Já a administração de CFA reduziu, significativamente (#p < 0,0001), a latência de retirada da pata após a estimulação térmica em todos os grupos. Por outro lado, a injeção i.t. de inibidor de PKR reverteu totalmente a hipernocicepção induzida pelo estímulo térmico induzida por CFA após

A

B

*** *** ***

* #


50

Toniolo, E. F.

30 minutos da realização da injeção (***p < 0,001). Esse efeito perdurou por 60 minutos quando administrada na dose de 5µM/10µL. Quando administrada a dose de 1µM/10µL ocorreu uma redução parcial da hipernocicepção induzida por CFA após 60 minutos quando comparado com os animais que receberam a dose de 0,05µM/10µL (*p < 0,05), enquanto que a dose de 0,05µM/10µL não causou alteração alguma. (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, * p < 0,05 e *** p < 0,001; e teste t de Student, #p < 0,0001, n= 12).

Nossos resultados sugerem que a atividade de PKR está associada com

mecanismos de origem e manutenção da dor crônica de origem inflamatória,

em neurônios ou células da glia na coluna dorsal da medula espinal. Nossos

resultados ressaltam, principalmente, a participação de PKR no

desenvolvimento da hipernocicepção.

4.5. Efeito da inflamação crônica sobre o estado de fosforilação das

proteínas p38, JNK e p42/44 na coluna dorsal da medula espinal

Durante a inflamação crônica de origem inflamatória, há aumento

significativo da fosforilação das proteínas p38 e JNK, mas não de p42/44 na

coluna dorsal da medula espinal (Fig. 19 e 20). Este aumento foi observado no

terceiro dia após a injeção de CFA quando comparado com animais intactos e

com animais que foram administrados óleo mineral. Entretanto, após a

administração de inibidor de PKR (5µM/10µL) nos animais com 3 dias de

inflamação ocorreu diminuição significativa p da expressão de p38 e JNK (Fig.

19, 20). Por outro lado, o inibidor de PKR não teve qualquer efeito sobre a


51

Toniolo, E. F.

fosforilação de p42/44 (Fig. 21). Já os animais que receberam controle

negativo de inibidor de PKR (5µM/10µL) com 3 dias de inflamação não ocorreu

alteração alguma na fosforilação dessas proteínas quando comparados aos

animais com 3 dias de inflamação. (Fig. 19 e 20).

Intacto

Óleo 3d

CFA 3d

CFA + inib

CFA + cn

Óleo +

inib0

50

100

150

200

250 **

% s

obre

o c

ontr

ole

Figura 19: Inflamação crônica induz a fosforilação de p38 na coluna dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6. Os animais receberam injeção de CFA (20 µl) ou Óleo Mineral (20 µl) na região dorsal da pata posterior esquerda. Os painéis superiores ao gráfico representam um filtro de Western blot dos extratos da coluna dorsal da medula espinal dos animais submetidos à inflamação induzida por CFA ou óleo mineral e o tratamento com inibidor de PKR ou seu controle negativo. Gráfico representa a análise quantitativa de fosfo-p38 nos diferentes grupos experimentais. O resultado está expresso como a porcentagem média da razão dos níveis da intensidade do sinal de fosfo-p38 para p38 total (forma não fosforilada). (*p < 0,05; teste t de Student, n= 6-7).


52

Toniolo, E. F.

Intacto

Óleo 3d

CFA 3d

CFA + inib

CFA + cn

Óleo +

inib0

50

100

150

200

250

*

*

% s

obre

o c

ontr

ole

Figura 20: Inflamação crônica induz a fosforilação de JNK na coluna dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6. Os animais receberam injeção de CFA (20 µl) ou Óleo Mineral (20 µl) na região dorsal da pata posterior esquerda. Os painéis superiores ao gráfico representam um filtro de Western blot dos extratos da coluna dorsal da medula espinal dos animais submetidos à inflamação induzida por CFA ou óleo mineral e o tratamento com inibidor de PKR ou seu controle negativo. Gráfico representa a análise quantitativa de fosfo-JNK nos diferentes grupos experimentais. O resultado está expresso como a porcentagem média da razão dos níveis da intensidade do sinal de fosfo-JNK para JNK total (forma não fosforilada). (*p < 0,05; teste t de Student, n= 4-5).


53

Toniolo, E. F.

Intac

to p42/44

Óleo 3d

-p42/44

CFA 3d-p42

/44

CFA + inib p42

/44

CFA + cn

p42/44

Óleo + in

ib p42/44

0

50

100

150

200

% s

obre

o c

ontr

ole

Figura 21: Inflamação crônica (3 dias) não induz um aumento da fosforilação de p42/44 na coluna dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6. Os animais receberam injeção de CFA (20 µl) ou Óleo Mineral (20 µl) na região dorsal da pata posterior esquerda. Os painéis superiores ao gráfico representam um filtro de Western blot dos extratos da coluna dorsal da medula espinal dos animais submetidos à injeção de CFA ou óleo mineral e o tratamento com inibidor de PKR ou seu controle negativo. Gráfico representa a análise quantitativa de fosfo-p42/44 nos diferentes grupos experimentais. O resultado está expresso como a porcentagem média da razão dos níveis da intensidade do sinal de fosfo-p42/44 para p42/44 total (forma não fosforilada). (*p < 0,05; teste t de Student, n= 6-7).

Esses resultados reforçam a idéia de que PKR pode desempenhar

papel importante nos mecanismos neurobiológicos de manutenção das

alterações de sensibilidade provocadas por processo inflamatório crônico.


54

Toniolo, E. F.

Nossos dados indicam, claramente, que o estímulo nociceptivo induz um

aumento da atividade da proteína PKR na coluna dorsal da medula espinal

onde a informação nociceptiva é inicialmente processada pelo SNC.


55

Toniolo, E. F.

5. DISCUSSÃO:

Nossos resultados indicam que PKR está presente, tanto no gânglio da

raiz dorsal, quanto na coluna dorsal da medula espinal e sua expressão e

atividade estão, significativamente, aumentados durante processo inflamatório

crônico. Demonstramos ainda que PKR desempenha um papel pró-

nociceptivo através de diferentes mecanismos espinais de

transmissão da dor persistente. Dentre esses mecanismos, destacamos a

ativação das MAPKs p38 e JNK, cujo aumento da fosforilação em neurônios

do corno dorsal durante inflamação crônica periférica é bloqueado pela

inibição da atividade de PKR.

Diversos mediadores envolvidos na gênese do processo inflamatório,

os quais podem levar a ativação de inúmeras vias de sinalização, são capazes

de ativar e sensibilizar neurônios nociceptivos periféricos e centrais envolvidos

com os mecanismos de manutenção da dor crônica (Garcia, Meurs et al.,

2007). Tais fatores mobilizam mediadores citoplasmáticos a partir de

receptores TLR, que promovem a dimerização e autofosforilação de PKR que

culminará com ativação de suas vias de transdução (Bennett, Blalock et al.,

2006; Cole, 2007; Scheuner, Davies et al., 2003; Williams, 1997). Dessa

maneira, tanto no gânglio da raiz dorsal, quanto na coluna dorsal da medula

espinal, PKR pode está agindo através de diversos mediadores envolvidos

com os mecanismos intracelulares de sensibilização de populações celulares

envolvidas na manutenção da dor. Por exemplo, membros da família das


56

Toniolo, E. F.

MAPKs (ERK-1 e ERK-2, p38 e JNK) e NF-κB são, possivelmente, os

principais intermediários envolvidos com esses mecanismos, tanto

perifericamente, quanto no sistema nervoso central (Bonnet, Weil et al., 2000;

Kadereit, Galabru et al., 1994; Kaempfer, 2003; Marchand, Perretti et al.,

2005; Scumpia, Kelly et al., 2005). Além disso, Rong et al., investigaram a

ativação de ERK pela inflamação periférica induzida por injeções de CFA,

demonstrando que a inflamação persistente e, consequente, ativação

sustentada de ERK, recrutam neurônios das camadas superficiais (lâminas I-

II) da medula espinal (Rong, Woolf et al.,2002). O mesmo grupo, verificou que

fosfo-p38 está localizado no núcleo e no citoplasma dos neurônios do GRD e

que a indução da inflamação periférica fosforilava p38 no soma de

nociceptores associados a fibras do tipo C. Após 24 horas, com pico em 2

dias, e a atividade de p38 permaneceu elevada até o sétimo dia. Nossos

resultados corroboram com estes resultados demonstrando que durante a

inflamação crônica induzida por CFA, há aumento significativo da fosforilação

das proteínas p38 e JNK, mas não de p42/44, na coluna dorsal da medula

espinal. Este aumento foi observado no terceiro dia após a injeção de CFA

quando comparado com animais intactos e com animais que foram

administrados óleo mineral. Entretanto, durante o processo inflamatório

periférico após a administração de inibidor de PKR (5µM/10µL) ocorreu

diminuição, significativa, na expressão de p38 e JNK. Gao et al.,

demonstraram que CFA induziu um aumento rápido nos níveis de fosfo-JNK1

e fosfo-JNK2 na medula espinal iniciando em 6 h após a injeção e se

mantendo por 14 dias. Ressaltando ainda, que a presença de fosfo-JNK1 na


57

Toniolo, E. F.

medula espinal é muito maior que fosfo-JNK2, sugerindo que fosfo-JNK1

possui um importante papel na manutenção da dor inflamatória persistente

(Gao et al., 2010). Assim, é possível sugerir que a ativação de p38 e JNK na

medula espinal e, eventualmente, no gânglio da raiz dorsal possam ser

dependente, total ou parcialmente, da ativação direta de PKR. Esta

interpretação poderia justificar a mudança no perfil de expressão tecidual e

temporal, tanto do RNAm, quanto da proteína. Além disso, verificamos,

aumento da expressão da PKR logo nas primeiras horas (3 e 12 horas) após a

injeção de CFA, o que pode ser justificado pela atuação aguda de citocinas

do tipo de IFN-γ, IL-1 ou TNF-α presentes no gânglio da raiz dorsal (Bonnet,

Weil et al., 2000; Kadereit, Galabru et al., 1994; Kaempfer, 2003; Marchand,

Perretti et al., 2005; Scumpia, Kelly et al., 2005). O papel preponderante de

PKR na neurobiologia da dor inflamatória fica ainda mais evidente pelos dados

comportamentais. A inibição da atividade de PKR provocou uma redução,

significativa, da hiperalgesia térmica nos animais com inflamação. É

importante ressaltar, que esse efeito só foi observado nos animais submetidos

à inflamação persistente, mas não nos animais que receberam a injeção de

óleo mineral. Esses dados indicam que os efeitos do inibidor de PKR são

dependentes da plasticidade neural induzida pela estimulação crônica de

nociceptores e sugere que PKR não deve influenciar a transmissão da

informação nociceptiva em condições fisiológicas.

Outra hipótese é o envolvimento de receptor de potencial transiente

(TRP) que compreendem seis domínios de proteínas transmembrana que

formam canais de cátion não seletivos especializados na detecção de


58

Toniolo, E. F.

estímulos térmicos ou químicos (DeLeo, Sorkin et al., 2007). Nicol et al., 1997

demonstraram que a aplicação de TNF-α por 4, 12 e 24 horas aumentava

duas vezes a amplitude da corrente produzida pela aplicação de capsaicina.

Esse aumento não foi observado após 10 minutos de aplicação de TNF-α,

indicando que o curso temporal da modulação de TNF-α das correntes TRPV1

observadas nesse estudo foi da ordem de horas. Entretanto, dados

comportamentais consideraram que TNF-α e TRPV1 apontaram que TNF-α

possa causar hiperalgesia térmica mediada por TRPV1 (Cruz et al., 2005; Ji

et al., 1999; Hu et al., 2003; Karim et al., 2001; Kawasaki et al., 2004). Além

disso, estudo realizado em oócito de Xenopus demonstrou que a expressão

de RNAdf dependente de PKR atenuou as correntes de membrana

dependentes da entrada de Ca2+, pela depleção dos estoques para Ca2+,

enquanto que em PKR-/- obteve o efeito oposto. Assim PKR pode ter novos

substratos protéicos e funções celulares no armazenamento de Ca2+ e

sinalização. (Thomas et al., 1998) .

Pode ainda está ocorrendo o envolvimento do NF-kB que é requerido

para transcrição de muitas citocinas, incluindo TNF-α, IL-1, IL-6, e IL-8, assim

como na geração de respostas inflamatórias. Em geral, as citocinas não são

armazenadas intracelularmente e sua secreção depende da síntese de novas

proteínas. Assim, PKR poderia estar ativando NF-kB e, consequentemente,

mantendo a resposta inflamatória adequada através da transcrição dos genes

associados à citocinas (Timothy, Blackwell et al.,1997). A ativação do NF-kB

ocorre, tanto intracelularmente, quanto extracelularmente e o feedback

positivo pode ocorrer por mecanismos extracelulares, amplificando os sinais


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Toniolo, E. F.

inflamatórios. Desta forma, a ativação de NF-kB realça a transcrição de TNF-α

e IL-1, causando a ativação de NF-kB e gerando amplificação do sinal

inflamatório original (Timothy, Blackwell et al.,1997).

Juntos, estes dados sugerem que PKR pode desempenhar papel

importante nos mecanismos neurobiológicos de indução e manutenção da das

alterações de doença inflamatória crônica. Uma vez que nossos dados indicam,

claramente, que o estímulo nociceptivo induz um aumento da atividade da

proteína PKR na coluna dorsal da medula espinal onde a informação

nociceptiva é inicialmente processada pelo SNC.


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Toniolo, E. F.

6. CONCLUSÃO:

I) Nossos resultados indicam que PKR está presente em células, tanto do

gânglio da raiz dorsal, quanto na coluna dorsal da medula espinal e seu

perfil de expressão aumenta durante processo inflamatório crônico.

II) Durante inflamação crônica periférica a redução da atividade de PKR

pela manipulação genética ou por ação farmacológica promove uma

redução ou reversão da hipernocicepção térmica, mas não da alodínia

mecânica. Estes dados indicam que PKR desempenha papel pró-

nociceptivo durante o processo inflamatório persistente.

III) A inibição intratecal de PKR reverte na coluna dorsal da medula espinal,

o aumento da fosforilação das MAPKs, p38 e JNK, induzido pela

inflamação periférica crônico. Juntos estes resultados indicam haver um

potencial terapêutico antinociceptivo para compostos que sejam capazes

de inibir ou reduzir a atividade de PKR na medula espinal.


61

Toniolo, E. F.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Almeida, T. E; Roizenblatt, S; Tufik, S. Afferent pain pathways: a neuroanatomical review. Brain Res. 1000, p.40-56.2004.

Bennett RL, Blalock WL, Abtahi DM et al. RAX, the PKR activator, sensitizes cells to inflammatory cytokines, serum withdrawal, chemotherapy, and viral infection. Blood;108, p.821-829. 2006.

Bonnet MC, Weil R, Dam E et al. PKR stimulates NF-kappaB irrespective of its kinase function by interacting with the IkappaB kinase complex. Mol Cell Biol. 20, p.4532-4542. 2000. Bonnet MC, Daurat C, Ottone C, Meurs EF. The N-terminus of PKR is responsible for the activation of the NF-kappaB signaling pathway by interacting with the IKK complex. Cell Signal. 18, p.1865-1875. 2006. Bueno S. Dicionário da lingual portuguesa. FTD. São Paulo. 2000. Cai R, Williams BR. Mutations in the double-stranded RNA activated protein kinase insert region that uncouple catalysis from eIF2alpha binding. J Biol Chem. 273, p.11274-11280. 1998.

Calne, S.M. Validating equality of life rating scale for idiopathic parkinsonism: Parkinson´s Impact Scale (PIMS). Parkinsonism Related Disorders. 2, p.273-276. 1996.

Carlson CB, Stephens OM, Beal PA. Recognition of double-stranded RNA by proteins and small molecules. Biopolymers. 70, p.86-102. 2003.

Chao, M. V.Neurotrophin receptors: a window into neuronal differentiation. Neuron, v.9, n.4, Oct, p.583-93. 1992.

Chaplan SR et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. of Neuroscience. 53, p. 55-63. 1994.

Clemens MJ, Hershey JW, Hovanessian AC et al. PKR: proposed nomenclature for the RNA-dependent protein kinase induced by interferon. J Interferon Res. 13, p.241. 1993. Cole JL. Activation of PKR: an open and shut case? Trends Biochem. Sci. 32, p.57-62. 2007.


62

Toniolo, E. F.

Cruz CD, Neto FL, et al. Inhibition of ERK phosphorylation decreases nociceptive behavior in monoarthritic rats. Pain. 116, p.411-419. 2005. Deb A, Zamanian-Daryoush M, Xu Z et al. Protein kinase PKR is required for platelet-derived growth factor signaling of c-fos gene expression via Erks and Stat3. Embo J. 20, p.2487-2496. 2001. DeLeo JA., Sorkin LS., et al. Immune and glial regulation of pain. IASP PRESS. p.189-207. 2007. Der SD, Yang YL, Weismann C, Williams BR. A double-stranded RNA-activated protein kinase-dependent pathway mediating stress induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, p.3279-3283. 1997. Gao YJ., Xu ZZ, et al. The c-JNK N-terminal kinase 1 (JNK1) in spinal astrocytes is required for maintenance of bilateral of mechanical allodynia under a persistent inflammatory pain condition. Pain. 2010. Garcia MA, Gil J, Ventoso I et al. Impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action. Microbiol Mol Biol Rev. 70, p.1032-1060. 2006.

Garcia MA, Meurs EF, Esteban M. The dsRNA protein kinase PKR: virus and cell control. Biochimie. 89, p.799-811. 2007.

Gunnery S, athews MB. RNA binding and modulation of PKR activity. Methods. 15, p.189-198. 1998.

Hu HJ, Gereau RW, et al. Integrates PKA and PKC signaling in superficial dorsal horn neurons !!: modulation of neuronal excitability. J. Neurophysiology. 90, p.1680-1688. 2003.

Hylden JL, Wilcox GL. Intrathecal morphine in mice: a new technique. J of Pharmacology. 67, p.313-316. 1980.

Ji RR, Baba H, et al. Nociceptive-specific activation of ERK in spinal neurons contributes to pain hypersensitivity. Nat. Neurosci. 2, p. 1114-1119. 1999.

Julius, D; Basbaum, A. I Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413, p.203-210. 2001.

Kadereit S, Galabru J, Robert N, et al. Characterization of an interferon-induced 48-kD protein immunologically related to the double-stranded RNA-activated protein kinase PKR. J Interferon Res. 14, p.251-257. 1994.


63

Toniolo, E. F.

Kaempfer R. RNA sensors: novel regulators of gene expression. EMBO Rep. 4, p.1043-1047. 2003.

Karim F, Wang CC, et al. Metabotropic glutamate receptor subtypes 1 and 5 are activators of extracellular signal-regulated kinase signaling required for inflammatory pain in mice. J. Neurosci. 21, p.3771-3779. 2001.

Kawasaki Y, Kohno T, et al. Ionotropic and metabotrópico receptors, protein kinase A, protein kinase C, and Src contribute to C-fiber-induced ERK activation and cAMP response element-binding protein phosphorylation in dorsal horn neurons, leading to central sensitization. J. Neurosci. 24, p.8310-8321. 2004.

Kim D, Lee J, S. A Critical Role of Toll-like Receptor 2 in Nerve Injury-induced Spinal Cord Glial Cell Activation and Pain Hypersensitivity. The J. of Biological Chemistry. v. 282, n. 20, May 18, p.14975–14983. 2007. Kigerl, K. A., Popovich, P. G. Toll-like receptor (TLR)-2 and TLR-4 regulate inflammation,gliosis, and myelin sparing after spinal cord injury. Journal of Neurochemistry. 102, p.37–50. 2007. Kumar A, Haque J, Lacoste J et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase activates transcription factor NF-kappa B by phosphorylation I kappa B. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, p.6288-6292. 1994.

Lai J, Ossipov MH, Vanderah TW et al. Neuropathic pain: the paradox of dynorphin. Mol Interv. 1, p.160-167. 2001.

Lee JH, Park EJ, Kim OS et al. Double-stranded RNA-activated protein kinase is required for the LPS-induced activation of STAT1 inflammatory signaling in rat brain glial cells. Glia. 50, p.66-79. 2005. Lemaire PA, Lary J, Cole JL. Mechanism of PKR activation: dimerization and kinase activation in the absence of double stranded RNA. J Mol Biol. 345, p.81-90. 2005.

Lever I, Cunningham J, Grist J et al. Release of BDNF and GABA in the dorsal horn of neuropathic rats. Eur J Neurosci. 18, p.1169-1174. 2003.

Livak KJ and Schmittgen. Analysis of Gene Expression Data Using Teal-Time Quantitative PCR and the 2-∆∆C

T Method. 25, p.402-408. 2001.

Loeser JD, Treede RD. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 137, p.473-477. 2008.


64

Toniolo, E. F.

Lu B. Acute and long-term synaptic modulation by neurotrophins. Prog Brain Res. v.146, p.137-50. 2004.

Lu B., P.T. Pang , et. al. The yin and yang of neurotrophin action. Nat Rev Neurosci, v. 6, n.8, Aug, p.603-14. 2005.

Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6, p.521-532. 2005.

Menescal de Oliveira, L. As Dores, In: Lent, R. Eds. Neurociência da Mente e do Comportamento. Guanabara Koogan S.A. p.183-201. 2008.

Meurs EF, Galabru J, Barber GN et al. Tumor suppressor function of the interferon-induced double-stranded RNA-activated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, p.232-236. 1993. Millan, M. J. The induction of pain: an interactive review. Prog. Neurobiol, v.57, n.1, Jan, p.1-164. 1999.

Millan, M. J. Descending control of pain. Progress in Neurobiology, 66, p.355–474. 2002.

Moore KA, Baba H, Woolf CJ. Synaptic transmission and plasticity in the superficial dorsal horn. Prog Brain Res. 129, p.63-80. 2000.

Nicol GD., Lopshire JC., et al., Tumor necrosis factor enhances the capsaicin sensitivity of rat sensory neurons. J. Neurosci. 17, p.975-982. 1997. Niedner RH, Buzko OV, Haste NM et al. Protein kinase resource: an integrated environment for phosphorylation research. Proteins. 63, p.78-86. 2006. Obata, K., Noguchi, K., et al. Toll-like receptor 3 contributes to spinal glial activation and tactile allodynia after nerve injury. J. of Neurochemistry. 105, p.2249-2259. 2008. Patel RC, Sen GC. Characterization of the interactions between double-stranded RNA and the double-stranded RNA binding domain of the interferon induced protein kinase. Cell Mol Biol Res. 40, p.671-682. 1994. Purves, DA, et al. Neuriscience. Second Edition. 2002.

Purves, DA; et al. Neuriscience. 3rd Edition. 2004.

Robertson HD, Mathews MB. The regulation of the protein kinase PKR by RNA. Biochimie. 78, p.909-914. 1996.


65

Toniolo, E. F.

Rong R., Woolf J, C., et al. ERK MAP Kinase Activation in Superficial Spinal

Cord Neurons Induces Prodynorphin and NK-1 Up regulation and Contributes to

Persistent Inflammatory Pain Hypersensitivity. The Journal of Neuroscience.

v.22, n.2, Jan.15, p.478–485. 2002.

Rong R., Woolf J, C., et al. p38 MAPK Activation by NGF in Primary Sensory Neurons after Inflammation Increases TRPV1 Levels and Maintains Heat Hyperalgesia. Neuron, v.36, September 26, p.57–68. 2002. Russo, C. M; Brose, W.G. Chronic pain. Ann. Rev. Med. 49, p.123-33. 1998.

Saunders LR, Barber GN. The dsRNA binding protein family: critical roles, diverse cellular functions. J Faseb. 17, p.961-983. 2003.

Scheuner D, Gromeier M, Davies MV et al. The double-stranded RNA-activated protein kinase mediates viral-induced encephalitis. Virology. 317, p.263-274. 2003. Scumpia PO, Kelly KM, Reeves WH, Stevens BR. Double-stranded RNA signals antiviral and inflammatory programs and dysfunctional glutamate transport in TLR3-expressing astrocytes. Glia. 52, p.153-162. 2005. Scholz J, Woolf CJ. Can we conquer pain? Nat Neurosci. 5, p.1062-1067. 2002.

Su Q, Wang S, Baltzis D et al. Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch to full-scale activation of the eIF2alpha RNA dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, p.63-68. 2006.

Su Q, Wang S, Baltzis D et al. Interferons induce tyrosine phosphorylation of the eIF2alpha kinase PKR through activation of Jak1 and Tyk2. EMBO Rep. 8, p.265-270. 2007.

Tanaka H, Samuel CE. Mechanism of interferon action: structure of the mouse PKR gene encoding the interferon-inducible RNA dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, p.7995- 7999. 1994.

Taylor SS, Haste NM, Ghosh G. PKR and eIF2alpha: integration of kinase dimerization, activation, and substrate docking. Cell. 122, p.823-825. 2005.

Tsuda M., K Inout, et al. Neuropathic pain and spinal microglia: a big problem from molecules in ‘small’ glia. Trends in Neurosciences. v. 28, n.2, Feb, p.101-7. 2005.


66

Toniolo, E. F.

Thomas D., Kim HY, et al. Double-stranded-RNA-activated protein kinase (PKR) regulates Ca2+ stores in Xenopus oocytes. J. Biochem. 330, p.599-603. 1998.

Timothy S. Blackwell and John W. Christman. The Role of Nuclear Factor k B in Cytokine Gene Regulation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. v.17, p.3-9. 1997.

UEDA, H.; INOUE, M. Animal models and peripheral nociception tests for the study of neuropathic pain. Folia Pharmacol. Jpn., v.188, p.89-95. 2001.

Ueda, H. Molecular mechanisms of neuropathic pain–phenotypic switch and initiation mechanisms. Pharmacol Ther, v. 109, n.1-2, Jan, p.57-77. 2006. Wang S, Raven JF, Baltzis D et al. The catalytic activity of the eukaryotic initiation factor-2alpha kinase PKR is required to negatively regulate Stat1 and Stat3 via activation of the T-cell protein-tyrosine phosphatase. J Biol Chem. 281, p.9439-9449. 2006. Williams BR. Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans. 25, p.509-513. 1997. Williams BR. PKR; a sentinel kinase for cellular stress. Oncogene. 18, p.6112-6120. 1999.

Williams BR. Signal integration via PKR. Sci STKE. 2001. Zamanian-Daryoush M, Mogensen TH, DiDonato JA, Williams BR. NF-kappaB activation by double-stranded-RNA-activated protein kinase (PKR) is mediated through NF-kappaB-inducing kinase and IkappaB kinase. Mol Cell Biol. 20, p.1278-1290. 2000.

Zhang F, Romano PR, Nagamura-Inoue T et al. Binding of double stranded RNA to protein kinase PKR is required for dimerization and promotes critical autophosphorylation events in the activation loop. J Biol Chem. 276, p.24946-24958. 2001.

Zieglgänsberger W, Berthele A, et al. Understanding neuropathic pain. CNS Spectr, v.10, n. 4, Apr, p.298-308. 2005.

Zimmermann M. Pathobiology of neuropathic pain. Eur J Pharmacol, v.429, n. 1-3, Oct 19, p.23-37. 2001.


67

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8. ANEXO I

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Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia