UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRO PRETO

PS-GRADUAO EM PERIODONTIA

Aplicao da Microtomografia Computadorizada para a

Anlise Morfomtrica Bi e Tridimensional na Avaliao da

Perda ssea Experimental em Ratos.

PATRICIA GARANI FERNANDES

Ribeiro Preto, SP Brasil.

2014

ii

PATRICIA GARANI FERNANDES

Aplicao da Microtomografia Computadorizada para a

Anlise Morfomtrica Bi e Tridimensional na Avaliao da

Perda ssea Experimental em Ratos.

Tese apresentada Faculdade de Odontologia de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Doutora em Periodontia.

Orientador: Prof. Dr. Mrio Taba Jnior

Ribeiro Preto, SP Brasil

2014

iii

Autorizo a reproduo e divulgao total ou parcial deste trabalho, por qualquer

meio convencional ou eletrnico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a

fonte.

FICHA CATALOGRFICA

Fernandes, Patricia Garani Aplicao da Microtomografia Computadorizada para a Anlise

Morfomtrica Bi e Tridimensional na Avaliao da Perda ssea Experimental em Ratos.

124p.: il.; 30 cm Tese de Doutorado, apresentada Faculdade de Odontologia de

Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo. rea de concentrao: Periodontia.

Orientador: Taba Jnior, Mrio

1. Perda ssea na doena periodontal.

2. Microtomografia computadorizada. 3. Mtodo de avaliao de perda ssea do osso alveolar da mandbula.

4. Estudo em ratos.

iv

FOLHA DE APROVAO

Patricia Garani Fernandes

Aplicao da Microtomografia Computadorizada para a Anlise Morfomtrica Bi e

Tridimensional na Avaliao da Perda ssea Experimental em Ratos.

Tese apresentada Faculdade de Odontologia de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor. rea de Concentrao: Periodontia

Aprovado em: ____ / ____ / 2014

Banca Examinadora

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituio: _______________________ Assinatura: _________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituio: _______________________ Assinatura: _________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituio: _______________________ Assinatura: _________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituio: _______________________ Assinatura: _________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituio: _______________________ Assinatura: _________________________

v

DEDICATRIA

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A minha amada e querida famlia

Meus amados pais, Oswaldo e Maria das Graas, vocs so exemplos de

dedicao, ateno, cuidado, pacincia e amor para com suas filhas. Muito obrigada

pelo apoio quando resolvi fazer ps-graduao, pelas palavras de carinho, pelos

ensinamentos e pelas lies de vida. O amor incondicional de vocs foi responsvel

por me dar foras para superar os obstculos e vencer este desafio. Muito obrigada!

Espero sempre poder corresponder s suas expectativas. Amo vocs de todo meu

corao.

Renata, minha nica irm, exemplo de garra e superao, voc muito

importante para mim. Inspiro-me na sua determinao para seguir em frente.

Obrigada pelo incentivo, pelas mensagens de nimo e pela amizade sincera. Por

acompanhar minha trajetria seja com um telefonema carinhoso, uma visita

repentina, um carto postal ou uma mensagem de carinho no celular, eu serei

sempre grata a voc e a Deus, por ter me dado uma irm to maravilhosa.

Ao meu amor

Saulo sua participao foi muito importante em todas as etapas dessa longa

caminhada. Obrigada pelo seu apoio, carinho, amor, respeito, pela pacincia e

dedicao. Nesses cinco anos de convivncia ns demos muitas risadas, outras

vezes camos no choro, mas sempre em apoio mtuo e muita perseverana estamos

vencendo os obstculos e juntos vamos seguir em frente, sempre!

vii

AGRADECIMENTOS

viii

Agradeo em primeiro lugar a Deus criador de tudo e de todos.

Aos meus pais e tia Aparecida pelo apoio, incentivo e carinho.

Renata por ser uma irm presente, atenciosa e sempre pronta a me ajudar.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Mrio Taba Jnior, pela orientao, por confiar em mim

em todos os momentos, pela convivncia amistosa e pela grande oportunidade de

aprendizado que me proporcionou.

Ao coordenador do Programa de Ps-Graduao em Periodontia, Prof. Dr. Arthur

Belm Novaes Jnior, pela pacincia, por ter confiado no meu trabalho e acreditado no meu potencial. Muito obrigada por tudo!

Aos docentes do curso de ps-graduao em Periodontia da FORP-USP, Prof. Dr.

Srgio Lus Scombatti de Souza, Prof. Dr. Mrcio Fernando de Moraes Grisi, Prof.

Dra. Daniela Bazan Palioto, Prof. Dr. Michel Reis Messora e Prof. Dr. Paulo

Tambasco de Oliveira, pelas oportunidades de trabalho e aprendizado.

tcnica de laboratrio e amiga Adriana Gonalves de Almeida, sem sua contribuio nada disso seria possvel, com certeza. Muito obrigada Dri.

A todos os funcionrios da FORP que contriburam de alguma maneira para a

realizao desse trabalho, em especial: Tatiana, Dulce, Carla Daniela, Isabel Sola,

Regiane Moi, Mary, Paulo Girolineto, Augusto, Vera, Ana Cludia, Sueli e Daniela da

clnica de PG, Isabel Gobbo, Paulo Fazzio, Hermano. Aos tcnicos de laboratrio e

biotrio: Sebastio, Mila, Fabiola, Serginho, Aline, Massaro.

Ao meu querido amigo Adriano Henrique Pinheiro pelos anos de amizade, lealdade,

companheirismo e apoio, por tantas conversas, mensagens, telefonemas e conselhos sempre oportunos.

Solena, amiga para todas as horas e de tantas jornadas. Exemplo de dedicao

ao trabalho, aos amigos e famlia. Uma grande amizade que com certeza ultrapassa a distncia e o tempo.

Aos meus queridos amigos de colgio Bom Jesus (impossvel citar todos os nomes)

pelos bons momentos vividos, pelas risadas proporcionadas e pela amizade duradoura alicerada na confiana, carinho e companheirismo.

ix

turma de Odontologia de 2001 - UFPR. Obrigada aos amigos pelos quatro anos de

convvio dirio e por tantos bons momentos passados juntos.

Aos meus amigos da especializao em Periodontia turma de 2005 e aos professores e mestres da Universidade Estadual de Londrina.

Aos amigos da minha turma de Doutorado, Danilo e Luciana, pelos anos de convvio, companheirismo e aprendizado.

Aos amigos da turma de Mestrado 2011- Cristine, Mariana, Kelly, Paula, Felipe,

Tlio, Andr. Vocs tiveram participao especial nesta longa caminhada. Obrigada a todos, sem distino.

Aos amigos da turma de Doutorado 2012 Carol Delmondes, Carol Mandetta,

Gustavo e Umberto. Obrigada pelo apoio em vrios momentos, pela ajuda com

grficos, tabelas, pelo auxlio com os pacientes e com os animais de laboratrio. Cada um de vocs tem um lugar especial no meu corao.

Aos amigos da ps-graduao durante esses seis anos que aqui passei: Patrcia

Freitas, Andra, Rafael, Guilherme, Raquel, Luciana Bastos, Priscila Paganini,

Priscila Nbrega, Flvia, Adriana pela convivncia diria na clnica, pelos

conhecimentos compartilhados e pela amizade.

A todas as minhas companheiras de moradia nesses cinco anos: Adriana, Luciana,

Gislaine, Marina, Sarah, Karina, Larissa, Mariana, Renata e agregadas. Juntas ns

formamos uma grande famlia com direito a muitas conversas, conselhos, bilhetes,

momentos de alegrias e de tristezas que foram importantes para meu crescimento

pessoal. Obrigada por cada momento compartilhado, guardarei com carinho nossa

amizade e sempre as levarei em meu corao.

Renata Spagolla por ser uma pessoa querida, companheira, amiga e por fazer parte da minha vida num momento to importante e decisivo. Obrigada de corao.

Ao amigo Lucas Novaes pela amizade, apoio, conselhos, pela ajuda com photoshop e pelos vdeos engraados compartilhados.

amiga Viviane Mariguela e ao amigo Mario Lisboa pelas conversas, pelo carinho, apoio, incentivo e abraos apertados.

x

famlia Miranda e a todos os amigos de Alvo, pelo apoio nos momentos de

angstia e tristeza, sempre me ajudando a vencer os obstculos.

famlia Abouchedid pelo carinho com que me acolheram, pelo apoio incondicional, pela amizade que construmos e por todos os momentos juntos.

Ao querido amigo e incentivador Joo Moura Neto pela amizade, pelo apoio em

todas as horas difceis, pelo abrao apertado. Sua garra e empreendedorismo so motivos de inspirao para mim.

Aos amigos da Clinface. Obrigada pelo carinho e por vocs sempre torcerem pelo meu sucesso profissional.

psicloga Vera Otero pelas palavras certas, pelo apoio e por sua generosidade.

A todos os amigos e familiares que torceram por mim e pelo meu sucesso. Sem o

apoio de vocs esse trabalho no seria possvel. A caminhada longa e a jornada

rdua, mas com perseverana e garra eu hei de vencer todos os desafios.

Muito obrigada de corao!

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D: bidimensional.

3D: tridimensional

SHR: Spontaneously Hypertensive Rat

WK: Rato Wistar Kyoto

Micro CT: microtomografia computadorizada

CT: micro-CT

DP: doena periodontal

C: controle

mm: milmetro

m: micrmetro

M1: primeiro molar mandibular

M2: segundo molar mandibular

JCE: juno cemento esmalte

COA: crista ssea alveolar

COV: crista ssea vestibular

COL: crista ssea lingual

COI: crista ssea interproximal

POA: perda ssea alveolar

VOI: volume sseo de interesse

ROI: regio ssea de interesse

CT-Analyser (CTAN): Software de Anlise Morfomtrica

DMO: Densidade Mineral ssea

TC: Tomografia Computadorizada

BS: rea superficial das trabculas sseas

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BV: Volume sseo da amostra

BV/TV: Razo entre o volume sseo e o volume da amostra

BS/BV: Razo entre a rea ssea da amostra e o volume sseo da amostra

BS/TV: Razo entre o volume sseo da amostra e o volume total da amostra

TS: rea superficial da amostra ssea

Tb. N: Nmero Trabecular

Tb. Sp: Separao Trabecular

Tb. Th: Espessura Trabecular

TV: Volume Total da Amostra

Mp: Mega pixel

NRECON = Software usado para reconstruir imagens de seo transversal a partir

de imagens de projeo tomogrfica

CTAN = Software de Anlise Morfomtrica

DATA VIEWER = Software de Visualizao Morfomtrica

CTVOX = Software para visualizao e manuseio das imagens tridimensionais

xiii

SUMRIO

JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 1 RESUMO ..................................................................................................................... 5 ABSTRACT ................................................................................................................. 7 1. INTRODUO ........................................................................................................ 9 2. OBJETIVO ............................................................................................................ 16 3. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 18

3.1. Animais .......................................................................................................... 19 3.1.1. Diviso dos grupos ...................................................................................... 19 3.1.2. Registro da presso arterial ......................................................................... 20 3.1.3. Induo da doena periodontal experimental .............................................. 21 3.1.4. Remoo da ligadura .................................................................................. 22 3.1.5. Eutansia e coleta de material .................................................................... 23 3.2. Microtomografia computadorizada ............................................................. 23 3.2.1. Anlise das medidas unidimensionais ......................................................... 28 3.2.2. Anlise das medidas volumtricas ............................................................... 29 3.3. Anlise estatstica......................................................................................... 36

4. RESULTADOS ...................................................................................................... 37

4.1. Medidas lineares ............................................................................................. 38 4.2. Medidas volumtricas ..................................................................................... 44

5. DISCUSSO ......................................................................................................... 65 6. CONCLUSES ..................................................................................................... 75 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 77 8. ANEXO .................................................................................................................. 84 9. APNDICE ............................................................................................................ 89

1

JUSTIFICATIVA

2

JUSTIFICATIVA

A doena periodontal caracterizada por um processo inflamatrio que

culmina na destruio dos tecidos de suporte dos dentes (a gengiva, o ligamento

periodontal, o cemento radicular e o osso alveolar). Um crescente corpo de

evidncias tende a demonstrar que as interaes microbianas entre as diferentes

espcies bacterianas so fatores importantes na patogenia da doena periodontal,

alm da resposta do hospedeiro frente a essa agresso (Baker, 2000; Ali et al.,

2011).

Diversos mtodos podem ser utilizados para medir a perda ssea alveolar

decorrente da periodontite, dentre eles: as tcnicas de morfometria (uma tcnica

simples e eficiente na qual a medio da distncia entre a juno cemento-esmalte

[JCE] crista ssea alveolar [COA] se d via captura das imagens e avaliao

destas por meio de um programa de anlise de imagens), os exames radiogrficos

(anlise de perda ssea pela visualizao das estruturas duras [JCE e COA] e sua

relao de proximidade ou perda) e a anlise de dados histolgicos (observao dos

tecidos mineralizados e no-mineralizados por meio de lminas de histologia). A

observao de tecidos ao microscpio ptico feita por transparncia. necessrio

que o tecido seja submetido a cortes finssimos, para que possibilite sua incluso

num bloco de parafina, para ser cortado num micrtomo; depois de cortado, retirada

a parafina e colocado numa lmina, a amostra fixada e corada. As lminas

coradas podem ser finalmente observadas ao microscpio ptico, pela microscopia

eletrnica ou ainda pela imunofluorescncia (Lindhe et al., 2003; Wilkie et al., 2004;

Trisi et al., 2006; Vanderlei et al., 2012;).

3

No entanto, esses mtodos proporcionam apenas informaes bidimensionais

(2D), pois estes medem a perda ssea horizontal (no sentido mesio-distal ou

vestbulo-lingual) portanto existem limitaes de preciso e sendo assim, no tem a

capacidade de produzir dados sobre as trs dimenses (3D). Nessas anlises,

mudanas intra-sseas que podem ocorrer durante a infeco periodontal podem

no ser quantificadas.

Com o intuito de proporcionar uma melhor visualizao da estrutura ssea

trabecular, mas sem a necessidade de destruio da amostra, muitos estudos

procuraram mtodos alternativos que pudessem fazer esta quantificao (Genant et

al.,1996; Slyfield et al.,2012). A microtomografia computadorizada (micro-CT) pode

ser uma alternativa mais sensvel para medir a massa ssea e a microestrutura do

osso alveolar quando comparada aos mtodos convencionais consolidados

(Bouxsein et al., 2010; Molon et al., 2013). Por se tratar de uma tcnica no

destrutiva que fornece imagens de alta resoluo espacial em 3D em um nvel

micromtrico, permite a reorientao auxiliada por computador seguindo a

digitalizao de imagens, garantindo assim um alinhamento quase idntico ao real.

Assim a micro-CT (CT) consegue mostrar pequenas alteraes tanto nos defeitos

infrasseos periodontais bem como nos casos de perda ssea alveolar (Feldkamp et

al., 1989; Park et al., 2007).

As imagens tridimensionais representam muito bem uma imagem

bidimensional correspondente, obtida com a microscopia, por exemplo. Estudos

sobre a confiabilidade e preciso de radiografias bidimensionais demonstraram

diferenas de at 25% entre os clculos de quantificao do osso alveolar de

radiografias em 2D quando comparadas com imagens em 3D (Fernandes et al.,

2007; Ebina et al., 2009; Ferrare et al., 2013). As vantagens desta tcnica podem ser

4

enumeradas de acordo com os seguintes itens: facilidade de escolha da regio a ser

avaliada sem a necessidade de preparao da amostra, sem interferncia de

manchas ou artefatos e sem corte fino - uma nica varredura da imagem 3D

apresenta a estrutura completa da amostra em alta resoluo, alm de se obter a

amostra intacta de volta ao final do escaneamento (De Smet et al., 2006;

Chackartchi et al., 2011).

Em longo prazo, acredita-se que a anlise morfomtrica da ultraestrutura de

fentipos e o estudo das relaes entre os fentipos de ossos em diferentes nveis

de hierarquia, abriro novas perspectivas na avaliao da qualidade do osso.

(Schneider et al., 2007).

Assim, a utilizao da CT tem sido amplamente divulgada para estudar o

metabolismo sseo em modelo com animais, e constitui uma nova forma para avaliar

estruturas de tecidos duros, em 3D. As anlises utilizando micro-CT de alta

resoluo podem ser usadas para construir um modelo de osso em 3D e tambm

para analisar os dados de uma forma altamente precisa e no destrutiva.

5

RESUMO

6

RESUMO

Introduo: A histomorfometria do osso um dos mtodos padronizados que pode ser utilizado para quantificar a microestrutura do osso trabecular. Existem muitos meios de acesso para conseguir a visualizao dos defeitos sseos no caso de um acometimento de doena periodontal, por exemplo. A extenso e morfologia da perda ssea alveolar podem ser acessadas e examinadas aps confeco de retalhos mucoperiosteais em cirurgias periodontais ou atravs de exames radiogrficos. A partir de ento, a tecnologia da micro-CT tornou-se padro ouro para avaliao da arquitetura 3D do osso trabecular; exibindo como uma de suas principais vantagens sua habilidade em proporcionar resultados quantitativos com pouco ou nenhum preparo da amostra e sem a sua destruio. Metodologia: Foram utilizados 40 ratos machos: ratos normotensos (WK) e espontaneamente hipertensos (SHR) foram divididos em grupos com doena periodontal induzida por ligaduras (DP), e grupos controle, em que a DP no foi induzida (C). Cada um desses quatro grupos foram divididos em 2 subgrupos, de acordo com o perodo de eutansia, que foi realizada no 10 e no 21 dia do experimento, desse modo cada grupo teve um n=5. Os animais do grupo DP receberam ligadura com fio de algodo ao redor do primeiro molar inferior. Aps a eutansia todas as hemimandbulas dos animais tiveram seu tecido mole removido atravs de processos qumico e biolgico a fim de proporcionar uma pea histolgica preparada adequadamente para ser escaneada no microtomgrafo. Para realizao da anlise microtomogrfica foi utilizado um aparelho modelo 1172 da fabricante SkyScan. As amostras foram verificadas nos trs planos espaciais atravs dos softwares CTAN, DATA VIEWER e CTVOX que tambm foram utilizados para a visualizao tridimensional, anlise qualitativa e quantitativa da anatomia externa e interna do osso alveolar. Resultados: Os resultados das medidas lineares foram aqueles extrados de uma imagem bidimensional de uma fatia nica escolhida por ser a mais representativa para detectar a perda ssea alveolar. Para a quantificao dos parmetros volumtricos foi realizada a avaliao em dois pontos distintos: a rea da regio de furca do M1 mandibular e a rea da regio interproximal entre M1 e M2 da mandbula. De todos os parmetros avaliados e analisados os mais representativos para detectar a perda ssea alveolar neste modelo de estudo foram: Furca e JCE-COV (juno cemento-esmalte crista ssea vestibular) em 2D (medidas lineares) e a relao entre a superfcie ssea e o volume sseo; relao entre o volume sseo e o volume total; porosidade e densidade mineral ssea nos parmetros em 3D (medidas volumtricas). Concluso: A metodologia empregada mostrou ser eficiente para a caracterizao da perda ssea alveolar nos grupos controle e doena periodontal. A regio escolhida e o mtodo de anlise tem influncia no resultado. Assim medidas lineares e medidas volumtricas de uma mesma amostra podem apresentar porcentagens diferentes em relao perda ssea. Palavras-chave: anlise morfomtrica bi e tridimensional, microtomografia computadorizada, avaliao de perda ssea alveolar da mandbula, doena periodontal induzida em ratos.

7

ABSTRACT

8

ABSTRACT Introduction: The histomorphometry of bone is one of the standard methods that can be used to quantify the microstructure of the trabecular bone. There are many ways to get access to the visualization of bone defects in the case of onset of periodontal disease, for example. The extent and morphology of alveolar bone loss may be accessed and examined after making mucoperiosteais flaps in periodontal or through radiographic examinations surgeries. Since then, the technology of micro - CT has become the gold standard for evaluation of the 3D architecture of trabecular bone; showing as one of its main advantages its ability to provide quantitative results without destruction and with little or no sample preparation. Methodos: Normotensive rats (WK) and spontaneously hypertensive (SHR) were divided into groups of ligature-induced periodontal disease (PD), and control groups (C), where PD is not induced. 40 rats were used and each of these four groups were divided into 2 subgroups according to the time of euthanasia , which was held on the 10th and 21st day of the experiment , thus each group had an n = 5 . The animals in the PD group received ligature with cotton thread around the first molar. After euthanasia, all animals had their mandibles soft tissue removed through chemical and biological processes to provide a suitably prepared for micro-ct analysis. In order to perform the micro-CT analysis, a model 1172 device manufacturer of SkyScan was used. The samples were observed in the three spatial planes through the CTAN, DATA VIEWER and CTVOX softwares which were also used for threedimensional visualization, qualitative and quantitative analysis of the external and internal anatomy of the alveolar bone. Results: The results of linear measurements were those extracted from a twodimensional image of a single slice chosen for being the most representative for detecting bone loss. For quantification of the volumetric parameters were assessed at two different points: the area of the furcation region of the mandibular M1 and interproximal area of the region between M1 and M2 of the jaw. Of all the most representative in detecting alveolar bone loss in this model of study parameters were evaluated and analyzed : Furcation and cementum-enamel junction to the buccal bone crest = 2D (linear measurements) and the relationship between the bone surface and bone volume ; ratio of bone volume to the total volume ; porosity and bone mineral density in 3D parameters ( volumetric measurements) . Conclusion: The methodology was efficient for the characterization of alveolar bone loss in the periodontal disease groups. The region chosen and method of analysis have affected the outcome. Thus, linear and volumetric measurements of the same sample may have different percentages in relation to bone loss. Keywords: bi e three-dimensional morphometric analysis, computed microtomography, evaluation of alveolar bone loss, induced periodontal disease, study in rats

9

INTRODUO

10

1. INTRODUO

A doena periodontal uma infeco polimicrobiana iniciada e mantida por

microorganismos presentes no biofilme dental e caracterizada inicialmente pela

inflamao gengival, sangramento sondagem na rea da bolsa gengival,

diminuio da resistncia dos tecidos periodontais sondagem (bolsa periodontal),

perda de insero gengival e se no for tratada adequadamente pode evoluir para a

perda do osso alveolar (Le et al., 1992).

O osso alveolar uma parte especializada dos ossos da mandbula e da

maxila, que forma a estrutura de suporte principal para os dentes. Embora

fundamentalmente comparvel a outros tecidos do osso no corpo, o osso alveolar

submetido remodelao contnua e rpida, associada com a erupo dos dentes e,

subsequentemente, s exigncias funcionais da mastigao. A capacidade do osso

alveolar, de se submeter remodelao rpida tambm importante para

adaptao posicional dos dentes, mas por outro lado pode ser prejudicial para a

progresso da doena periodontal. A complexidade geomtrica dos dentes

multirradiculados no osso alveolar, a resposta desse tecido mastigao e a outras

foras dentro da cavidade oral, resultam num padro complexo de remodelao

ssea. A organizao ultraestrutural da matriz ssea e consequentemente, a

compreenso dos eventos moleculares que regulam a formao e remodelao dos

tecidos sseos de fundamental importncia no desenvolvimento de modalidades

de tratamento para contornar ou corrigir anomalias estruturais e funcionais (Sodek &

McKee, 2000).

A histomorfometria do osso um dos mtodos padronizados que pode ser

utilizado para quantificar a microestrutura do osso trabecular. Recentemente, foram

11

delineados novos parmetros para melhorar a quantificao histomorfomtrica da

microestrutura trabecular. Entretanto, estes tm sido limitados anlise

bidimensional.

Existem muitos meios de acesso para conseguir a visualizao dos defeitos

sseos no caso de um acometimento de doena periodontal, por exemplo. A

extenso e a morfologia da perda ssea alveolar podem ser acessadas e

examinadas aps confeco de retalhos mucoperiosteais em cirurgias periodontais

ou atravs de exames radiogrficos. O diagnstico precoce de pequenas alteraes

sseas alveolares, decorrentes de processos patolgicos como periodontite e leses

periapicais, ou devido a tratamento regenerativo, requer mtodos de diagnstico

precisos e sensveis. Com o advento da microtomografia computadorizada

possvel avaliar mudanas dinmicas na espessura do ligamento periodontal e na

remodelao ssea alveolar de forma clara e precisa. (Ferrare et al., 2013)

Xu et al. (2013) observaram mudanas significativas na espessura do

ligamento periodontal e uma pobre recuperao da espessura desse ligamento

durante o perodo experimental no modelo de estudos em ratas ovariectomizadas. A

frao do volume sseo aumentou, a separao trabecular diminuiu

significativamente e a perda ssea foi observada claramente. Os autores puderam

demonstrar que a microtomografia computadorizada possibilitou analisar o colapso

da microestrutura da rede do osso trabecular e a evidente perda de massa ssea.

O osso uma forma altamente especializada de tecido conjuntivo no qual a

matriz extracelular mineralizada conferindo rigidez e fora ao esqueleto, mas

mantendo certo grau de elasticidade. Sua composio pode ser separada em uma

matriz orgnica, composta quase que totalmente por colgeno (95% colgeno tipo I

e quase 5% colgeno tipo V), e uma matriz inorgnica, formada basicamente de

12

clcio e fosfato na forma de hidroxiapatita. Em conjunto com o cemento radicular e o

ligamento periodontal, o osso alveolar constitui o aparelho de insero dos dentes,

cuja funo principal distribuir e absorver as foras geradas, por exemplo, pela

mastigao e por outros contatos dentrios.

A estrutura anatmica do osso alveolar bastante complexa, desse modo, ela

constituda de um tipo de osso com insero colgena, que formado por

camadas com uma orientao paralela direo coronal-apical do dente. A esta

insero de fibras colgenas pertencem as fibras de Sharpey que se estendem

obliquamente de uma fina lamela de osso que reveste a parede interna do alvolo e

so contnuas com as fibras do ligamento periodontal. A camada externa mais

espessa de osso formado de placas corticais se prolonga desde o osso da

mandbula para formar as superfcies lingual e vestibular do processo alveolar que

em grande parte composta internamente de osso esponjoso (Sodek e McKee, 2000).

Tanto o osso cortical quanto o esponjoso sofrem constante remodelao

(reabsoro seguida de formao) em reposta movimentao fisiolgica ou no

dos dentes e s mudanas nas foras funcionais que agem sobre os dentes.

Doenas periodontais so doenas inflamatrias crnicas que eventualmente

podem levar perda das estruturas de suporte dos dentes, incluindo a reabsoro

do osso alveolar dos maxilares. Essa a doena mais prevalente das doenas

sseas que atingem o ser humano, sendo bastante severa para permitir a perda dos

dentes em cerca de 10 a 15% dos adultos (Baker, 2000). tambm doena

infecciosa associada ao crescimento subgengival de certas espcies anaerbias

facultativas, as bactrias gram-negativas. Muitos dos danos gerados pelas infeces

bacterianas, no se tratam apenas de fatores de virulncia, mas sim da resposta do

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hospedeiro frente a essa agresso podendo resultar at em severa perda ssea

alveolar (Baker, 2000).

A microtomografia computadorizada uma tcnica no destrutiva que

reconstri e modela interiores de amostras na escala micromtrica e obtm

informaes sobre sua geometria tridimensional e propriedades do material. O

conceito bsico desse processo de imagem provou que um objeto tridimensional

pode ser reconstrudo atravs de suas projees bidimensionais (Argenta MA et al.,

acessado em 2013).

A utilizao da microtomografia computadorizada (micro-CT ou CT) para

anlise tridimensional da estrutura ssea in vitro foi primariamente introduzida por

Feldkamp et al. (1989). Os autores descreveram o novo mtodo baseados na alta

resoluo da tomografia computadorizada onde uma matriz de reconstruo

tridimensional foi criada diretamente por meio de uma srie de cortes

bidimensionais. Todos os ndices estruturais normalmente determinados a partir de

sees histolgicas bidimensionais puderam ser obtidos de forma no destrutiva a

partir de um grande nmero de fatias em cada uma das trs direes ortogonais.

Isto permitiu uma descrio detalhada da variao estrutural dentro de um espcime

e facilitou enormemente o estudo da anisotropia estrutural. Assim os autores

puderam afirmar que o mtodo teria potencial para superar muitas das limitaes

das atuais abordagens para o estudo da arquitetura do osso a nvel microscpico.

Nesse trabalho os autores desenvolveram um novo mtodo para o exame direto da

estrutura ssea tridimensional in vitro, enfatizarando sua aplicao ao osso

esponjoso, no entanto o mtodo tambm pode ser usado para o estudo do osso

cortical.

14

A partir de ento, esta tecnologia tornou-se padro ouro para avaliao da

arquitetura 3D do osso trabecular; exibindo como uma de suas principais vantagens

sua habilidade em proporcionar resultados quantitativos sem destruio e com

pouco ou nenhum preparo da amostra.

Em um estudo de Seto et al. (2008) foram examinados os efeitos da

sinvastatina in vitro utilizando clulas de calvria de ratos em cultura e in vivo,

utilizando ratos com periodontite induzida por ligaduras. Nesse estudo os autores

revelaram a destruio dos tecidos periodontais, mostrando uma diminuio da

espessura da camada epitelial e insero irregular das fibras de colgeno no grupo

com ligaduras. Em contrapartida, a quantidade de osso alveolar tinha aumentado no

grupo tratado com sinvastatina e os resultados histolgicos confirmaram os

resultados obtidos por anlise de microtomografia computadorizada, demonstrando

assim a validade do mtodo de anlise por imagem.

Nos anos recentes tem crescido enormemente o uso de imagens obtidas

atravs da microtomografia computadorizada de alta resoluo para medir e/ou

avaliar a morfologia ssea trabecular e cortical tanto em estudos em modelo animal

como em humanos. Existem diversos sistemas disponveis comercialmente e como

resultado disto, existem vrias abordagens para conseguir a aquisio das imagens,

realizar a avaliao destas e interpretar os resultados obtidos. (desse modo a falta

de consistncia torna difcil a interpretao correta dos dados e a comparao dos

achados entre diferentes estudos).

Britz et al. (2010) demonstraram por meio de um estudo em tbia de ratos, que

possvel visualizar e quantificar a porosidade da cortical ssea em ratos usando

um aparelho disponvel no mercado (SkyScan 1172 - Aartselaar, Belgium) e eles

15

puderam validar seus resultados comparando com a anlise histolgica

convencional.

Como esperado, alguns autores puderam observar uma forte correlao entre

histomorfometria 2D tradicional e anlise 3D por meio da CT de bipsias de crista

ilaca em humanos. Fortes relaes entre as avaliaes 2D e 3D de bipsias da

crista transilaca e entre scans HR-pQCT (alta resoluo perifrica quantitativa em

tomografia computadorizada) do rdio e da tbia,foram encontradas e a mais forte

correlao foi vista entre a bipsia e parmetros HR-pQCT, especificamente entre

BV / TV, Tb.N e Tb.Sp medido pela CT (Cohen et al.,2010).

A qualidade ssea clinicamente monitorada pela medida da densidade

mineral ssea (DMO), mas esta medida no suficiente para identificar

completamente a fragilidade ssea e o risco de fratura de um indivduo. A medida de

parmetros micro estruturais, denominada de anlise morfomtrica bidimensional

(2D) e tridimensional (3D), deve ser incorporada ao monitoramento da qualidade

ssea para uma determinao mais precisa dessa qualidade e para o

aprimoramento do estudo do trabeculado sseo (Silva, 2009).

Considerando a importncia deste tema, este trabalho teve como objetivo

promover uma nova abordagem quanto anlise morfomtrica que pode ser

realizada lanando uso da microtomografia computadorizada e os aspectos que

devem ser levados em considerao desde a construo at a obteno das

imagens 2D e 3D. Este estudo desenvolveu um mtodo de medio especfico no

qual foram feitas as medidas morfomtricas 2D e 3D por meio da microtomografia

computadorizada, para comparao e avaliao da perda ssea em doena

periodontal induzida em ratos.

16

OBJETIVO

17

2. OBJETIVOS

O objetivo primrio do presente trabalho foi descrever o passo-a-passo de aplicao

da microtomografia computadorizada para a avaliao da perda ssea alveolar em

um modelo experimental animal.

O objetivo secundrio foi comparar os parmetros 2D e 3D e avaliar a

preciso do mtodo microtomogrfico em modelo experimental de perda ssea

alveolar induzida por ligadura em ratos por meio da microtomografia

computadorizada.

18

MATERIAL E MTODOS

19

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados 40 ratos machos neste experimento, sendo 20 normotensos

da raa Wistar Kyoto (WK) e 20 hipertensos da raa SHR = Spontaneously

Hypertensive Rats, com aproximadamente 10 12 semanas de idade, provenientes

do Biotrio do Departamento de Neurologia da Faculdade de Medicina de Ribeiro

Preto, da Universidade de So Paulo (USP), sendo a cepa original da Taconics

Pharm. Inc. Germantown. importante ressaltar que a relao entre hipertenso e

perda ssea decorrente da doena periodontal no ser avaliada e correlacionada

neste estudo.

Durante todo o experimento, os animais foram mantidos em gaiolas de

dimenses 41 x 34 x 16 cm, em salas com ciclo claro/escuro de 12 horas e

temperatura controlada (22-25C) no biotrio da Faculdade de Odontologia de

Ribeiro Preto - USP. Eles seguiram uma alimentao com dieta laboratorial padro

e gua ad libitum. Todos os procedimentos foram executados de acordo com as

normas ticas regidas pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) e

submetidos aprovao da Comisso de tica na Experimentao Animal da

Instituio (Protocolo n 10.1.379.53.2).

3.1.1. Diviso dos grupos:

Os ratos WK e SHR foram divididos em grupos com doena periodontal

induzida por ligaduras (DP), e grupos controle, em que a DP no foi induzida (C).

Cada um desses 4 grupos foram divididos em 2 subgrupos, de acordo com o

20

perodo de eutansia, que foi realizada no 10 e no 21 dia do experimento

constituindo as seguintes situaes:

WK + DP ratos normotensos com doena periodontal (n=10);

WK+DP com eutansia no 10 dia (n=5)

WK+DP com eutansia no 21 dia (n=5)

WK+C ratos normotensos sem doena periodontal (n=10);

WK+C com eutansia no 10 dia (n=5)

WK+C com eutansia no 21 dia (n=5)

SHR+DP ratos hipertensos com doena periodontal (n=10);

SHR+DP com eutansia no 10 dia (n=5)

SHR+DP com eutansia no 21 dia (n=5)

SHR+C ratos hipertensos sem doena periodontal (n=10);

SHR+C com eutansia no 10 dia (n=5)

SHR+C com eutansia no 21 dia (n=5)

3.1.2. Registro da presso arterial:

A presso arterial dos animais foi verificada atravs do mtodo indireto de

pletismografia de cauda, utilizando-se um pletismgrafo adaptado para ratos. Os

registros foram realizados por um nico operador, no perodo da manh, no incio do

21

experimento (antes da colocao da ligadura) e, depois, semanalmente, at o

momento da eutansia dos animais. Este registro da presso arterial foi realizado

em laboratrio especfico com controle de luminosidade e rudos para evitar o

estresse dos animais. Assim sendo, foram considerados hipertensos apenas os

animais que apresentaram presso arterial superior a 150 mmHg sob as condies

supracitadas.

3.1.3. Induo da Doena Periodontal Experimental com Ligadura

Para a colocao da ligadura nos grupos DP, os animais foram anestesiados por

meio de injeo intraperitoneal, com soluo de Cloridrato de Xilazina a 2% (2mg/ml)

(Rompum - Bayer Sade Animal) e Cloridrato de Ketamina a 10% (10mg/ml)

(Dopalen - Agribands - Brasil Ltda) nas respectivas doses de 8 mg/Kg (Xilazina) e

75mg/Kg (Ketamina). Aps a anestesia geral, os animais foram posicionados em

mesa operatria, a qual permitiu a manuteno da abertura bucal dos ratos,

facilitando o acesso aos dentes posteriores da mandbula.

Com o auxlio de uma sonda exploradora odontopeditrica (Hu-Friedy, Chicago,

USA) para efetuar o espao adequado para insero do fio e com a ajuda do porta-

agulha tipo castroviejo (Quinelato, Rio Claro, SP, Brasil) o fio de algodo foi

colocado ao redor dos primeiros molares inferiores de cada animal (Fig. 1A e 1B).

Periodicamente, foram verificados o peso corpreo e a presena das ligaduras nos

animais. Quando constatada a perda da ligadura antes do perodo de induo e

manuteno da doena, um novo animal era preparado para o estudo e ento

substitudo.

22

Figura 1. A. Colocao do fio de algodo ao redor do primeiro molar mandibular com

auxlio de porta-agulha e pina adequados. B. Ligadura instalada.

3.1.4. Remoo da Ligadura

Com a inteno de avaliar o reparo sseo, alguns animais tiveram suas

ligaduras removidas antes da eutansia. Dessa forma, no 10 dia aps a induo da

DP por ligadura, metade dos animais de cada grupo (WK+DP e SHR+DP) foi

submetida eutansia bem como metade dos animais do grupo controle (WK+C e

SHR+C). A outra metade teve a ligadura removida no 10 dia e a eutansia ocorreu

23

no 21 dia do experimento, tanto dos animais do grupo DP quanto dos animais do

grupo C.

3.1.5. Eutansia e coleta de material para as devidas anlises

Os animais foram submetidos eutansia sob anestesia geral com soluo final

de Cloridrato de Xilazina 2% (8mg/Kg) (Dopaser Herpate Calier, Juatuba-MG,

Brazil) e Cloridrato de Ketamina 10% (75mg/Kg) (Agener So Paulo-SP Brazil),

nas respectivas doses de 30 mg/Kg (Xilazina) e 240 mg/Kg (Ketamina), de acordo

com o perodo de eutansia de cada grupo, isto , 10 ou 21 dias.

As hemimandbulas foram dissecadas atravs de processos qumico e biolgico

e as peas anatmicas obtidas foram acondicionadas individualmente em potes

plsticos identificados, contendo soluo de formalina neutra tamponada 10%, a fim

de proporcionar uma pea histolgica adequadamente preparada para ser

escaneada no microtomgrafo.

3.2. Microtomografia computadorizada

A Tomografia Computadorizada (TC) uma tcnica que permite a

visualizao de seces transversais (cortes internos) de um objeto de forma no

destrutiva. O princpio de funcionamento do microtomgrafo de raios-X baseia-se na

propriedade dos materiais absorverem esta radiao de forma diferenciada

dependendo de sua composio qumica e densidade. A TC divide virtualmente o

objeto de estudo em fatias nas quais so mapeados parmetros fsicos como a

densidade e a porosidade de cada regio interna do objeto que so apresentadas na

forma de imagens bidimensionais que podem ser compostas de modo a obter

24

objetos virtuais 3D, por meio de algoritmos computacionais. No caso de ossos,

pode- se estudar a estrutura trabecular, verificar a existncia de processos de

osteopenia ou osteoporose e medir a densidade ssea. A obteno das imagens

tomogrficas (seces transversais) realizada em duas etapas:

a) aquisio das imagens radiogrficas de diversas projees angulares da

amostra ao longo de uma rotao de 180 ou 360 com passos de rotao

muito precisos (alguns dcimos de graus);

b) reconstruo das imagens das seces transversais a partir das imagens das

projees angulares por meio do algoritmo de reconstruo de feixe cnico de

Feldkamp modificado que roda no cluster de computadores. Este processo de

reconstruo cria uma completa representao 3D da microestrutura interna

do objeto.

Para realizao da anlise microtomogrfica foi utilizado um aparelho modelo

1172 (Fig. 1A do Anexo) da fabricante SkyScan (SKYSCAN N.V., Kontich,

Belgium). As amostras foram verificadas em todos os trs planos espaciais atravs

do aparelho modelo 1172 verso 1.5, composto por um tubo de raios-X de microfoco

com fonte de alta tenso (100 kV), um porta-amostra com manipulador de preciso e

um detector baseado em uma cmera CCD de 11Mp (4000 x 2300 pixels)

conectados a um computador de controle e aquisio de dados (host) interligado em

rede a um cluster de computadores utilizados na reconstruo das imagens.

O escaneamento das amostras foi padronizado com um tamanho de voxel

isotrpico de 9 m, 60 kV, 165 A, em 180, ngulo de rotao de 0.6 e filtro de Al

0,5 mm com tempo de exposio de 540 milissegundos ou seja 0,5 segundos,

utilizando um filtro de alumnio de 0.5 mm de espessura. As imagens de cada

amostra foram reconstrudas a partir do pice da coroa, incluindo o processo do

25

osso alveolar com o software especfico NRECON v 1.6.3.3 em cerca de 100 a 120

fatias de acordo com os parmetros anatmicos adotados. Os softwares CTAN v

1.10.11.0 e DATA VIEWER v 1.4.3 e CTVOX v 2.0.0.0 foram utilizados para a

visualizao tridimensional e a anlise qualitativa (quantitativa tambm) da anatomia

externa e interna dos dentes e do osso alveolar. A gama completa de softwares para

anlise quantitativa SkyScan 2D / 3D e visualizao em 3D permitiu que cada hemi-

mandbula de cada um dos grupos fossem examinadas pelo sistema de aplicativos e

softwares fornecidos pela SkyScan.

As peas foram posicionadas e fixadas no porta-amostra (Fig. 1B do Anexo)

apropriado para o equipamento, com cera utilidade, possibilitando a estabilizao a

fim de prevenir qualquer tipo de movimentao durante o escaneamento. Aps o

escaneamento, as projees tomogrficas foram reconstrudas com o auxlio de um

programa especfico (N.Recon, SkyScan). Este programa gerou as imagens em

3D. O programa DataViewer foi utilizado para visualizao e avaliao em 2D

(medidas lineares) dos eixos coronal, transaxial e sagital bem como a definio da

distncia da juno cemento-esmalte crista ssea nos aspectos vestibular e lingual

dos dentes, e da regio interproximal e de furca. A posio da crista ssea alveolar

foi determinada como o primeiro contato do osso com a superfcie radicular.

As anlises lineares (2D) foram realizadas aps o estabelecimento de uma

posio ideal, determinada pelo examinador. Tal posio era representada quando,

no plano sagital, podiam-se visualizar, nitidamente, o primeiro e segundo molares,

enquanto que no plano coronal as razes estavam completamente separadas. A

medio da regio de furca foi realizada na imagem existente no eixo sagital, ao

passo que a quantificao de perda ssea por vestibular, lingual e interproximal foi

feita nas imagens no eixo transaxial.

26

Para as anlises volumtricas foi escolhido um eixo de interesse (coronal) e

utilizado um programa especfico de anlise 3D (CTAn ).

O objetivo das anlises volumtricas (3D) foi quantificar o volume do osso

alveolar em duas regies distintas: interproximal entre M1 e M2 e furca do M1 e,

para tanto, foi escolhido como ponto de partida o corte (slice) onde as quatro razes

do primeiro molar inferior do animal foram visualizadas nitidamente. O ponto final da

seleo foi determinado como a posio em que no era possvel visualizar mais o

osso interradicular, delimitando dessa forma a regio a ser analisada. Com estes

referenciais estabeleceu-se o intervalo de 100 a 120 cortes (slices) para anlise da

rea de interesse. O retngulo foi a figura geomtrica escolhida para representar a

regio a ser analisada; regio de interesse (ROI). Esta forma geomtrica foi

adequada por interpolao rea a ser medida e obtivemos o volume de interesse

(VOI).

Todos os clculos so realizados sobre a regio e/ou volume de interesses

selecionados. Uma seleo consistente e precisa das regies ou volumes de

interesse de fundamental importncia para a obteno de dados precisos e

significativos. Alguns esclarecimentos sobre a terminologia para isso til

(http://www.skyscan.be acessado em 10/02/2013). O termo "regio de interesse", ou

ROI, ir se referir a uma regio selecionada de uma imagem nica de seo

transversal. A anlise 2D realizada dentro de um ROI. O "volume de interesse"

refere-se soma de todos os ROIs coletivos sobre um conjunto contguo de fatias

de imagem de seo transversal, representando um volume 3D selecionado. Dessa

forma, as anlises morfomtricas em 3D so realizadas em um VOI.

Em seguida procedemos a binarizao para diferenciar o osso do restante do

tecido. Esse processo consiste na escolha de um valor limiar para os pixels

27

(threshold), que ser aplicado imagem. Todos os pixels cujos valores forem

maiores ou iguais aos do limiar sero convertidos em um valor denominado

saturado. Em uma imagem digital com resoluo de 8 bits, este valor saturado vale

255. De forma anloga, todos os pixels com valores inferiores aos do limiar sero

convertidos em 0 (zero). O resultado uma imagem em preto e branco, onde a fase

branca corresponde ao tecido sseo e a fase preta ao restante do tecido (no

quantificado). Os parmetros obtidos dependem muito dos valores de threshold

utilizados nas imagens binarizadas (Lima et al., 2009).

Determinados o limite inferior em 40 e o limite superior em 160 (grayscale

threshold 0-255), a mesma binarizao foi usada para todas as amostras.

Recapitulando tem-se que cada fatia tomogrfica considerada como

representativa de uma poro volumtrica da amostra, com a espessura do tamanho

idntico ao do lado do pixel da imagem. Empilhando-se essas fatias no espao,

obtm-se um slido tridimensional representativo da amostra de osso. A primeira

etapa na construo do slido tridimensional representativo da amostra de osso a

identificao de quais pixels de cada fatia tomogrfica fazem parte da estrutura

ssea e quais pixels representam vazios. Esse processo, chamado de segmentao

ou binarizao (Fig. 2), foi realizado tomando-se, primeiramente, uma pequena

regio de uma das fatias, contendo parte do osso e parte de vazio. Ento,

comparando-se os valores dos nveis de cinza com a imagem, optou-se por assumir

o valor 160 como limiar. Ou seja, pixels com valor de cinza maior que 160 foram

considerados espaos vazios e valores menores que 40 foram considerados osso.

28

Figura 2. Imagem da segmentao binria da rea de interesse. A. Representa a imagem

real. B. a imagem binarizada de A.

3.2.1. Anlise das medidas unidimensionais (2D)

As medidas lineares foram produzidas por meio do software DataViewer

(Skyscan), onde possvel a visualizao em trs eixos ao mesmo tempo: sagital,

coronal e transaxial. Para avaliar a perda ssea alveolar, as distncias da juno

cemento-esmalte (JCE) crista ssea alveolar (CO) foram medidas em micrmetros

(m) em quatro locais distintos entre os primeiros (M1) e os segundos molares (M2)

mandibulares. Uma linha imaginria foi traada tangenciando a crista ssea tanto na

furca do M1 quanto na regio interproximal entre M1 e M2; perpendicularmente uma

linha vertical cruzou a linha horizontal formando um ngulo de 90, assim foi da JCE

crista ssea por vestibular (COV) = JCE-COV; da JCE crista ssea por lingual

(COL) = JCE-COL; do ponto de contato (PC) entre o primeiro e segundo molar e a

crista ssea interproximal (COI); e da regio de bifurcao (furca) do primeiro molar,

medida correspondente distncia entre o teto da furca e a crista ssea

interradicular (Fig. 3A e 3B). As imagens abaixo exemplificam como foi realizada a

marcao para as distncias avaliadas:

29

Figura 3. A. Eixo sagital ilustrando a medida linear da regio de furca no primeiro molar e

medida da regio interproximal entre o M1 e M2. B. Eixo transaxial ilustrando as duas

medidas lineares JCE-COV e JCE-COL. M1= primeiro molar mandibular; M2= segundo

molar mandibular; M3= terceiro molar mandibular; JCE= juno cemento-esmalte; CO=

crista ssea.

3.2.2. Anlise das medidas volumtricas ou tridimensionais (3D)

Para a captura das imagens (Fig. 4) utilizadas na construo dos parmetros

volumtricos utilizou-se os softwares do fabricante do microtomgrafo (Data Viewer

e CTAnalyser). Abaixo podemos observar as telas explicativas de cada etapa da

seleo das imagens at chegar gerao das medidas e das imagens em 3D (ver

figuras no Anexo).

30

Figura 4. Imagem da tela inicial do aplicativo Data Viewer. Primeiro passo para iniciar a

construo do volume da regio de interesse, possibilita visualizar os trs eixos de

orientao da pea anatmica. A: Eixo coronal; B: Eixo transaxial; C: Eixo sagital.

Com os trs eixos alinhados, o eixo coronal (A) foi o escolhido para se realizar

a medio volumtrica. Esta escolha foi baseada na facilidade em se obter um guia

para a reproduo em todas as amostras. Uma vez que a possibilidade de se

desenhar um polgono no qual todos os lados tangenciassem as razes do primeiro

molar mandibular era mais reproduzvel e confivel. A metodologia da escolha de

uma figura geomtrica para anlise da regio de interesse est documentada na

literatura (Xu et al., 2013).

Escolhido o eixo sagital, foi necessrio abrir o software (aplicativo) CTan

(Fig. 5) para o incio da escolha das ferramentas que auxiliaram na construo dos

parmetros morfomtricos de volume sseo.

31

A escolha do Top e do Bottom (Fig. 5) foi o prximo passo para selecionar

a quantidade de fatias (slices) que compem a regio de interesse (ROI). O top,

primeiro slice selecionado escolhido quando as quatro razes do primeiro molar

esto aparecendo nitidamente; o bottom, ltimo slice selecionado escolhido

quando a imagem das razes se funde, no mais possibilitando a visualizao da

parte ssea na regio de interesse. O ROI representado nesse estudo foi composto

de uma quantidade de cem a cento e vinte slices e depois disso uma figura

geomtrica na forma de um retngulo (Fig. 6) foi selecionada para propiciar a

interpolao dos ROIs, ou seja, faz-los unidos em uma s estrutura, para permitir o

clculo em 3D dos ndices volumtricos. A escolha do eixo coronal, como dito

anteriormente, foi decisiva para a escolha da regio anatmica a ser analisada.

Aps a interpolao dos ROIs, foi realizado o processamento da imagem (Fig.

7) e por fim, a gerao dos dados volumtricos para a posterior confeco das

imagens em 3D.

32

Figura 5: Imagem da tela inicial do aplicativo CTAnalyser. Selecionando o Top e Bottom para a criao do ROI.

33

Figura 6. Imagem da escolha da forma geomtrica. O retngulo vermelho o guia para direcionar o local da regio de interesse (ROI). Ele deve ficar posicionado de tal modo que

os seus lados possam tocar a face de cada uma das razes, em todos os slices que

compem o ROI.

Figura 7. Imagem ilustrativa da barra de ferramentas. Depois da interpolao do ROI necessrio fazer o processamento da imagem (A) em processed images indicado pelo crculo vermelho. Prxima etapa deve-se selecionar o cone indicado pela seta azul (B) e a anlise 3D ser inicializada (C).

34

O clculo do volume da regio de interesse foi feito atravs do aplicativo

CTan que atravs do selecionamento prvio dos parmetros de interesse (Fig. 8),

nos fornece em uma tabela os dados requeridos e suas respectivas unidades de

medida.

Com os dados de cada parmetro calculados, foi possvel construir a imagem

tridimensional da rea de interesse (Fig. 2 do Anexo) bem como da rea total da

amostra (Fig. 3 do Anexo) com a utilizao do aplicativo CTVOX.

35

Figura 8. Selecionados os parmetros de interesse, os resultados aparecem em uma tabela

contendo cada parmetro calculado pelo CTAnalyser e sua respectiva unidade de medida.

36

3.3. Anlise estatstica

A anlise estatstica foi feita utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0,

(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Ademais, os dados foram registrados

como mdia e seus respectivos desvios-padro para os parmetros lineares e

volumtricos e a unidade experimental foi o rato. Para seleo do teste estatstico

adequado foram realizados testes de homogeneidade e homocedasticidade. A

anlise estatstica foi realizada atravs da aplicao de testes paramtricos. Para a

comparao entre os resultados obtidos no grupo controle (C), no grupo teste (DP) e

nos diferentes tempos de eutansia (10 e 21 dias) foi aplicado o teste de anlise de

varincia (One Way ANOVA) seguido do ps-teste de Tukey. Para todas as anlises

estatsticas, foi adotado nvel de significncia de 95% (p

37

RESULTADOS

38

4. RESULTADOS

A parte experimental envolvendo os animais transcorreu de maneira tranquila,

sem grandes intercorrncias. Cada grupo deste estudo teve um n= 5. Desse modo,

se um animal morresse antes do perodo indicado para sua eutansia, um novo

animal de caractersticas semelhantes (idade, peso, raa) era introduzido no estudo,

para que ao final da parte experimental cada um dos oito grupos permanecesse com

cinco animais.

4.1. Medidas Lineares

Os resultados das medidas lineares foram extrados de uma imagem

bidimensional de uma fatia nica escolhida por ser a mais representativa para

detectar a perda ssea alveolar (Fig. 3A e 3B).

Os parmetros avaliados para medir POA (perda ssea alveolar) foram:

A) Furca - distncia do teto da furca crista ssea interradicular do M1.

B) Vestibular - distncia da JCE (juno cemento-esmalte) crista ssea por

vestibular = JCE-COV

C) Lingual - distncia da JCE crista ssea por lingual = JCE-COL

D) Interproximal - Ponto de contato entre M1 e M2 crista ssea alveolar

interproximal = PC-COI

Os valores de todas as mensuraes, bem como os resultados que se

mostraram estatisticamente significante (p

39

Figura 9. Nvel sseo alveolar para os grupos SHR e WK. As medidas

indicam a distncia mdia entre o teto da furca e a crista ssea interradicular (m)

de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de

21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por

ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise intragrupo mostra maior perda

ssea nos grupos DP quando comparados aos grupos C (p

40

Figura 10. Nvel sseo alveolar para os grupos SHR e WK. As medidas

indicam a distncia entre a JCE-COV (m) de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia

aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de

10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta.

A anlise intragrupo mostra maior perda ssea nos grupos DP quando comparados

aos grupos C. A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21

dia foi observada somente no grupo SHR-DP (p

41

Figura 11. Nvel sseo alveolar para os grupos SHR e WK. As medidas

indicam a distncia entre a JCE-COL (m) de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia

aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de

10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta.

A anlise intragrupo mostra maior perda ssea no grupo DP quando comparado ao

grupo C somente nos ratos SHR com eutansia no 21 dia (p

42

Figura 12. Nvel sseo alveolar para os grupos SHR e WK. As medidas

indicam a distncia entre o PC-COI (m) de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia

aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de

10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta.

A anlise intragrupo mostra maior perda ssea nos grupos DP quando comparados

aos grupos C em ambos os ratos SHR e WK aos 21 dias (p

43

Tabela 1. Mdias e desvios-padro (m) dos parmetros lineares do grupo Wistar Kyoto (WK) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias.

GRUPO WK (10 dias) GRUPO WK (21 dias)

Parmetro C DP C DP

Furca (m) 112,131,77 468,7895,21* 185,5844,50 667,87220,16

JCE-COV (m) 386,656,34 1136,64255,13* 502,692,70 1539,7218,89

JCE-COL (m) 780,96178,01 862,14143,10 908,54120,71 961,7155,93

PC-COI (m) 978,12228,56 1174,325153,33 954,94189,71 1511,16248,37

JCE: juno cemento esmalte; COV: crista ssea vestibular; COL: crista ssea lingual; PC: ponto de contato; COI: crista ssea interproximal; C: controle; DP: doena periodontal. * Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

44

4.2. Medidas Volumtricas

Para a quantificao dos parmetros volumtricos, que so a soma de um

conjunto de cortes previamente selecionados e determinados de acordos com

alguns pontos de referncia, neste caso foram pontos anatmicos (razes dos

dentes), foi realizada a avaliao em dois locais distintos: a rea da regio de furca

do M1 mandibular e a rea da regio interproximal entre M1 e M2 da mandbula.

Para uma fcil compreenso dos resultados, os valores numricos foram

distribudos em tabelas e para uma melhor visualizao, foram confeccionados

grficos (um da regio de furca e outro da regio interproximal) para cada parmetro

tridimensional avaliado.

As tabelas contm os grupos (WK e SHR) com os respectivos tempos de

eutansia (10 e 21 dias) e cada parmetro e sua respectiva unidade de medida. Os

valores para os quais houve diferena estatisticamente significante esto

devidamente assinalados nos grficos a seguir.

45

Tabela 3: Mdias e desvios-padro dos parmetros volumtricos de furca dos grupos Wistar Kyoto (WK) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias dos grupos controle (C) e doena periodontal (DP).

Grupo WK (10 dias) Grupo WK (21 dias) Grupo SHR (10 dias) Grupo SHR (21 dias)

Parmetro C DP C DP C DP C DP

Volume

Tecidual

(VT, mm)

1,040,08

1,090,14

1,230,13

1,080,17

1,070,08

1,160,13 0,950,21 1,230,16

Volume

sseo (VO,

mm)

0,710,08 0,530,12 0,900,13 0,580,05 0,850,06 0,730,05 0,770,13 0,610,14

VO/VT (%) 68,056,37 52,442,76* 73,265,46 54,365,51 79,602,72 60,523,55* 81,755,73 49,446,04

Superfcie

Tecidual

(mm)

6,940,21 7,080,53 7,550,54 7,000,76 7,150,29 7,440,66 6,571,01 7,820,55

Superfcie

ssea

(SO, mm)

15,731,36 15,672,18 17,541,90 14,190,19 12,540,62 16,713,17 11,342,76 13,942,79

* Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

46

Tabela 3 (Continuao): Mdias e desvios-padro dos parmetros volumtricos de furca dos grupos Wistar Kyoto (WK) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias dos grupos controle (C) e doena periodontal (DP).

Grupo WK (10 dias) Grupo WK (21 dias) Grupo SHR (10 dias) Grupo SHR (21 dias)

Parmetro C DP C DP C DP C DP

Superfcie de

Interseo

(mm)

2,890,49 1,680,30* 3,180,22 2,010,27 3,410,12 2,550,49 3,530,46 2,180,26

SO/VO (mm-1)

22,492,83

30,022,99*

19,532,06

24,521,89

14,720,99

24,940,70*

14,641,58

22,962,10

SO/VT (mm-1) 15,170,54 14,441,31 14,230,41 13,361,93 11,710,58 14,351,31 11,900,52 11,321,47

Espessura de

trabeculado

(mm)

0,140,01 0,120,01 0,150,01 0,130,00 0,200,03 0,150,03* 0,190,02 0,130,01

* Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

47

Tabela 3 (Continuao): Mdias e desvios-padro dos parmetros volumtricos de furca dos grupos Wistar Kyoto (WK) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias dos grupos controle (C) e doena periodontal (DP).

Grupo WK (10 dias) Grupo WK (21 dias) Grupo SHR (10 dias) Grupo SHR (21 dias)

Parmetro C DP C DP C DP C DP

Nmero de

trabculas

(mm-1)

4,700,14 4,160,47 4,910,10 4,350,51 4,040,50 4,780,15 4,330,22 3,740,48

Espao entre

trabculas

(mm)

0,120,02 0,150,01 0,110,03 0,140,01 0,130,02 0,130,02 0,120,03 0,300,01

Porosidade

(%) 31,956,37 51,357,92* 26,745,46 45,645,51 20,412,22 43,597,54* 18,255,73 50,566,04

* Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

48Tabela 4: Mdias e desvios-padro dos parmetros volumtricos da regio interproximal dos grupos Wistar Kyoto (WK) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias dos grupos controle (C) e doena periodontal (DP).

GrupoWK(10dias) GrupoWK(21dias) GrupoSHR(10dias) GrupoSHR(21dias)

Parmetro C DP C DP C DP C DP

Volume

Tecidual

(VT,mm)

3,990,33 3,730,28 3,880,62 4,740,65 4,740,61 5,290,34 5,130,55 5,170,36

Volumesseo

(VO,mm)1,660,12 1,080,18* 1,550,23 1,790,23 2,480,12 1,490,14* 2,080,30 1,460,11

VO/VT(%) 41,612,06 29,07 4,18* 40,19 4,67 34,02 3,68 42,76 6,44 28,22 2,78* 43,90 3,74 28,172,12

Superfcie

Tecidual

(mm)

16,861,00 16,160,77 16,781,60 18,881,62 18,861,31 20,211,01 18,671,48 20,060,98

Superfcie

ssea

(SO,mm)

31,853,87 30,147,24 28,113,26 37,445,89 33,425,68 34,472,62 32,774,31 30,873,03

* Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

49

Tabela 4 (Continuao): Mdias e desvios-padro dos parmetros volumtricos da regio interproximal dos grupos Wistar Kyoto (WK) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias dos grupos controle (C) e doena periodontal (DP).

GrupoWK(10dias) GrupoWK(21dias) GrupoSHR(10dias) GrupoSHR(21dias)

Parmetro C DP C DP C DP C DP

Superfciede

Interseo

(mm)

6,960,75 4,970,65* 6,630,71 5,320,70 7,110,98 5,121,24* 7,120,98 5,170,39

SO/VO(mm1) 19,252,01 23,19 0,69 18,20 1,13 20,98 1,43 16,64 2,10 23,25 2,34* 15,81 0,44 21,221,33

SO/VT(mm1) 8,000,82 7,36 1,75 7,29 0,63 7,14 0,97 7,02 0,33 6,53 0,65 6,94 0,64 5,970,48

Espessurade

trabeculado

(mm)

0,230,02 0,200,02 0,250,00 0,200,01 0,240,02 0,190,03* 0,250,03 0,190,00

* Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

50

Tabela 4 (Continuao): Mdias e desvios-padro dos parmetros volumtricos da regio interproximal dos grupos Wistar Kyoto (WK) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) com tempo de eutansia aos 10 e aos 21 dias dos grupos controle (C) e doena periodontal (DP).

GrupoWK(10dias) GrupoWK(21dias) GrupoSHR(10dias) GrupoSHR(21dias)

Parmetro C DP C DP C DP C DP

Nmerode

trabculas

(mm1)

1,780,13 1,450,28 1,580,17 1,680,24 1,740,13 1,460,17 1,780,22 1,510,09

Espaoentre

trabculas

(mm)

0,510,06 0,560,06 0,530,07 0,580,04 0,510,06 0,630,05 0,530,05 0,700,04

Porosidade

(%)58,392,07 70,934,18* 59,814,67 65,983,68 57,246,45 71,782,78* 56,103,74 71,832,12

* Diferena estatisticamente significante de C (10 dias) (ANOVA, Tukey, p

51

Figura 13. Volume tecidual (mm) para os grupos SHR e WK. As medidas indicam o volume total de interesse na regio de furca (A) e interproximal, entre M1 e M2 (B), de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. No

foram observadas diferenas estatisticamente significantes nas anlises intra e intergrupos (p>0,05). As barras representam

mdias desvios-padro (mm) do volume tecidual. *Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

52

Figura 14. Volume sseo (mm3) na regio de furca (A) e interproximal, entre M1 e M2 (B). As medidas indicam o volume sseo, volume total binarizado dentro do VOI, de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias

correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise entre

os grupos C e DP mostrou diferenas estatisticamente significantes para WK aos 21 dias na regio de furca e para todos os

grupos, exceto para WK aos 21 dias na regio interproximal. A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21

dia foi observada somente para (B) no grupo WK-DP. As barras representam mdias desvios-padro (mm3) do volume sseo na

regio A e B. *Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

53

Figura 15. Superfcie do tecido (mm2) para os grupos SHR e WK. As medidas indicam a rea de superfcie do volume de interesse de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos

de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise intragrupo e a progresso da DP

aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia no demostraram diferenas com relevncia significativa. As barras

representam mdias desvios-padro (mm2) da superfcie do tecido nas regies de furca (A) e interproximal (B). *Nvel de

significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

54

Figura 16. Superfcie ssea (mm2) para os grupos SHR e WK. As medidas indicam a rea de todos os objetos slidos dentro do VOI de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. A anlise intragrupo no mostrou diferena estatstica para as regies furca (A) e interproximal (B). A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia para este parmetro tambm no foi observada. As barras representam mdias desvios-padro (mm2) da superfcie ssea na regio A e B.

*Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

55

Figura 17. Superfcie de interseo (mm2) para os grupos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo

desta. As medidas indicam a superfcie do VOI entrecortado por objetos binarizados slidos, isto , a parte da superfcie do VOI na

qual as partculas sseas se cruzam, na interface do trabeculado sseo. A anlise intergrupo (C e DP) mostrou diferenas significantes no grupo SHR e WK aos 10 dias na regio de furca (A) alm do grupo WK aos 10 dias e nos grupos SHR e WK aos 21 dias na regio interproximal (B). A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia no foi observada. As barras representam mdias desvios-padro (mm2) da superfcie de interseo na regio A e B. *Nvel de significncia foi

considerado 95% (Anova, Tukey, p

56

Figura 18. Relao entre a superfcie ssea (SO) e o volume total (VT) (1/mm) para os grupos SHR e WK. As medidas indicam a proporo entre a rea de superfcie e o volume total medido dentro do VOI, na regio de furca (A) e na regio interproximal (B),

nos tempos de 10 e 21 dias para ratos SHR e WK. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena

periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise estatstica mostrou diferena significante apenas para

o grupo SHR-DP entre o 10 e o 21 dia demonstrando a progresso da DP 11 dias aps a remoo da ligadura. As barras

representam mdias desvios-padro (mm-1) da proporo SO/VT nas duas regies avaliadas furca e interproximal. *Nvel de

significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

57

Figura 19. Relao entre a superfcie ssea (SO) e o volume sseo (VO) (1/mm) para os grupos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. As medidas indicam a razo entre a superfcie do osso com o volume medido em 3D no VOI, nas

regies de furca (A) e interproximal (B). Denominada tambm de superfcie especfica um parmetro til para caracterizar a

espessura e complexidade das estruturas sseas. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena

periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise intragrupo (entre 10 e 21 dias) mostrou diferena

estatisticamente significante somente para WK-DP em A. A anlise intergrupos (C e DP) mostrou diferena estatisticamente

significante em A com SHR aos 10 e 21 dias; WK aos 10 dias e em B com SHR aos 10 e 21 dias. As barras representam mdias

desvios-padro (mm-1) da proporo SO/VO nas duas regies avaliadas furca e interproximal. *Nvel de significncia foi

considerado 95% (Anova, Tukey, p

58

Figura 20. Relao entre o volume sseo (VO) e o volume total (VT) medidos em porcentagem para os grupos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. As medidas indicam a proporo do VOI ocupado por osso. Os valores de 21 dias

correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise

intergrupos mostrou diferena estatisticamente significante em todos os grupos em A (regio de furca) e nos grupos SHR aos 10 e

21 dias e WK aos 10 dias em B (regio interproximal). A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia no

foi observada. As barras representam mdias desvios-padro (%) da proporo VO/VT na regio de furca e na regio

interproximal. *Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

59

Figura 21. Nmero de trabculas (Tb.N) (1/mm) para os grupos SHR e WK. A estrutura de densidade linear ou nmero trabecular implica o nmero de transversais atravs de uma estrutura trabecular feito por unidade de comprimento em um caminho

linear aleatrio atravs do VOI de ratos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias

correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise

intragrupo e intergrupos no mostrou diferena estatisticamente significante para nenhuma regio avaliada em A (furca) nem em B

(interproximal). As barras representam mdias desvios-padro (mm-1) do Tb. N nas regies analisadas. *Nvel de significncia foi

considerado 95% (Anova, Tukey, p

60

Figura 22. Espessura de trabculas (Tb.Th) (mm) para os grupos SHR e WK ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura, medidos na regio da furca (A) e na regio interproximal entre M1 e M2 (B). As medidas indicam a espessura trabecular ssea no

qual a principal vantagem da medio da espessura local que o vis da orientao 3D da estrutura mnimo. A distribuio de

espessura um poderoso mtodo para caracterizar a forma de uma estrutura complexa, no caso o osso trabecular. Os valores de

21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A

anlise intergrupos (C e DP) mostrou diferena estatisticamente significante apenas para os grupos SHR aos 10 e aos 21 dias

tanto para regio A quanto para regio B. A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia no foi

observada para nenhum grupo em nenhuma das regies avaliadas. As barras representam mdias desvios-padro (mm) para

Tb.Th nas regies avaliadas. *Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

61

Figura 23. Espao entre trabculas (Tb.Sp) (mm) para os grupos SHR e WK na regio de furca (A) e na regio interproximal (B). As medidas indicam a separao trabecular que essencialmente a espessura dos espaos definidos pela binarizao dentro do

VOI. As medidas foram realizadas ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos

efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise intergrupos (C e DP)

mostrou diferena estatisticamente significante para SHR aos 21 dias tanto para regio A quanto para regio B. A progresso da

DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia foi observada somente no grupo SHR-DP na regio de furca. As barras

representam mdias desvios-padro (mm) do Tb.Sp nas regies avaliadas. *Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova,

Tukey, p

62

Figura 24. Porosidade total (%) para os grupos SHR e WK na regio de furca (A) e na regio interproximal (B). A porosidade total o volume de todos os poros (abertos e fechados) como uma percentagem do volume total do VOI. As medidas foram realizadas

ao 10 e ao 21 dia aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena

periodontal induzida por ligadura e 11 dias aps a remoo desta. A anlise intergrupos (C e DP) mostrou diferena

estatisticamente significante para todos os grupos tanto para regio A quanto para regio B; exceto WK aos 21 dias na regio

interproximal. A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia no foi observada somente no grupo SHR-

DP na regio de furca. As barras representam mdias desvios-padro (%) da porosidade nas regies avaliadas. *Nvel de

significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

63

Figura 25. Densidade Mineral ssea (DMO) para os grupos SHR e WK na rea total (furca e interproximal). A densidade mineral ssea quantidade de minerais encontrada nos ossos e pode ser medida em qualquer osso do corpo. As medidas foram realizadas ao 10 e ao 21 dia

aps a colocao da ligadura. Os valores de 21 dias correspondem aos efeitos de 10 dias de doena periodontal induzida por ligadura e 11

dias aps a remoo desta. A anlise intergrupos (C e DP) mostrou diferena estatisticamente significante para todos os grupos. A progresso da DP aps a remoo da ligadura entre o 10 e o 21 dia no foi observada. A. No grfico as barras representam mdias desvios-padro (em %) da DMO nas regies avaliadas. B. A tabela mostra os valores numricos expressos como mdias desvios-padro em porcentagem. *Nvel de significncia foi considerado 95% (Anova, Tukey, p

64

De todos os parmetros analisados os mais representativos para detectar a

perda ssea alveolar neste modelo de estudo foram:

Na avaliao em 2D (medidas lineares ou bidimensionais):

- Furca e JCE-COV.

Na avaliao dos parmetros 3D (medidas volumtricas ou tridimensionais):

- Relao entre a superfcie ssea (SO) e o volume sseo (VO) (expressa

como 1/mm); relao entre o volume sseo (VO) e o volume total (VT) expressa em

porcentagem; a porosidade (PO) e a densidade mineral ssea ambas expressas em

porcentagem.

A diferena percentual entre os mtodos de avaliao propostos neste estudo

foi calculada e o resultado mostrado no grfico abaixo.

Figura 26. Diferena percentual em relao ao mtodo de medida (bidimensional ou

tridimensional) utilizado para avaliao perda ssea alveolar decorrente da doena periodontal

induzida.

65

DISCUSSO

66

5. DISCUSSO

Este estudo apresentou uma tcnica 3D que permite ilustrar o estado do osso

alveolar em um modelo em ratos sem ligadura (controle) e com periodontite

experimental induzida por ligadura (DP) alm de fornecer dados sobre as alteraes

sseas alveolares lineares e volumtricas, que ocorreram durante o experimento.

Foi demonstrado que a perda de osso alveolar ocorreu em ambos os grupos com

doena periodontal. Isto sugere que a infeco periodontal deve contribuir para o

desenvolvimento de perda de massa ssea, independentemente da presena do

estado de hipertenso (ratos SHR) ou no (ratos WK).

Muitos estudos j demonstraram a relao da infeco patognica com a

perda ssea alveolar como Polak e colaboradores (2009), que descobriram que uma

infeco polimicrobiana com P. gingivalis / F. nucleatum agravou a perda ssea

alveolar e induziu uma resposta inflamatria mais forte em comparao com o

observado aps infeco monobacteriana. Isto sugere que a destruio do tecido se

mantm aps a infeco periodonto-patgena ser erradicada e que o processo de

destruio mediado pela resposta do hospedeiro.

A ligadura pode causar perda significativa no trabeculado sseo alveolar,

resultando em uma maior perda ssea e deteriorao da microestrutura ssea

alveolar. Sobre os achados clnicos do presente estudo na anlise intra-grupo, os

grupos DP mostraram perda ssea superior, aps 10 dias da colocao da ligadura

em relao ao grupo controle, indicando que o mtodo de ligadura foi eficiente para

induzir periodontite. Este resultado est de acordo com Bastos et al. (21) que

verificaram que h maior perda ssea na rea de bifurcao, bem como a espcie

SHR apresentou graves alteraes no osso alveolar, independentemente da

67

inflamao. Aos 21 dias, os grupos DP mostraram um aumento da perda de massa

ssea acumulada em comparao com o grupo controle, indicando que eles no

apresentaram formao ssea na fase no-ligadura deste estudo. No entanto,

verificou-se uma perda ssea mais elevada entre 10 e 21 dias apenas no grupo

SHR-DP. De qualquer modo pode-se observar com este estudo que a

microtomografia computadorizada um mtodo capaz de detectar a perda ssea e

que esta pode ser interpretada de diversas maneiras dependendo do local ou stio

escolhido e tambm do modo como a anlise feita atravs dos diversos recursos

que os aplicativos do mtodo escolhido (SKYSCAN-BRUKER) oferecem.

Esse trabalho fez a avaliao da perda ssea alveolar pela doena

periodontal, utilizando um modelo de estudo em ratos por meio da anlise

microtomogrfica. de conhecimento geral que o mtodo mais frequente de

mensurao da perda ssea em estudos em animais a anlise histolgica. No

entanto, estas tem limitada capacidade de identificar os nveis sseos associados

com os tecidos saudveis e os associados doena periodontal. Para minimizar

esta limitao o estudo de Fernandes et al. (2007) comparou os procedimentos de

medida da altura ssea histolgica e morfomtrica e nos resultados os autores

definiram que para a realizao de medidas lineares, ambas as anlises histomtrica

(histolgica) e morfomtrica so capazes de detectar diferenas induzida por

ligadura em altura ssea em ratos. Os autores supracitados esto de acordo com

este estudo quando mostram que a anlise histomorfomtrica atravs da anlise de

micro-CT capaz de detectar perda ssea alveolar; no necessitando de estudo

histolgico para confirmao dos dados. Alis, uma das grandes vantagens do

sistema de micro-CT justamente que este um sistema de avaliao no

destrutivo.

68

Pode-se dizer que a histologia um mtodo complementar anlise 3D. Sua

importncia se d no momento que traz informaes qualitativas do processo

biolgico envolvido com inflamao e alteraes teciduais. (Lindhe et al., 2003;

Molinaro et al., 2010).

A cicatrizao ssea alveolar foi examinada quantitativamente por imagens

tomogrficas atravs da micro-CT. No presente trabalho a maior dificuldade

encontrada foi a de se estabelecer uma forma precisa para quantificar o osso

perdido na regio de furca e na interproximal, uma vez que o que foi medido era o

espao onde no havia mais osso, ou seja, o osso calculado era o remanescente da

perda ssea alveolar. O que foi perdido no foi possvel, nesse modelo de estudo,

de ser mensurado, contudo conseguiu-se calcular quantitativa e qualitativamente o

osso remanescente aps a presena da doena periodontal induzida por ligadura.

Desde o seu desenvolvimento inicial a microtomografia (micro-CT) tornou-se

uma ferramenta importante para a anlise da morfologia ssea, principalmente para

o osso esponjoso/trabecular. Parmetros estereolgicos tm sido usados como uma

estimativa para a arquitetura do osso trabecular. (Estereologia = estudo das partes

slidas dos corpos vivos). A microestrutura da rede trabecular frequentemente

medida usando medidas tais como frao de volume de osso (BV/TV), nmero

trabecular (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th), separao trabecular (Tb.Sp), e

para a proporo entre a superfcie ssea e o volume sseo (BS/BV).

Como dito anteriormente, o sistema de micro-CT foi introduzido pela primeira

vez por Feldkamp et al. (1989). Este sistema foi validado como um mtodo de

anlise 3D por Muller et al. (1998) ao demonstrar a boa correlao entre os

resultados da anlise em 3D com a consolidada histologia 2D. Este mtodo de

anlise permite medies em 3D de quantidade ssea e uma avaliao da

69

arquitetura e da microestrutura do osso, que so importantes para a estimativa da

durabilidade e fora ssea, por exemplo. Ambos os mtodos de anlise so teis na

verificao dos parmetros morfomtricos, porm uma desvantagem a respeito da

anlise histolgica, segundo Chackartchi et al. (2011) que ela baseada num

clculo quantitativo de uma imagem 2D, feita a partir da poro central da amostra, e

assim isto est em contraste com a anlise de micro-CT, o qual feita a partir do

volume total da amostra, e, portanto, mais completa neste aspecto.

Finalmente, em todos os casos a escolha de parmetros de verificao deve

basear-se em particular na avaliao dos resultados relevantes para a questo de

pesquisa de interesse. Alguns autores (Kim et al.,2004; Verdelis et al., 2011) indicam

que as medies morfomtricas no devem ser diretamente comparadas entre os

sistemas de micro-CT. Alm disso, certas condies, incluindo a dimenso do voxel,

para estudos de morfometria ssea trabecular em ratos devem ser escolhidas com

base no sistema de micro-CT especfico e as medies de interesse principal

(dependente do fabricante). Da a dificuldade no momento da comparao dos

estudos que utilizam o mtodo da microtomografia computadorizada para medio

ssea.

Polak et al. (2009) demonstraram que o modelo experimental de estudo para

doena periodontal em ratos um modelo bem aceito, o qual mimetiza as

caractersticas reais da doena periodontal. O objetivo dos autores foi alcanado no

que diz respeito ao estabelecer um modelo animal de infeco poli-microbiana para

o estudo da patognese da doena periodontal. Alm disso, a literatura tem

mostrado previamente que a tecnologia de micro-CT mais sensvel do que o

mtodo de anlise bidimensional (Wilensky et al., 2005). Essa tcnica para avaliao

volumtrica de perda ssea alveolar em ratos relativamente simples e precisa e,

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devido sua alta sensibilidade, permite ao investigador reduzir o nmero de animais

necessrios em cada grupo experimental.

Diversos autores (Engelke et al., 1996; Genant et al., 1996; Croucher et al.,

1996; Schneider et al., 2007) acreditam que a anlise morfomtrica ultraestrutural

dos fentipos e o estudo das relaes entre os fentipos de osso em diferentes

nveis de hierarquia abriro novas perspectivas na avaliao da qualidade ssea em

todos os nveis da hierarquia de osso, em particular, h a hiptese de que a previso

da mecnica do osso possa ser melhorada em certas doenas. Comparando os

resultados obtidos pela histomorfometria tradicional e a micro-CT, ao analisar o

enxerto de seio maxilar em humanos, com Biogran e osso autgeno, Trisi e

colaboradores (2006) observaram que os valores da quantidade de osso

mineralizado obtidos por ambas as tcnicas foram similares para todas as amostras,

sem diferen