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Aplicações Clínicas da Citometria de Fluxo
• Diagnóstico baseado nas células
• Prognóstico baseado nas células
• Monitoramento de terapias
• Analise de lesões e morte celular
Imunologia
Hematologia
Anatomia patológica
Biologia celular
Oncologia
Avaliação de populações celulares: normais/
reativas/ em regeneração/ malignas.
Classificar as neoplasias hematopoiéticas
Monitorar a eficácia do tratamento: Estudo da
doença residual mínima
Imunofenotipagem (IMF) - Etapas
Indicação clínica e Avaliação dos dados clínicos
Marcação das amostras: Seleção e combinação de
AcMo, Morfologia
Análise e interpretação de dados:
› Caracterização fenotípica das populações celulares:
normais e alteradas
› Identificação da população neoplásica
Laudo : diagnóstico ou descritivo
Conhecimento da diferenciação imunofenotipica
das células hematopoiéticas em medula óssea
normal, timo e outros tecidos, e sua freqüência:
› Permite a seleção adequada de painéis (AcMo)
› Reconhecimento de padrões anormais de diferenciação,
de proliferações, de células em regeneração, de padrões
reativos
“software”de analises para CF : melhora a
capacidade, eficiência e velocidade de analise
dos dados pois informam simultaneamente uma
serie de parâmetros numa única células.
Selecionar o painel adequado dos marcadores antigênicos
Definir as populações a analisadas em % e qualitativamente:
› Blastos
› maturação de neutrófilos, monócitos e com menor
freqüência: eritroblastos e megacariocitos
Definir as alterações fenotípicas a serem consideradas:
› alterações numéricas , aberrações fenotípicas nos blastos.
› intensidade de fluorescência
› expressão assíncrona de marcadores associados à
maturação
Loken et al, Leuk Res, 2007
› Descrever em % as populações celulares da amostra:
normais ou alteradas.
› Nas neoplasias hematopoiéticas correlacionar com a
classificação da OMS
› Comentar as limitações de interpretação
› Emitir o laudo.
Interpretação de dados
Tipo de amostra Indicação e historia clinica Dados morfológicos Combinações dos diferentes tubos de AcMo
baseada na expressão antigênica das células durante a hematopoiese em MO.
Objetivo: detectar e diferenciar as linhagens de células hematopoiéticas e seus estádios maturativos
Linfócitos B
Linfócitos T/NK
CD79a citoplasma, CD10, CD19, CD20, CD45,
Kappa, Lambda.
CD2, CD3citoplasma ou membrana, CD4,
CD5, CD7,CD8,CD56
CélulasMielomonocíticas
MPO,CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33,
CD117, CD34, CD7, CD56
CD19, CD38, CD56, CD117Células
Plasmáticas
Wood B., Cytometry, Part B. 2007
Combinação mínima de AcMo com sensibilidade para
demonstrar a presença ou ausência de neoplasia
hematopoiética.
Linfócitos B
Linfócitos T/NK
CD9, CD11c, CD15, CD22, cCD22, CD23, CD25, CD13, CD33,
CD34, CD38, CD43, CD58, CD79b, CD103, FMC7, Bcl-2,
cKappa, cLambda, TdT, Zap-70, cIgM/membrana
CD1a, cCD3, CD10, CD16, CD25, CD26, CD30,
CD34, CD45RA, CD45RO, CD57, ab-TCR, gd-TCR,
cTIA-1, TdT
CélulasMielomonocíticas
CD10, CD138, CD56, CD117, CélulasPlasmáticas
CD2, CD4, CD25, CD36, CD38, CD41, CD61, CD61c,
CD64, CD71, CD123, CD163, CD235a, CD105.
Combinação de AcMo que permita realizar o diagnóstico,
classificação e auxilie no prognóstico
Wood B., Cytometry, Part B. 2007
serie de etapas com múltiplas mudanças e variações na
intensidade de expressão de produtos gênicos nas células
hematopoiéticas.
Cel.Tronco
Precursor Linfoide
Precursor Mielóide
Linfócitos-TLinfócitos-BCélulas-NKCD Plasmocitoides
Células EritróidesCélulas MegacariocíticasNeutrófilosMonócitosCD MonocíticasEosinófilosBasófilosMastócitos
Celulas % ± % dp Intervalo 2dp
CD34+(CPH) 1,1 ± 0,6 0,3 – 2,6
CD34+ ou CD117+ 2,2 ± 1,4 0,6 – 6.0
Eritroides 4,7 ± 2,1 2.0 – 9.0
Neutrófilos 67 ± 6,1 57 – 80
Células monocitárias 4,3 ± 1,4 2.0 – 6.0
Eosinofilos 2,5 ± 1.3 0,8 – 5.0
Basófilos 0,4 ± 0.4 <0.1 – 2.4
Mastocitos 0,02 ± 0.02 <0.03
Plasmocitos 0,2 ± 0.2 0.01 –0.5
Linfócitos B maturos 2,9 ± 1.5 1.6 – 6.3
Linfócitos B precursores 0,9 ± 0.8 0.1 – 3.9
Linfócitos T 9,2 ± 4.5 2.6 - 18.0
Células Natural Killer 2,8 ± 1.4 0.7 – 5.0
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Linhagem % Freqüência
Eritroide 15 5 -35
Megacariocitica <1
Neutrofilica 31 12 - 39
Eosinofilica <1
Basofilica <1 <1 - 3
Monocitica 5 3 -15
Mastocitica <1
Dendritica Pl 6 1 -15
Linfoide B 23 <1 - 45
Total 81
CD34+
HPC
B
SSC
CD34-APC
% CD34+ HPC: 1.1 + 0.6 (0.3-2.6)
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Informação Fenotípica
Identificação e enumeração das CP CD34+ da MO e seu
comprometimento às diferentes linhagens :
› Imaturas e comprometidas a linhagem neutrofilica e
linfoides B
› Outras CP: monociticas, basofilicas, dendriticas (pDC),
mastocíticas e eritróides.
Caracterização fenotípica dos diferentes compartimentos das
CP CD34+ ( MO normal x MO SMD) :
› Detecção de bloqueios maturativos em MO displásica
› Investigação de padrões alterados na expressão de
antígenos individuais.
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Monócitos
CP CD34+
Granulócitos
S.Eritróide
MO Normal
MO SMD: Fenótipos Alterados
CD45
CD45 CD45CD45
SSC
SSC
SSC
SSC
• CPH CD34+ Linfóide origina:
linfócitos T e B
• Maturação T- timo
• Maturação B - MO
• Células Plasma ticas - presentes
na MO,tecido linfático e
tecido conectivo
CPH Pluripotente
Ross 5th Ed Table 10.4
CPHLinfoide
Progenitor Linfoide T
Progenitor
Linfoide B
Celulas T
Celulas B
Celulas
Plasmaticas
Timo Medula Ossea
Progenitor
Linfoide B
Perez M., Cytometry, Part B. 2010
Maturação de Linfócitos B
MO
TecidosLinfoides
MO
Mucosa
Baco
SPSP
Maturação de linfócitos T
Linfócitos T Periféricos
CD34,HLA-DR
TdT
CD2 CD7
CD3c
TdT
CD2 CD7 CD5
CD3c
(CD10) TdT
CD3c (TCR-CD3)
CD1aCD2,CD7
CD5
CD4 CD8
(TdT)
(CD3c) TCR-CD3
CD2 CD7 CD5
CD4 ou
CD8
Pró-timócito
TimócitoPrecoce
TimócitoComum
TimócitoMaduro
CD4 TCR-CD3
CD2 CD7 CD5
CD8 TCR-CD3
CD2 CD7 CD5
Linfócitos T - Timo
Linfócitos B
Sangue periférico Normal
Piatosa B., Cytometry, Part B. 2010
Células B circulantes :
› Os diferentes fenótipos estão relacionados ao processo maturacional
› Correlação com o estado imune : alterações no desenvolvimento de
células B, auto-imunidades, e linfoproliferação, tais como a linfocitose B
monoclonal
Perez M., Cytometry, Part B. 2010
WHO, 4th Ed., Fig 8.02, 2008
CD38
CD34
CD38
CD34
CD34
CD34CD45
CD45
MO normal
Blastos na LLA-B
Fenotipos B – Normal x neoplásico
WHO, 4th Ed., Fig. 8.04, 2008
Blastos de LLA-T
Origem das células Linfocito B Linfocito T Relacao
Pele < 1 > 95 95
Timo < 1 > 95 95
Linfonodo 20 70 3.5
Baco 50 40 0.8
Tonsilas 50 40 0.8
Int Delgado
Lamina P. 30 70 2.3
Placas de Peyer 40 45 1.1
Westermann J.; J of Mol. Med., 1992
Cuidado! A freqüência dos linfócitos e influenciada por muitas
variáveis: Idade, sexo, stress, Infecções ...
Distribuição da população celular (n=15), analisada por
CF . Volume LCR: 1.3 ± 0.6 mL ( 0.3 – 2.4 mL)
Quijano S. et al., JCO 2009
Diferenciação Granulocítica – MO normal
Mieloblasto MielocitoPromielocito Meta-mielocitoBastao
Neutrofilo
CD34+CD117+HLA-DR+CD13+forteCD33+forte
HLA-DR-/+CD13+CD33+forteCD15+ CD11b-/+
CD13+ fracoCD33+CD15 +CD11b+
CD13+CD33+fCD15 +CD11b+ CD16-/+
CD13+forteCD33+fracoCD15CD11b+fo CD16+fo
De
nsi
da
de
an
tig
ên
ica
Maturação Neutrofílica
Maturação neutrófilos
Analise da expressão de CD13, CD11b, CD15, MPO
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Diferenciação Granulocítica – MO normalD
en
sid
ad
e a
ntig
ên
ica
Monoblasto Promonócito Monócito
CÉLULAS MONOCÍTICAS
MO NORMAL MO SMD: Fenótipos Alterados
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Irem-2 Irem-2
De
nsi
da
de
an
tig
ên
ica
Estágio I Estágio II Estágio III Estágio IV
Eritrócitos
CD45
CD45
SSC
SSC
CD
64
CD
64
CD36
CD36
MO Normal
MO SMD: Fenótipos Alterados
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
A IMF por CF :
› Método ágil e preciso.
Uma boa análise e interpretação exigem:
› Um conhecimento sólido da técnica e dos padrões
normais da expressão antigênica nas diferentes
populações.
É necessário a padronização e validação da técnica
para obter informações precisas.
Novos programas de análise, novos fluorocromos e
anticorpos monoclonais, abrem novas perspectivas
para esta tecnologia.
Obrigada!
Chng W. et al, Clin and Diag Lab Imm., 2004
