Lima, LM©

Lima, LM©

Lima, LM©

Figura 1. Principais causas de insucesso durante as etapas de

desenvolvimento de um fármaco.

O metabolismo influencia a natureza, a

intensidade e a duração dos efeitos

terapêuticos e/ou tóxicos dos fármacos e

seus eventuais metabólitos bioativos

Metabolismo de Fármacos: Conjunto de transformações química, catalisadas por enzimas, introduzidas na estrutura de xenobióticos (e.g. fámacos) visando favorecer sua desativação e depuração renal.

O papel fisiológico do metabolismo de fármacos pode ser medido através dos parâmetros farmacocinéticos de biodisponibilidade (F) e clearance (Cl);

Cominados a F e Cl afetam a quantidade total de fármaco no sangue (AUC) x tempo.

A estabilidade metabólica de um determinado composto (e.g. fármacos) é inversamente proporcional a sua clearance.

metabolismo pré-sistêmico metabolismo

pós-sistêmico

Bugrim, A., Nikolskaya, T. & Nikolsky, Y. (2004) Drug Discovery Today 9, 127-35.

Lima, LM©

Fármacos lipofílicos são reabsorvidos após filtração glomerular, retornando a

circulação sistêmica.

Metabolismo de Fármacos: fase 1 & fase 2

As reações metabólicas de fase 1 e fase 2 tem como principal objetivo transformar fármacos lipofílicos (↑ LogP; LogD7,4 > 0;

↓PSA) em metabólitos hidrofílicos (↓LogP; LogD7,4 < 0; ↑PSA), favorecendo a eliminação por via renal.

CONSEQUÊNCIAS DO METABOLISMO DE FÁRMACOS

Fármaco ativo Metabólito inativo (Bioinativação)

Fármaco ativo Metabólito ativo (Bioativação ouToxificação)

Fármaco inativo (pró-fármaco)

Metabólito ativo (Bioativação)

Lima, LM©

Metabolismo de Fase 1

Complexo Enzimático Localização subcelular principal

Citocromo P450 monooxigenases Microssoma e mitocôndria

Flavina monoamina oxidase Microssoma

Aldeído desidrogenase Citosol, microssomal e mitocôndria

Álcool desidrogenase Citosol

Monoamina oxidase Mitocôndria

Xantina oxidase Citosol

Azo ou nitro-redutases Citosol

Aldo/ceto-redutases Citosol

Óxido-redutases Citosol

Epóxido hidrolase Microssoma e citosol

Hidrolases (esterases, amidases, lipases) Citosol e microssoma

Metabolismo de Fase 2

Complexo Enzimático Localização subcelular principal

Glicuroniltransferase Microssoma

Glutationatransferase Citosol

Sulfotransferase Citosol

Metiltransferases não específicas Citosol

Catecol o-metil transferase Citosol

Acetiltransferase Citosol

Barreiro, E.J. & Fraga, C.A.M., Química Medicinal: As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos, ArtMed Editora Ltda, Porto Alegre, RS, 3ª Edição, 2014 ;

Reações metabólicas de Fase 1: Oxidação, Redução

e Hidrólise

Reações metabólicas de Fase 2: Conjugação

Lima, LM©

Metabólitos estáveis /

frequentemente inativos Xenobióticos (eg. Fármacos)

Excretados

Fase II

Glicuronidação

Sulfatação

Conjugãção com Gly, Glu

Conjugação com Glutationa

Acetilação

Metilação

Metabólitos Fase I Fase II

Metabólitos

Reativos

Estresse oxidativo

Aduto fármaco-proteína

Danos ao DNA

Apoptose Injúria-imune ou imunotoxicidade Malignidades

Detoxificação Fase II ou III

Glutationa (GSH)

Proteínas transportadoras

de efluxo

Oxidações

Reduções

Hidrólises

O-desalquilação

N-desalquilação

S-desalquilação

Mutações

Peroxidação lipídica

Interação

c/ oxigênio

(ERO)

ROH, RSH, RNH2

Fase I ou Fase II

neo-antígenos/haptenos

citotoxicidade

Necrose/apoptose

ligações

covalentes ligações

covalentes

ligações

covalentes

Lima, LM©

Number of human CYP450 estimated at 57 genes:

divided in 18 families e 44 subfamilies

1- They are all monooxygenases

2- So that all Cytochrome P450’s are heme proteins (can also be called mixed function oxidases)

3-They all catalyze a reaction: NAD(P)H(electron donor)* + O2 RH + H+ → NAD(P)+ + ROH + H2O

4- The O2 is split, so one molecule of the oxygen goes into the substrate, and the other is

reduced to H2O

5- the oxygen is carried on a Heme (Heme is the prosthetic group of the enzyme)

6- This is the same type of heme as in hemoglobin and myoglobin

7- The heme in the reaction cycles between Fe+3 to Fe+2 back to Fe+3, whereas in hemoglobin or

myoglobin, you want the heme to be Fe+2

8- require a Cytochrome P450 Reductase to transfer electrons from NADPH to their substrate

*NADH is the reducing cofactor in bacterial and NADPH is the reducing cofactor in all mammalian

Lima, LM©

Famílias de

CYP450 humana

Membros funcionais Principais funções

CYP1 1A1, 1A2, 1B1 Metabolismo de xenobióticos

CYP2 2A6, 2A7, 2A13, 2B6, 2C8, 2C9,

2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 2F1, 2J2,

2R1, 2S1, 2U1, 2W1

Metabolismo de xenobióticos & Metabolismo de esteróides

CYP3 3A4, 3A5, 3A7, 3A43 Metabolismo de xenobióticos

CYP4 4A11, 4A22, 4B1, 4F2, 4F3, 4F8,

4F11, 4F12, 4F22, 4V2, 4X1, 4Z1

Metabolismo de ácidos graxos e ácido araquidônico

CYP5 5A1 Síntese de tromboxana A2

(tromboxana sintase)

CYP7 7A1, 7B1 Esteróide 7a-hidroxilase

CYP8 8A1, 8B1 Síntese de prostaciclina (prostaglandina sintase) e biossíntese

de ácidos biliares

CYP11 11A1, 11B1, 11B2 Biossíntese de esteróides

CYP17 17A1 Biossíntese de testosterona e estrogênio (esteróide 17a-

hidroxilase

CYP19 19A1 Biossíntese de estrogênio (aromatase)

CYP20 20A1 Desconhecidas

CYP21 21A2 Biossíntese de esteróides

CYP24 24A1 Metabolismo da vitamina D

CYP26 26A1, 26B1, 26C1 Metabolismo do ácido retinóico

(hidroxilase da ácido retinóico)

CYP27 27A1, 27B1, 27C1 Biossíntese de ácidos biliares e ativação da vitamina D3

CYP39 39A1 Metabolismo do colesterol

CYP46 46A1 Metabolismo do colesterol

(colesterol 24-hidroxilase)

CYP51 51A1 Metabolismo do colesterol

(lanosterol 14a-demetilase)

Lima, LM©

Estrutura cristalográfica do CYP3A4 (PDB 4K9W)

N

H2C

H3C

N

CH3

CH2

N

CH3

O OH

N

H3C

O OH

Fe+3

S

Cys

Lima, LM©

CYP

CYP 1 CYP 2 CYP 3

CYP 1A CYP 2C CYP 2D CYP 2E CYP 3A

CYP 1A2 CYP 2C9

CYP 2C19

CYP 2D6 CYP 2E1 CYP 3A4

Superfamília

Família

Subfamília

Isoenzimas

•57 genes de CYP450 humano → 8 isoenzimas são responsáveis por >90% do

metabolismo de todos os fármacos [CYP1A2, 2A6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4.

Clarke,SE; Jones, BC. Human cytochromes P450 and their role in metabolism-based drug-drug interactions. In Drug-Drug

Interactions, Rodrigues, AD, Ed Marcel Dekker, NY, 2002.

Lima, LM©

Lima, LM©

•São proteínas ligadas a membrana; •Presentes em alta concentração no retículo endoplasmático de órgãos como: fígado, rins, vias nasais, cerébro, pele e intestino

Substratos de baixo a

elevado PM

[eg. MeOH (PM = 42

g/mol) e Ciclosporina

(PM = 1203 g/mol)]

Substratos de elevada

diversidade química

Hidrofóbicos

Lima, LM©

O

Fe+3

N N

S

NN

Cys

Fe+3 hexacoordenado Fe+3 pentacoordenado

Fe+3

N N

S

NN

Cys

R-H

R= substrato (e.g. fármaco)

R-H

1 e-

NADPH-P450 redutase

Fe+2

N N

S

NN

Cys

R-H

O2

Fe+3

N N

S

NN

Cys

R-H

O

O

NADPH

NAD(P)+

NADPHNAD(P)+

1 e-

Fe+3

N N

S

NN

Cys

R-H

O

O

Fe+3

N N

S

NN

Cys

R-H

O

OH

NADPH-P450 redutase

H+

H2O

Fe+4

N N

S

NN

Cys

R-H

O

R-OH

AB

C

DEF

G

H+

N

H2C

H3C

N

CH3

CH2

N

CH3

O OH

N

H3C

O OH

Fe+3

S

Cys

CYP450

baixo spin (S =1/2)

=

alto spin (S =5/2)

=

R

H H

Lima, LM©

Ligação C-H Tipo de Ligação Energia de dissociação

em KJ/mol

H-C6H5 fenila 464

H-CH3 metano 438

H-CH2CH3 alquila primário 420

H-CH2CH2CH3 alquila primário 417

H-CH2C(CH3)3 alquila primário 418

H-CH(CH3)2 alquila secundário 401

H-C(CH3)3 alquila terciário 390

H-CH2Ph benzílica primária 368

H-CH(CH3)Ph benzílica secundário 357

H-CH(CH3)2Ph benzílica terciário 353

H-CH2CH=CH2 alílica primária 361

H-CH(CH3)CH=CH2 alílica secundária 345 PONDERAÇÕES: FORÇA DA LIGAÇÃO C-H x ESTABILIDADE do RADICAL x

EFEITO ESTÉRICO

Lima, LM©

HIDROXILAÇÕES (Aromática; Benzílica, Alílica, -Hetroátomo; Alifática) DESALQUILAÇÕES (N, O, S) EPOXIDAÇÕES OXIDAÇÕES DE HETEROÁTOMOS (N, S, P)

1. Oxidação Aromática = Hidroxilação Aromática

Pró-quiral

pro-S

pro-S

pro-R

“balanço entre efeito eletrônico & estérico”

Lima, LM©

1. Oxidação Aromática = Hidroxilação Aromática

Fe+4

N N

S

NN

Cys

O

Fe+3

N N

S

NN

Cys

O H

H

complexo- complexo-radicalar

CYP450(Fe+3)

O

óxido de areno

Fe+3

N N

S

NN

Cys

O H

H

complexo-

NIH shift

CYP450(Fe+3)

O

HH

HO

A

A' C

C'

D

E

An NIH shift is a chemical rearrangement where a hydrogen atom on an aromatic ring undergoes an intramolecular migration primarily during a hydroxylation reaction. This process is also known as a 1,2-hydride shift.

Guroff, G.; Daly, J.W.; Jerina, D.M.; Renson, J.; Witkop, B.; Udenfriend, S. (1967). "Hydroxylation-induced migration: the NIH shift. Recent experiments reveal an unexpected and general result of enzymatic hydroxylation of aromatic compounds.". Science 157 (3796): 1524–1530

Lima, LM©

NOO

NOO

NOO

NOO

NOO

Fe+4

OCYP450 CYP450 OFe+4

espécies deficientes

em elétronsPapel dos Substituintes no Anel Aromático???

OH OH OH OH OHGrupo

elétron doador

Grupo

elétron retirador

orto orto

para

meta meta

meta meta

para

orto orto

-0,068

-0,157

-0,140 -0,140

-0,088

-0,213

-0,092

-0,166

-0,092

-0,068

1. Oxidação Aromática = Hidroxilação Aromática

Lima, LM©

HIDROXILAÇÕES (Aromática; Benzílica, Alílica, Alifática, -Hetroátomo) DESALQUILAÇÕES (N, O, S) EPOXIDAÇÕES OXIDAÇÕES DE HETEROÁTOMOS (N, S, P)

1. Oxidação Aromática = Hidroxilação Aromática

Pró-quiral

pro-S

pro-S

pro-R

“balanço entre efeito eletrônico & estérico”

N

O

CH3

H

acetanilida

CYP450

N

O

CH3

H

OH

paracetamol

Fig. 1: The binding site of S-warfarin within the active site of

CYP2C9 leaves the haem, shown edge on in the figure, accessible

to other compounds [www.esrf.fr/.../Highlights/2003/MX/MX06 ].

O O

OH

Ph

O

CH3

HO

varfarina

O O

OH

Ph

O

CH3

CYP2C9

traços o e m-OH

NN

CH3

N

H

N

O

HO

CYP450N

N

CH3

N

H

N

O

minaprina

1. Oxidação Aromática = Hidroxilação Aromática

Lima, LM©

O O

OH

Ph

O

CH3

HO

varfarina

O O

OH

Ph

O

CH3

CYP2C9-0,206

0,003

-0,258

CARGA ELETROSTÁTICA

0,012

E = -163,35 kJ/mol E = -162,56 kJ/mol

E = -148,68 kJ/mol

1. Hidroxilação Aromática

Lima, LM©

traços o e m-OH

NN

CH3

N

H

N

O

HO

CYP450N

N

CH3

N

H

N

O

minaprina

1. Oxidação Aromática = Hidroxilação Aromática

atorvastatina

Lima, LM© Mancy, A. et al., Biochemistry (1999) 38: 14264

N

H

Cl

Cl

O

OH

121'

3'

4'

4'

3'

1' 2 1N

H

Cl

Cl

O

OH

HO

N

H

Cl

Cl

O

OH

OH

121'

3'

4'

CYP2C9

CYP3A4

diclofenaco

>>>

<<<

Pq

N

H

Cl

Cl

OH

CYP2C9N

H

Cl

Cl

OH

OH

>>>

5

4

3 5

4

3

6

6

Bort, R. et al., Biochem. Pharmacol. (1999) 58: 787

-0,173

-0,218

0,147 (MO)

0,094 (MO)

1. Hidroxilação Aromática

A previsão da regiosseletividade do processo de hidroxilação aromática deve considerar fatores eletrônicos (SOM), e fatores estéricos – provenientes da interação enzima-substrato

Lima, LM©

2. Hidroxilação Benzílica

CYP450

NH

O

OH

ClCl

CH3

ácido meclofenâmico

NH

O

OH

ClCl

OH

CYP450

NH

O

OH

ClCl

O

OH

alprazolam

Xanax®

N

NCl

N

NH3C

t1/2= 12h

CYP3A4 N

N

Cl

N

N

OH

Lima, LM©

naloxona(2.48)

N

OH3C

HON

CH2

CYP3A4

N

OH3C

HON

CH2HO

(2.49)

HO

O

O

OH

N

CH2

quinina(2.46)

CYP2D6

HO

O

O

OH

N

CH2

OH

(2.47)

3. Hidroxilação Alílica

Lima, LM©

3. Hidroxilação Alílica

O

OH

CH3

H3C

H3C

OH

O

OH

CH3

H3C

H3C

CH3 A A’

hidroxi-THC Δ9-tetraidrocanabinol (THC)

CYP450

CYP450

O

OH

CH3

H3C

H3C

CH3

HO

B’

B

hidroxi-THC

Lima, LM©

4. Hidroxilação Alifática

OHN

OH

CH3

CH3

CH3

CYP3A4

terfenadina

OHN

OH

CH3

CH3

OHCYP3A4

OHN

OH

CH3

CH3

OH

O

fexofenadina

ibuprofeno

CH3

O

HOCH3

CH3

CYP2C9

CH3

O

HOCH3

CH3

CH3

O

HO

CH3

OH

OH

Lima, LM©

5. Hidroxilação α-Heteroátomo

HN NH

O O

CH3

primidona

HN NH

O O

CH3

OH

HN NH

O O

CH3

O

CYP2C9CYP2C19

ADH

N

N

H3CO

Cl N

N

H3CO

Cl

OH

diazepam temazepam

CYP3A4

fenobarbital

Lima, LM©

X-DESALQUILAÇÃO (X = O, S, N)

O

NCH3

H

HO

HO

O

NCH3

H

H3CO

HO

CYP450

CODEÍNA MORFINA

O-dealquilação

O-demetilação

S

N

N

SCH3

CH3

tioridazina (antipsicótico)

CYP 450

S-dealquilação

S

N

N

SH

CH3

Lima, LM©

X-DESALQUILAÇÃO (X = O, S, N)

i-MAO antidepressivos

tricíclicos

metabólitos ativos

SSRIAntidepresivo

t1/2= 60-100 h

Inibidor Enzimático da CYP 2D6

Metabólito ativo

Zoloft®, Pfizer

(S)

demetilsertraline

(S)Cl

Cl

N

H

H

N-demetilação

CYP 3A4

sertraline

(S)

(S)Cl

Cl

N

CH3

H

N

N

CH3

CH3

imipramina

CYP450

N-demetilação N

N

H

CH3

CYP450

N-demetilação N

N

H

H

Lima, LM©

EPOXIDAÇÕES

OH

O

NH2

*

vigabatrin

(S)-eutômero

OH

O

NH2

O

*

vigabatrin

(S)-eutômero

CYP 450

OH

HO

dietilestilbestrol

CYP450

HO

OH

O

(DES, FDA 1941) Estrogênio não-esteroide sintético, prescrito para tratamento de sintomas da menopausa, vaginites (atrófica e gonorreica), cancêr de mama e próstata, etc

Proscrito em 1975: vaginal clear cell adenocarcinoma in girls and young women who had been exposed to this drug in utero

carbamazepina

CYP2C9N

O

NH2

N

O

NH2

O

Lima, LM©

EPOXIDAÇÕES

micotoxina encontrada

em alimentos (e.g.

amendoim, milho).

Produzida por fungos

Aspergillus

http://www.cib.org.br/pdf/biotech09.pdf

O

O

O

OO

OCH3

CYP3A4/2A6

H

H

O

O

O

OO

OCH3

H

H

O

Aflatoxina B1

Hepatocarcinógeno

(câncer de fígado: China & África)

CYP1A2

O

O

H

O

não-genotóxico

Lima, LM©

OXIDAÇÃO DE HETEROÁTOMOS (S, N)

CYP450

F

S

CH3

CO2H

H3C

rápida

F

S

CH3

CO2H

H3C

O

sulindaco

CYP450

lenta

F

S

CH3

CO2H

H3C

O O

FMO

(rápida)

N

CH3

H

amina 2ª

CYP N

CH3

OH

hidroxilamina

CYP

N

CH3

HO

N-óxido

voriconazol

CH3

HO

N

N

N

NN

FFF

CYP3A4

CYP2C19FMO CH3

HO

N

N

N

NN

FFF

O

N

CH3

CH3

amina 3ª

CYP N

CH3

CH3O

N-óxido

N

H

H

amina 1ª

CYPN

H

OH

>>hidroxilamina

N

H

O

<<<nitroso

+

N

O

O0% nitro

Lima, LM©

OXIDAÇÃO DE HETROÁTOMOS (S, N)

H2N

SNH

O OON

CH3

sulfametoxazol

CYP3A4

CYP1A2

NH

SNH

O OON

CH3

HO

N

SNH

O OON

CH3

O

>>

<<

N

H

O

CH3

CYP450N

OH

O

CH3

N-acetilaminofluorenoN-hidroxiacetilaminofluoreno

(Pró-carcinogênico)amida 2ª ou 1ª

FMO

Lima, LM©

Evans, W. E. & McLeod, H. L. Pharmacogenomics—drug disposition, drug targets, and side effects. N. Engl. J. Med.

348, 538–549 (2003).

Estudo do genoma humano com o objetivo de identificar genes individuais relevantes na susceptibilidade a doenças e a atuação dos fármacos, assim como a descoberta de novos alvos terapêuticos.

Variações nas sequências de nucleotídeos do DNA, que ocorrem na população geral de forma estável, sendo encontradas com freqüência de 1% ou superior, são denominadas polimorfismos genéticos

Farmacogenômica = farmacogenética + genômica + biotecnologia.

Lima, LM©

Área da farmacologia clínica que estuda as bases

genéticas das variações individuais nas respostas a

tratamentos farmacológicos.

Evans, W. E. & McLeod, H. L. Pharmacogenomics—drug disposition, drug targets, and side effects. N. Engl. J. Med.

348, 538–549 (2003).

FARMACOGENÉTICA

O perfil metabólico de cada indivíduo pode ser alterado por polimorfismos genético, caracterizando os seguintes fenótipos:

metabolizadores lentos, intermediários e rápidos

Lima, LM©

Lima, LM©

Wu, X. et al. The tamoxifen metabolite, endoxifen, is a potent antiestrogen that targets estrogen receptor α for degradation in breast

cancer cells. Cancer Res. 69, 1722–1727 (2009).

CH3

O N

CH3

CH3

tamoxifeno

CYP2D6(2B6; 2C9; 2C19; 3A4) CH3

O N

CH3

CH3

OH4-OH-tamoxifeno

CYP3A4(2C9, etc)

CH3

O N

H

CH3

OHendoxifeno

CYP3A4(2C9, etc)

CH3

O N

CH3

H

CYP2D6(2B6; 2C9; 2C19; 3A4)

N-demetil-tamoxifenometabólito ativo

metabólito ativo

Polimorfismo Genético CYP2D6

Metabolizador lento

Metabolizador intermediário

Metabolizador rápido

Perda da eficácia (↓efeito antitumoral)

Aumento da eficácia (↑efeito antitumoral)

http://jinapharma.com/?page_id=184

Lima, LM©

Monçores et al. Rev SOCERJ. 2008;21(3):184-193

Farmacogenômica Medicina

Personalizada

1/3 obtém benefício

terapêuticos Efeitos adversos

7% das hospitalizações (EUA)

CYP2C9*2 ou CYP2C9*3 têm maior

susceptibilidade

a complicações hemorrágicas com o

tratamento com warfarina

Genotipagem

& Fenotipagem

comorbidades, diferenças

na farmacocinética e

farmacodinâmica dos

medicamentos, fatores

ambientais e genéticos