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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
NOELLY BASTOS CAVALCANTE
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA DE
NANOPARTÍCULAS DE PRATA PRODUZIDAS POR
Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn
PETROLINA
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
NOELLY BASTOS CAVALCANTE
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA DE
NANOPARTÍCULAS DE PRATA PRODUZIDAS POR
Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus
Petrolina - Centro, como requisito para obtenção do título
de mestre em Recursos Naturais.
Orientador: Prof. Dr. Leonardo Sousa Cavalcanti
Linha de pesquisa: Química e Atividade Biológica
PETROLINA
2014
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca: SIBI/UNIVASF Bibliotecário (a): Maria Betânia de Santana da Silva CRB4-1747.
Cavalcante, Noelly B.
C376a
Atividade antibacteriana e antifúngica de nanopartículas de prata
produzidas por Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn / Noelly Bastos
Cavalcante. -- Petrolina, 2014.
79 f.: il. ; 29cm.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) -
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Centro, Petrolina
- PE, 2014.
Orientador: Prof. Dr. Leonardo Sousa Cavalcanti.
Referências
1. Atividade antibacteriana e antifúngica. 2. Nanopartículas de prata.
3. Nanotecnologia 4. Curvularia inaequalis. 5. Fungos na agricultura –
controle. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 620.5
Nos momentos de dificuldade, de cansaço e de ausência,
a imagem, o sorriso, a compreensão e o amor de vocês
me fizeram continuar. Aos meus pais, Davina e
Umberto e à minha irmã, Marielly, por fazerem parte
de mim, com amor.
Na busca dos saberes, junto a eles é onde mais aprendo.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me amar e por permitir que eu tenha forças para lidar com as
adversidades. Por permitir que eu possa aprender a ser uma pessoa melhor a cada
dia. E, principalmente, por me compreender nas falhas e por me dar sempre a
oportunidade de corrigi-las...
Aos meus pais, Davina e Umberto, pelo amor e apoio incondicional, pelos
exemplos e ensinamentos que me mostraram a importância da honestidade, da
disciplina e da força de vontade.
À minha irmã, Marielly, presente de Deus em minha vida, sempre tão próxima
em todas as minhas aflições e alegrias, sempre tão disposta a me ajudar e a me
levantar sempre que eu necessito.
A todos os meus familiares que, mesmo à distância, me apoiaram e torceram
por mim.
Ao professor Leonardo Sousa Cavalcanti, pela valiosa orientação e pelas
oportunidades proporcionadas durante esses dois anos de trabalho.
Ao professor Mateus Matiuzzi da Costa, por ter me oferecido a primeira
oportunidade de ingressar na pesquisa e por acreditar em minha capacidade.
Agradeço pela confiança, dedicação, paciência, competência e pela paixão
acadêmica que transmitiu ao longo dos nossos anos de convivência.
Ao professor Luís Fernando Gusmão e a todos os integrantes do
Departamento de Ciências Biológicas da UEFS de Feira de Santana-BA, pelo
fornecimento das amostras de Curvularia inaequalis, fundamentais para a realização
deste trabalho.
À professora Vanessa Polon Donzeli, por ter disponibilizado seu laboratório,
suas sugestões, idéias e atenção.
Ao professor Helinando Pequeno de Oliveira, pelo apoio, pelas idéias
inovadoras e por estar sempre disposto a ajudar, com interesse e entusiasmo.
Ao professor Jackson Roberto Guedes, coordenador do Programa de Pós-
graduação em Recursos Naturais do Semiárido, pela competência, disponibilidade e
receptividade presentes em todas as vezes que o procurei.
A todos os professores do mestrado em Recursos Naturais do Semiárido, que
de alguma forma contribuíram para a minha formação.
Aos meus amigos do Laboratório de Química orgânica e Bioquímica vegetal,
Ismara e Ivanildo, por toda a aprendizagem em conjunto, pelas dificuldades que
dividimos e superamos e, principalmente, pela amizade e companheirismo em todas
as horas.
A todos os meus amigos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia
Animal, pela convivência maravilhosa, pela amizade, pelos ensinamentos, pelos
momentos compartilhados de estudos, de dificuldades e de alegrias.
A todos os meus colegas do mestrado, pela ótima convivência, amizade,
experiências compartilhadas e momentos de descontração.
Às instituições de ensino e pesquisa: Universidade Federal do Vale do São
Francisco (UNIVASF), Instituto Federal do Sertão Pernambucano (IF Sertão-PE) e
Universidade do Estado da Bahia (UNEB), pelo incentivo profissional, apoio
financeiro e oportunidade de crescimento pessoal.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa de estudos e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) que, por meio do Projeto SISBIOTAIR, possibilitou o
desenvolvimento deste trabalho.
E, finalmente, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a
realização deste trabalho.
A todos vocês, muito obrigada!
Existe somente uma idade para a gente ser feliz. Uma única época na vida de
cada pessoa em que é possível sonhar e fazer planos, ter energia bastante para
realizá-los mesmo diante de tantas dificuldades e obstáculos. Uma só idade para a
gente se encantar com a vida e viver apaixonadamente, desfrutando tudo com
intensidade, sem medo. Fase dourada em que a gente pode criar e recriar a vida,
vestir-se com todas as cores, experimentar todos os sabores e entregar-se a todos
os amores sem preconceito nem pudor. Tempo de entusiasmo e coragem em que
todo desafio é mais um convite à luta, que a gente enfrenta com toda disposição de
tentar algo NOVO, de NOVO e de NOVO, e quantas vezes for preciso. Essa idade
tão fugaz na vida da gente chama-se PRESENTE e tem a duração do instante que
passa...
"Pedras no caminho? Guardo todas... um dia ainda vou construir um castelo!"
(Fernando Pessoa)
RESUMO
A nanotecnologia é a ciência responsável pelo desenvolvimento de novos materiais com dimensões em escala nanométrica (1-100nm). Devido às suas propriedades únicas, a aplicação de nanopartículas metálicas em diferentes áreas tem se tornado cada vez mais notória. Entre as nanopartículas metálicas, as de prata são as mais amplamente reconhecidas por suas aplicações em áreas como agricultura, medicina, biotecnologia, indústria de alimentos, entre outras. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica de nanopartículas de prata sintetizadas pelo fungo Curvularia inaequalis, para controle in vitro de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e do fungo Alternaria brassicicola, causador da alternariose em couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala). Em um estudo preliminar, foi utilizado um procedimento simples para a biossíntese de nanopartículas de prata, à temperatura ambiente, a partir da ação de C. inaequalis como agente de redução. O grau de agregação e o tamanho das partículas biossintetizadas foram otimizados a partir de um planejamento fatorial envolvendo a combinação de três diferentes parâmetros de preparação, denominados: Parâmetro A (produção de nitrato redutase), parâmetro B (tempo de reação) e parâmetro C (concentração de nitrato de prata). A caracterização das nanopartículas de prata foi realizada por espectroscopia de UV-Vis e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Utilizando as técnicas de concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bactericida mínima (CBM) observou-se que as nanopartículas de prata sintetizadas por C. inaequalis apresentaram forte atividade antimicrobiana principalmente contra Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, demonstrando assim que este fungo representa um potencial novo candidato à alternativa de biossíntese de nanopartículas de prata com atividade antimicrobiana. Na segunda etapa do estudo, as nanopartículas de prata sintetizadas pelo fungo C. inaequalis, já com comprovada eficiência, foram utilizadas para controle in vitro do fungo Alternaria brassicicola. Através da avaliação do crescimento micelial e teste de ação direta, observou-se que as nanopartículas de prata foram eficientes até a concentração 1/64, inibindo consideravelmente o crescimento do fungo em ambos os testes.
Palavras-chave: Nanotecnologia, biossíntese, bactérias Gram (+) e Gram (-),
Alternaria brassicicola.
ABSTRACT
Nanotechnology is the science responsible for developing new materials with dimensions on the nanometer scale (1-100nm). Due to its unique properties, the use of metal nanoparticles in various fields have become increasingly apparent. Between metal nanoparticles, silver is the most widely recognized for their applications in areas such as agriculture, medicine, biotechnology, food industry, among others. In this study, we aimed to evaluate the antibacterial and antifungal activity of silver nanoparticles synthesized by the fungus Curvularia inaequalis, for in vitro control of Gram-positive and Gram-negative and the fungus Alternaria brassicicola, which causes alternaria in kale (Brassica oleracea L. var. acephala). In a preliminary study, a single procedure for the biosynthesis of silver nanoparticles at room temperature was used, from the action C. inaequalis as a reducing agent. The degree of aggregation and size of particles are optimized biosynthesized from a factorial design involving the combination of three different preparation parameters, called: Parameter A (production of nitrate reductase), parameter B (reaction time) and parameter C (concentration silver nitrate). The characterization of silver nanoparticles was performed by UV -Vis spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM ). Using the techniques of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) has been observed that silver nanoparticles synthesized by C. inaequalis showed strong antimicrobial activity especially against Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, demonstrating that this fungus represents a new potential candidate for alternative biosynthesis of silver nanoparticles with antimicrobial activity. In the second stage of the study, the silver nanoparticles synthesized by the fungus C. inaequalis , already proven efficiency, were used for in vitro control of the fungus Alternaria brassicicola. By assessing mycelial growth and direct action test, it was observed that silver nanoparticles were effective concentration to 1/64, greatly inhibiting the growth of the fungus in both tests. Key words: Nanotechnology, biosynthesis, Gram-positive e Gram-negative bacteria,
Alternaria brassicicola.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema da interação de uma nanoesfera metálica com a luz. O campo
eletromagnético da luz induz uma oscilação dipolar da condução eletrônica através
da partícula ................................................................................................................25
Figura 2 - Curvularia inaequalis com seus conídios septados alojados em um
conidióforo .................................................................................................................35
Figura 3 - Curvularia inaequalis com seus conidióforos curvados e seus conídios
septados ....................................................................................................................36
Figura 4 - Cultura de Curvularia inaequalis com 3 dias ............................................37
Figura 5 - Cultura de Curvularia inaequalis com 7 dias ............................................37
Figura 6 - Estrutura química das Pirenocinas A e B produzidas por Curvularia
inaequalis ..................................................................................................................39
Figura 7 - Brassica oleracea L. var. acephala ..........................................................40
Figura 8 - Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire .............................................44
Figura 9 - Folha de couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala) com lesões
típicas de alternariose ...............................................................................................45
Figura 10 - Folha de couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala) com
lesões típicas de alternariose ....................................................................................45
Figura 11 - Esquema do teste de ação direta utilizando placa de microcultivo. As
colunas da placa (em azul) representam os tratamentos utilizados e as linhas
representam as repetições ........................................................................................54
Figura 12 - Ilustração de todos os campos (A, B e C) da câmara de Neubauer
....................................................................................................................................55
Figura 13 - Espectro de UV-vis da dispersão coloidal de nanopartículas de prata em
solução aquosa .........................................................................................................56
Figura 14 - Produção de nitrato redutase antes (esquerda) e depois (direita) da
reação completa com nitrato de prata .......................................................................57
Figura 15 - Importância relativa dos parâmetros de preparação no pico de absorção
SPR ...........................................................................................................................58
Figura 16 - Importância relativa dos parâmetros de preparação sobre o potencial
zeta das partículas ....................................................................................................59
Figura 17 - Cinética de crescimento das partículas em função da concentração de
nitrato redutase .........................................................................................................60
Figura 18 - Partículas de prata após 100 h de síntese (elevada concentração de
nitrato redutase - lado esquerdo e baixa concentração de redutase - lado direito)
....................................................................................................................................61
Figura 19: Crescimento micelial de Alternaria brassicicola após o 10° dia de
avaliação nas diferentes concentrações de nanopartículas de prata .......................63
Figura 20 - Crescimento micelial nos dois tratamentos com doses mais baixas de
nanopartículas de prata: 1/128 e 1/256 (Início: 6° dia de avaliação - Término: 10° dia
de avaliação) .............................................................................................................65
Figura 21 - Percentual de redução de germinação dos esporos de Alternaria
brassicicola em função do aumento da concentração de nanopartículas de prata
...................................................................................................................................66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Relação entre o tamanho de nanopartículas de prata e a redução de
microrganismos em contato ......................................................................................31
Tabela 2 - Época de plantio da couve-manteiga ......................................................41
Tabela 3 - Combinação de parâmetros aplicada no estudo quimiométrico .............49
Tabela 4 - Cepas de referência padrão utilizadas nos testes de sensibilidade
...................................................................................................................................52
Tabela 5 - Concentrações de nanopartículas de prata utilizadas para o teste de ação
direta sobre o fungo Alternaria brassicicola ..............................................................53
Tabela 6 - Atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata sobre bactérias
gram-negativas e gram-positivas ..............................................................................62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ag+: íon Prata
Ag: Prata
AgNO3: Nitrato de prata
AgNPs: Nanopartículas de prata
Au: Ouro
ATCC: Do inglês American Type Culture Collection
BD: Batata dextrose
BDA: Agar batata dextrose
BOD: Demanda bioquímica de oxigênio, do inglês Biochemical oxygen demand
cm: centímetros
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Cu: Cobre
DLS: Espalhamento de luz dinâmico, do inglês Dynamic Light Scattering
DNA: Ácido desoxirribonucléico
EDX: Energia de Dispersão de Raios X
EUA: Estados Unidos da América
EM: Campo eletromagnético
ha: hectare
MCT: Ministério de Ciência e Tecnologia
MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura
m: metro
mM: milimolar
nm: nanômetro (10-9 m)
NPs: Nanopartículas
rpm: Rotações por minuto
SPR: Ressonância de Plasmon de Superfície, do inglês Surface Plasmon
Ressonance
SEM: Microscópio Eletrônico de Varredura, do inglês Scanning Electron Microscope
t: tonelada
TTC: Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazol
UFC: Unidades formadoras de colônia
UV-Vis: Ultravioleta-Visível
µ: micro (1 x 10-6 m)
μL: microlitro
µm: micrômetro
LISTA DE TRABALHOS GERADOS A PARTIR DESTA DISSERTAÇÃO
Artigos publicados em revistas científicas
OLIVEIRA, H. P.; CAVALCANTI, L. S.; CAVALCANTE, N. B.; NASCIMENTO, I. K.
S.; PASCHOLATI, S. F.; GUSMÃO, L. F. P.; MACEDO, A. G. C. and COSTA, M. M.
2013. Antimicrobial activity of silver nanoparticles synthesized by the fungus
Curvularia inaequalis. African Journal of Biotechnology. Vol. 12(20), pp. 2917-
2923, 15 May.
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................18
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................21
3. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................22
3.1. A importância da nanotecnologia .......................................................................22
3.2. Nanopartículas metálicas ...................................................................................23
3.2.1. Métodos de caracterização de nanopartículas metálicas .....................24
3.2.1.1. Espectroscopia no Ultravioleta-visível e Pico SPR .................24
3.2.1.2. Potencial Zeta .........................................................................26
3.2.1.3. Importância do estudo quimiométrico .....................................27
3.3. Nanopartículas de prata (AgNPs) ......................................................................30
3.4. Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn ...............................................................33
3.4.1. O gênero Curvularia .............................................................................33
3.4.2. A espécie Curvularia inaequalis (Shear) Boedjin .................................34
3.4.3. Distribuição geográfica .........................................................................37
3.4.4. Hospedeiros .........................................................................................38
3.4.5. Onde são encontrados .........................................................................38
3.4.6. Patogenicidade de Curvularia inaequalis .............................................38
3.5. Cultura da couve-manteiga ................................................................................39
3.5.1. Importância econômica .........................................................................42
3.6. Alternaria brassicicola e alternariose ..................................................................43
4. MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................47
4.1. Obtenção das amostras de Curvularia inaequalis Shear (Boedijn) ....................47
4.2. Obtenção da enzima nitrato redutase utilizando Curvularia inaequalis .............47
4.3.Obtenção das nanopartículas de prata (AgNPs) utilizando Curvularia inaequalis
como agente de redução ...........................................................................................48
4.4. Planejamento fatorial aplicado na preparação de nanopartículas de prata .......48
4.5. Caracterização das amostras .............................................................................50
4.5.1. Absorbância ..........................................................................................50
4.5.2. Tamanho das partículas e potencial zeta .............................................50
4.5.3. Obtenção de imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV).........................................................................................................................50
17
4.6. Isolamento do fungo Alternaria brassicicola .......................................................50
4.7. Atividade antibacteriana de nanopartículas de prata (AgNPs) ...........................51
4.8. Teste de Avaliação do crescimento micelial de Alternaria brassicicola .............52
4.9. Teste de Ação direta das nanopartículas de prata sobre o fungo Alternaria
brassicicola ...............................................................................................................53
4.10. Análise estatística ............................................................................................55
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................56
5.1. Caracterização das amostras obtidas pela combinação dos parâmetros de
preparação de nanopartículas de prata (A, B e C) ...................................................56
5.2. Cálculos da importância relativa dos parâmetros isolados e combinados para o
pico SPR e Potencial Zeta ........................................................................................57
5.3. Cinética de formação de nanopartículas de prata .............................................59
5.4. Atividade antibacteriana de nanopartículas de prata sintetizadas por Curvularia
inaequalis (Shear) Boedijn ........................................................................................61
5.5. Avaliação do crescimento micelial de Alternaria brassicicola ............................63
5.6. Teste de ação direta ..........................................................................................66
6. CONCLUSÕES ..........................................................................................69
7. REFERÊNCIAS ..........................................................................................71
18
1. INTRODUÇÃO
A ciência e tecnologia em nanoescala têm atraído considerável atenção nos
últimos anos, pelo impacto que os materiais nanoestruturados vêm causando na
melhoria da qualidade de vida e na preservação do meio ambiente (FERREIRA &
RANGEL, 2009). Nanomateriais são estruturas que têm dimensões na escala do
nanômetro (nm), ou seja, um bilionésimo (10-9) de um metro, com tamanho
estabelecido entre 1 e 100 nanômetros. Em tais dimensões, estes materiais podem
apresentar diferentes propriedades físicas, químicas e/ou biológicas, abrindo um
leque de novas possibilidades para a nanotecnologia (SUDARENKOV, 2012).
Dentro da nanotecnologia, as nanopartículas metálicas (NPs) têm recebido
atenção crescente, devido principalmente às suas propriedades físico-químicas
únicas, que diferem significativamente dos seus semelhantes em escalas maiores
(VAHABI et al., 2011; KIRTH et al., 2012). Estudos recentes têm demonstrado que
vários tipos de nanopartículas metálicas, com destaque para as nanopartículas de
prata, possuem atividade antimicrobiana (DERBALAH et al., 2011), sendo eficientes
no combate a diversos tipos de microrganismos como bactérias, fungos e vírus
(VIGNESHWARAN et al., 2007). A evolução da nanotecnologia tem permitido aos
pesquisadores incorporar o uso de substâncias coloidais com íons de prata em
medidas preventivas e/ou de controle muito eficientes (DERBALAH et al, 2011).
Nos últimos anos, o surgimento de cepas de bactérias e fungos resistentes
aos agentes antimicrobianos disponíveis comercialmente tem aumentado em um
ritmo alarmante, tornando-se um sério problema. Os microrganismos, tais como
bactérias, fungos e vírus, livres no meio ambiente, muitas vezes são patogênicos,
podendo causar infecções graves em seres humanos, animais ou vegetais. Em
virtude disso, há uma crescente necessidade de se buscar novos agentes
antimicrobianos de origem natural e atóxicos (GAJBHIYE et al., 2009).
Com relação aos danos em vegetais, as doenças fúngicas emanam como
uma das principais causas de perdas econômicas consideráveis em diversos tipos
de culturas. Atualmente é difícil controlar o crescimento de fungos porque o controle
químico tradicional depara-se com o surgimento de isolados de patógenos
resistentes às principais substâncias químicas utilizadas (DERBALAH et al, 2011).
Dentre as culturas de grande importância econômica, a couve-manteiga (Brassica
oleracea L. var. acephala) está entre as mais importantes na nutrição humana,
19
devido à grande quantidade de sais minerais e vitaminas presente na sua
composição (PAULINO, 2008). É uma excelente fonte de carotenoides e contribui
para a redução de riscos de algumas doenças como câncer de pulmão e catarata
(LEFSRUD et al., 2007). Seu cultivo pode ser prejudicado pelo surgimento de
doenças como a alternariose, provocada pelo fungo Alternaria brassicicola e que
causa danos significativos às plantas hospedeiras, desde a fase de mudas até a
fase reprodutiva das mesmas. As lesões são caracterizadas principalmente pela
formação de uma massa pulverulenta e escura formada pelos conídios e
conidióforos do fungo (RIMMER et al., 2007). A doença pode ocorrer tanto no
estádio de plântula quanto em plantas adultas. Em plântulas, geralmente ocorre
necrose nos cotilédones e hipocótilo, levando ao tombamento e à morte.
Sabe-se que é de grande importância para a economia a manutenção da
qualidade dos produtos olerícolas que são comercializados. No entanto, é
necessário tomar alguns cuidados no uso dos agroquímicos disponíveis para
controle de doenças. A melhor alternativa de controle de doenças de plantas deve
se destacar pela sua praticidade, economia e menor impacto ambiental (KUHN,
2010). Atualmente, novos métodos de controle menos agressivos ao meio ambiente
e mais viáveis do ponto de vista econômico vêm sendo estudados. É o caso da
utilização de nanopartículas metálicas, como as nanopartículas de prata (AgNPs)
(GAJBHIYE et al., 2009).
Recentemente, a utilização de sistemas biológicos tem emergido como um
novo e importante método para a síntese de nanopartículas metálicas. Sabe-se que
muitos organismos, tanto unicelulares quanto pluricelulares, são capazes de produzir
materiais inorgânicos intra ou extracelularmente (FAYAZ et al., 2009), minimizando a
toxicidade no processo de produção destas nanopartículas. Certos fungos, por
exemplo, têm a capacidade de produzir metabólitos extracelulares em função da sua
própria sobrevivência quando expostos a certos tipos de estresses, como a
exposição a materiais tóxicos (íons metálicos, por exemplo). Na biossíntese de
nanopartículas metálicas por um fungo, o micélio é exposto à solução com íons do
metal. Neste processo, o fungo é induzido a produzir enzimas que vão provocar a
redução dos íons metálicos tóxicos em nanopartículas metálicas sólidas sem
toxicidade (VAHABI et al., 2011).
Portanto, pelo exposto acima, este trabalho teve como objetivo principal
avaliar as atividades antibacteriana e antifúngica de nanopartículas de prata
20
sintetizadas pelo fungo Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn, no controle in vitro de
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e Alternaria brassicicola (Schwein.)
Wiltshire, fungo causador da alternariose em couve-manteiga (Brassica oleracea var.
acephala), visando contribuir ainda mais com os estudos na área da nanotecnologia,
inclusive com aplicações na área de controle de doenças em plantas, estimulando a
inovação e a redução da utilização de produtos de elevado impacto ambiental.
21
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar a atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata (AgNPs)
biossintetizadas pelo fungo Curvularia inaequalis.
2.2. Específicos
2.2.1. Explorar um procedimento simples para a biossíntese de nanopartículas de
prata, à temperatura ambiente, a partir da ação do fungo Curvularia inaequalis como
agente de redução.
2.2.2. Caracterizar as nanopartículas de prata produzidas utilizando as técnicas de
Espectroscopia no UV-visível (UV-vis) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
2.2.3. Avaliar a atividade antibacteriana de nanopartículas de prata (AgNPs)
produzidas por C. inaequalis no controle in vitro de bactérias Gram-negativas e
Gram-positivas pelas técnicas de Concentração Inibitória Mínima (MIC) e
Concentração Bactericida Mínima (CBM).
2.2.4. Avaliar a atividade antifúngica de nanopartículas de prata (AgNPs) produzidas
por C. inaequalis no controle in vitro do fitopatógeno Alternaria brassicicola,
causador da alternariose em couve-manteiga (Brassica oleracea L. var acephala)
pela avaliação de crescimento micelial e teste de ação direta.
22
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. A importância da nanotecnologia
A palavra “nanotecnologia” está relacionada às tecnologias que permitem a
construção de materiais ou estruturas numa escala muito reduzida: a do nanômetro
(nm). Este corresponde à bilionésima parte do metro (10-9 m) (EGUCHI et al., 2013).
Popularmente, o prefixo "nano" é usado para descrever objetos, sistemas ou
fenômenos com características decorrentes de sua estrutura em escala nanométrica
(BUZEA et al., 2007).
O uso da nanotecnologia vem modificando substancialmente a forma como os
diversos tipos de materiais são utilizados. Em escala nanométrica, os materiais
apresentam comportamento muito distinto de suas conhecidas propriedades físicas
e químicas em escalas maiores, principalmente no que diz respeito à sua reatividade
química, resistência mecânica e comportamento sob ação da luz. Particularmente,
as nanopartículas metálicas e seus óxidos provaram, no decorrer dos anos, terem
inúmeras aplicações, especialmente medicinais, pela ação dos íons e metais
reduzidos contra bactérias e fungos patogênicos, graças à sua interação com células
vivas (GARCIA, 2011).
No Brasil, estudos relacionados à nanotecnologia vêm sendo incentivados
pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT), desde 2001. O país vem investindo cada
vez mais em nanotecnologia. A produção científica em Nanociência e
Nanotecnologia (N&N) no Brasil desfruta de certo prestígio no cenário mundial, com
uma comunidade científica composta por cerca de 3 mil indivíduos e a melhor
infraestrutura da América Latina (SANT’ANNA et al., 2013).
Atualmente, espera-se que a nanotecnologia tenha um profundo impacto na
economia e na sociedade durante o século 21, comparável à tecnologia da
informação ou aos avanços na Biologia Celular e Molecular. Pesquisas científicas
em nanotecnologia podem trazer grandes descobertas nas áreas de engenharia,
medicina, agricultura, meio ambiente, energia, biotecnologia, tecnologia da
informação, entre tantas outras possibilidades. A busca por um desenvolvimento que
seja sustentável, ou seja, que permita que a geração presente satisfaça as suas
23
necessidades sem comprometer as gerações futuras é um dos maiores desafios
atuais da nanotecnologia.
3.2. Nanopartículas metálicas
As nanopartículas (NPs) são vistas como os blocos de construção
fundamentais da nanotecnologia. Elas são o ponto de partida para a preparação de
vários materiais e dispositivos nanoestruturados. A sua síntese é um processo vital
para a eficiência cada vez maior dos estudos que integram a nanociência (VAHABI
et al., 2011).
Nos últimos anos, a busca por novos sistemas em escalas de tamanho cada
vez menores têm atraído significativamente a atenção da comunidade científica
mundial. Neste cenário, as nanopartículas (NPs) metálicas, partículas com diâmetro
menor que 100 nm, desempenham um papel de grande importância no
desenvolvimento de novas tecnologias. Estas NPs exibem propriedades físicas e
químicas únicas que proporcionam sua aplicação em diversas áreas, tais como
óptica, luminescência, eletrônica, catálise, biomedicina, entre tantas outras. Dois
fatores fundamentais, ambos relacionados com o tamanho de nanocristais
individuais, são responsáveis por suas propriedades: (1) grande razão
superfície/volume e (2) confinamento quântico (SANTOS, 2011).
Podem exibir também propriedades completamente novas ou melhoradas
baseadas em determinadas características específicas como tamanho, distribuição,
morfologia, fase, entre outras, se comparadas a partículas com dimensões maiores
provenientes da mesma fonte de onde as nanopartículas foram geradas. Podem
apresentar morfologias muito distintas (flocos, esferas, formas dendríticas, etc.),
correspondente ao tipo de material que se encontra na base da sua formação
(WILLEMS, 2005).
A síntese de nanopartículas metálicas tem atraído a atenção dos
pesquisadores em virtude de suas características físicas e químicas, que não são
encontradas em materiais convencionais, permitindo sua aplicação em vários
campos da ciência como a medicina, a agricultura, a biotecnologia, a indústria de
alimentos, entre outros (GÚZMAN et al., 2009). Existem diversas formas de síntese
de nanopartículas metálicas, sendo as nanopartículas sintetizadas por via aquosa as
24
mais estudadas. Dentre estas, se destacam as nanopartículas de prata (DASTJERDI
et al., 2009).
Atualmente, estudos na área da nanotecnologia focam na síntese controlada
de nanopartículas metálicas com diferentes tamanhos, formas e composição
química, controlando sua dispersão para aplicações biológicas em diversas áreas,
com benefícios para o ser humano, animais e vegetais. As nanopartículas
começaram a ser produzidas por via química e física, com elevada eficiência,
obtendo-se partículas puras e com propriedades bem definidas. No entanto, estes
métodos de síntese são considerados muito caros e potencialmente perigosos para
o meio ambiente. De modo a contornar este problema, recorreu-se ao uso de
sistemas biológicos de síntese (microrganismos, extratos de plantas ou a sua
biomassa) como alternativa aos métodos químicos e físicos, para a produção de
nanopartículas de um modo sustentável e benéfico para o meio ambiente (KUMAR &
YADAV, 2008).
3.2.1. Métodos de caracterização de nanopartículas metálicas
3.2.1.1. Espectroscopia no Ultravioleta-visível e Pico SPR
A Espectroscopia de Absorção UV-vis envolve a absorção da radiação
ultravioleta/visível, que compreende a faixa de 180 a 780 nm, causando a promoção
de elétrons do estado eletrônico fundamental para o estado excitado. O espectro é
obtido pela irradiação da luz através de uma solução diluída da amostra e o espectro
de absorção é dado pela razão da intensidade da radiação, que passa pela amostra
e pela referência nesta faixa de comprimentos de onda (SKOOG et al., 1996).
Algumas nanopartículas metálicas apresentam bandas de absorção na região
do ultravioleta-visível que se devem à oscilação coletiva dos elétrons das
nanopartículas em ressonância com as ondas de luz, induzindo a formação de
momentos dipolo pelo carregamento da superfície. Uma força de restauração nas
nanopartículas tenta compensar, resultando em um comprimento de onda
ressonante único, gerando uma banda. Esta é denominada banda de plasmon de
superfície (SPR) (LIZ-MARZÁN, 2004; LINK & EL-SAYED, 1999). Resumidamente, o
fenômeno da ressonância de plasmon de superfície pode ser explicado pela
oscilação dos elétrons livres em uma superfície metálica. Quando uma nanopartícula
25
é muito menor do que o comprimento de onda da luz, um campo eletromagnético em
certa frequência induz uma ressonância, coerente com a oscilação dos elétrons,
como ilustra a figura 1(JAIN et al., 2007).
Figura 1: Esquema da interação de uma nanoesfera metálica com a luz. O campo eletromagnético da
luz induz uma oscilação dipolar da condução eletrônica através da partícula.
Os espectros de absorção de nanopartículas de metais alcalinos como Ag, Au
e Cu têm sido extensivamente investigados, incluindo o efeito das variações no
tamanho e forma das partículas no espectro (DAS et al., 2009; CREIGHTON &
EADON, 1991). Nem todos os materiais apresentam ressonância de plasmon,
porque é necessária a presença de elétrons de condução livres, como ocorre em Ag,
Au e Cu (LIZ-MARZÁN, 2004).
O comprimento de onda de oscilação depende de vários fatores como o
tamanho e a forma da partícula, o meio que se encontra (constante dielétrica) e
distância interpartículas (interação entre dipolos). Para partículas não esféricas,
como bastões por exemplo, o comprimento de onda de ressonância depende da
orientação do campo elétrico. Portanto, duas oscilações são possíveis: a transversal
e a longitudinal, gerando duas bandas de absorção no espectro (LIZ-MARZÁN,
2004).
No caso de nanopartículas de prata (AgNPs), quando o campo elétrico de
uma onda induz uma polarização dos elétrons para o núcleo iônico mais pesado das
AgNPs, a diferença de carga cria uma oscilação dipolar de todos os elétrons na
mesma fase. Quando a frequência do campo electromagnético se encontra
ressonante com a corrente de elétrons em movimento, ocorre uma banda de
26
absorção, que está na origem das cores observadas para as AgNPs. Como foi
descrito anteriormente, a absorção depende fortemente do tamanho da partícula,
meio dielétrico e dos compostos circundantes. As AgNPs esféricas com
aproximadamente 20 nm exibem uma única banda SPR que ocorre na região do
visível a entre 420 e 450 nm (MARTINEZ-CASTANON et al., 2008). A largura das
bandas SPR está relacionada com a distribuição de tamanhos das AgNPs.
3.2.1.2. Potencial Zeta
Partículas coloidais dispersas em uma solução adquirem uma carga elétrica
superficial, devido à ionização de grupos químicos e a adsorção diferencial de íons
da solução na superfície da partícula. Em um campo elétrico, cada partícula e os
íons mais fortemente ligados a ela se movem como uma unidade. O potencial no
plano de cisalhamento entre essa unidade e o meio circundante é denominado
Potencial Zeta (ζ) (SKOOG & ROLER, 2002). Quando uma camada de
macromoléculas, por exemplo, é adsorvida na superfície da partícula, ela move o
plano de cisalhamento para longe da superfície e altera o potencial zeta. Dessa
forma, o potencial zeta é a função da carga superficial da partícula, de qualquer
camada adsorvida na interface com o meio e da natureza e composição do meio
circundante (GUINGAB et al., 2007).
O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas, o qual é
influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da
dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de
espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão. Este parâmetro é
determinado utilizando-se técnicas de eletroforese (SCHAFFAZICK et al., 2003).
Esse potencial pode ser determinado experimentalmente e, como ele reflete a carga
efetiva das partículas, ele se correlaciona com a repulsão eletrostática entre elas e
com a estabilidade da suspensão. Quanto maior o potencial zeta, maior a tendência
da suspensão à estabilidade, pois as partículas carregadas se repelem entre si, com
uma força que supera a tendência natural de agregação. Este é influenciado
principalmente pela concentração eletrolítica e pelo pH da suspensão coloidal
(RIBEIRO et al., 2011).
A estabilidade das partículas em solução ocorre quando o valor do potencial
zeta é ζ ≤ -30mV ou ζ ≥ 30mV. Caso ocorra o contrário, -30mV ≤ ζ ≤ 30mV, a
27
aglomeração irá ocorrer. A velocidade da aglomeração vai aumentando conforme o
valor do potencial zeta se aproxima de zero. Assim, coloides com potencial zeta
elevados (positivos ou negativos) são eletricamente estáveis, enquanto que coloides
com baixos potenciais zeta tendem a formar agregados (SKOOG & ROLER, 2002).
O quadro abaixo ilustra a relação entre o valor do potencial zeta e a estabilidade do
coloide em solução.
Potencial Zeta [mV] Estabilidade do comportamento do coloide
0 a ± 5 Rápida coagulação ou floculação
± 10 a ± 30 Instabilidade incipiente
± 30 a ± 40 Estabilidade moderada
± 40 a ± 60 Boa estabilidade
Mais de ± 61 Excelente estabilidade
Fonte: SKOOG & ROLER, 2002.
O equipamento utilizado para as medidas de potencial zeta é o Zeta Sizer
Nano ZS da Malvern Instruments.
3.2.1.3. Importância do estudo quimiométrico
A análise de dados multivariados tem se tornado, de modo crescente, uma
importante área da química e de outras ciências, sugerindo que a tendência atual do
pensamento científico envolve um raciocínio multivariado, principalmente devido ao
desenvolvimento tecnológico atingido neste último século (TEÓFILO, 2013).
Com o advento das inúmeras técnicas instrumentais de análises químicas, o
crescente desenvolvimento computacional a estas acoplado e a consequente
complexidade dos dados obtidos, é de fundamental importância a utilização conjunta
de métodos matemáticos com o objetivo de retirar o máximo proveito dos resultados
disponíveis. A aplicação de métodos matemáticos a um conjunto de dados por
natureza multivariada, como por exemplo, a decomposição por valores singulares,
permite uma simplificação do mesmo no sentido de comprimir o espaço dimensional
a que este está confinado, possibilitando dessa forma uma melhor interpretação e
visualização desses dados (TAULER et al., 2000; SENA et al., 2000).
28
De um modo geral, a análise multivariada refere-se a todos os métodos
estatísticos que analisam, simultaneamente, múltiplas medidas sobre cada objeto
que está sob investigação. Um exemplo importante é a intensidade de absorção em
um número muito grande de comprimentos de onda, que é registrado em um único
espectro. Com essa grande quantidade de dados, surgiu a necessidade de se
buscar ferramentas mais sofisticadas para tratá-los e extrair informações relevantes,
dando origem à Quimiometria, que é uma área especificamente destinada à análise
de dados químicos de natureza multivariada (CASANOVA, 2010)
Ainda segundo Casanova (2010), a quimiometria emprega métodos
matemáticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para
fornecer o máximo de informações químicas com a análise dos dados obtidos.
Nesse sentido, o planejamento fatorial emerge como uma ferramenta estatística
importante e simples. A observação dos efeitos das variáveis e interações entre os
parâmetros utilizados é de extrema importância para entender os processos que
estão sendo monitorados em um determinado sistema (PEREIRA-FILHO et al.,
2002). O planejamento fatorial é indicado para a fase inicial de um procedimento
experimental onde há a necessidade de se definir os fatores mais importantes e
estudar os efeitos sobre a variável resposta escolhida. É considerado um modelo de
efeitos fixos, ou seja, a análise dos efeitos provocados pelos fatores não pode ser
transferida para outros níveis que não sejam os analisados no planejamento
(BUTTON, 2001).
Segundo Wu e Hamada (2009), planejar um experimento fatorial ao invés de
um-fator-por-vez é a maneira mais eficaz de determinar a influência de dois ou mais
fatores sobre a variável resposta, porque:
Requer menos recursos (experimentos, tempo, material) para a quantidade de
informação obtida.
As estimativas dos efeitos fatoriais são mais precisas. Usando mais
observações para estimar um efeito resulta em maior precisão.
O efeito das interações entre os fatores pode ser estimado sistematicamente.
Obtém-se informações para uma região experimental maior.
Alguns tipos especiais de planejamentos fatoriais são muito úteis, como o
planejamento com k fatores. Um experimento fatorial com k fatores, cada um com
deles dois níveis, é denominado experimento fatorial 2k. O processo experimental
dessa técnica consiste em realizar testes com cada uma das combinações da matriz
29
experimental para, em seguida, determinar e interpretar os efeitos principais e de
interação dos fatores investigados. Dessa maneira, é possível determinar as
melhores condições experimentais de determinado processo (MONTGOMERY,
2009).
Para ilustrar o procedimento desta técnica, considere-se um experimento
com três fatores (x1, x2 e x3), cada um testado em dois níveis (+1 e -1). Assim, a
matriz de planejamento para o experimento fatorial 23 é representada no quadro
abaixo:
N
Teste
Fatores de controle Ordem do
teste
Resposta
(yi) x1 x2 x3
1 -1 -1 -1 6 y1
2 +1 -1 -1 8 y2
3 -1 +1 -1 1 y3
4 +1 +1 -1 2 y4
5 -1 -1 +1 5 y5
6 +1 -1 +1 3 y6
7 -1 +1 +1 4 y7
8 +1 +1 +1 7 y8
Fonte: MONTGOMERY,1991
Devor (1992) descreve o procedimento a ser utilizado para construir a matriz
genérica do experimento fatorial 2k. Desse modo, na matriz de planejamento, as
colunas representam o conjunto de fatores investigados (x1, x2, x3...xk) e as linhas
representam os diferentes níveis ou combinações de fatores [-1 (mínimo); +1
(máximo)]. Portanto, segundo Montgomery (1991), o modelo estatístico do
experimento fatorial 23 é dado pela equação abaixo:
yijk = µ +τi + βj + γk + (τβij) + (τγik) + (βγjk) + (τβγijk) + εijk
onde:
µ: é a média dos resultados;
τi: é o efeito principal do fator x1;
βj: é o efeito principal do fator x2;
γk: é o efeito principal do fator x3;
(τβij): é o efeito de interação entre os fatores x1 e x2;
(τγik): é o efeito de interação entre os fatores x1 e x3;
30
(βγjk): é o efeito de interação entre os fatores x2 e x3;
(τβγijk): é o efeito de interação entre os fatores x1, x2 e x3;
εijk: é o erro experimental.
3.3. Nanopartículas de prata (AgNPs)
Dentre os inúmeros tipos de metais utilizados na preparação de
nanopartículas, os metais de transição são os que despertam maior interesse,
especialmente em virtude de suas propriedades catalíticas. A prata é um dos metais
de transição mais estudados na literatura, principalmente com relação ao
desenvolvimento de novas metodologias de preparação de nanopartículas e também
por ser um material tecnologicamente importante (FRATTINI et al., 2005).
É um mineral extraído da natureza e possui uma ação anti-séptica conhecida
desde os primórdios da civilização. Estudos na área da medicina têm demonstrado
que a prata é eficiente contra mais de 650 organismos patogênicos, possuindo um
amplo espectro de atuação. Sua utilização na forma de nanopartículas potencializa
esta propriedade, permitindo sua utilização em uma ampla gama de aplicações
(DASTJERDI et al., 2009; YOON et al., 2007).
As nanopartículas de prata são de fundamental importância e seu amplo
espectro de atuação inclui microrganismos em geral, como bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas, fungos filamentosos, leveduras e vírus. Sua propriedade mais
marcante é possuir uma grande área superficial. Com relação à toxicidade para as
células animais, as nanopartículas de prata são as que apresentam o menor índice
(NETO et al, 2008). A atividade antifúngica das nanopartículas de prata foi relatada
por diversos pesquisadores (KIM et al., 2009; FALKIEWICZ-DULIK & MACURA,
2008; KIM et al., 2008; PETICA et al., 2008).
Todavia, apesar da sua eficiência já bastante conhecida, o mecanismo de
ação das nanopartículas de prata ainda não está bem esclarecido. Este é bastante
complexo e ainda possui muitas controvérsias. Sabe-se que as nanopartículas de
prata têm grande afinidade com grupos que possuem os elementos enxofre e
fósforo, que são encontrados nas membranas celulares. Sua interação ocorre com a
membrana celular dos microrganismos causando danos no processo de respiração
celular e, no interior destas células, interagem com o DNA provocando a sua
desnaturação e impedindo a divisão celular (NETO et al., 2008). Também podem
31
atacar a superfície da membrana celular e interferir de forma negativa em suas
funções de permeabilidade. Pode-se afirmar que a ligação destas partículas na
célula depende da área superficial disponível para a interação. Partículas menores
possuem uma área muito maior de superfície disponível para interagir com o
microrganismo, sendo, por isso, mais eficazes no combate a este, se comparadas à
partículas maiores (MORONES et al., 2005).
A tabela 1 ilustra a relação entre o tamanho das nanopartículas de prata com
a redução de microrganismos quando estes entram em contato com as mesmas:
Tabela 1 - Relação entre o tamanho de nanopartículas de prata e a redução de microrganismos em contato. (Fonte: BERNI et al, 2008).
Tamanho da Partícula Taxa de redução de microrganismos (%)
30 nm 99,9
70 nm 99,4
150 nm 97,7
300 nm 97,5
Wong e colaboradores, em 2010, listaram os supostos mecanismos de ação
das nanopartículas de prata na eliminação de microrganismos. São eles:
A) A prata em escala nanométrica possui uma melhor interação com os
microrganismos devido a sua elevada área superficial. Desta forma, estas
nanopartículas atacam a superfície celular e também penetram no interior
desses organismos.
B) As membranas celulares possuem proteínas cujas estruturas contêm enxofre
e fósforo. Tanto as nanopartículas de prata quanto os íons de prata podem
interagir com essas proteínas. Podem ainda inibir as funções do DNA ao
interagirem com esses grupos.
C) As nanopartículas de prata e/ou os íons de prata podem provocar danos na
cadeia respiratória, dentro da mitocôndria, provocando assim a morte celular.
32
D) As nanopartículas de prata podem promover uma liberação sustentada de
Ag+ dentro das células dos microrganismos, podendo formar radicais livres e
induzir o estresse oxidativo, reforçando sua atividade antimicrobiana.
Nos últimos anos, o surgimento de microrganismos resistentes como fungos,
vírus e bactérias aumentou em um ritmo alarmante, tornando-se um sério problema.
Livres no meio ambiente, muitas vezes são patogênicos, podendo provocar danos
aos seres humanos, animais e vegetais. Com isso, torna-se cada vez mais
necessário a busca de novos agentes para controle efetivo destes microrganismos.
De preferência naturais e que não sejam tóxicos ao meio ambiente nem aos seus
componentes em geral (GAJBHIYE et al., 2009). Para tanto, a utilização de
nanopartículas metálicas (com destaque para as nanopartículas de prata) surge
como uma alternativa viável e eficiente para este fim.
Dessa maneira, há uma crescente necessidade de se obter nanopartículas
utilizando processos de síntese onde não se use produtos químicos tóxicos em seus
protocolos de execução. Em virtude disso, pesquisadores do campo da síntese de
nanopartículas estão voltando sua atenção aos sistemas biológicos. Muitos
organismos, tanto unicelulares quanto multicelulares, são conhecidos por
produzirem materiais inorgânicos, quer intra ou extracelularmente (VENGADESH-
PRABHU et al., 2011).
A utilização de microrganismos como bactérias, fungos e leveduras na síntese
de nanopartículas é uma atividade relativamente recente. Acredita-se que estes
organismos minimizam a toxicidade no processo de produção de nanopartículas
(VAHABI et al., 2011). Os fungos, por exemplo, se comparados às bactérias,
secretam quantidades muito mais elevadas de substâncias bioativas, o que torna
sua utilização muito mais adequada, levando-se em conta uma produção de
nanopartículas em grande escala. Além disso, o uso de fungos na biossíntese
extracelular também pode ser um processo muito mais fácil do que se fossem
utilizadas bactérias (GUANGQUAN et al., 2012).
Em resumo, o método biológico de síntese proporciona uma ampla gama de
recursos para a produção de nanopartículas de prata. Em síntese biológica, a
parede celular dos organismos desempenha um papel importante na síntese de
nanopartículas. A parede celular negativamente carregada interage
eletrostaticamente com os íons metálicos carregados positivamente. Quando os
33
organismos são incubados em contato com os íons de prata, nanopartículas de
prata podem ser geradas extracelularmente como um mecanismo de defesa contra a
toxicidade do metal. A taxa de redução de íons metálicos utilizando agentes
biológicos é muito mais rápida em condições de temperatura e pressão ambiente.
Além disso, este método pode ser considerado uma abordagem ecológica,
sustentável e economicamente viável (TRAN et al., 2013).
3.4. Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn
3.4.1 O gênero Curvularia
De acordo com Boedijn (1933) (apud SUN et al., 2003), a classificação
taxonômica do gênero Curvularia é:
Reino: Fungi;
Filo: Ascomycota;
Classe: Euascomycetes;
Ordem: Pleosporales;
Família: Pleosporaceae;
Gênero: Curvularia.
O gênero Curvularia é composto por mais de 40 espécies que se distinguem
por diferenças evidentes na morfologia dos conídios, número de septos e morfologia
da colônia (FERREIRA, 2010).
Descrito com a espécie tipo C. lunata (Wakker) Boedijn, o gênero Curvularia
permitiu acomodar espécies da família Pleosporaceae que possuíam conidióforos
macronematosos, mononematosos, lineares ou levemente curvados,frequentemente
geniculados, por vezes nodosos, células conidiogênicas integradas, terminais e
simpodiais, fragmoconídios solitários, oliváceos a castanhos, elipsóides, cilíndricos
ou obovóides, três ou mais septos transversais, terceira célula ou segunda e terceira
distintamente maiores e escuras, muitas vezes desigualmente curvos devido ao
alargamento de uma ou duas células centrais, septos rígidos, hilo truncado ou
protuberante (LIMA & FURTADO, 2007).
34
A identificação deste gênero por meio de características morfológicas é
relativamente simples, uma vez que possuem características bem evidentes e
peculiares. (LIMA & FURTADO, 2007). Contudo, a identificação ao nível de espécie
é dificultada pelas poucas descrições e ausência de ilustrações em trabalhos mais
antigos, bem como pela diversidade de características morfológicas e biométricas
dos conídios, causada por diferentes condições de cultura e sobreposição dos
valores das medidas apresentadas por diferentes autores (HOSOKAWA et al.,
2003). Nos estudos sobre a micoflora de muitos ecossistemas, os fungos do gênero
Curvularia constituem um dos mais fascinantes grupos, devido à frequência com que
são observados e ao elevado número de espécies que são normalmente
identificadas. Apesar da maioria dos táxons do gênero ser conhecida como saprófita
em diferentes substratos vegetais, podendo ainda ser isolada a partir do solo e do
ar, existem espécies fitopatogênicas, sobretudo em gramíneas e em regiões de
clima tropical e subtropical (LIMA & FURTADO, 2007).
Apesar das dificuldades enfrentadas no processo de identificação desses
organismos, esta continua a ser feita numa aproximação fenotípica, com base em
características morfológicas. Desta maneira, a identificação molecular é um
diferencial para o reconhecimento de diferentes tipos de linhagens. Trabalhos de
sequenciamento de regiões específicas, codificadoras ou não, do genoma de
fungos, tem auxiliado significativamente a classificação destes organismos. O
sequenciamento do DNA ribossomal tem contribuído para a identificação de várias
espécies fúngicas (FERREIRA, 2010).
A possibilidade de detecção de fungos potencialmente patogênicos de
humanos ou de culturas vegetais importantes no Brasil faz com que a identificação
de isolados de Curvularia sp. ao nível de espécie seja de grande relevância.
3.4.2. A espécie Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn
Curvularia inaequalis é uma espécie de fungo de crescimento relativamente
rápido. Podem ser saprófitas ou patogênicos. Possui características morfológicas
bem definidas, dentre as quais podemos destacar:
Conidióforos macronematosos, mononematosos, terminais ou laterais em
hifas, isolados ou em pequenos grupos, comprimento até 240 µm, simples ou
ramificados, direitos ou frequentemente flexuosos, ocasionalmente geniculados,
35
septados, castanhos, lisos, célula da base dilatada ou não. Conidióforos torcidos,
pluri-ramificados em culturas mais velhas. Conídios solitários, 2-4-6 septos, terceira
célula ou terceira e quarta células a partir da base são mais longas e por vezes mais
largas que as demais, hilo fracamente protuberante, direitos ou ligeiramente curvos,
elipsóides, fusiformes ou quase cilíndricos, pouco afilados para as extremidades,
uniformemente castanhos ou menos frequentemente com as células da extremidade
mais pálidas, lisos, 25-44 x 9-15 µm. Conídios formados em culturas velhas 3-4-5
septos, 20-38 x 8-14 µm. Colônias efusas, cotonosas a feltrosas, densidade média,
cinzentas a negras, frente de crescimento regular e ausência de zonagem; ausência
de estromas (KIM et al., 2000).
Os aspectos mais marcantes nesta espécie são a condição direita ou
fracamente curva dos conídios, células intermédias mais longas e o fraco afilamento
para as extremidades e elevado número de conídios nos conidióforos (LIMA &
FURTADO, 2007).
Figura 2 - Curvularia inaequalis com seus conídios septados alojados em um conidióforo. (Fonte:
PIMENTEL et al., 2005)
36
Figura 3 - Curvularia inaequalis com seus conidióforos curvados e seus conídios septados. (Fonte:
PIMENTEL et al., 2005).
A colônia tem micélio aéreo com aspecto algodonoso. No início apresenta-se
com coloração verde-escuro a castanho e por volta de 3 dias começa a surgir a
esporulação com tonalidade castanho escuro. Com o decorrer do tempo o micélio
vai adquirindo uma coloração mais escura. No prazo de 7 dias ou mais o fungo
cobre totalmente uma placa Petri de 6 cm de diâmetro.
37
Figura 4 - Cultura de Curvularia inaequalis com 3 dias. (Fonte: PPBIO/UEFS)
Figura 5 - Cultura de Curvularia inaequalis com 7 dias. (Fonte: PPBIO/UEFS)
3.4.3. Distribuição geográfica
O fungo Curvularia inaequalis é encontrado em países como Austrália, Brasil,
Canadá, França, Índia, Japão, Malásia e Turquia (LIMA & FURTADO, 2007).
38
3.4.4. Hospedeiros
Gramíneas, incluindo Hordeum (gênero da cevada), Oryza (gênero do arroz),
Sorghum (gênero do sorgo), Triticum (gênero do trigo) e Zoysia (gênero da grama).
Algumas dicotiledôneas, como Pisum (gênero da ervilha) e Vaccinium (gênero do
mirtilo ou uva-do-monte) também são consideradas hospedeiras. A doença começa
no campo, quando coincidem a época de floração e maturação com o período
chuvoso, produzindo-se a infecção das panículas e grãos e manchado dos grãos. A
maioria destes fungos, no entanto, têm um comportamento saprófita quando
encontram-se associados à sementes (KIM et al., 2000).
3.4.5. Onde são encontrados
Curvularia inaequalis tem ampla distribuição em áreas temperadas e
subtropicais, e é associado principalmente com gramíneas forrageiras e grãos. São
frequentemente isolados a partir do solo e do ar. Surgiu associado a um caso de
peritonite num paciente humano (PIMENTEL et al., 2005).
3.4.6. Patogenicidade de Curvularia inaequalis
O fungo Curvularia inaequalis raramente é considerado patogênico, mas é
capaz de produzir substâncias tóxicas, principalmente se relacionado à gramíneas.
Kim e colaboradores (2000) relataram, em um estudo com grama esmeralda, que
Curvularia inaequalis foi capaz de provocar doença nos indivíduos inoculados.
Sintomas foliares, como ferrugem de cor marrom-avermelhada, foram observados
nas plantas doentes. A partir deste resultado, foi observado que esta espécie produz
fitotoxinas como Pirenocina A e B. Dentre estas, a Pirenocina A apresentou uma
maior atividade fitotóxica em relação à Pirenocina B.
39
Figura 6 - Estrutura química das Pirenocinas A e B produzidas por Curvularia inaequalis
De acordo com estudos realizados por Carter & Boudreaux (2004) algumas
espécies do gênero Curvularia podem ser patogênicas a seres humanos, podendo
causar sinusite alérgica, pneumonia, endocardite, feridas infecciosas, micetoma,
onicomicose, queratites, abscessos cerebrais, entre outros. Pimentel et. al (2005),
relataram que a espécie Curvularia inaequalis também é capaz de provocar
peritonite em humanos, sendo o primeiro trabalho descrito na literatura a respeito da
patogenicidade desta espécie para os seres humanos. É importante salientar que os
estudos com relação à patogenicidade de Curvularia inaequalis ainda são
incipientes.
3.5. Couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala) O mercado de hortaliças orgânicas está em crescente expansão destacando-
se, entre elas, a couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala). A couve-
manteiga é uma hortaliça de grande importância econômica, sendo utilizada
amplamente na culinária brasileira, principalmente por possuir alto valor nutricional e
facilidade de cultivo (SOUZA & RESENDE, 2003).
Dentre os vegetais consumidos diariamente, as hortaliças folhosas são
consideradas como um grupo de enorme interesse para a saúde humana, devido
principalmente à riqueza de vitaminas, elementos minerais e fibras. Tais
componentes tornam seu consumo indispensável para se obter uma alimentação
saudável e equilibrada (KINUPP & BARROS, 2008). A couve-manteiga é uma
hortaliça rica principalmente em ferro, cálcio, vitamina A e ácido ascórbico. Além
disso, representa uma importante fonte de carotenóides, com maiores
40
concentrações de luteína e beta caroteno (NOVO et al., 2010), reduzindo riscos de
câncer no pulmão e de doenças oftalmológicas crônicas como cataratas (LEFSRUD
et al., 2007).
A couve-manteiga se caracteriza pela presença de um caule vertical, que
emite novas folhas em seu ápice e numerosos brotos laterais, que se originam nas
axilas das folhas. As folhas constituem a parte comestível, sendo, portanto, o
produto comercial. As folhas apresentam um limbo muito desenvolvido e
arredondado, com pecíolo longo e nervuras bem destacadas (FILGUEIRA, 2000). As
plantas são obtidas através de propagação vegetativa de clones tradicionais na
maioria das áreas de cultivo, não havendo aceitação, pelos olericultores, de
cultivares propagadas por sementes (PERUCH, 2004).
É uma hortaliça arbustiva, anual ou bienal, da família Brassicaceae. Possui
distribuição cosmopolita e constitui umas das principais famílias do ponto de vista
econômico, apresentando cerca de 400 gêneros e 4000 espécies (PAULINO, 2008).
Seu cultivo é de grande importância, devido principalmente à elevada produção,
retorno econômico e valor nutricional. No Brasil, dentre as espécies pertencentes a
essa família botânica, as mais cultivadas são Brassica oleracea var. italica L.
(brócolis), Brassica pekinensis L. (couve-chinesa), Brassica oleracea var. botrytis L.
(couve-flor), Brassica oleracea var. acephala L. (couve-manteiga) e Brassica
oleracea var. capitata L. (repolho) (FILGUEIRA, 2000).
Figura 7 – Brassica oleracea L. var. acephala. (Fonte: http://www.biolib.cz/en/taxonimage)
41
O ciclo desta planta em produção é de 100 dias para o verão, estendendo
esse período em alguns dias a mais com a chegada de épocas frias (OLIVEIRA,
2011). A produção comercial é normalmente conduzida segundo recomendações
convencionais, que incluem desde o preparo e correção do solo, adubações
orgânica e química, até o controle de pragas e doenças (SHINGO & VENTURA,
2009). A colheita é iniciada aos 80-90 dias do transplante, perdurando por um
período de oito meses. Segundo Filgueira (2003), o padrão de 25-30 cm de
comprimento é o ideal para a comercialização das folhas de couve.
A couve-manteiga pode ser cultivada em todo o país, não havendo data
especial para plantio. É uma planta tolerante a fatores climáticos, com produtividade
em regiões quentes e/ou frias. É uma cultura típica dos períodos de outono e
inverno, apresentando certa tolerância ao calor (OLIVEIRA, 2011). Pode ser
plantada durante o ano todo, mas as épocas mais indicadas, por região, estão
descritas na tabela abaixo:
Tabela 2 - Época de plantio da couve-manteiga. Fonte: http://jornalagricola.wordpress.com
ÉPOCA DE PLANTIO
Sul Sudeste Nordeste Centro-oeste Norte Ciclo
Fev./Jul. Fev./Jul. Abr./Ago. Fev./Jul. Abr./Jul. 80-90 dias
A cultura da couve-manteiga, apesar de bem adaptada às condições edafo-
climáticas da região Nordeste, apresenta baixa produtividade em alguns estados
devido a ocorrência de doenças. Dentre estas destaca-se a alternariose, causada
pelo fungo Alternaria brassicicola , fitopatógeno predominante em cultivos orgânicos
e convencionais de brássicas (MICHEREFF et al., 2003).
O crescimento adequado e o rendimento das plantas dependem da
disponibilidade de água, dos nutrientes do solo e da manutenção de fatores
ambientais como temperatura, luminosidade e umidade em níveis favoráveis
(FILGUEIRA, 2008). Uma prática adequada a ser realizada durante o cultivo da
couve-manteiga é o emprego de esterco bovino na adubação das plantas, para
auxiliar no crescimento e desenvolvimento da parte vegetativa, principalmente
quando o solo apresentar baixo percentual de matéria orgânica (FILGUEIRA, 2000).
42
Práticas adequadas de pós-colheita são de fundamental importância, pois
reduzem as perdas de produção e aumentam o aproveitamento desta hortaliça pelo
homem.
3.5.1. Importância econômica
O Brasil ocupa uma posição de destaque em relação ao cultivo de hortaliças,
sendo considerado um dos maiores produtores com 9.888.000t produzidas
atualmente. Nos últimos dez anos, a área cultivada com couve-manteiga (Brassica
oleracea L. var. acephala) e outras brássicas se manteve estável, em torno de
13.266 ha (OCAMPOS, 2010).
No Nordeste brasileiro, o estado de Pernambuco é um dos principais
produtores de crucíferas. A família Brassicaceae engloba o maior número de
culturas olerícolas de grande importância econômica principalmente para os
pequenos produtores, pois são culturas de fácil cultivo e rentáveis em pequenas
áreas. Dentre estas, a couve-manteiga tem sido abordada constantemente em
estudos e pesquisas, devido principalmente à sua importância na nutrição humana,
alto valor nutricional e elevada produtividade (FILGUEIRA, 2008).
Dentro da família Brassicaceae, as espécies mais importantes
economicamente estão no gênero Brassica: B. oleracea, B. napus e B. juncea. Além
de sua importância como hortaliças, essas espécies são utilizadas como adubo
verde, forrageiras, condimentos e para a produção de óleo a partir de sementes. No
Brasil, o cultivo de brássicas se destaca na região Centro-Sul, especialmente nos
estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais. Dentre as brássicas, o
repolho, a couve-manteiga, a couve-flor, o rabanete e o brócolos têm se expandido
consideravelmente nos últimos anos (MIGUEL-WRUCK et al, 2010). No Brasil, o
cultivo de brássicas tem destacada importância nos sistemas de produção
convencional e orgânico.
Entre as brássicas de maior importância econômica, destaca-se a couve-
manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala). O consumo de couve-manteiga no
Brasil tem aumentado gradativamente, devido, provavelmente, às novas maneiras
de utilização na culinária e às recentes descobertas da ciência quanto às suas
propriedades nutricêuticas (NOVO et al., 2010).
43
Ainda segundo Novo e colaboradores (2010), a maioria das cultivares
comercializadas no Brasil é formada por plantas de porte médio a alto. As cultivares
compactas, com altura inferior a 50 cm, híbridas, multiplicadas por sementes, são
pouco cultivadas devido a características morfológicas não atrativas para o
consumidor.
3.6. Alternaria brassicicola e alternariose
Fungos do gênero Alternaria geralmente atacam a parte aérea de seus
hospedeiros. Nas folhas vegetais, os sintomas da infecção por Alternaria geralmente
começam com o surgimento de uma pequena mancha circular escura. À medida que
a doença progride, os pontos circulares podem crescer cerca de 1 cm de diâmetro
ou até mais. Normalmente são acizentados, castanho-acizentados ou negros. Os
esporos das espécies de Alternaria são cilíndricos e multicelulares. As células são
divididas longitudinalmente e transversalmente (LAEMMLEN, 2001).
Nas brássicas, fungos do gênero Alternaria podem provocar danos em
sementes, mudas, folhas e vagens. Além da transmissão pelo ar, os esporos dos
patógenos também podem ser transmitidos pelas sementes (J. KOHL et al.; 2010).
Os fungos do gênero Alternaria sobrevivem entre um cultivo e outro em restos de
cultura infectados e hospedeiros intermediários, podendo sobreviver ainda em
equipamentos agrícolas, estacas e/ou caixas usadas. Além destas formas de
sobrevivência, existe a possibilidade de o patógeno permanecer viável no solo na
forma de micélio, esporos ou clamidósporos. Os conídios de Alternaria spp. são
altamente resistentes a baixos níveis de umidade, podendo permanecer viáveis por
até um ano nestas condições (TOFOLI & DOMINGUES, 2004).
Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire é um fungo fitopatogênico que
provoca uma das doenças economicamente mais importantes das brássicas, a
alternariose (PEDRAS, 2001). O fungo se caracteriza por apresentar colônias
profusas, marrom-oliváceas amarrom-escuras e aveludadas. O micélio, possui hifas
ramificadas, septadas, hialinas, intere intracelulares, lisas e com 1,5 a 7,5 µm de
largura. Os conidióforos são solitários ou em grupos de 2 a 12 ou mais, no entanto, é
mais comum encontrá-los isolados. São eretos ou ascendentes, mais ou menos
cilíndricos, arredondados na base. Os conidióforos são septados, cor pálida a
marrom olivácea, lisos com tamanho de até 70 µm de comprimento e de 5 a 8 µm
44
de espessura. Os conídios apresentam-se geralmente em cadeias de 20 ou mais e
algumas vezes aparecem ramificados. Estes são acropleurógenos, crescendo a
partir de pequenos poros na parede do conidióforo, retos, quase cilíndricos, afinando
suavemente até a ponta. A sua célula basal é arredondada, com bico quase não
existente, célula apical sendo mais ou menos retangular ou parecendo um cone
truncado, sempre pequena e fina. O conídio apresenta de 1 a 11 septos,
posicionados transversalmente, freqüentemente constritos, de cor pálida ou marrom
oliváceo. A sua parede é lisa, tornando-se enrugada com a idade, tamanho de 18 a
130 µm de comprimento, 8 a 30 µm de espessura na parte mais larga, pedicelo com
1/6 do comprimento do conídio e 6 a 8 µm de espessura (ELLIS, 1971).
Figura 8 – Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire. (Fonte: http://www.fungi.myspecies.info)
A alternariose, doença provocada pelo fungo Alternaria brassicicola
(Schwein.) Wiltshire, causa danos significativos às plantas hospedeiras, desde a
fase de mudas até a fase reprodutiva das mesmas. As lesões são caracterizadas
principalmente pela formação de uma massa pulverulenta e escura formada pelos
conídios e conidióforos do fungo (RIMMER et al., 2007). A doença pode ocorrer
tanto no estádio de plântula quanto em plantas adultas. Em plântulas geralmente
ocorre necrose nos cotilédones e hipocótilo, levando ao tombamento e à morte
(NICOLINI, 2008).
Ainda segundo Nicolini (2008), as condições epidemiológicas ideais para a
ocorrência da alternariose são: umidade relativa superior a 87% e temperatura
45
variando de 15 a 30°C, sendo necessárias 16 horas para o início da infecção e de 48
a 72 horas para um ótimo estabelecimento da doença. A faixa de temperatura para
infecção de A. brassicicola é de 25ºC e para produção de esporos, temperatura de
20 a 30ºC. Em plantas adultas, os principais sintomas são as manchas foliares,
geralmente iniciando nas folhas mais externas, posteriormente avançando para
todas as folhas. As lesões causadas por A. brassicicola possuem coloração marrom-
escura a preta, são arredondadas e formam anéis concêntricos com halo clorótico.
Figura 9 – Folha de couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala) com lesões típicas
de alternariose. (Foto: Noelly Bastos Cavalcante).
Figura 10 – Folha de couve-manteiga (Brassica oleracea L. var. acephala) com lesões típicas
de alternariose. (Foto: Noelly Bastos Cavalcante).
46
Sobre as lesões pode ser observada uma massa escura pulverulenta formada
por conídios e conidióforos do fungo. Em casos mais severos, estas lesões podem
coalescer causando o secamento e a queda das folhas. Quando ocorre infecção
sistêmica em sementes jovens, estas são destruídas e ficam chochas (MARINGONI,
2005).
Ainda segundo Maringoni (2005), sementes contaminadas, restos de cultura
infectados, plantas daninhas e uma ampla gama de plantas hospedeiras com
sintomas constituem as principais fontes de inóculo da doença. A disseminação
ocorre principalmente pelas sementes, mudas infectadas e pelo vento. Em sistemas
de produção convencionais, o controle da alternariose baseia-se, principalmente, em
pulverizações preventivas ou após o aparecimento dos primeiros sintomas
(AZEVEDO et al., 2000), utilizando fungicidas como oxicloreto de cobre, mancozeb,
maneb, captan, azoxistrobin e difenoconazol (MAPA, 2008).
É importante considerar que, independentemente do sistema de produção,
nenhuma medida isolada é viável, estável, efetiva, sustentável e econômica no
controle da alternariose das brássicas, sendo indispensável a adoção de práticas
integradas para o manejo efetivo da doença. Estas incluem plantio de sementes
sadias, plantio de cultivares híbridos tolerantes, rotação de culturas, redução do
estresse das plantas pela correta adubação e irrigação, além da aplicação de
fungicidas (TÖFOLI & DOMINGUES, 2004).
47
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Obtenção das amostras de Curvularia inaequalis Shear (Boedijn)
As cepas do fungo Curvularia inaequalis foram fornecidas pelo Departamento
de Biologia da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) a partir do projeto
PPBIO (Programa de Pesquisa em Biodiversidade). Após a obtenção das culturas,
estas foram repicadas em placas de Petri com capacidade para 20 mL, contendo
meio de cultura Agar batata dextrose (BDA). Após esse procedimento, as culturas
em placa foram incubadas em estufa BOD a 25°C durante 3 dias. Após crescimento
micelial adequado, as culturas foram mantidas sob refrigeração, a 4°C, até o
momento das análises.
4.2. Obtenção da enzima nitrato redutase utilizando Curvularia inaequalis
Para a obtenção da enzima nitrato redutase, o fungo Curvularia inaequalis foi
cultivado em erlenmeyers com capacidade para 250 mL, contendo 100 mL de meio
de cultura BD caldo (batata dextrose) em cada um. Foram confeccionados
manualmente discos de micélio, a partir de culturas de C. inaequalis em placas,
utilizando um vazador previamente esterilizado. Após esse procedimento, seis
discos de micélio foram adicionados em cada erlenmeyer com meio de cultura BD
caldo. Todo o procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar sob condições
assépticas. Em seguida, os erlenmeyrs foram incubados em estufa a 25°C, sob
rotação constante, a 120 rpm durante 48 horas. Decorrido o tempo de incubação, a
biomassa micelial resultante (10 g) foi separada por filtração e lavada com água
destilada estéril para remover os vestígios de componentes de meio de cultura. Em
seguida, a biomassa micelial foi suspensa em 100 mL de água destilada estéril e
incubada em estufa a 25°C, sob rotação constante, a 120 rpm. Foram determinados
dois tempos de incubação, a fim de se explorar a influência da enzima nitrato
redutase no tamanho das nanopartículas produzidas. Dessa forma, um grupo de
amostras permaneceu em incubação durante 24h e outro grupo durante 72h.
Decorrido esse tempo, as suspensões foram filtradas utilizando papel de filtro
Whatman n. 42. (GAJBHIYE et al., 2009).
48
A massa micelial foi descartada, sendo aproveitado apenas o filtrado (solução
aquosa), onde a enzima nitrato redutase se encontrava dispersa
4.3. Obtenção das nanopartículas de prata (AgNPs) utilizando Curvularia
inaequalis como agente de redução
O nitrato de prata (AgNO3) a ser reduzido foi obtido através da empresa
Aldrich (EUA). A obtenção de nanopartículas de prata foi estabelecida realizando a
dispersão do nitrato de prata com uma concentração predefinida de nitrato redutase
em solução aquosa. O nitrato de prata (nas concentrações de 5mM e 100 mM) foi
introduzido nos filtrados que foram obtidos através do procedimento anterior. Nesse
sentido, um grupo de amostras teve a concentração de 5mM de nitrato de prata
adicionada aos filtrados, enquanto outro grupo de amostras teve a concentração de
100mM adicionada. As amostras foram incubadas por mais 24 ou 72 horas em
estufa, à temperatura ambiente, sob rotação de 90 rpm, para que a reação celular
pudesse ocorrer, promovendo a redução de nitrato de prata em nanopartículas de
prata (AgNPs). O procedimento pôde ser observado visualmente, pela ocorrência de
mudança na coloração do meio aquoso de transparente (antes da reação com
nitrato de prata) para amarelado (após a reação com nitrato de prata) (GAJBHIYE et
al., 2009).
4.4. Planejamento fatorial aplicado na preparação de nanopartículas de prata
O planejamento fatorial (ou projeto fatorial) é uma importante ferramenta
aplicada no estudo de sistemas com variáveis múltiplas. A minimização do número
de experimentos em comparação com sistemas de variáveis múltiplas é obtida com
a definição de dois níveis diferentes (máximo e mínimo) e com o cálculo da
importância relativa, obtido pelo contraste de médias (CARVALHO et al, 2010;
OLIVIER et al, 2007; DE OLIVEIRA et al, 2005). Utilizando este conceito, a utilização
de dois níveis diferentes aplicados a três diferentes parâmetros de preparação
(Parâmetro A: concentração de nitrato redutase; Parâmetro B: tempo de reação; e
Parâmetro C: concentração de nitrato de prata) pode ser explorada, a fim de otimizar
a síntese de nanopartículas de prata. Considerando as diferentes possibilidades de
combinação entre os diferentes parâmetros (combinação variada de mínimos e
49
máximos de cada parâmetro), oito amostras diferentes puderam ser obtidas,
conforme ilustra a Tabela 3.
Tabela 3 - Combinação de parâmetros aplicada no estudo quimiométrico.
Amostra
Parâmetro A
(Produção de nitrato
redutase)
Parâmetro B
(Tempo de reação)
Parâmetro C
(Concentração de
Nitrato de Prata)
I 24h (-) 24h (-) 5mM (-)
C 24h (-) 24h (-) 100 mM (+)
B 24h (-) 72h (+) 5mM (-)
A 72h (+) 24h (-) 5mM (-)
BC 24h (-) 72h (+) 100 mM (+)
AC 72h (+) 24h (-) 100 mM (+)
AB 72h (+) 72h (+) 5mM (-)
ABC 72h (+) 72h (+) 100 mM (+)
Para compreender melhor como o processo de preparação afeta o tamanho e
a concentração relativa das partículas sintetizadas, delineou-se um desenho fatorial
em que a resposta (absorbância no UV-Vis e Potencial Zeta) foi analisada em
termos de três parâmetros diferentes e sua variação. A absorbância na região do
UV-vis representa um parâmetro importante na medição da eficiência da síntese de
nanopartículas de prata, que exibem forte absorção de luz devido à ressonância de
plasmon de superfície (pico SPR) (BASAVARAJA et al., 2008). Por sua vez, a
magnitude do potencial zeta pode indicar o potencial de estabilidade da dispersão
coloidal. Grandes valores negativos ou positivos de potencial zeta indicam elevado
nível de estabilidade sem tendência para floculação. Através da utilização de ambas
as técnicas de medição, a importância relativa dos efeitos principais (A, B, C) ou
efeitos de interação (AB, AC e BC) pode ser calculada. Por exemplo, a importância
relativa do parâmetro A, a partir da medida de absorbância, assume um valor
positivo e contribui com a elevação na absorbância das amostras resultantes, como
ilustra a Equação 1.
(1) Importância do fator A = [ ¼ (fa+ fab+ fac+ fabc)- ¼(fi+ fb+ fc+ fbc)]
50
Onde, fab representa a resposta (absorbância ou potencial zeta) da amostra AB,
como foi definido anteriormente na Tabela 3.
4.5. Caracterização as amostras
4.5.1. Absorbância
A absorbância das amostras foi medida utilizando um espectrofotômetro de
Ultravioleta-Visível Hach DR5000.
Faixa de Leitura: 190-1100 nm
Banda de passagem: 2 nm
Precisão de comprimento de onda: +/- 1,0 nm
Resolução de comprimento de onda: 0,1 nm
4.5.2. Tamanho das partículas e potencial zeta
O tamanho das partículas e o potencial zeta foram medidos usando um
espectrofotômetro Zeta Sizer Malvern (Nano ZS90), sendo calculados usando
medidas de mobilidade eletroforética.
4.5.3. Obtenção de imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As imagens de MEV foram obtidas utilizando um Microscópio Eletrônico de
Varredura Hitachi TM1000. É um equipamento capaz de produzir imagens de alta
resolução (30 nm) e alta magnificação (aplicação) de até 10.000X. Possui detector
de elétrons retroespalhados (BSE) e tem profundidade de foco de 0.5 mm.
4.6. Isolamento do fungo Alternaria brassicicola
Plantas de couve saudáveis foram inoculadas com uma suspensão de
esporos a 1x106 esporos/mL de Alternaria brassicicola, para posteriormente realizar-
se o isolamento do fungo. As plantas inoculadas foram submetidas à câmara úmida,
51
onde permaneceram durante 48h. Esse procedimento auxilia a penetração do fungo
fitopatogênico na planta hospedeira, facilitando o surgimento da doença. Decorrido
este tempo, foram escolhidas as folhas que apresentaram lesões características de
alternariose. O processo de isolamento foi baseado na metodologia descrita por
ALFENAS et al. (2007) onde, inicialmente, foi feita a limpeza superficial das folhas
com água e detergente. Após a lavagem, as folhas foram colocadas em papel filtro
esterilizado para secar. Depois de secas, foram retirados das folhas fragmentos
tissulares das margens das lesões utilizando uma lâmina previamente flambada.
Estes fragmentos foram então transferidos para uma solução de álcool 70%, onde
permaneceram por 60 segundos. O álcool funciona como desinfestante e também
reduz a tensão superficial do tecido foliar, facilitando a ação da solução
desinfestante. Passado este tempo, os fragmentos foram transferidos para uma
solução de hipoclorito de sódio com 0,1% de Cl2, onde ficaram por 60 segundos.
Esse tempo é considerado suficiente para eliminar os organismos saprófitas da
superfície das folhas. Após esse processo, os fragmentos foram transferidos para
papel filtro esterilizado para remover o excesso de Cl2 e, em seguida, quatro
fragmentos foram adicionados em cada placa de Petri com meio de cultura BDA
(Agar batata dextrose). Todo o procedimento foi realizado em capela de fluxo
laminar sob condições assépticas. Em seguida, as placas foram incubadas a 25ºC
em estufa BOD até o crescimento do fungo. Depois de iniciado o crescimento do
mesmo, este foi repicado para outras placas de Petri com meio de cultura BDA, a fim
de se obter culturas isoladas.
4.7. Atividade antibacteriana de nanopartículas de prata (AgNPs)
A ação das nanopartículas de prata biossintetizadas contra bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas foi avaliada utilizando a técnica de microdiluição em
caldo, de acordo com metodologia proposta por CLSI (2006). Nesse sentido, foi feita
a inoculação de 1x104 UFC ml-1 (unidades formadoras de colônias) em placa de
microcultivo utilizando como tratamentos as diluições 1/8, 1/16,
1/32, 1/64,
1/128 e 1/256 das
nanopartículas biossintetizadas (medição relacionada às concentrações de 5mM e
100mM de nitrato de prata). As amostras foram incubadas a 37°C por 24h. A
concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada utilizando-se cloreto de 2,3,5-
52
trifeniltetrazol (TTC), recomendado para detecção de crescimento microbiano. As
medidas da concentração bactericida mínima (CBM) foram realizadas por meio de
inoculação em diluições sucessivas em tubos de ensaio. Como resultado, uma leve
turbidez foi observada no caldo. Em seguida, as amostras que não apresentaram
turvação foram inoculadas em Agar Mueller-Hinton e incubadas a 37°C durante 24 h,
para detecção da concentração bactericida mínima. As cepas de referência padrão
incluídos neste estudo estão ilustradas na tabela 4.
Tabela 4 - Cepas de referência padrão utilizadas nos testes de sensibilidade.
Escherichia coli ATCC 25922
E. coli ATCC 35218
Klebsiella pneumoniae ATCC 1388
Bacillus cereus 11778
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Staphylococcus spp. resistente à meticilina - MRSA (n=1)
Staphylococcus spp. não produtora de biofilme (n=2)
4.8. Teste de Avaliação do crescimento micelial de Alternaria brassicicola
Para a avaliação do crescimento micelial de Alternaria brassicicola, foram
utilizadas as nanopartículas sintetizadas pelo fungo Curvularia inaequalis Shear
(Boedijn) em diferentes diluições em meio de cultura BDA (Agar batata dextrose),
onde cada concentração correspondeu a um tratamento. A tabela 5 ilustra todas as
diluições utilizadas no experimento:
53
Tabela 5 - Concentrações de nanopartículas de prata utilizadas para o teste de ação direta sobre o
fungo Alternaria brassicicola.
Tratamentos Concentração
Controle
BDA puro
T1
1/8
T2
1/16
T3
1/32
T4
1/64
T5
1/128
T6
1/256
Obtidas as diluições, as mesmas foram distribuídas em placas de Petri com
capacidade para 20 ml. Para cada tratamento foram utilizadas cinco repetições.
Após a solidificação do meio de cultura BDA acrescido da concentração
correspondente de nanopartículas de prata, foi feito o repique do fungo Alternaria
brassicicola. Foram confeccionados manualmente discos de micélio, utilizando um
vazador previamente esterilizado. Em cada placa de Petri foi adicionado, no centro,
um disco do micélio de A. brassicicola. Todo o processo foi realizado em capela de
fluxo laminar em condições assépticas. Em seguida, as placas foram incubadas em
estufa BOD a 25oC. As avaliações tiveram início após 24h de incubação. Ao todo,
foram realizadas 10 avaliações, uma a cada 24h. As medidas de crescimento
micelial foram mensuradas com auxílio de um paquímetro.
4.9. Teste de Ação Direta das nanopartículas de prata sobre o fungo
Alternaria brassicicola
Para a avaliação do efeito de ação direta das nanopartículas de prata
biossintetizadas por Curvularia inaequalis Shear (Boedijn) sobre o fungo Alternaria
brassicicola, foi empregado o teste de inibição de germinação de esporos, de acordo
com metodologia adotada por BONALDO et al. (2004), adaptada. Para tanto, foram
utilizados 100 μL da suspensão de esporos (1x106 esporos/mL) de Alternaria
brassicicola + 100 μL de cada concentração de nanopartículas produzidas diluídas
em meio de cultura BD caldo (Tabela 5). Estas alíquotas foram então adicionadas
nos recipientes de uma placa de microcultivo, com 96 cavidades, como ilustra a
54
figura 11. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com sete
tratamentos em oito repetições. No tratamento controle foi utilizado meio de cultura
BD puro, sem adição de nanopartículas de prata. As placas foram incubadas em
estufa BOD durante 20h, sob luz constante e temperatura de 25ºC. Ao término
desse tempo, deu-se início às avaliações. Estas foram realizadas em microscópio
óptico, com aumento de 40x. Todos os esporos germinados contidos em todos os
campos (A, B e C) da câmara de Neubauer (Figura 12) foram contados, obtendo-se
com isso a quantidade de esporos germinados em cada repetição/tratamento que,
em seguida, foi comparada ao controle. A câmara de Neubauer consiste de uma
lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina normal, com marcações
em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio, percebe-se
que existem três tipos de quadrantes, denominados A, B e C que, juntos, formam um
quadrado maior. Para a contagem de esporos, foram considerados como
germinados aqueles que apresentaram tubo germinativo de tamanho igual ou
superior ao tamanho do esporo.
Figura 11 - Esquema do teste de ação direta utilizando placa de microcultivo. As colunas da placa
(em azul) representam os tratamentos utilizados e as linhas representam as repetições.
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
C T1 T2 T3 T4 T5 T6
55
Figura 12 - Ilustração de todos os campos (A, B e C) da câmara de Neubauer.
4.10. Análise estatística
Todos os dados obtidos foram submetidos ao teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização das amostras obtidas pela combinação dos parâmetros
de preparação de nanopartículas de prata (A, B e C).
O espectro de absorção na região de UV-vis das nanopartículas de prata (WU
et al., 2000), como ilustrado na Figura 13, indica que o pico SPR é máximo para a
amostra AB (concentração máxima de nitrato redutase, concentração mínima de
nitrato de prata e tempo de reação máximo) (Tabela 3), enquanto que o pico mais
fraco foi obtido para a amostra AC ( concentrações máximas de nitrato redutase e
nitrato de prata). Neste caso, a formação de grandes agregados de nanopartículas
de prata é verificada na solução. Este fato é um forte impedimento para a síntese de
sistemas coloidais com razoável estabilidade (WU et al., 2000).
Comprimento de onda (nm)
Figura 13 - Espectro de UV-vis da dispersão coloidal de nanopartículas de prata em solução aquosa.
O processo de formação de nanopartículas de prata pode ser identificado
visualmente, tal como ilustrado na Figura 14: uma imagem de dois erlenmeyers
contendo uma solução antes e depois da síntese de nanopartículas de prata. Este
Absorbância
57
processo é detectado pela mudança de cor da solução, que de incolor passa para
uma coloração amarelada (YAHYAEI et al., 2013;. ALANI et al., 2012).
Figura 14 - Produção de nitrato redutase antes (esquerda) e depois (direita) da reação completa com
nitrato de prata (Foto: Noelly Bastos Cavalcante)
5.2. Cálculos da importância relativa dos parâmetros isolados e combinados
para o pico SPR e Potencial Zeta
Com base no valor obtido para o pico SPR de cada amostra (Figura 13), foi
possível analisar a importância relativa dos parâmetros isolados e combinados na
absorbância da solução coloidal e, consequentemente, sobre a eficiência da síntese.
Os resultados da importância relativa do pico SPR, como mostrado na Figura
15, indicam que o parâmetro B (tempo de reação em relação à interação de nitrato
de prata com o filtrado do fungo) representa o parâmetro mais importante na
otimização do pico SPR, seguido da interação dos parâmetros A e B (AB) e
parâmetro A, respectivamente. Por outro lado, o parâmetro C (concentração de
nitrato de prata) apresenta influência negativa sobre o pico SPR. A contribuição
negativa para o pico SPR é verificada também para os parâmetros C, AC, BC e
ABC, em um forte indício de que a elevação da concentração de nitrato de prata
induz o crescimento desordenado de grandes agregados, como pôde ser detectado
58
visualmente com a precipitação das partículas. Com base nessas informações, é
possível verificar se a concentração mínima de nitrato de prata (5mM) representa a
condição adequada para regular o crescimento de nanopartículas de prata em
função do tempo.
Figura 15 - Importância relativa dos parâmetros de preparação no pico de absorção SPR
A importância relativa dos parâmetros medidos pelo potencial zeta (Figura 16) indica
que, se isolados, os parâmetros B e C tendem a diminuir o potencial zeta e,
consequentemente, a estabilidade da dispersão coloidal. Apesar deste resultado,
pôde-se observar que a interação dos parâmetros A e C tende a aumentar o valor de
potencial zeta, proporcionando estabilidade para a dispersão coloidal durante alguns
dias. É uma indicação de que a alta concentração de nitrato de prata é compensada
pela alta concentração de nitrato redutase, promovendo a dispersão estável das
nanopartículas em solução.
Importância relativa
59
Figura 16 - Importância relativa dos parâmetros de preparação sobre o potencial zeta das partículas.
O parâmetro de importância relativa de influência mais negativa é a
concentração de nitrato de prata (variável C), de acordo com o resultado anterior de
absorbância, indicando que o crescimento desordenado de partículas com baixo
potencial zeta influencia na formação progressiva de precipitados. Com base nos
resultados anteriores, explorou-se a cinética de crescimento das nanopartículas de
prata utilizando o sistema mais promissor para definir a condição mais adequada
para a biossíntese de nanopartículas de prata. Como alternativa para o
procedimento padrão de medição da cinética de base na absorção da luz
(YAHAYAEI et al, 2013;. ALANI et al., 2012), explorou-se a cinética em termos de
tamanho de partículas sintetizadas, a fim de correlacionar a atividade antimicrobiana
com a dimensão das partículas sintetizadas.
5.3. Cinética de formação de nanopartículas de prata
A cinética de formação de nanopartículas foi analisada através da medição do
tamanho das partículas dispersas em solução aquosa em função do tempo de
reação. Os resultados demonstrados na Figura 17 indicam que com a baixa
Importância relativa
60
concentração de nitrato redutase a formação de nanopartículas é estabelecida após
algumas horas e a saturação do tamanho das partículas pode ser verificada.
Levando-se em consideração a alta concentração de nitrato redutase
(conforme estabelecido na Tabela 3) após 100 h de reação, observa-se que ocorreu
na amostra uma distribuição de grandes agregados e partículas com diâmetro na
ordem das centenas de nanômetros, conforme ilustrado na Figura 18. O EDX
(Energia de Dispersão de Raios X) da amostra indica que a prata representa 100%
das partículas sintetizadas, como o esperado.
Tempo (horas)
Figura 17 - Cinética de crescimento das partículas em função da concentração de nitrato redutase.
Tamanho das partículas (nm)
61
Figura 18 - Partículas de prata após 100 h de síntese (elevada concentração de nitrato redutase -
lado esquerdo e baixa concentração de redutase - lado direito).
Portanto, de acordo com os resultados obtidos nas etapas anteriores, a baixa
concentração de nitrato redutase (24h de incubação) numa reação com 5mM de
nitrato de prata durante 60h é a condição mais adequada para a produção de
nanopartículas de prata. Usando este parâmetro otimizado, analisou-se a atividade
antimicrobiana destas nanopartículas de prata.
5.4. Atividade antibacteriana de nanopartículas de prata sintetizadas por
Curvularia inaequalis (Shear) Boedijn
Embora a sensibilidade antimicrobiana dos microrganismos tenha sido
descrita como dose-dependente (GHOSH et al., 2012; HOMOLA et al. , 1999. ), os
resultados obtidos no presente estudo comprovam que as nanopartículas de prata
foram eficazes até a diluição de 1/256 em Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. A
exceção foi verificada em E. coli ATCC 25922. Em bactérias Gram-negativas, a
resistência à prata pode ser explicada devido à existência de mecanismos de efluxo,
codificados pelo gene sil. Sua presença foi relatada na família Enterobacteriaceae e
na espécie Pseudomonas aeruginosa (SUTTERLIN et al., 2012). A sensibilidade das
bactérias Gram-negativas foi mais elevada do que para as bactérias Gram-positivas
utilizadas neste estudo. Diversos autores relatam (SUTTERLIN et al., 2012;
ANTONY et al., 2011; MOHANTY et al., 2011) que a maior sensibilidade das
bactérias Gram-negativas está associada à estrutura da parede celular, que permite
62
uma maior interação com os compostos de prata. De acordo com Ghosh et al.
(2012), as nanopartículas de prata produzidas por Dioscorea bulbifera foram mais
eficazes contra E. coli e Pseudomonas aeruginosa, se comparadas com Salmonella
typhi, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. De acordo com Mohanty et al.
(2011), as nanopartículas de prata foram mais eficazes do que o próprio AgNO3
contra patógenos de interesse médico, tais como S. aureus. Diferença insignificante
foi observada quando isolados de Staphylococcus spp. produtores e não produtores
de biofilme foram comparados. No entanto, as nanopartículas de prata estão
associadas à regulação negativa de formação de biofilme (MOHANTY et al., 2011).
As nanopartículas de prata demonstram atividade antimicrobiana contra MRSA
(RICCO et al., 2012; BRANDT et al., 2011), como também foi descrito no presente
estudo. Em bactérias Gram-positivas, o efeito das nanopartículas de prata pode
estar associado à fragmentação da parede de peptideoglicano (MIRZAJANI et al.,
2011). A atividade antimicrobiana das nanopartículas de prata é resumida na Tabela
6.
Tabela 6 - Atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata sobre bactérias gram-negativas e
gram-positivas.
Microrganismos isolados
Redutase (-) Redutase (+)
MIC CBM MIC CBM
Diluições em série em relação a 5mM de AgNO3
Escherichia coli ATCC 25922 1/16 1/8 1/16 1/8
E. coli ATCC 35218 1/256 1/256 1/256 1/256
Klebsiella pneumoniae ATCC 1388 1/128 1/64 1/256 1/128
Bacillus cereus ATCC 11778 1/16 1/16 1/16 1/16
Staphylococcus aureus ATCC 6538 1/16 1/8 1/16 1/16
S. epidermidis ATCC 12228 1/32 1/16 1/16 1/16
S. aureus MRSA 1/64 1/64 1/64 1/16
Staphylococcus spp.118 1/16 1/16 1/16 1/16
Staphylococcus spp. 131 1/16 1/16 1/32 1/16
63
5.5. Avaliação do crescimento micelial de Alternaria brassicicola
A análise da evolução do crescimento micelial de Alternaria brassicicola em
contato com as diferentes concentrações de nanopartículas de prata (Tabela 5),
como indica a figura 19, demonstra que, após o décimo dia de avaliação, houve o
efeito direto das concentrações de nanopartículas de prata na evolução do
crescimento micelial das colônias. Estes dados sugerem que, quanto maior a
concentração de nanopartículas de prata, mais reduzido será o crescimento micelial.
A testemunha (concentração 0) obteve a maior média de crescimento no decorrer
dos dias, como o esperado. Não houve evolução significativa no crescimento
micelial das amostras submetidas às diluições de 1/8 (0,12500) a 1/64 (0,01563) ao
longo dos dez dias de avaliação.
Figura 19 - Crescimento micelial de Alternaria brassicicola após o 10° dia de avaliação nas diferentes
concentrações de nanopartículas de prata.
De acordo com LEE et al. (2013), o fato de a maior parte dos fungos ter
desenvolvido resistência aos fungicidas utilizados tradicionalmente, faz com que as
medidas de controle em estudo atualmente estejam concentradas principalmente na
prevenção de plantas não infectadas. Dessa maneira, a aplicação de nanopartículas
de prata para controlar doenças de plantas emerge como uma alternativa
1/8 1/16 0 1/128 1/256
1/64
1/32 (mL)
64
interessante, uma vez que as AgNPs possuem um grande potencial antifúngico,
sendo altamente tóxicas para a maioria dos fungos, incluindo Alternaria brassicicola.
No estudo realizado por estes pesquisadores, a atividade antifúngica das
AgNPs sintetizadas biologicamente foi altamente eficiente. O crescimento médio do
diâmetro das colônias do fitopatógeno Colletotrichum coccodes, em centímetros, foi
inibido entre 49,4% e 87,1% no 7° dia de avaliação. Da mesma forma, nos
fitopatógenos Monilinia sp. e Pyricularia sp., a taxa de redução do crescimento
micelial variou entre 43,5% e 86,5% e entre 37,6% e 83,5%, respectivamente, de
acordo com o aumento na concentração de AgNPs. Os nossos dados corroboram
com estes resultados, demonstrando que nanopartículas sintetizadas biologicamente
têm uma atividade antifúngica significativa, sugerindo a possibilidade de utilizá-las
no controle de fungos fitopatogênicos.
Em estudo realizado por KIM et al. (2012), a atividade antifúngica de
nanopartículas de prata foi testada contra 18 espécies de fungos fitopatogênicos,
causadores de doenças em diversos tipos de cultura. Foram utilizadas as
concentrações de 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm e 100 ppm diluídas em meios de cultura
BDA (Ágar batata dextrose), EMA (Ágar extrato de malte) e CMA (Ágar cenoura e
milho). Realizando o teste de crescimento micelial, concluiu-se que, na maioria dos
casos, a maior taxa de inibição deve-se à concentração de 100 ppm. Além disso, a
maioria dos fungos demonstrou inibição do crescimento micelial com o aumento do
tempo de incubação. Inibição máxima foi observada no meio de cultura BDA com a
concentração de 100ppm de nanopartículas de prata contra as espécies Alternaria
solani, Cylindrocarpon destructans, Fusarium sp., Pythium aphanidermatum e
Pythium spinosum.
Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que as nanopartículas de prata
são altamente capazes de inibir o fitopatógeno Alternaria brassicicola. É importante
salientar que, de acordo com KIM et al. (2012), a taxa de inibição varia de acordo
com a concentração e o tipo de nanopartículas de prata utilizadas contra os
fitopatógenos. Além disso, o estudo indica que um maior grau de inibição é
observado em meio de cultura BDA, se comparado a outros meios de cultura.
Nossos resultados foram semelhantes, havendo variação nas taxas de inibição do
fungo A. brassicicola em função da concentração de nanopartículas de prata.
Quanto maior a concentração de nanopartículas de prata no meio BDA, menor foi o
diâmetro de suas colônias, demonstrando a sua eficácia contra A. brassicicola.
65
A figura 20 faz uma comparação entre as duas concentrações mais baixas de
nanopartículas de prata utilizadas neste experimento (Tabela 5) a partir do 6° dia de
avaliação, finalizando no 10° dia. Os dados demonstram que houve evolução no
crescimento micelial de A. brassicicola em ambas as concentrações ao longo dos
dez dias de avaliação, o que não ocorreu com as demais. É possível observar que a
maior evolução no crescimento micelial das amostras corresponde à diluição 1/256,
onde o crescimento médio diário no diâmetro das colônias foi de 0,8 cm. Por sua
vez, na diluição 1/128, o crescimento médio diário no diâmetro das colônias foi de 0,5
cm. Este dado indica mais uma vez que quanto maior a concentração de
nanopartículas de prata, maior será a eficácia de sua atividade antifúngica.
Dias
Figura 20 - Crescimento micelial nos dois tratamentos com doses mais baixas de nanopartículas de
prata: 1/128 e 1/256 (Início: 6° dia de avaliação - Término: 10° dia de avaliação)
Em 2009, Gajbhiye e colaboradores utilizaram nanopartículas de prata
biossintetizadas pelo fungo Alternaria alternata em combinação com o fluconazol,
um fármaco com atividade antifúngica. O objetivo principal foi o controle dos fungos
patogênicos Phoma glomerata, Phoma herbarum, Fusarium semitectum,
Trichoderma sp. e Candida albicans. Com isso, foi observado que a atividade do
fluconazol foi aumentada quando em combinação com as nanopartículas de prata,
obtendo efeito máximo de inibição contra C. albicans, seguido por P. glomerata e
Trichoderma sp. KIM et al. (2008) relatam que um dos principais mecanismos de
ação das nanopartículas é a sua interação com a membrana celular fúngica,
Crescimento
micelial (cm)
66
causando desarranjos em suas funções principais, o que justifica sua alta eficiência
contra esses microrganismos. Além disso, estudos indicam que um importante
mecanismo de ação inibitória dos íons prata é o ataque ao DNA. Quando em contato
com Ag+, o mesmo perde a capacidade de se replicar, impedindo assim a divisão
celular (FENG et al, 2000).
5.6.Teste de ação direta
O teste de ação direta foi realizado com o objetivo de avaliar a eficiência das
nanopartículas de prata biossintetizadas pelo fungo Curvularia inaequalis na redução
da germinação de esporos do fungo Alternaria brassicicola. A figura 21 indica a
redução em percentual de germinação dos esporos em relação ao aumento das
concentrações de nanopartículas de prata (Tabela 3) em comparação à testemunha,
onde não houve adição de nanopartículas. É possível observar que a maior taxa de
redução de germinação de esporos (1.513%) corresponde à diluição 1/8, como o
esperado. A segunda maior taxa de redução corresponde à diluição 1/16, 718%,
seguida das diluições 1/32 e 1/64, com taxas de redução de 524% e 376%,
respectivamente. Os resultados demonstram que, de forma semelhante ao teste de
crescimento micelial, quanto maior a concentração de nanopartículas de prata em
contato com os esporos, maior a taxa de redução na germinação dos mesmos.
Figura 21 - Percentual de redução de germinação dos esporos de Alternaria brassicicola em
função do aumento da concentração de nanopartículas de prata.
(mL)
67
Segundo MIN et al. (2009), pouco se sabe sobre o efeito de nanopartículas de
prata em fungos fitopatogênicos, pois muitos estudos focaram em atividade
antibacteriana e atividade antiviral contra patógenos de animais. No trabalho
desenvolvido por estes pesquisadores, foi avaliada a atividade antifúngica de
nanopartículas de prata contra os fitopatógenos Rhizoctonia solani, Sclerotinia
sclerotiorum e S. minor. Como resultado, foi observado que as nanopartículas de
prata inibiram fortemente o crescimento micelial dos fungos em teste de crescimento
micelial em placas de Petri e também foram muito eficientes na inibição da
germinação de escleródios. Estudo realizado por Morones et al. (2005) relata que as
nanopartículas de prata podem interromper os sistemas de transporte na célula,
incluindo o efluxo de íons. Esta disfunção no efluxo de íons pode causar rápida
acumulação dos íons de prata, que interrompem os processos celulares mesmo em
baixas concentrações (SAMUEL & GUGGENBICHLER, 2004), tais como o
metabolismo e a respiração. Além disso, os íons de prata são conhecidos por
produzirem espécies reativas de oxigênio através de sua reação com o oxigênio.
Estas moléculas são prejudiciais para as células, causando danos nos ácidos
nucléicos, inclusive. Em trabalho realizado por Woo et al. (2009), objetivando avaliar
a eficácia de nanopartículas de prata no controle do fitopatógeno Raffaelea sp., foi
relatado que o crescimento desse fungo na presença de nanopartículas de prata foi
inibido significativamente, sendo a concentração de 25 ppm a mais eficiente no teste
de crescimento micelial. Todos os trabalhos citados demonstram a eficiência das
nanopartículas de prata no controle de diversas espécies de fungos, o que confirma
a eficiência de sua atividade antifúngica.
Durante as últimas duas décadas, a utilização de plantas, bactérias, fungos e
algas na síntese de nanopartículas de prata têm sido bem investigadas. Os fungos,
em especial, têm um enorme potencial para a produção de nanopartículas de prata.
No entanto, pesquisas ainda precisam ser cada vez mais aprimoradas. A utilização
de nanopartículas de prata na agricultura minimizando riscos e resíduos para a
saúde e para o meio ambiente será essencial para o desenvolvimento de novos
produtos sustentáveis e economicamente viáveis. Trabalhos futuros deverão
continuar desenvolvendo experimentos que incluem o desenvolvimento de
nanopartículas de prata, com tamanho e forma bem definidos. Uma melhor
compreensão dos mecanismos de biossíntese da prata promoverá um bom
desenvolvimento em termos de produção e utilização das nanopartículas na
68
agricultura em escala comercial, principalmente no controle de doenças de plantas
(SAHAYARAJ & RAJESH, 2011).
69
6. CONCLUSÕES
O resultado do planejamento fatorial 23 realizado no presente estudo indica
que a elevação da concentração de nitrato de prata (AgNO3) minimiza a estabilidade
de dispersão coloidal, provocando a agregação das nanopartículas e subsequente
formação de grandes precipitados. Por outro lado, o aumento na concentração de
nitrato redutase contribui com a redução na cinética de formação das nanopartículas
de prata. Essas informações foram fundamentais para a otimização dos parâmetros
utilizados na síntese de nanopartículas de prata.
Na avaliação da atividade antibacteriana para controle in vitro de bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas, as nanopartículas de prata produzidas pelo fungo
Curvularia inaequalis apresentaram maior atividade contra Escherichia coli e
Klebsiella pneumoniae.
No presente estudo também foi avaliada a atividade antifúngica de
nanopartículas de prata produzidas pelo fungo Curvularia inaequalis para controle in
vitro do fitopatógeno Alternaria brassicicola. Nossos dados demonstram de forma
clara que as nanopartículas de prata são capazes de inibir significativamente o
crescimento e o desenvolvimento do fungo fitopatogênico e de seus esporos,
através da realização do teste de crescimento micelial e do teste de ação direta. A
eficácia da atividade antifúngica pôde ser detectada até a concentração 1/64. Nossos
resultados sugerem a possibilidade de utilização de nanopartículas de prata
biossintetizadas no controle desse fitopatógeno, como uma alternativa para
colaborar na redução do uso de agroquímicos com elevada toxicidade.
70
7. REFERÊNCIAS
ALANI, F.; MOO-YOUNG, M.; ANDERSON, W. 2012. Biosynthesis of silver nanoparticles by a new strain of Streptomyces sp. compared with Aspergillusfumigatus. World J. Microb. Biotech. 28 (3):1081-1086. ALFENAS, A. C.; FERREIRA, F. A.; MAFIA, R. G.; GONÇALVES, R. C. 2007. Isolamento de fungos fitopatogênicos. In: ALFENAS, A. C.; MAFIA, R. G. (Eds.). Métodos em fitopatologia, Viçosa: Ed. UFV, p. 53-90. ANTONY, J. J.; SIVLINGAM, P.; SIVA, D.; KAMALAKKANNAN, S.; ANABARASU, K.; SUKIRTHA, R.; KRISHNAN, M.; ACHIRAMAN, S. 2011. Comparative evaluation of antibacterial activity of silver nanoparticles synthesized using Rhisophora apiculata and glucose. Coll. Surf. B 88:134-140. AZEVEDO, S. S.; MARIANO, R. L. R.; MICHEREFF, S. J. 2000. Levantamento da intensidade da podridão negra e da alternariose do repolho no Agreste de Pernambuco e determinação do tamanho das amostras para quantificação dessas doenças. Summa Phytopathologica, Jaboticabal, v. 26, n. 3, p. 299-306. BASAVARAJA, S.; BALAJI, S. D.; LAGASHETTY, A.; RAJASAB, A. H.; VENKATARAMAN, A. 2008. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium semitectum. Mat. Res. Bull. 43(5):1164-1170. BERNI, E; RIBEIRO, C; ZUCOLOTTO, V. 2008. Síntese de Nanopartículas de Prata para Aplicação na Sanitização de Embalagens. Embrapa Instrumentação Agropecuária - Comunicado Técnico, 4p. São Carlos, SP. BONALDO, S. M.; SCHWAN-ESTRADA, K. R. F.; STANGARLIN, J. R.; TESSMANN, D. J.; SCAPIM, C. A. 2004. Fungitoxicidade, atividade elicitor de fitoalexinas e proteção de pepino contra Colletotrichum lagenarium, pelo extrato aquoso de Eucalyptus citriodora. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 29, n.2, p.128-134. BRANDT, O.; MILDNER, M.; EGGER, A. E.; GROESSEL, M.; RIX, U.; POSCH, M.; KEPPLER, B. K.; STRUPP, C.; MUELLER, B.; STINGL, G. 2011. Nanoscalic silver possesses broad-spectrum antimicrobial activities and exhibits fewer toxicological side effects than siver sulfadiazine. Nanomed.: Nanotechnol. Biol. Med. In press. BUZEA, C.; BLANDINO, I. I. P.; ROBBIE, K. 2007. Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity. Biointerphases, vol. 2, issue 4, pages MR17 - MR172. BUTTON, S. T. 2001. Metodologia para planejamento experimental e análise de resultado. São Paulo-SP. Universidade Estadual de Campinas. CARTER, E. & BOUDREAUX, C. 2004.Fatal cerebral phaeohyphomycosis due to Curvularia lunata in an imunocompetent patient. J. Clin. Microbiol. 42: 5419-5423. CARVALHO, R. H. R.; CONCEIÇÃO, M. M.; SOUZA, A. G.; SOUZA, E. M. B. D. 2010. Application of factorial planning and response surface methodology in the
71
production of biodiesel from cottonseed oil (Gossipium hisutum L.). Braz. J. Petroleum Gas 4(3):103-109. CASANOVA, M. C. R. 2010. Síntese, caracterização e estudo da estabilidade de nanopartículas metálicas estabilizadas com polieletrólitos e tiois. Dissertação de mestrado. Instituto de Química de São Carlos. São Paulo-SP. 87p. CREIGHTON, J. A. & EADON, D. G. 1991. Ultraviolet-visible absorption spectra of the colloidal metallic elements. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions, pp. 3881 - 3891. DAS, R.; NATH, S. S.; CHAKDAR, D.; GOPE, G.; BHATTACHARJEE, S. 2009. Preparation of Silver Nanoparticles and Their Characterization. Disponível em: www. azonano.com/article.aspx?ArticleID=2318. Acesso em: 27 Jan. 2014. DASTJERDI, R.et al. 2009. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, v. 345, p. 202–210. DE OLIVEIRA, H. P.; TENORIO, A. C.; DE LIMA, E. G.; DE MELO, C. P. 2005. Dielectric characterization of colloidal solutions of retinoic acid embedded in microspheres of polyvinyl alcohol. Coll. Surf. A 257-258: 3-7. DERBALAH, A. S.; ELKOT, G. A. E.; HAMZA, A. M. 2011.Laboratory evaluation of botanical extracts, microbial culture filtrates and silver nanoparticles against Botrytis cinerea. Ann Microbiol. DOI 10.1007/s13213-011-0388-1 DEVOR, R. E.; CHANG, T.; SUTHERLAND, J. W. 1992. Statistical quality design and control – Contemporary concepts and methods. New Jersey, Prentice Hall, Inc. Cap. 15-20, p. 503-744. EGUCHI, E. S., CECATO, U. e SILVA, S. L. 2013. O caminho da nanotecnologia na produção animal brasileira. PUBVET, Londrina, v. 7, n. 8, Ed. 231, Art. 1528. ELLIS, M. B. Dematiaceous hyphomycetes. Kew: Commonwealth Mycological Institute, 1971. 512 p. FALKIEWICZ-DULIK, M.; MACURA A. B. 2008. Nanosilver as substance biostabilising footwear materials in the foot mycosis prophylaxis. Mikologia Lekarska, v. 15: p. 145-50. FAYAZ, A. M.; BALAJI, K.; KALAICHELVAN, P. T. and VENKATESAN, R. 2009. Fungal based synthesis of silver nanoparticles - An effect of temperature on the size of particles. Biointerfaces. (v) 74, p. 123–126. FENG, Q. L., WU, J., CHEN, G. Q., CUI, F. Z., KIM, T. N., KIM, J. O. 2000. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J. Biomed. Mater; 52:662-8 FERREIRA, L. S. 2010. Caracterização de isolados de Curvularia spp. endofíticos do milho (Zea mays L.) por parâmetros morfológicos e moleculares. Dissertação
72
(mestrado). Universidade Federal do Paraná – Setor de Ciências Biológicas; Programa de Pós-Graduação em Genética. Curitiba, 2010. 118f. FERREIRA, H. S.; RANGEL, M. C. 2009. Nanotechnology: general aspects and
potential applications in catalysis. Quím. Nova, v. 32, n.7, São Paulo-SP.
FILGUEIRA, F. A. R. 2008. Novo manual de olericultura: agrotecnologia moderna na produção e comercialização de hortaliças. Viçosa: UFV. 421p. FILGUEIRA, F. A. R. 2003. Novo manual de olericultura: agrotecnologia moderna na produção e comercialização de hortaliças. 2. ed. Viçosa: UFV. p. 274-294. FILGUEIRA, F. A. R. 2000. Novo manual de olericultura: agrotecnologia moderna na produção e comercialização de hortaliças. Viçosa: UFV. 402 p. FRATTINI, A.; PELLEGRI, N.; NICASTRO, D.; SANCTIS, O. D. 2005. Effect of amine
groups in the synthesis of Ag nanoparticles using aminosilanes. Materials
Chemistry and Physics. 94, p. 148-152.
GAJBHIYE, M.; KESHARWANI, J.; INGLE, A.; GADE, A. and RAI, M. 2009. Fungus-mediated synthesis of silver nanoparticles and their activity against pathogenic fungi in combination with fluconazole. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine (v) 5, p. 382–386. GARCIA, M. V. D. 2011. Síntese, caracterização e estabilização de nanopartículas de prata para aplicações bactericidas em têxteis. Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química. 89f. GHOSH, S.; PATIL, S.; AHIRE, M.; KITTURE, R.; KALE, S.; PARDESI, K.; CAMEOTRA, S. S.; BELLARE, J.; DHAVALE, D. D.; JABGUNDE, A.; CHOPADE, B. A. 2012. Synthesis of silver nanoparticles using Dioscorea bulbifera tuber extract and evaluation of its synergistic potential in combination with antimicrobial agents.Int. J. Nanomed. 7:483-496. GUANGQUAN, L.; HE, D.; QIAN, Y.; GUAN, B.; GAO, S.; CUI, Y. YOKOYAMA, K.; WANG, L. 2012. Fungus-Mediated Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Aspergillus terreus. Int. J. Mol. Sci., 13(1), 466-476 GUINGAB, J. D.; LAULY, B.; SMITH, B. W.; OMENETTO, N.; WINEFORDNER, J. D. 2007. Stability of silver colloids as substrate for surface enhanced Raman spectroscopy detection of dipicolinic acid. Talanta, v. 74, p. 271-274. GÚZMAN, M. G.; DILLE, J.; GODET, S. 2009.Synthesis of silver nanoparticles by chemical reduction method and their antibacterial activity. International Journal of Chemical and Biomolecular Engineering, v. 2, p. 3. HENSON, J. M.; SHEEHAN, K. B.; RODRIGUES, R. J.; REDMAN, R. S. UNITED STATES PATENT, nº 79066313, 15 de Março de 2011.
73
HOMOLA, J.; YEE, S. S.; GAUGLITZ, G. 1999. Surface plasmon resonance sensors: review. Sens. Act. B-Chem. 54 (1-2):3-15. HOSOKAWA, M., TANAKA, C. & TSUDA, M. 2003. Conidium morphology of Curvularia geniculata and allied species. Mycoscience 44: 227-237. JAIN, P. K., EL-SAYED, I., H., EL-SAYED, M. A. 2007. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. v.2(1), p.18-29. J. KOHL, C. A. M.; VAN TONGEREN, B. H.; GROENENBOOM DE HAAS, R. A. VAN HOOF, R.; DRIESSENAND, L. H. 2010. Epidemiology of dark leaf spot caused by Alternaria brassicicola and A. brassicae in organic seed production of cauliflower. Plant Pathology. v. 59, p. 358–367 KIM, S. W.; JUNG, J. H.; LAMSAL, K.; KIM, Y. S.; MIN, J. S. and LEE, Y. S. 2012. Antifungal Effects of Silver Nanoparticles (AgNPs) against Various Plant Pathogenic Fungi. Mycobiology 40(1) : 53-58 KIM, K. J.; SUNG, W. S.; MOON, S. K.; CHOI, J. S.; KIM, J. G. et al. 2009. Antifungal activity and mode of action of silver nanoparticles on Candida albicans. Biometals. v. 22: p. 235-242. KIM, K. J.; SUNG, W. S.; MOON, S. K.; CHOI, J. S.; KIM, J. G. and DONG, G. L. 2008. Antifungal effect of silver nanoparticles on dermatophytes. J. Microbiol. Biotechnol. v.18: p.1482-1484. KIM, J. S.; KUK, E.; YU, K. N.; KIM, J. H.; PARK, S. J.; LEE, H. J.; KIM, S. H.; PARK, Y. K.; HWANG, C. Y.; KIM, Y. K.; LEE, Y. S.; JEONG, D. H.; CHO, M. H. 2007. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 3(1):95-101. KIM, J. C., CHOI, G., KIM, H., KIM, H. J. & CHO, K. 2000. Pathogenicity and pyrenocine production of Curvularia inaequalis isolated from zoysia grass. Plant Dis. 84: 684-688. KINUPP, V. F. e BARROS, I. B. I. 2008. Protein and mineral contents of native species, potential vegetables, and fruits. Ciênc. Tecnol. Aliment. vol. 28, n. 4 Campinas-SP. Oct./Dec. KIRTH, A. V.; RAHUMAN, A. A.; JAYASEELAN, C.; KARTHIK, L.; MARIMUTHU, S.; SANTHOSHKUMAR, T.; VENKATESAN, J.; KIM, S. K.; KUMAR, G.; KUMAR, S. R. S.; RAO, K. V. B. 2012. Novel approach to synthesis silver nanoparticles using plant pathogenic fungi, Puccinia graminis. Mat. Lett. 81:69-72. KUHN, O. J. 2010. Indução de resistência no arroz irrigado: tecnologia para preservação dos recursos hídricos. Tropical Plant Pathology, v. 35, p. 69-70. KUMAR, V. and YADAV, S. K. 2008. Plant-mediated synthesis of silver and gold nanoparticles and their applications. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, pp. 151-157.
74
LAEMMLEN, F. 2001. Alternaria diseases. Publication 8040. University of California. Agriculture and Natural resources. LEE, H. J.; PARK, S. H.; GOVARTHANAN, M.; HWANG, P. H.; SEO, Y. S.; CHO, M.; LEE, W. H.; LEE, J. Y.; KAMALA-KANAN, S. and OH, B. T. 2013. Synthesis of silver nanoparticles using cow milk and their antifungal activity against phytopathogens. Materials Letters, v. 105, p. 128–131. LEFSRUD M; KOPSELL D; WENZEL A; SHEEHAN J. 2007. Chances in kale (Brassica oleracea L. var. acephala) carotenoid and chlorophyll pigment concentrations during leaf ontogeny. Scientia Horticulturae, 112: 136-141. LIMA, A. & FURTADO, M. 2007. Curvularia species (anamorphic fungi: Hyphomycetes) from Santiago island, Cape Vert. Portugalia e Acta Biol. 22: 145-156. LINK, S.; EL-SAYED, M. A. 1999. Size and Temperature dependent of the Plasmon Absortion of Colloidal Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. B. v. 103, p. 4212-4217. LIZ-MARZÁN, L. M. 2004. Nanometals: formation and color. Mater. Today, p. 26-31. MAPA. Agrofit-sistema de agrotóxicos fitossanitários. Brasília: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2008. Disponível em: < http://extranet.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>. Acesso em: 11 Set. 2013. MARINGONI, A. C. Doenças das crucíferas (brócolis, couve, couve-chinesa, couve-flor, rabanete, repolho e rúcula). In: KIMATI, H. et al. (Eds.). Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4 ed. São Paulo-SP: Agronômica Ceres, 2005. v.2. p. 285-291. MARTINEZ-CASTANON,G. A.; NINO-MARTINEZ, N.; MARTINEZ-GUTIERREZ et al. 2008. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research, vol. 10, no. 8, pp. 1343-1348. MICHEREFF, S.J., NORONHA, M.A., ROCHA, J. R. O.M., SILVA, J.A. & MIZUBUTI, E.S.G. 2003. Variabilidade de isolados de Alternaria brassicicola no Estado de Pernambuco. Fitopatologia Brasileira, 28:656-663. MIGUEL-WRUCK, D. S.; OLIVEIRA, J. R.; DIAS, L. A. S. Especificidade de hospedeiro nas interações Xanthomonas campestris pv. campestris – brássicas. 2010. Summa phytopathol. v. 36, n. 2, Botucatu Apr./June. MIN, J. S., KIM, K. S., KIM, S. W., JUNG, J. H., LAMSAL, K., KIM, S. B., JUNG, M. and LEE, Y. S. 2009. Effects of Colloidal Silver Nanoparticles on Sclerotium-Forming Phytopathogenic Fungi. Plant Pathol. J. 25(4): 376-380 MIRZAJANI, F.; GHASSEMPOUR, A.; ALIAHMADI, A.; ESMAEILI, M. A. 2011. Antibacterial effect of silver nanoparticles on Staphylococcus aureus. Res. Microbiol. 162:542-549.
75
MOHANTY, S.; MISHRA, S.; JENA, P.; JACOB, B.; SARKAR, B.; SONAWANE, A. 2011. An investigation on the antibacterial, cytotoxic, and antibiofilm efficacy of starch-stabilized silver nanoparticles. Nanomed.: Nanotechnol. Biol. Med. In press. MONTGOMERY, D. C. 2009. Design and analysis of experiments. 7 ed. New York: John Wiley & Sons. 656p. MONTGOMERY, D. C. 1991. Diseño y análisis de experimentos. Tradução: Jaime Delgado Saldivar. MORONES, J.; ELECHIGUERRA, J.; CAMACHO, A.; HOLT, K.; KOURI, J.; RAMIREZ, J. T.; YACAMAN, M. J. 2005. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology, Bristol, v. 16, p. 234-235. NETO, E. A. B., RIBEIRO, C.; ZUCOLOTTO, V. 2008. Síntese de nanopartículas de prata para aplicação na sanitização de embalagens. Comunicado técnico. São Carlos-SP. NICOLINI, C. 2008. Sensibilidade de isolados de Alternaria brassicicola (Schwn.) Wilt. De cultivos convencionais e orgânicos de brássicas a fungicidas. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Recife-PE. 48 p. NOVO, M. C. S. S.; PRELA-PANTANO, A.; TRANI, P. E.; BLAT, S. F. 2010. Desenvolvimento e produção de genótipos de couve manteiga. Horticultura Brasileira v. 28: p. 321-325. OCAMPOS, C. J. G.; 2010. Bactérias isoladas do filoplano no biocontrole da alternariose e da podridão negra da couve. Dissertação (mestrado). Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, MG. 2010. 39f. OLIVEIRA, A. C. Cultura da Couve. 2011. Fonte: http://jornalagricola.wordpress.com. Acesso em: 14/05/2013. OLIVIER, S.; SILVA, V. L.; MOTTA, M. 2007. Use of factorial planning in developing a methodology for galvanic zinc residue extraction. Quim. Nova 30(7):1750-1753. PAULINO, F. F. 2008. Avaliação dos componentes voláteis e atividade antioxidante de Eruca sativa Mill.,Brassica rapa L. e Raphanus sativus L. após processamento. 2008. 219 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio de Janeiro. PEDRAS L. F. 2001. “Alternaria Diseases.” University of California Agriculture and Natural Resources. Disponível em: http://ucanr.org/freepubs/docs/8040.pdf. Acesso em: 18 Set. / 2013
76
PEREIRA-FILHO, E. R.; POPPI, R. J.; ARRUDA, M. A. Z. 2002. Emprego de planejamento fatorial para a otimização das temperaturas de pirólise e atomização de Al, Cd, Mo e Pb por ETAAS. Quím. Nova, Vol. 25, No. 2, 246-253. PERUCH, L. A. M. 2004. Levantamento da intensidade da alternariose e da podridão negra em cultivos orgânicos de brássicas e longevidade da esporulação de Alternaria brassicicola em restos foliares de brócolis. 59f. Dissertação (Doutorado em Fitopatologia) - Programa de Pós-Graduação em Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco, 2004. PETICA, A.; GAVRILIU, S.; LUNGUA, M.; BURUNTEA, N. and PANZARUB, C. 2008.Colloidal silver solutions with antimicrobial properties. Mater. Sci. Eng. B.v. 152: p. 22-27. PIMENTEL, J., MAHADEVAN, K., WOODGYER, A., SIGLER, L., GIBAS, C.,HARRIS, O., LUPINO, M. & ATHAN, E. 2005. Peritonitis due to Curvularia inaequalis in an elderly patient. J. Clin. Microbiol. 43: 4288-4292. RIBEIRO, B. T.; LIMA, J. M.; CURI, N.; OLIVEIRA, G. C.; LIMA, P. L. T. 2011. Cargas superficiais da fração argila se solos influenciadas pela vinhaça e fósforo. Quím. Nova, Vol. 34, No. 1, p. 5-10. RICCO, J. B.; ASSADIAN, A.; SCHNEIDER, F.; ASSADIAN, O. 2012. In vitro evaluation of the antimicrobial efficacy of a new silver-triclosanvs a silver collagen-coated polyester vascular graft against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Vasc. Surg. 55-3:823-829. RIMMER, S. R.; SHATTUCK, V. I.; BUCHWALDT, L. 2007. Compendium of Brassica diseases. Saint Paul: APS Press. 117p. SCHAFFAZICK, S. R.; GUTERRES, S. S.; FREITAS, L. L.; POHLMANN, A. R. 2003. Physicochemical characterization and stability of the polymeric nanoparticle systems for drug administration. Quím. Nova. vol.26, no.5, São Paulo-SP. SAHAYARAJ, K. and RAJESH, S. 2011. Bionanoparticles: synthesis and antimicrobial applications. Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. A. Méndez-Vilas (Ed.). 17p. SANT’ANNA, L. S.; ALENCAR, M. S. M.; FERREIRA, A. P. 2013. Nanotechnology
patenting in Brazil: development, potentialities and reflections for the environment
and human health. Quím. Nova, v. 36, n.2, São Paulo-SP.
SANTOS, H. W. L. 2011. Síntese de nanopartículas metálicas por deposição física de vapor em líquidos iônicos e óleos vegetais. Tese de doutorado. Instituto de Física da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). 146p.
SAMUEL, U. and J. P. GUGGENBICHLER. 2004. Prevention of catheter-related infections: The potential of a new nano-silver impregnated catheter. Int. J. Antimicrob. Agents 23S1: S75-S78.
77
SENA, M. M., POPPI, R. J., FRIGHETTO, R. T. S., VALARINI, P. J. 2000. Evaluation of the use of chemometric methods in soil analysis. Quím. Nova, v. 23, p. 547-556. SHINGO, G. Y.; VENTURA, M. U. 2009. Produção de couve Brassica oleracea L. var.acephala com adubação mineral e orgânica. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 30, n. 3, p. 589-594, jul./set. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J. N. T. A. 2002. Princípios da análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre, 2002. SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. L. 1996. Analytical Chemistry, 7a ed. Saunders College Publishing, EUA.
SOUZA, J. L.; RESENDE, P. 2003. Manual de horticultura orgânica. Viçosa: Aprenda Fácil. 546p.
SUN, G., OIDE, S., TANAKA, E., SHIMIZU, K., TANAKA, C. & TSUDA, M. 2003. Species separation in Curvularia geniculata group inferred from Brnl gene sequences. Mycoscience 44: 239-244. SUDARENKOV, V. 2012. Nanotechnology: balancing benefits and risks to public health and the environment. Committee on Social Affairs, Health and Sustainable Development. 19 Nov. Moscow. 21p. SUTTERLIN, S.; TANO, E.; BERGSTEN, A.; TALLBERG, A. B.; MELHUS, A. 2012. Effects of Silver-based wound dressings on the bacterial flora in chronic leg ulcers and its susceptibility in vitro to silver. Acta Derm.Venereol. 92:34-39. TAULER, R., BARCELLO, D., THURMAN, E. M. 2000. Multivariate correlation between concentrations of selected herbicides and derivatives in outflows from selected US midwestern reservoirs. Environ. Sci Technol., v. 34, p. 3307-3314. TEÓFILO, R. F. 2013. Métodos Quimiométricos: Uma Visão Geral - Conceitos básicos de quimiometria, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Vol. 1, 118p. TOFOLI, J. G. & DOMINGUES, R. J. 2004. Alternarioses em hortaliças: sintomas, etiologia e manejo integrado. Biológico, São Paulo, v.66, n.1/2, p.23-33. TRAN, Q. H., NGUYEN, V. Q. and LE, A. T. 2013. Silver nanoparticles: synthesis, properties, toxicology, applications and perspectives. Adv. Nat. Sci.:Nanosci. Nanotechnol.v. 4. 20p. VAHABI, K.; MANSOORI, G. A.; KARIMI, S. 2011. Biosynthesis of Silver Nanoparticles by Fungus Trichoderma reesei. (A Route for Large-Scale Production of AgNPs). Insciences J., 1(1), p. 65-79. VENGADESH-PRABHU, K.; SUNDARAMOORTHI, C.; DEVARASU, S. 2011. Biosynthesis of Silver Nanoparticles from Streptomyces aureofaciens. Journal of Pharmacy Research, Vol: 4(3), 820-822.
78
WILLEMS, W. 2005. Roadmap report on nanoparticles, W&W. Espana sl, Barcelona, Spain. WONG, K. K. Y.; LIU, X. 2010. Silver Nanoparticles – The Real “Silver Bullet” in Clinical medicine? Med. Chem. Commun, v.1, p.125-131. WOO, K. S., KIM, K. S., LAMSAL, K., KIM, Y. J., KIM, S. B., JUNG, M., SIM, S. J., KIM, H. S., CHANG, S. J., KIM, J. K. and LEE, Y. S. 2009. An In Vitro Study of the Antifungal Effect of Silver Nanoparticles on Oak Wilt Pathogen Raffaelea sp. J. Microbiol. Biotechnol. 19(8), 760–764. WU, C. F. J. & HAMADA, M. S. 2009. Experiments planning, analysis and optimization. 2 ed. Hoboken: John Wiley & Sons. 716p. WU, P. W.; DUNN, B.; DOAN, V.; SCHWARTZ, B. J. 2000. Controlling the spontaneous precipitation of silver nanoparticles in sol-gel materials. J. Sol. Gel Sci. Technol. 19:249-252. YAHYAEI, B.; AZIZAH, S. 2013. Rapid photogeneration of silver nanoparticles in ethanolic solution: A kinetic study. Spectrochim. Acta Part A 101:343-348. YOON, K.; BYEON, J. H.; PARK, J.; HWANG, J. 2007. Susceptibility constants of Escherichia coli and Bacillus subtilis to silver and copper nanoparticles. Science of the Total Environment, v. 373, p. 572–575.
