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APLICAÇÕES DA CLONAGEMAPLICAÇÕES DA CLONAGEM

Disciplina: Biotecnologia Farmacêutica

Produção de proteínas

Cultura em banho: cultura em grandes recipientes a partir dos quais se extraem as células ou o composto de interesse. O meio não é renovável;

Cultura contínua: cultivam-se células num fermentador onde o meio é continuamente extraído e renovado, proporcionando uma fonte contínua de produto. Este tipo de cultura tem vindo a substituir a cultura em banho.

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Organismos e Vetores

ORGANISMOS

-E.coli

-Células eucarióticas

-Animais transgênicos

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Problemas na produção de proteínas recombinantes em E.coli

Gene exógeno:

- pode conter íntrons. A bactéria não possuimaquinaria para remoção;

- pode conter sequências de terminação em E.coli;

- o viés de códons do gene pode não ser o ideal.

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Problemas na produção de proteínasrecombinantes em E.coli

E.coli:

-pode não processar proteína corretamente (alterações pós-tradução);

-pode não enovelar a proteína corretamente (ligações dissulfeto) – corpos de inclusão;

- pode degradar a proteína recombinante

VETORES PARA E.coli

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Vetores de expressão em E.coli

•Promotor: marca o local de inicio da transcrição. Éreconhecido pela subunidade σ da RNA polimerase;

•Ribossome Binding Site (RBS): pequena sequência denucleotídios complementar ao rRNA 16S (região Shine-Delgarno). Esta zona é reconhecida pelo ribossoma,favorecendo a sua ligação e o início da transcrição algunsnucleotídios a seguir;

•Terminador: local a seguir a um codão stop onde atranscrição termina. É geralmente um sequência denucleotídios capaz de, por complementaridade de bases,formar uma estrutura em forma de gancho que induz adissociação da RNA polimerase.

Vetores de expressão

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O promotor é o componente crítico de um vetor de expressão

-Controla o primeiro estágio da expressão gênica;

-Determina a frequência na qual o RNAm é sintetizado.

Quantidade de proteína

recombinante produzida

Natureza do promotor

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Regulação da expressão

•Promotores fortes e fracos

•Indução e repressão da expressão

Indução e Repressão

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IPTG= isopropiltiogalactosídeo

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CASSETES E FUSÕES GÊNICAS

Produção de proteínas porcélulas eucarióticas

ou animais transgênicos

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Produção de proteínas por células eucarióticas

•- Fungos e leveduras: Saccharomyces cerevisiae

l- Células de mamíferos

Produção de proteínas por animais vivos

Animais Transgênicos

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