MÉTODOS DE ANÁLISE DE PROTEÍNAS

BROMATOLOGIA PROFª MÁRCIA CRESTANI BIN

Avaliação de proteínas em alimentos

• Métodos químicos• Métodos físicos• Métodos biológicos• Métodos microbiológicos e

enzimáticos

MÉTODOS QUÍMICOS

• Métodos que analisam teor de C:

– digestão mais fácil do que para o nitrogênio;

– menores erros no resultado por causa da maior quantidade em relação ao nitrogênio;

– fator de correção mais constante que para o nitrogênio;

– maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína dos carbonos de outros componentes.

ANÁLISE DO N

ANÁLISE DO C

MÉTODOS QUÍMICOS

MÉTODO DE KJELDAHL

Johann Kjeldahl(1849-1900)

Desenvolveu em 1883 o processo básico para determinação de nitrogênio orgânico total. Os passos incluem:

-Digestão: H2SO4 a 350ºC-400ºC + catalisador

-Neutralização e destilação

-Titulação

-Conversão do teor de nitrogênio para teor de proteína

Esse método determina N orgânico total: N protéico e N não-protéico.

ANÁLISE DO N

Etapa de digestão

K2SO4: aumenta o ponto de ebulição do H2SO4 (de 337ºC para mais de 400ºC), torna a digestão mais eficiente;

CuSO4: Catalisador. Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica.

Aquecimento da amostra com ácido sulfúrico para a digestão até que o C e H sejam oxidados e o N da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia.

Microdigestor de Kjeldahl

Etapa de neutralização e destilação

Destilador

Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico e indicador, formando borato de amônia.

Destilador de Nitrogênio Kjeldahl

Etapa de titulação

O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl ou H2SO4) padronizada.

Etapa de titulação

Conversão do teor de N para proteína bruta

A maioria dos alimentos possui em média 16% de nitrogênio, portanto:

16g N ___ 100g proteínas 1g N ____ Xg

Xg = 100/16 = 6,25

é obtido pela multiplicação do teor de N total pelo fator de conversão (6,25).

O teor de proteína bruta de um alimento

O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:

Método de Kjeldahl

• Vantagens – Aplicável a todos os tipos de alimentos– Relativamente simples– Não é caro– Preciso. Trata-se de um método oficial para a

determinação de proteínas– Pode ser utilizado para análise de microgramas de

proteína (micro Kjeldhal)

• Desvantagens – Mede Nitrogênio orgânico total, não apenas

nitrogênio de proteínas– Demorado- Utiliza reagentes corrosivos.

Método de Kjeldahl

Outras possíveis fontes de N na amostra:

Métodos químicos por grupos

METODO DE BIURETO

• Substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas.

• A intensidade da cor é proporcional a quantidade de proteínas

METODO DE BIURETO

• Vantagens – Ser bastante específico por não apresentar problemas de

interferentes.– É simples, rápido e barato.– Por envolver uma reação com a ligação peptídica, o método

determina proteína, ao contrário do método de Kjeldahl que determina N total

• Desvantagens – A necessidade de uma curva de calibração tomada com um

padrão conhecido de proteína, por exemplo, uma proteína determinada por Kjeldahl.

– A cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas, porém os desvios causados são menores do que em outros métodos colorimétricos

Métodos químicos por grupos

MÉTODO DO FENOL (Folin-Ciocalteau – Lowry)

• Baseia-se na interação das proteínas com o reagente fenol e cobre em condições alcalinas;

• Reação colorimétrica envolve uma oxidação catalisada por cobre, de aas aromáticos por um reagente heteropolifosfato, desenvolvendo uma cor azul que vai ser medida num colorímetro e comparada com uma curva padrão.

Métodos químicos por grupos

ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

Proteínas possuem absorção UV em 280 nm devido à presença de tirosina, triptofano e fenilalanina

MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS

Medida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente precipitante, como TCA, ferricianato de potássio e ácido sulfossalicílico

Métodos químicos por grupos

MÉTODOS DE DYE-BINDING

• Quando uma amostra é tratada com corante (excesso) que reage com proteína quantitativamente para formar um complexo insolúvel que pode ser separado. O excesso de corante não reagido em solução é medido colorimetricamente;

• Utilizado em amostras de grãos de cereais, sementes oleaginosas, produtos vegetais e animais e laticínios;

• Boa correlação com o método oficial.

MÉTODOS FÍSICOS

• Não muito utilizados;

• Utiliza-se para avaliação da qualidade de proteínas e não da quantidade;

• Índice de refração, densidade específica, viscosidade; tensão superficial; condutividade; polarização.

MÉTODOS BIOLÓGICOS

Princípios importantes:

• Balanço de nitrogênio • Crescimento • Valor biológico da proteína• Digestibilidade da proteína

90 % urina10 % fezes

Nitrogênio ingerido

Nitrogênio excretado

INDIVÍDUO SAUDÁVEL + DIETA BALANCEADA

EQUILÍBRIO NITROGENADO

Balanço do Nitrogênio

Balanço de N BN = NI – (NF + NU)

Digestibilidade

Valor biológico

NPU

Crescimento

• PER: Quociente de eficiência protéica: ganho de peso pela quantidade de proteína ingerida em um grupo de ratos

• NPR: Quociente de eficiência líquida da proteína: ganho de peso expresso em gramas frente a um grupo controle que não recebeu proteína. Avalia a capacidade de sustentar o crescimento e capacidade de sustentar a manutenção do organismo através da proteína.

Crescimento

Simulam a perda de peso sem usar 2 grupos:

PI = peso inicial

PF = peso final

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

• Certos micro-organismos são usados para medir o valor nutritivo de proteínas.

• Baseia-se na avaliação de aminoácidos essenciais comuns entre homem e microorganismos.

• Verifica-se o crescimento de micro-organismos na presença da proteína teste.

MÉTODOS ENZIMÁTICOS

• Utilizados para medir a digestibilidade e biodisponibilidade de aminoácidos essenciais. Utiliza pepsina, pancreatina.

• Simula in vitro as condições estomacais e intestinais para pesquisar a digestibilidade.

• Outro método a proteína é digerida por 3 enzimas (quimiotripsina, tripsina pancreática e peptidase intestinal suína).