Métodos de identificação de biomoléculas e análise de

proteínas

Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

Seminário de Bioquímica

SO2-T2

Coimbra, 07 de Outubro de 2009

Elaborado por:

Joana AbrantesJoana CoutoJoão CostaJoão PedroJoão MirandaJoão BarrosJoão GomesJoão BernardesJoão Martins

Introdução1º Passo

Identificar: Indicar; Reconhecer; Sinalizar; Focar.

2º Passo

Isolar a Biomolécula Estudar a sua avaliação funcional. 3º Passo

Estudo das mesmas para o diagnóstico em Medicina.

Métodos de Identificação de Biomoléculas

As biomoléculas são identificadas por:

Químicas analíticas (espectroscopia de massa); Absorção/emissão/refracção da luz; Propriedades redox; Propriedades biológicas; Propriedades químicas; Propriedades físicas.

Alguns métodos de separação de Biomoléculas

Cromatografia;

Detergentes;

Centrifugação;

Absorvência;

Teste do Biureto;

Electroforese.

Cromatografia Um dos métodos mais comuns de identificação de proteínas

Consiste na passagem de proteínas através de uma coluna (fase estacionária), destinada a reter/diminuir a velocidade de passagem dessas mesmas proteínas na fase móvel da coluna, de modo a serem devidamente separadas.

A coluna possui uma matriz/gel, que deverá estar embebido num líquido (tampão), usado para forçar o contacto entre a matriz e as proteínas a separar.

Utilizando este método, as proteínas podem ser separadas segundo:

carga (IEX – cromatografia de troca iónica) hidrofobicidade (HIC – cromatografia de interacção hidrofóbica) tamanho (GF – filtração em gel) afinidade (cromatografia de afinidade)

Cuidados especiais: a solução a analisar deve ter a proteína concentrada e a execução do método deve ser rápida para evitar a degradação da mesma.

AbsorvânciaMétodo utilizado na identificação de biomoléculas numa solução aquosa, permitindo calcular a sua concentração em determinada amostra.

Definição: Aλ= -log10(I/I0)

λ – comprimento de onda da radiaçãoI – intensidade radiação incidenteI0 – intensidade na radiação transmitida

UltracentrifugaçãoCom esta técnica podemos identificar parâmetros como a massa e densidade, aprender algo sobre a forma da biomolécula e investigar interacções entre moléculas.s=m(1-vp)/f

s – coeficiente de sedimentaçãom – massa da particulav – volume parcial específicop – densidade do meiof – coeficiente de atrito

1. Uma particula com maior massa sedimenta mais rapidamente.

2. Uma particula mais compacta sedimenta mais rapidamente.

3. Uma particula mais densa sedimenta mais rapidamente.

4. A velocidade de sedimentação depende da densidade da solução

Análise de proteínasExemplos de métodos para análise de proteínas:

Electroforese em gel; Cromatografia de afinidade; Teste do biureto; Ultra centrifugação; Salting out; Diálise; Anticorpos.

Electroforese em gelEm função da carga eléctrica líquida das proteínas, em que a velocidade de migração das proteínas depende da intensidade do campo, da carga da proteína e do quoeficiente de atrito

Em função da massa, em que as moléculas de maior peso ficam quase imóveis enquanto que as menores adquirem maior velocidade

Em função dos relativos ao ponto isoeléctrico, em que cada proteína mover-se-á até atingir uma posição no gel no qual o pH é igual ao pI da proteína

Estudo de Proteínas e Diagnóstico em Medicina

A electroforese desempenha um papel preponderante, por exemplo, na referenciação imediata de algumas anomalias proteicas, como por exemplo:

Mieloma múltiplo;Macroglobulinémia;Enteropatia exudativa;Sindroma nefrótico; Cirrose;Sarcoidose;Doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas.

Diagnóstico de Cirrose Hepática através da Electroforese

No diagnóstico da cirrose hepática podemos notar uma diminuição da albumina, por diminuição da catabolização das globulinas no fígado, cuja função está deficiente (insuficiência hepática).

Para além disto, denota-se um aumento do nº de proteínas na região β e γ.