IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À …

KARINA TACIANA SANTOS SILVA

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À CARCINOGÊNESE

INDUZIDA POR DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA EM

RATOS WISTAR

OURO PRETO – MG, ABRIL DE 2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS – NUPEB

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À CARCINOGÊNESE

INDUZIDA POR DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA EM

RATOS WISTAR

Autora: Karina Taciana Santos Silva

Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade

Coorientador: Prof. Dr. William de Castro Borges

Ouro Preto – MG, abril de 2015

Tese submetida ao programa de Pós-

Graduação do Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do título de Doutor

em Ciências Biológicas, área de

concentração: Bioquímica Estrutural e

Biologia Molecular.

S381i Silva, Karina Taciana Santos. Identificação de proteínas associadas à carcinogênese induzida por

Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona em ratos Wistar [manuscrito] / Karina Taciana Santos Silva. - 2015.

xxii, 172pf.: il.: color; grafs; tabs.

Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade. Coorientador: Prof. Dr. William Castro-Borges.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de

Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Bioquímica Estrutural e Biologia Molecular.

1. Câncer. 2. Dibenzotiofeno. 3. Proteômica. I. Andrade, Milton Hércules Guerra de. II. Castro-Borges, William. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.

CDU: 616-006.6:577.122

Catalogação: www.sisbin.ufop.br

http://www.sisbin.ufop.br/

Silva, K.T.S. Ata Defesa

i

Silva, K.T.S. Colaboradores

ii

COLABORADORES

Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima - UFOP

Profª. Drª. Yara Cristina de Paiva Maia - UFU

Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho – UFU

Dr. Fausto Emílio Capparelli - UFU

Msc. Renata Alves de Oliveira e Castro

Msc. Vinícius Corrêa Rodrigues

Aline Dias de Almeida

Silva, K.T.S. Auxílio

iii

Este trabalho foi realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E

PROTEÔMICA – NUPEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de

aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Universidade

Federal de Ouro Preto (UFOP).

Silva, K.T.S. Dedicatória

iv

Dedico este trabalho à

minha família e ao Allan,

minhas fontes de força, amor

e apoio incondicionais.

Silva, K.T.S. Epígrafe

v

“O homem interior se renova

sempre. A luta enriquece-o de

experiência, a dor aprimora-lhe as

emoções e o sacrifício tempera-lhe

o caráter.”

(Chico Xavier)

Silva, K.T.S. Agradecimentos

vi

AGRADECIMENTOS

Às agências de fomento FAPEMIG e CNPq pelo apoio financeiro.

Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela disponibilidade e

aprendizado. Obrigada pela coorientação e por compartilhar os problemas,

alegrias e enfrentar comigo as dificuldades encontradas.

Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pela orientação.

Ao Técnico José Henrique Braga Fortes, muito obrigada por toda a ajuda,

pela amizade, risadas e por compartilhar as alegrias, angústias e dúvidas

surgidas durante esses anos de convivência.

Ao Prof. Marcos Aurélio de Santana, pelo apoio e colaboração.

Ao Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima, pelo aprendizado e

colaboração.

Aos laboratórios LIMP, LIP e LBBM por permitirem o uso de equipamentos

e dependências para realização de parte deste trabalho.

Aos professores do NUPEB que contribuíram de maneira construtiva para

a realização deste trabalho.

À Renata, pela colaboração e disponibilidade dedicadas a este trabalho.

Pela amizade e apoio que recebi durante esses anos de estudo.

Aos alunos de iniciação científica Aline, Vinícius e Pablo, que

participaram diretamente da realização deste trabalho, obrigada pela ajuda

inestimável. Sem vocês, a conclusão deste trabalho teria sido impossível.

Aos amigos que fiz no LEP durante esses 6 anos de pós-graduação, muito

obrigada pelas risadas, conversas e pela ajuda, principalmente nos momentos

finais do desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus pais, pelo amor, carinho e apoio incondicionais. Obrigada por

acreditarem nos meus sonhos e muitas vezes abrirem mão dos seus para que

essa conquista se tornasse possível.

A minha irmã, pela amizade e companheirismo mesmo à distância.

Ao Allan, por transformar qualquer dia em um dia especial, pelo amor,

carinho e apoio.

Enfim, agradeço a todos que de maneira direta ou indireta contribuíram

para a realização deste trabalho.

Silva, K.T.S. Índice

vii

ÍNDICE

RESUMO .........................................................................................................................x

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................xiii

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................xvi

LISTA DE TABELAS ...................................................................................................xx

1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................2

1.1. Epidemiologia ................................................................................................2

1.2. Aspectos Gerais da Oncogênese .....................................................................3

1.3. Trato Gastrointestinal Inferior ........................................................................4

1.3.1. Características Gerais ......................................................................4

1.3.2. Câncer Intestinal ..............................................................................6

1.3.3. Fatores de Risco e Genéticos ...........................................................8

1.4. Visão Geral de Vias de Sinalização Atuantes no CCR ...................................9

1.4.1. Via Wnt/β-catenina ..........................................................................9

1.4.2. Via Notch .......................................................................................11

1.4.3. Via Hedgehog ................................................................................12

1.4.4. Via PI3K/Akt ..................................................................................14

1.5. Carcinogênese Química ................................................................................16

1.5.1. Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona .....................................18

1.5.2. 1,2-Dimetilhidrazina ......................................................................21

1.6. Biomarcadores e Câncer ...............................................................................21

1.6.1. Proteômica e Phage Display ..........................................................23

2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................................25

3. OBJETIVOS ..............................................................................................................27

3.1. Objetivo Geral ..............................................................................................27

3.1.1. Objetivos Específicos ....................................................................27

4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................29

4.1. Material Biológico ........................................................................................29

4.1.1. Indução de Câncer em Ratos Wistar Tratados com DMH, DBT e

DBTO2 ............................................................................................................................29

4.1.2. Necropsia .......................................................................................30

4.2. Análise Histológica .......................................................................................30

4.2.1. Imunohistoquímica: CEA e CD44 .................................................31


viii

4.3. Extração de Proteínas e Análise Proteômica .................................................31

4.3.1. Eletroforese Uni e Bidimensional (1D/2D SDS-PAGE) ................32

4.3.2. Digestão in gel ...............................................................................33

4.3.3. Análise de Proteínas por Espectrometria de Massas .......................34

4.3.4. Categorização Funcional e Mapa de Interação Proteica .................34

4.4. Western bloting …………………………………………………………….35

4.5. Biopanning (Phage Display)……………………………………………….35

4.5.1. Extração de Proteínas para Phage Display .....................................35

4.5.2. Ciclos de Seleção de Phage Display ...............................................36

4.5.3. Titulação de Clones Obtidos no Phage Display ............................37

4.5.4. Extração de DNA de Fagos e Sequenciamento .............................37

4.5.5. Análise in silico dos Peptídeos Obtidos .........................................39

4.6. Síntese de Peptídeos ......................................................................................40

4.6.1. Análise de Pureza e Confirmação de Identidade ............................41

4.7. Síntese de Colunas de Afinidade ...................................................................42

4.7.1. Identificação de Proteínas Ligantes ................................................43

4.7.2. Análise in silico da Interação Proteína/Peptídeo ............................44

4.8. Análise Estatística .........................................................................................44

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...............................................................................46

5.1. Efeitos Biológicos do Tratamento com DMH, DBT e DBTO2 ......................46

5.1.1. Hemogramas e Dosagens Séricas de ALT, AST e Amilase ............47

5.1.2. Avaliações Morfológicas Macro e Microscópicas de Tecidos

Extraídos Durante a Necropsia ........................................................................................48

5.1.3. Marcação Imunohistoquímica: CEA e CD44 .................................54

5.2. Análise Proteômica .......................................................................................57

5.3. Identificação de Peptídeos Ligantes à Tecidos Neoplásicos Intestinais de

Animais Tratados com DMH, DBT e DBTO2 .................................................................71

5.3.1. Biopanning de Tecido Intestinal ....................................................72

5.3.2. Análise in silico de Peptídeos Selecionados ..................................73

5.3.3. Síntese de Peptídeos .......................................................................75

5.3.4. Isolamento de Proteínas por Afinidade aos Peptídeos Selecionados

por Phage Display ...........................................................................................................77

6. CONCLUSÕES .........................................................................................................82

7. PERSPECTIVAS ......................................................................................................84


ix

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................86

9. APÊNDICES ..............................................................................................................99

9.1. Apêndice A – Contagens Global e Diferencial de Leucócitos para Todos os

Animais Tratados ............................................................................................................99

9.2. Apêndice B – Dosagens séricas de AST, ALT e Amilase ............................100

9.3. Apêndice C – Análise Estatística Referente a Avaliação Histológica de

Intestinos Delgado e Grosso Entre Grupos Controle .....................................................101

9.4. Apêndice D – Dados Obtidos por Espectrometria de Massas para 2D SDS-

PAGE e Cromatografia de Afinidade ............................................................................102

9.5. Apêndice E – Western bloting .....................................................................155

9.6. Apêndice F – Alinhamento Entre Sequências Peptídicas e Banco de Dados de

Proteínas para Rattus norvegicus ...................................................................................156

9.7. Apêndice G – Artigo Publicado ..................................................................161

Silva, K.T.S. Resumo

x

RESUMO

O alto conteúdo de compostos organossulfurados nos derivados de petróleo compromete

sua qualidade; assim, sua remoção ou conversão a substâncias menos tóxicas são

importantes etapas durante o processo de refino. Os limites de concentração para esses

compostos estão sob rígido controle em diversos países com o objetivo de minimizar seu

impacto negativo sobre a saúde animal e o ambiente. Dentre eles, o dibenzotiofeno (DBT)

é um hidrocarboneto policíclico aromático que contém um átomo de enxofre em

substituição em sua estrutura. Devido à importância dessas moléculas na oncogênese, e a

escassez de investigações toxicológicas relacionadas ao DBT, este trabalho propôs

realizar uma avaliação dos efeitos tóxicos e moleculares promovidos por um tratamento

crônico de ratos Wistar com dose sub-letal (30 mg/kg) de DBT e seu derivado oxidado

DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), ambos administrados durante 10 semanas. Em paralelo,

seus efeitos tóxicos foram comparados com aqueles provocados pelo tratamento com o

agente mutagênico clássico, 1,2-dimetilhidrazina (DMH), administrado na mesma dose

durante o mesmo período. Na 14ª semana após a última dose, os animais foram

sacrificados para uma avaliação inicial da contagem de células sanguíneas e das funções

hepáticas e pancreáticas. Não foram observadas alterações nesses parâmetros. Entretanto,

análises histopatológicas revelaram lesões de caráter pré-neoplásico nos intestinos dos

animais tratados com DBT e DBTO2 que mostraram-se comparáveis em intensidade e

alterações morfológicas com aquelas encontradas no cólon de animais tratados com

DMH. Em concordância com esse achado, os marcadores tumorais CD44 e CEA

(antígeno carcinoembrionário), utilizados em ensaios de imunohistoquímica

demonstraram aumento de expressão de aproximadamente três vezes para os animais dos

grupos Testes em relação aos animais dos grupos Controle. Análises proteômicas

realizadas por eletroforese bidimensional (2D SDS-PAGE) demonstraram padrões de

expressão proteica diferenciados entre os diferentes grupos. Além da análise proteômica,

foi realizado ensaio de seleção de peptídeos ligantes de proteínas especificamente

relacionados às alterações promovidas pelos indutores químicos utilizados, empregando

a técnica de Phage Dislay. Tal metodologia permitiu a pré-seleção de seis peptídeos

específicos e relacionados aos mecanismos de desenvolvimento/manutenção de câncer.

A identificação das proteínas diferencialmente expressas observadas por 2D SDS-PAGE

e, das proteínas alvo que interagem com peptídeos específicos relacionados às alterações

promovidas por esses agentes químicos, auxilia no avanço do entendimento acerca dos

Silva, K.T.S. Resumo

xi

mecanismos envolvidos no estabelecimento das lesões encontradas nos animais tratados

com DBT e DBTO2.

Silva, K.T.S. Abstract

xii

ABSTRACT

The high content of organosulfur compounds in petroleum derivatives compromises their

quality and, therefore, their removal or conversion to less toxic substances are important

steps during oil refining. The concentration limits of such compounds in fuels are under

strict control worldwide with the aim to minimize their negative impact upon animal

health and the environment. Among them, dibenzothiophene (DBT) is a polycyclic

aromatic hydrocarbon containing a sulfur atom replacing a carbon in the main structure.

Given the importance of such molecules during oncogenesis and the scarcity of

toxicological investigations related to DBT, this work proposes an evaluation of the toxic

effects promoted by a chronic treatment of Wistar rats with a sub-lethal dose (30 mg/kg)

of DBT and its oxidized derivative DBTO2 (dibenzothiophene sulfone), both

administered during 10 weeks. In parallel, their toxicological effects were compared to

those inflicted by treatment with the classic mutagenic compound, 1,2-dimethylhydrazine

(DMH), given at 30 mg/kg for the same period. At the 14th week after the last dose, the

animals were sacrificed for the initial evaluation of blood cell counts and assessment of

hepatic and pancreatic functions. We have observed no alterations in either blood cell

parameters or indication of liver and spleen injuries. However, pre-neoplastic lesions in

the small intestine of DBT and DBTO2 treated animals were comparable in intensity and

morphology to those found in the colon of DMH-treated animals. In agreement with this

finding two tumor markers CD44 and CEA (carcinoembrionic antigen), were detected by

immunohistochemistry and demonstrate approximately three fold higher for treated

animals when compared to control groups. Proteomic analyses by 2D electrophoresis

(2D SDS-PAGE) reveal different expression patterns for Test groups when compared to

Control groups. In addition to the proteomic analysis, we also performed a selection of

test specifically protein binding peptides related to changes produced by chemical

inducers used employing the Phage Display technique. This methodology allowed the

pre-selection of six specific peptides related to the mechanisms of

development/maintenance of cancer. The identification of differentially expressed

proteins observed by 2D SDS-PAGE, and of proteins that interact with specific peptides

related to alterations caused by such agents, assists in advancing understanding of

mechanisms involved in the establishment of lesions found in animals treated DBT and

DBTO2.

Silva, K.T.S. Lista de Abreviaturas

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

µg- micro gramas

µL- micro litros

µm- micro metros

2D SDS-PAGE- Eletroforese bidimensional em

gel de poliacrilamida

ACF- Focos de criptas aberrantes

ACN- Acetonitrila

ACTB- Actina subunidade beta

ADH- Álcool dehidrogenase

AHR- Receptor aril hidrocarbono

AKR1B1- Aldose redutase

Akt- Proteína quinase B

ALDOA- Aldolase A

ALT- Alanina amino transferase

ANOVA- Análise de variância

ANXA2- Anexina 2

ANXA5- Anexina 5

AOM- Azoximetanol

APC- Adenomatous polyposis coli

ARHGDIA- Inibidor de dissociação Rho-GDP

AST- Aspartato amino trasnferase

ATIC- Biossíntese de purina bifuncional

BAX- Proteína associada a BCL2

Bcl2- B-cell CLL/lymphoma 2

Bmi- BMI polycomb ring finger oncogene

CA- Carbohydrate antigen

CALR- Calreticulina

CANX- Calnexina

CCA- Centro de Ciência Animal

CCR- Câncer colorretal

CCT6- Proteína complexo T1 sub. zeta

CD44- Cluster of differentiation 44

CEA- Carcinoembrionic antigen

CEUA- Comissão de ética no uso de animais

CFL- Cofilina

c-Jun- Protooncogene jun

CK1- Caseína quinase 1

CKB- Creatina quinase B

CMPK- Citidina monofosfato quinase

c-Myc- Protooncogene myc

CORO1A- Coronina 1A

COX2- Ciclooxigenase

CYP450- Citocromo P450

DBT- Dibenzotiofeno

DBTO2- Dibenzotiofeno sulfona

DCC- Diciclohexilcarbodiimida

DCM- Diclorometano

DL50- Dose Letal 50%

DLD- Dihidrolipoil dehidrogenase

DMF- Dimetilformamida

DMH- 1,2-Dimetilhidrazina

DNA- Ácido desoxiribonucleico

DPP7- Dipeptidil peptidase

Dvl- Dishevelled

Dyrk1-Dual-specificity tyrosine-(Y)-

phosphorylation regulated kinase 1A

E1A- Fator de transcrição E1A

E2F- Fator de transcrição E2F

EEF2- Fator de elongação EEF2

EGFR- Receptor de fator de crescimento

epidermal

ENO1- Enolase alfa

EZR- Ezrina

FAK- Quinase de adesão focal

FDR- False Discovery rate

FITC- Isotiocianato de Fluoresceína

Fz- Frizzled

GAPDH- Gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase

GLI- Fator de transcrição GLI

GLUT- Receptor de glicose

GNB2L1- Proteína ligante de nucleotídeo guanina

GSK3- Glicogênio sintase quinase 3

HBP- 2-Hidróxibifenil

HDAC- Histona deacetilase

HE- Hematoxilina/Eosina

Hh- Hedgehog

HPA- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

HPAS- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

sulfurados

HPLC- Cromatografia Líquida de Alta Pressão

HRP- Horseradish peroxidase

HSP70- Heat shock protein 70

HSP90B1- Endoplasmina

HSPA2- Heat shock protein HSPA2

HSPA5- Heat shock protein HSPA5

IARC- Agência internacional para pesquisa em

câncer

IGF-IIR- Receptor de fator de crescimento tipo

insulina 2

IGG2A- Imunoglobulina gama 2A INCA- Instituto Nacional do Câncer

kDa- kilo Dalton

K-ras- Kirsten rat sarcoma viral oncogene

homolog

KRT8- Queratina 8

LDHA- Lactato dehidrogenase A

LEF- Fator potenciador linfóide

LGALS3- Galectina 3


xiv

LRP6- Lipoprotein receptor related protein 6

LUM- Lumican

M- Molar

MAM- Metil azoximetanol

MCPT1- Protease de mastócitos

mM- mili molar

mm- milímetro

MS- Espectrometria de Massas

mTORC1-

MYL- Miosina cadeia leve

ng- nanogramas

NHS- N-hidroxisuccinimida

NICD- Porção terminal do receptor Notch

NL- Não linear

NuA4- Histona acetiltransferase

OPAS- Organização Pan-Americana de Saúde

p/v- peso/volume

p53- Proteína tumoral p53

PAF- Polipose adenomatosa familiar

PBSS- Tampão Fosfato de Sódio com Salina

PGAM1- Fosfoglicerato mutase 1

PGK1- Fosfoglicerato quinase

pH- potencial hidrogeniônico

PIC- Coquetel de inibidores de protease

PIP- Fosfatidil inositol fosfato

PKM2- Piruvato quinase

PNLIP- Triacilglicerol lipase

ppm- Partes por milhão

PRDX1- Peroxiredoxina 1

Ptch- Proteína Patched

PTEN- Phosphatase and tensin homolog

PVDF- Polyvinylidene fluoride

Rac- Rho-GTPase

Raf- Quinase Raf

Ras- GTPase

RBBP4- Proteína ligante de histona RBBP4

RBP-JK- Recombining binding protein supressor

of hairless

RFESD- Proteína Rieske Fe-S

RNA- Ácido ribonucleico

SAGA- Histona acetiltransferase

SDS- Duodecil sulfato de sódio

SELENBP- Proteína ligante de selênio 1

SOD- Superóxido dismutase

STAGA- Histona acetiltransferase

TAGLN- Transgelina

TBST- Tampão Tris-HCL com Tween 20

TCF- Fator T celular

TF- Transferrina

TFA- Ác. Trifluoroacético

TFTC- TAT-binding protein free TAF-containing

complex

TGFβ- Fator de crescimento transformador

TIMP-1- Tissue inhibitor of metalloproteinases

TIP60- Histona acetiltransferase

TKT- Transcetolase

TNM- Estadiamento tumoral

TPM- Tropomiosina

TRA1- Proteína associada a transcrição 1

UI- Unidades internacionais

UICC- Union for International Cancer Control

v/v- volume/volume

VDAC2- Canal aniônico voltagem dependente

VEGF- Fator de crescimento vascular endotelial

WDR1- Repetição WD

WHO- World Health Organization

YWHAE- 14-3-3 ε


xv

Silva, K.T.S. Lista de Figuras

xvi

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Distribuição proporcional de óbitos no Brasil por tipo de câncer em 2014 por

sexo....................................................................................................................................2

Figura 02: Corte histológico de seção do duodeno no intestino delgado mostrando as

camadas que compõem o mesmo.......................................................................................5

Figura 03: Corte histológico de seção de intestino grosso mostrando as camadas Mucosa,

Submucosa, Túnica Muscular e Serosa além de componentes característicos..................5

Figura 04: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal......................................6

Figura 05: Eventos genéticos envolvidos no desenvolvimento do câncer colorretal.........7

Figura 06: Via Wnt/β-catenina........................................................................................10

Figura 07: Diagrama simplificado da via de sinalização Notch e seus possíveis alvos....12

Figura 08: Via de sinalização Hedgehog em vertebrados................................................13

Figura 09: Via de sinalização PI3K/Akt e vias associadas..............................................15

Figura 10: Vias de sinalização Notch, Wnt, e Hedgehog regulando o destino celular.....16

Figura 11: Estruturas químicas dos principais compostos contendo enxofre encontrados

no petróleo.......................................................................................................................19

Figura 12: “Via de metabolismo 4S para DBT”..............................................................20

Figura 13: Esquema representativo do tempo de tratamento e espera para o

desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e

DBTO2.............................................................................................................................30


xvii

Figura 14: Biopanning com a biblioteca de peptídeos Ph.D. Seleção de ligantes

específicos.......................................................................................................................37

Figura 15: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos

controles e testes ao longo de 24 semanas de tratamento/latência.....................................46

Figura 16: A) Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao Grupo III

(Teste DMH 30 mg/kg) onde podem ser observadas as formações de pólipos. B)

Fotografia de parte do intestino delgado de animais pertencentes aos Grupos IV e V

(Testes DBT 30 mg/kg e DBTO2 30 mg/kg respectivamente) onde podem ser observados

pólipos.............................................................................................................................49

Figura 17: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados

pela técnica de HE............................................................................................................53

Figura 18: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados

pela técnica de imunohistoquímica com anti-CEA e anti CD44 e contra corados com

hematoxilina....................................................................................................................56

Figura 19: Géis 2D SDS-PAGE 10% representativos da extração de proteínas solúveis

de intestinos delgados dos A) Grupo Controle Óleo (III) e B) Teste DBT (IV)................58


de intestinos delgados dos A) Grupo Controle Óleo (III) e B) Teste DBTO2 (V)..............58


de intestinos delgados dos A) Grupo Controle Salina (I) e B) Teste DMH (II).................59

Figura 22: Diferenças nos níveis de expressão proteica dos grupos Teste DBT IV (barras

brancas) e Teste DBTO2 V (barras pretas) em relação ao grupo Controle Óleo III...........63

Figura 23: Mapa de interação proteica para proteínas diferencialmente expressas entre

grupos Teste IV e V e Controle III....................................................................................66


xviii

Figura 24: Diferença nos níveis de expressão proteica entre o grupo Teste DMH (II) e o

grupo Controle Salina (I). Os resultados representam a média ± SEM de triplicatas

biológicas independentes.................................................................................................67

Figura 25: Mapa de interação proteína-metabólito para proteínas diferencialmente

expressas entre grupos Teste II e Controle I.....................................................................70

Figura 26: Perfis eletroforéticos representativos em 1D SDS-PAGE 12% de proteínas de

Intestino Delgado (Controle DBT; Teste DBT (D)) e de Intestino Grosso (Teste DBT (G);

Controle DMH; Teste DMH) para a verificação da qualidade da extração proteica.........71

Figura 27: Fotografias representativas da titulação dos fagos obtidos no último ciclo de

seleção de cada grupo para isolamento das colônias de ER2738 e consequente

amplificação e sequenciamento do DNA.........................................................................73

Figura 28: Alinhamento das sequências peptídicas obtidas após sequenciamento do DNA

dos fagos selecionados randomicamente ao fim do terceiro ciclo de biopanning para os

três grupos avaliados........................................................................................................74

Figura 29: Perfis cromatográficos em sistema HPLC dos peptídeos obtidos em fase

reversa..............................................................................................................................76

Figura 30: Perfis eletroforéticos de 1D SDS-PAGE de extratos proteicos referentes a

grupos Controle e Testes após cromatografia de afinidade...............................................77

Figura 01.A: Contagens global e diferencial de leucócitos provenientes dos grupos

Controles (I e III) e Testes (II, IV e V) ao final do período de tratamento/latência............99

Figura 01.B: Dosagens enzimáticas séricas: A) Razão AST/ALT; B) Amilase

provenientes dos grupos Controles (I e III) e Testes (II, IV e V) ao final do período de

tratamento/latência.........................................................................................................100

Figura 01.E: Validação dos experimentos de imunohistoquímica e análise proteômica.

A) SDS-PAGE 1D de extratos de proteína total de intestino delgado dos animais


xix

pertencentes aos grupos III, IV e V. B) Western blotting para detecção de CEA, Calnexina

e β-actina........................................................................................................................155

Silva, K.T.S. Lista de Tabelas

xx

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Peptídeos selecionados por Phage display para síntese em fase sólida..........40

Tabela 02: Frequência de lesões observadas no intest. grosso dos animais pertencentes

aos Grupos I-V.................................................................................................................51

Tabela 03: Frequência de lesões observadas no intest. delgado dos animais pertencentes

aos Grupos I-V.................................................................................................................51

Tabela 04: Proteínas identificadas por spot nos géis referentes aos grupos Teste IV e V

que apresentaram alteração na expressão ≥ 1,5 vezes em relação ao grupo Controle III..60

Tabela 05: Proteínas identificadas por spot nos géis referentes ao grupo Teste II que

apresentaram alteração na expressão ≥ 1,5 vezes em relação ao grupo Controle I............61

Tabela 06: Massas moleculares preditas e observadas para cada peptídeo sintetizado....75

Tabela 01.C: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino delgado para

os Grupos Controle Óleo e Controle Salina....................................................................101

Tabela 02.C: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino grosso para

os Grupos Controle Óleo e Controle Salina....................................................................101

Tabela 01.D: Peptídeos sequenciados por proteína identificada através de espectrometria

de massas para os grupos Teste IV e V em relação ao grupo Controle III no experimento

empregando 2D SDS-PAGE..........................................................................................102


de massas para o grupo Teste III em relação ao grupo Controle I no experimento

empregando 2D SDS-PAGE..........................................................................................114

Silva, K.T.S. Lista de Tabelas

xxi


de massas para as bandas isoladas por cromatografia de afinidade e selecionadas em 1D

SDS-PAGE....................................................................................................................149

Tabela 01. F: Relação de proteínas que apresentaram região de similaridade com os

peptídeos selecionados por Phage display através do alinhamento de sequências realizado

por BLASTp..................................................................................................................156

Introdução

Silva, K.T.S. Introdução

2

1- INTRODUÇÃO

1.1. Epidemiologia

Apesar dos avanços tecnológicos, a incidência e a mortalidade por câncer têm

aumentado nas últimas décadas. Em 2008, a Agência Internacional para Pesquisa em

Câncer (IARC)/Organização Mundial de Saúde (WHO) estimou que ocorreriam 12,4

milhões de novos casos e 7,6 milhões de óbitos por câncer, doença esta que em 2030 será

responsável por mais de 11 milhões de óbitos em todo o mundo (UICC 2005; WHO 2007,

2008). No ano de 2014 mais de 220 mil pessoas vieram a óbito no Brasil vítimas desta

patologia (Fig. 05) (WHO, 2015).

Figura 01: Distribuição proporcional de óbitos no Brasil por tipo de câncer em 2014 por sexo.

Fonte: (WHO, 2015).

Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) o câncer é uma importante causa

de doença e morte no Brasil e desde 2003 as neoplasias malignas representam quase 17%

dos óbitos de causa conhecida notificados no Sistema de Informações sobre Mortalidade.

As estimativas para o ano de 2014 apontaram a ocorrência de 32.600 novos casos de

câncer colorretal sendo 15.070 homens e 17.530 mulheres. Além disso, ocorreram mais

de 14 mil óbitos por essa neoplasia em 2011 (INCA, 2015).

O câncer colorretal constitui atualmente uma neoplasia de ocorrência universal e

de importância crescente como problema de saúde pública. Sua incidência varia de

maneira importante entre os diferentes países, representando a terceira causa de câncer

no mundo entre ambos os sexos e a segunda em países desenvolvidos (Lopez and Monafo,

1993; Jemal et al., 2005). A soma de casos novos diagnosticados a cada ano atinge 50%


3

do total observado nos cinco continentes, como registrou em 2002 a Organização Pan-

Americana da Saúde (OPAS) (INCA, 2006).

Diante deste cenário, fica clara a necessidade da continuidade em investimentos

no desenvolvimento de ações para o controle do câncer nos diferentes níveis de atuação,

como na promoção da saúde, na detecção precoce, na assistência aos pacientes, e na

formação de recursos humanos.

1.2. Aspectos Gerais da Oncogênese

Neoplasia (gr. “neo” + “plasis” = neoformação) é o termo utilizado para

caracterizar a proliferação local de clones celulares atípicos, sem causa aparente, de

crescimento excessivo, progressivo, ilimitado, não coordenado, autônomo, irreversível, e

com tendência a perda de diferenciação celular (Robbins and Cotran, 2010). No entanto,

a persistência do crescimento é resultado de alterações genéticas que permitem a

proliferação excessiva e desregulada de forma autônoma; apesar de os tumores

geralmente dependerem do organismo hospedeiro para nutrição e suprimento sanguíneo.

As anomalias genéticas encontradas no câncer afetam tipicamente três classes

gerais de genes (Croce, 2008). Os genes promotores, ou oncogenes (1), os genes

supressores de tumor (2) e, os genes envolvidos no reparo do DNA (3). Quando algum

desses sofre mutação, os controles genéticos pelos quais eles são responsáveis são

perdidos e o processo carcinogênico pode ser iniciado (Vogelstein and Kinzler, 2004; Lea

et al., 2007; Croce, 2008).

Desta forma, o câncer é uma doença complexa e multicausal que ocorre como

consequência do acúmulo progressivo de mutações nos genes onde os produtos protéicos

desempenham importantes papéis no controle da proliferação e diferenciação celular e na

apoptose. Usualmente, diversos fatores promotores atuam anteriormente ao

desenvolvimento neoplásico e com poucas exceções, uma mutação única não é suficiente

para o estabelecimento da doença.

Todos os tumores, benignos ou malignos, apresentam dois componentes básicos:

células neoplásicas clonais que constituem seu parênquima, e estroma reativo, constituído

de tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e quantidade variável de macrófagos e linfócitos.

Sabe-se que os tumores malignos induzem resposta inflamatória celular crônica não

relacionada com necrose ou infecção do tumor, e o infiltrado é composto principalmente

de células T e macrófagos. Assim, a defesa imunológica responde a antígenos tumorais

http://pt.wikipedia.org/wiki/Oncogene

http://pt.wikipedia.org/wiki/Gene_supressor_de_tumor

http://pt.wikipedia.org/wiki/Gene_supressor_de_tumor


4

presentes na superfície das células malignas expressos diferencialmente daqueles das

células normais e, em alguns casos, pode ser responsável pelo retardo do crescimento

tumoral e de sua progressão (Zbar, 2004).

In vitro, células isoladas do sistema imune têm mostrado serem efetivas contra

tumores através de mecanismos como lise osmótica ou apoptose e citotoxicidade celular.

In vivo, contudo, os tumores parecem desenvolver mecanismos de escape ao sistema

imune. As células neoplásicas podem evadir ao sistema imune por diversas vias, sendo a

capacidade de interferência na função das células imunes o principal motivo de falha no

controle da progressão tumoral (Dunn et al., 2004; Bellati et al., 2009). Além disso, o

papel do microambiente tumoral no reconhecimento e progressão do câncer tem sido cada

vez mais estudado, e as interações entre as células imunes, as células tumorais e os

componentes moleculares do tumor exercem influência significativa na progressão da

doença (Rosenberg et al., 2004).

1.3. Trato Gastrointestinal Inferior

1.3.1. Características Gerais

O trato gastrointestinal inferior está morfologicamente divido em regiões

distintas: intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e intestino grosso (ceco, cólon, reto,

canal anal e apêndice). É constituído de várias camadas histológicas dispostas

concentricamente e similares em toda a extensão com pequenas modificações e

especificações regionais.

O intestino delgado apresenta modificações estruturais que aumentam a área total

da sua superfície e que promovem a absorção de nutrientes vindos da alimentação. Possui

quatro túnicas que compõem a parede intestinal: (1) mucosa; (2) submucosa; (3) túnica

muscular e (4) serosa, sendo as duas primeiras, os principais sítios de alterações

histológicas observadas em estágios iniciais de transformações neoplásicas (Fig. 01).

Tumores na região do intestino delgado são geralmente raros, correspondendo a cerca de

1 a 6% de todas as neoplasias do trato gastrointestinal (Rangel et al., 2000).

As pregas e vilos encontrados no intestino delgado não são encontrados no

intestino grosso, porém, as mesmas camadas constituem este segmento. As células

epiteliais são mais planas e a mucosa é mais espessa, possuindo longas Glândulas de


5

Lieberkuhn e grande abundância de células caliciformes quando comparado com o

intestino delgado (Fig. 02) (Vries et al., 2010).

Figura 02: Corte histológico de seção do duodeno no intestino delgado mostrando as camadas que

compõem o mesmo: Mucosa; Submucosa; Túnica Muscular e Serosa além de Tecido Conjuntivo, Células

Caliciformes e Glândulas de Lieberkhunn.

Fonte: Atlas Virtual de histologia UFSM

Figura 03: Corte histológico de seção de intestino grosso mostrando as camadas Mucosa, Submucosa,

Túnica Muscular e Serosa além de componentes característicos: Glândulas de Lieberkhunn e Células

Caliciformes.

Fonte: Atlas Virtual de histologia UFSM


6

1.3.2. Câncer Intestinal

Os adenomas constituem os tipos de pólipos mais frequentemente encontrados no

intestino delgado, possuindo predileção pelo duodeno distal embora possam ser

encontrados em toda a sua extensão. Histologicamente, eles são similares aos adenomas

encontrados na região colorretal tendendo a apresentar uma arquitetura de vilos mais

pronunciada. Assim como para a região colorretal, o risco de progressão maligna de um

adenoma é maior quanto maior for o pólipo (Brosens et al., 2007).

A transformação de células epiteliais normais em adenomas e carcinomas segue,

usualmente, um modelo de progressão de estágios histológicos e alterações genéticas e

epigenéticas simultâneas (Fearon and Vogelstein, 1990) (Fig. 03). Tais alterações

fornecem às células neoplásicas vantagens sob sua expansão clonal e levam à perda da

inibição por contato celular, evasão de mecanismos apoptóticos e de interrupção do ciclo

celular, aquisição de características do tipo célula tronco, entre outros (Cardoso et al.,

2007).

Figura 04: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal. A iniciação e progressão da tumorogênese

de uma mucosa normal em carcinoma e metástase é geralmente associada a características morfológicas e

histopatológicas. Fonte: Adaptado de Cardoso et al., 2007 e Perse and Cerar, 2011.

A sequência adenoma-carcinoma-metástase é iniciada quando surgem pequenas

lesões na arquitetura glandular do epitélio intestinal chamadas focos de criptas aberrantes


7

(ACF). Os ACF são agregados de criptas anormais caracterizados por hiperproliferação,

tamanho aumentado, zonas pericrípticas expandidas e fendas alongadas (Rosenberg and

Liu, 1995; Papanikolaou et al., 1998; Papanikolaou et al., 2000).

Algumas mutações estágio-específicas que ocorrem no modelo de progressão

adenoma-carcinoma-metástase são conhecidas, e incluem alterações no gene supressor

de tumor APC (Adenomatous polyposis coli) (Epitélio Normal Adenoma), no proto-

oncogene K-ras (presente em adenomas) e no gene supressor de tumor p53 (na transição

Adenoma Carcinoma) (Nambiar et al., 2010). Além disso, outros genes estão

significativamente alterados em diferentes classes de tumores e envolvidos na

carcinogênese colorretal, no entanto, métodos de classificação e estadiamento do tumor

e realização de prognósticos mais robustos e menos invasivos continuam sendo

necessidades médicas ainda não atendidas (Fig. 04) (Hoops and Traber, 1997; Nambiar

et al., 2010).

Figura 05: Eventos genéticos envolvidos no desenvolvimento do câncer colorretal. A acumulação

gradativa de mutações afeta o controle de crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. Para o CCR

os genes cruciais envolvidos no desenvolvimento de pólipos e câncer para cada etapa são mostrados nas

caixas brancas.

Fonte: Adaptado de Simpson and Dorow, 2001.

Os recentes progressos da proteômica têm contribuído para o entendimento da

patofisiologia das neoplasias, propiciando novas perspectivas para diagnósticos e

descoberta de novas drogas anti-câncer. A avaliação sistemática do proteoma, de forma a

comparar a expressão proteica de duas células, tecidos ou organismos em diferentes

condições fisiológicas possibilita a obtenção de informações para identificação,


8

quantificação e caracterização de modificações pós-traducionais presentes em proteínas

e que influenciam diretamente o funcionamento celular (Wilkins et al., 1996; Cho, 2007).

Nesse sentido, a proteômica tem sido utilizada também como nova ferramenta na

busca por biomarcadores moleculares para o câncer colorretal (CCR). As alterações na

expressão proteica envolvidas na transformação maligna podem ser monitoradas de

maneira quantitativa e qualitativa e fornecem valiosas informações que podem ser

utilizadas para a obtenção de diagnósticos e prognósticos mais efetivos. Além disso,

representam um grande impacto na oncologia clínica, especialmente se o biomarcador

pode ser detectado antes dos sintomas clínicos ou se permite um acompanhamento da

resposta ao tratamento (Cho, 2007; Alhquist, 2010).

Embora as alterações moleculares relacionadas ao CCR tenham sido

extensivamente investigadas, poucos pesquisadores têm descrito as aplicações desses

biomarcadores na detecção de estágios primários de diagnóstico e prevenção do câncer.

Considerando que o CCR pode ser prevenido se o adenoma for diagnosticado e removido,

torna-se necessária a identificação de marcadores capazes de diagnosticar de maneira

tecido-específica e precoce as alterações iniciais que ocorrem durante o desenvolvimento

desta doença (Chang et al., 2005).

1.3.3. Fatores de Risco e Genéticos

A explicação para os altos índices encontrados para o CCR está na maior

exposição dos indivíduos a fatores de risco cancerígenos. A redefinição dos padrões de

vida, a partir da uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo

desencadeados pelo processo global de industrialização refletem-se no perfil

epidemiológico das populações (Montesano and Hall, 2001).

Fatores de risco hereditários e ambientais (dietéticos ou não) estão envolvidos no

desenvolvimento do CCR. As alterações genéticas que levam a esta doença podem ser

adquiridas, gerando o chamado câncer esporádico, responsável por 75 a 85% dos casos.

Nele, existe uma ação cumulativa de agentes carcinógenos ambientais e dietéticos sobre

a mucosa, levando a modificações específicas no DNA das células do epitélio intestinal

(Cecconello, 2008). Em outras circunstâncias, o indivíduo já apresenta ao nascimento ou

adquire precocemente mutações específicas que desencadeiam as formas hereditárias do

CCR, representadas principalmente pela polipose adenomatosa familiar (PAF) e pelo

câncer colorretal hereditário não associado à polipose (Hoops and Traber, 1997).


9

Quanto à influência da alimentação, é sabido que a dieta ocidental caracterizada

pelo alto teor de gordura saturada, juntamente com a ingestão excessiva de proteína de

origem animal e baixo teor de fibras, está associada a maior potencial carcinogênico.

Também são considerados nocivos, os fatores relacionados ao estilo de vida como fumo,

sedentarismo, obesidade, consumo excessivo de álcool e ingestão de aminas

heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos (Marques-Vidal et al., 2006).

1.4. Visão Geral de Vias de Sinalização Atuantes no CCR

No cólon humano, cerca de 10 bilhões de novas células são geradas diariamente

por progenitoras localizadas na base das criptas. O destino desse novo epitélio é

determinado por sinais extracelulares gerados a nível populacional. Tal sinalização

extrínseca é realizada por morfógenos, proteínas solúveis que formam gradientes de

concentração e atuam de maneira dose dependente induzindo respostas celulares distintas

em suas células alvo (Tabata and Takei, 2004).

1.4.1. Via Wnt/β-catenina

A via de sinalização Wnt/β-catenina é altamente conservada em eucariotos e

participa de diversos acontecimentos ligados ao desenvolvimento celular. Ela

desempenha papéis na proliferação, movimento, estabelecimento da polaridade e decisão

do destino celular e manutenção de células tronco. Um dos caminhos mais bem estudados

para essa via é caracterizado pela estabilização e acúmulo de β-catenina no citosol, que

então migra para o núcleo onde participa da ativação da transcrição de proteínas chave na

carcinogênese como c-Myc, VEGF, ciclina D1, entre outras (via canônica) (Krauzova

and Korinek, 2014; Markowska et al., 2014; Klimczak, 2015).

Na ausência de Wnt, a proteína β-catenina é constantemente degradada pela ação

do complexo proteico formado por Axina, APC, CK1 (caseína quinase 1) e GSK3

(glicogênio sintase quinase 3). As proteínas CK1 e GSK3 fosforilam continuamente a

região N terminal de β-catenina que resultam no reconhecimento do produto fosforilado

por β-Trcp, uma subunidade de E3 ubiquitina ligase. A ubiquitinação de β-catenina leva

a sua degradação proteassomal prevenindo assim que esta proteína migre para o núcleo e

ative a transcrição de genes reprimidos pelo complexo TCF/LEF ligado ao DNA (Fator

T celular/Fator Potenciador Linfóide) (Fig. 06, A). A via é ativada quando um ligante


10

Wnt se liga ao receptor transmembrana Fz (Frizzled) e seu co-receptor LRP6 (Lipoprotein

receptor related protein 6). Ocorre a formação de um complexo transmembrana Wnt-Fz-

LRP6 e recrutamento de uma terceira proteína chamada Dvl (Dishevelled), que por

fosforilação resulta no sequestro do complexo de degradação, inibindo-o (Fig. 06, B)

(MacDonald et al., 2009; White et al., 2012).

Figura 06: Via Wnt/β-catenina. A) Na ausência de Wnt, β-catenina é fosforilada pelo complexo formado

por Axina, CK1, GSK3 e APC sendo posteriormente reconhecida e ubiquitinada por β-Trcp e direcionada

para degradação proteassomal. B) Na presença de ligante Wnt, ocorre a formação de um complexo receptor

Fz-LRP6 que sequestra o complexo de degradação inibindo-o e estabilizando a β-catenina presente no

citosol que então migra para o núcleo onde co-ativa TCF levando à transcrição dos regulados por esta

proteína.

Fonte: MacDonald et al., 2009.

Os mamíferos apresentam 19 formas de proteínas Wnt ricas em cisteína e com

peptídeo sinal N-terminal para secreção. Tais proteínas sofrem glicosilação e lipidação

antes da excreção e tais modificações têm papel direto na ativação da via. No CCR cerca

de 90% dos tumores apresentam alguma mutação em fatores regulatórios da via sendo as

mais comuns aquelas que afetam o gene APC ou CTNNB1 (β-catenina). Tais mutações

conferem diferentes níveis de ativação da via e requerem diferentes subconjuntos de

eventos cooperativos (p. ex. silenciamento epigenético, sinais do microambiente ou

alterações em outras vias) para levar à progressão tumoral por diferentes mecanismos

(Brabletz et al., 1998; Vermeulen et al., 2010; White et al., 2012).


11

O crosstalk entre a via Wnt/β-catenina e outras vias de sinalização ligadas ao

desenvolvimento podem modular a via β-catenina no CCR. A proteína de membrana

Notch1 pode se ligar à β-catenina ativa e regular negativamente sua função em células

tronco e tumorais. A via Hedgehog também pode regular a via Wnt/β-catenina. Arimura

e colaboradores demonstraram correlação entre a presença do mediador de Hedgehog,

Smoothened (Smo), e aumento da atividade de Wnt/β-catenina em camundongos

mutantes para APC (Arimura et al., 2009).

Por fim, deve-se ressaltar que embora a via Wnt/β-catenina seja essencial na

reprogramação celular relacionada ao CCR através do estímulo da expressão gênica de

fatores chave, ela possui um efeito transitório e ativo somente nos estágios iniciais da

transformação não sendo necessária para a manutenção celular de pluripotência

(Klimczak, 2015).

1.4.2. Via Notch

A via Notch é essencial na diferenciação de células caliciformes e células

progenitoras, participando da regulação do desenvolvimento e homeostase intestinal. Em

humanos e camundongos os ligantes Notch (Jagged1, Jagged2, DLL1, DLL3 e DLL4)

ativam os receptores Notch (Notch1-4) levando à transcrição de diversos genes alvo (p21,

Hes-1, Dellex, etc) (Fre et al., 2005).

Um ligante Notch presente na membrana de uma célula adjacente liga-se a um

receptor presente na célula receptora. A interação receptor-ligante leva à ativação do

complexo enzimático γ-secretase que cliva a região transmembrana do próprio receptor

Notch (NICD) ativando-o. A porção NICD migra para o núcleo celular onde liga-se a um

regulador transcricional (CBP ou RBP-JK em vertebrados). O complexo formado desloca

co-repressores ligados aos fatores de transcrição e recruta co-ativadores transcricionais

que induzem a expressão gênica (Fig. 07). Diversas vias de sinalização podem ser super

reguladas através da ativação da via Notch, como por exemplo a via PI3K/AKT por

inativação de PTEN (homólogo de fosfatase e tensina deletado no cromossomo 10) e as

vias c-Myc e EGFR (receptor de fator de crescimento epidermal). A ativação da via

parece estar associada com o desenvolvimento primário do CCR indicando que este é um

evento inicial na carcinogênese colorretal (Qiao and Wong, 2009; Miyamoto and

Rosenberg, 2011; Xie et al., 2014).


12

Figura 07: Diagrama simplificado da via de sinalização Notch e seus possíveis alvos. Setas para cima

indicam aumento de expressão regulada por Notch e setas para baixo indicam diminuição de expressão

regulada por Notch.

Fonte: Qiao and Wong, 2009.

1.4.3. Via Hedgehog

Hedgehog são moléculas sinalizadoras secretadas que em mamíferos englobam

três proteínas homólogas com diferentes distribuições temporais e espaciais: Sonic

hedgehog (Shh); Indian hedgehog (Ihh); Desert hedgehog (Dhh) referidas em conjunto

como Hhs (Ingham and McMahon, 2001). Essas proteínas atuam via receptores de

membrana Patched (Ptch), cuja expressão é super regulada pela sinalização de Hh, e

Smoothened (Smo). Na ausência de Hh, Ptch inibe cataliticamente a atividade de Smo

afetando sua localização na membrana celular. Uma molécula endógena que atua como

agonista de Smo é transportada para fora da célula por Ptch prevenindo sua ligação a

Smo. Quando presente Hh liga-se a Patch inativando-a e consequentemente ativando Smo

que traduz o sinal ao citoplasma via GLI (família de fatores de transcrição com motivo

dedo de zinco) (Fig. 08) (Bale and Yu,2001; van den Brink and Hardwick, 2006;

Mazumdar et al., 2011).


13

Figura 08: Via de sinalização Hedgehog em vertebrados. A cascata de Hh é iniciada quando Hh liga-se a

Patch ativando uma segunda proteína transmembrana chamada Smo. Os fatores de transcrição GLI

localizados downstream na via de sinalização ativam a transcrição de genes alvo (GLI A). Na ausência de

Hh Ptch inibe a atividade de Smo afetando sua localização na membrana e levando ao processamento

proteolítico de proteínas GLI reprimindo a transcrição de genes alvo (GLI R).

Fonte: Adaptado de Gupta et al., 2010.

Os fatores GLI existem como três proteínas separadas: GLI1 e GLI2 que atuam

como ativadores transcricionais e GLI3 que atua como repressor transcricional. A

expressão de GLI1 é altamente dependente da ativação da sinalização por Hh. Na

ausência de Hh, Ptch bloqueia a atividade de Smo e as proteínas GLI são

proteoliticamente processadas para gerar o repressor GLIR, largamente derivado de GLI3

que reprime a transcrição. A ligação de Hh a Ptch interrompe a inibição de Smo gerando

o ativador GLIA constituído principalmente por GLI2 e ativando a expressão de genes

alvo (GLI1, Ptch1, proteína de interação com Hh, Ciclina D, Myc, Bmi1, Bcl2, VEGF,

etc). A ativação de GLI é regulada em diferentes níveis via fosforilação por inibidores

como Ren, PKA, GSK3 e ativadores como Dyrk1, Akt e Ras (Gupta et al.,2010).


14

1.4.4. Via PI3K/Akt

A ativação da via PI3K/Akt (fosfatidilinositol-3 quinase) ocorre através da ligação

de fatores de crescimento, citocinas ou insulina a um receptor de membrana tirosina

quinase, levando à autofosforilação de um domínio intracelular do mesmo. Tal

fosforilação permite que ocorram alterações na conformação e subsequente ativação de

PI3K (composta por uma subunidade catalítica – p110 e uma subunidade regulatória –

p85). PI3K promove a transformação de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em

fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) que, por sua vez, medeia a fosforilação e ativação

de Akt. PIP2 e PIP3 são lipídeos chave responsáveis por mediar respostas celulares ao

estímulo por fatores de crescimento ou citocinas, ligação de integrinas, e sinalização via

integrina quinase ou quinase de adesão focal (FAK) (Markowska et al., 2014).

Akt, também conhecida como proteína quinase B (PKB), pode ser ativada também

em condições de hipóxia, hipoglicemia, ação de radicais livres entre outras. Um dos

principais papéis de Akt é a promoção da proliferação celular e inibição da apoptose por

fosforilação de caspase 9 e interação com o antagonista de morte celular BCL2. A

fosforilação e inativação de GSK3 por Akt leva à inibição da ligação de GSK3 às ciclinas

D e E, e aos fatores de transcrição c-Myc e c-Jun, protegendo-os da degradação

proteolítica e favorecendo a entrada da célula na fase S. Quando ativada, Akt promove a

síntese proteica e crescimento celular por ativação do complexo mTORC1 que ativa a

quinase p70 S6, promovendo aumento na tradução de RNA mensageiro e ativando a

proteína ribossomal S6 e o fator de elongação 2 (EEF2) (Fig. 09). Além disso, Akt

também regula o balanço de carboidratos por aumento de expressão dos transportadores

de glicose GLUT1 e GLUT3, e facilitando a translocação de GLUT4 à membrana celular,

contribuindo para um aumento de influxo de glicose na célula (Brown and Toker, 2015;

Simpson et al., 2015).


15

Figura 09: Via de sinalização PI3K/Akt e vias associadas. PTEN: Homólogo de fosfatase e tensina

deletado no cromossomo 10; PI3K: fosfoinositol 3-quinase; EGFR: receptor de fator de crescimento

epidermal; ERK ½: quinase regulada por sinal extracelular ½; FGFR: receptor de fator de crescimento de

fobroblasto; HER2: fator de crescimento epidermal humano; IRS-1: substrato para receptor de insulina 1;

MEK ½: proteinaquinase ½ ativada por mitógeno; VEGFR: fator de crescimento vascular endotelial.

Fonte: Simpson et al., 2015.

Como descrito anteriormente, as vias de sinalização relacionadas ao

desenvolvimento celular estão interligadas em um complexo nível de regulação celular.

Na Figura 10 podemos observar os pontos de regulação cruzada exercidos pelas três vias

descritas neste tópico.


16

Figura 10: Vias de sinalização Notch, Wnt, e Hedgehog regulando o destino celular. A) Via Notch: a

interação ligante-receptor promove a clivagem do domínio NICD por γ-secretase e sua translocação para o

núcleo com consequente indução da transcrição de genes alvo. B) Via Wnt: estabilização e acúmulo nuclear

de β-catenina que se associa com os fatores de transcrição LCF/LEF e co-ativadores (CBP) ativando a

expressão de genes alvo. C) Via Hedgehog: o ligante Hh ativa o receptor Ptch que por sua vez libera o

receptor Smo. Smo então passa a inibir a fosforilação e clivagem de GLI por GSK3, CK1 e PKA

promovendo a formação de GLIA que ativa a transcrição. Notar que a transcrição de genes por Hedgehog

ativa a via Notch e a presença de GSK3 3 CK1 do complexo de degradação de Wnt são também

responsáveis por inibir a via Hedgehog por fosforilação de GLI.

Fonte: Malhotra et al., 2011

1.5. Carcinogênese Química

Os cânceres causados por agentes ambientais frequentemente ocorrem em tecidos

como pulmão, trato gastrointestinal e pele, porque esses órgãos estão expostos ao

ambiente (Shubik and Sice,1956). Recentemente, o estudo da carcinogênese química tem

sido mesclado com estudos de alterações celulares em células cancerígenas,

possibilitando assim a busca por marcadores biológicos e vias metabólicas alteradas.

A carcinogênese química causa alterações genéticas e epigenéticas em células

susceptíveis que podem transmitir vantagem seletiva para o crescimento e sofrer

expansão clonal. Sendo assim, elas se tornam geneticamente instáveis e transformadas


17

em células neoplásicas. O primeiro estágio da carcinogênese, o de iniciação tumoral,

envolve a exposição de células normais a carcinógenos físicos e químicos. Estes

carcinógenos causam danos ao DNA e a outras macromoléculas fornecendo às células

iniciadas responsividade alterada ao microambiente e vantagem proliferativa. No segundo

estágio, a promoção tumoral resulta na proliferação excessiva das células iniciadas e

aumenta a probabilidade de ocorrência de danos genéticos adicionais, incluindo mutações

endógenas que acumulam na população em expansão. No estágio de progressão tumoral

ou terceiro estágio ocorre a aquisição de múltiplas alterações genéticas e multiplicação

descontrolada e irreversível das células alteradas (Loeb and Harris, 2008; Irigaray and

Belpomme, 2010).

O campo de estudos sobre a carcinogênese química provavelmente teve início

com as associações epidemiológicas de ocorrência de tumores com a exposição à fumaça

de tabaco realizadas por Hill e Pott no início do século 18. A partir daí, seguiram-se

observações de tumores no trato urinário de trabalhadores que mantinham contato com

arilaminas nas fábricas européias no final do século 19. Além destes, trabalhos com

animais experimentais envolvendo hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA)

derivados de óleos crus serviram desde então como importantes protótipos para o estudo

de HPA (Guengerich,2001).

Os HPA representam uma importante classe de poluentes ambientais os quais têm

recebido atenção especial pelo fato de alguns de seus componentes demonstrarem forte

potencial mutagênico e carcinogênico, além de desempenharem papéis cruciais em três

problemas ambientais importantes: poluição do ar, chuva ácida e mudança climática

global. Esses compostos estão presentes nos combustíveis fósseis e são formados durante

a combustão incompleta e pirólise de matéria orgânica. Eles podem, por exemplo, ser

gerados durante incêndios florestais e erupções vulcânicas além de serem constituintes

naturais dos óleos crus, alguns tipos de alimentos e produtos petroquímicos. Além disso,

podem ser formados pelo gás de cozinha e no tráfego, sendo também uma das diversas

classes de carcinogênicos químicos presentes na fumaça de cigarro (Honer, 2001).

A ampla distribuição dos HPA provenientes de fontes naturais e antropogênicas

juntamente com processos de distribuição e transporte explica sua ocorrência ubíqua. Os

seres humanos são expostos a HPA ambientais, ocupacionais, medicinais e provenientes

da dieta. A absorção através do trato pulmonar, gastrointestinal e da pele ocorre de

maneira dependente do tipo de HPA, do tamanho das partículas onde estão adsorvidos,


18

da composição do adsorvente, e da sua afinidade por gordura (Jacob and Grimmer, 1996;

Angerer et al., 1997; Schoket, 1999; Strickland and Kang, 1999).

O metabolismo desempenha um importante papel na conversão de carcinógenos

químicos em espécies reativas que danificam macromoléculas celulares, interferem com

vias de sinalização e que podem causar câncer. Células de cólon humano sabidamente

metabolizam HPA. Os níveis induzíveis das enzimas do complexo citocromo P450

(CYP450) podem influenciar no desenvolvimento de tumores nos intestinos grosso e

delgado como consequência da ingestão de HPA (Diggs et al., 2011). Em roedores, a

absorção no trato gastrointestinal ocorre rapidamente e picos destes compostos podem ser

identificados no sangue 1-2 horas após a administração (Lipniak et al., 1993).

1.5.1. Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona

O petróleo e o carvão são importantes combustíveis fósseis de composição

complexa da qual se distinguem quatro famílias de compostos: hidrocarbonetos alifáticos,

cíclicos, aromáticos e heteromoléculas contendo átomos de nitrogênio (N), enxofre (S)

ou oxigênio (O) na estrutura. Os compostos sulfurados constituem a terceira população

presente nesses combustíveis e, devido à sua difícil biodegradabilidade, são considerados

compostos recalcitrantes podendo servir como marcadores da poluição gerada por óleo.

O dibenzotiofeno (DBT) e seus derivados são os maiores representantes desta classe (Fig.

11) (Kropp et al., 1997; Heilmann et al., 2004).

O conteúdo elevado de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos sulfurados

(HPAS) em produtos do petróleo compromete a qualidade dos mesmos e sua remoção ou

conversão em estruturas menos tóxicas é uma importante etapa no processo de refino

(Zhang et al., 2005). Os limites de concentração desses compostos em combustíveis

obedecem às legislações específicas de cada país com o objetivo de minimizar os efeitos

negativos à saúde e ao ambiente. A gasolina e o diesel comercializados na comunidade

Européia e nos EUA devem apresentar, respectivamente, os limites máximos de 30 e 50

ppm de HPAS. A Alemanha limitou o conteúdo de enxofre presente no diesel e na

gasolina a 10 ppm em 2001 (Babich and Moulijn, 2003).


19

Figura 11: Estruturas químicas dos principais compostos contendo enxofre encontrados no petróleo.

Fonte: Adaptado de Speight, 2002.

Visando uma redução da queima e consequente emissão de compostos sulfurados

no ambiente, diversos estudos buscam o desenvolvimento de tecnologias para a

remediação do enxofre de combustíveis. A redução dessas substâncias por parte das

refinarias revela a preocupação do setor em oferecer combustíveis menos tóxicos e menos

poluentes. Neste contexto, o dibenzotiofeno é utilizado na verificação da eficiência de

processos de dessulfurização em derivados do petróleo e, apesar disso, poucos relatos

sobre sua ação tóxica em mamíferos têm sido apresentados (Leighton, 1989; Kobayashi

et al., 2000; Madeira et al., 2008; Scherer et al., 2009).

Trabalhos da década de 80 foram realizados em animais experimentais

empregando doses maciças de DBT e derivados por via oral e subcutânea na expectativa

de demonstrar efeitos tóxicos. Tais trabalhos estabeleceram a dose letal (DL50) de 470

mg/kg e graves lesões no pâncreas e fígado, congestão pulmonar, edema, e hemorragia

intestinal com doses de 335 mg/kg observadas nos ratos que sobreviveram a um tempo

maior que 24 horas após a ingestão do DBT. Outros estudos onde foram administrados o

DBT e outros análogos ativos de petróleo demonstraram, além dos efeitos citados acima,

alterações nos linfonodos mesentéricos e necrose das células do timo (Leighton, 1989).

A toxicidade individual dos HPA de maneira geral está relacionada com a ativação

metabólica e a formação de metabólitos carcinogênicos responsáveis pela alquilação do

DNA e do estágio de iniciação através de mecanismos complexos associados à


20

carcinogênese química (Aas et al., 2000). Os metabólitos ativos formados a partir de HPA

são produtos de reações catalisadas por enzimas CYP450 em particular, pela isoenzima

P4501A1 e, embora os níveis basais dessa isoforma sejam baixos em diversos tecidos,

ocorre uma indução da sua expressão após a exposição a diversos tipos de HPA

(Soontjens et al., 1997; Jones et al., 2000).

Uma das vias de metabolização do DBT inicialmente descrita em espécies de

Rhodococcus sp. IGTS8 é chamada de via sulfóxido-sulfona-sulfonato-sulfato ou “Via

4S”. Durante o metabolismo, o DBT sofre a ação de um sistema multienzimático com

três diferentes atividades, que promovem um ataque oxidativo progressivo no grupo

tiofênico. A primeira enzima da via é uma monooxigenase que oxida o DBT a 5,5’-

dióxido de DBT (DBTO2) em dois passos; a segunda enzima apresenta atividade similar

à uma monoxigenase e converte o 5,5’-dióxido de DBT a 2’- hidroxibifenil-2-sulfinato.

Finalmente, a quebra da ligação C-S transforma o 2’-hidroxibifenil-2-sulfinato em dois

produtos finais, 2-hidroxibifenil (HBP) e sulfito (Fig. 12) (Gray et al., 1996).

Figura 12: “Via 4S”. O enxofre é removido na forma de sulfito, permanecendo intacta a estrutura

hidroxilada.

Fonte: Silva, 2007.


21

Sabe-se que exposições ao DBT presente em ambientes aquáticos podem exercer

efeitos em embriões de zebrafish, como por exemplo, promovendo uma curvatura dorsal

do tronco e cauda, redução do crescimento, e edemas severos do pericárdio e saco

vitelínico. Deformidades similares comumente chamadas de síndrome do saco azul e

reduções no nível de incubação concentração-dependentes também foram observadas

(Wozny et al., 2010).

Como a dieta é uma das principais fontes de exposição humana e animal a HPA,

as células epiteliais intestinais constituem os alvos primários a entrarem em contato com

os contaminantes. O metabolismo de HPA pelos citocromos P450 é bem caracterizado e,

embora exista evidência considerável de que o fígado de mamíferos pode metabolizar tais

substâncias, o metabolismo em tecidos extra-hepáticos como o intestino pode ser de

grande importância (Cavret and Feidt, 2005).

O fato de agentes químicos promoverem alterações randômicas no genoma

justifica o direcionamento de esforços para a quantificação dessas mudanças, diminuição

da exposição a esses agentes e desenvolvimento de alternativas para a quimioprevenção.

1.5.2. 1,2-Dimetilhidrazina

O modelo de indução de CCR utilizando DMH é largamente aplicado por

compartilhar similaridades histológicas, morfológicas e moleculares com o câncer

esporádico observado em humanos (Chen and Huang, 2009; Rosenberg et al., 2009). Tal

substância é metabolizada pelo fígado por diversas reações e intermediários (AOM –

azoxymethanol e MAM – methylazoxumethanol), levando à formação do produto final

altamente reativo: íon metildiazônio. O intermediário MAM pode ser excretado junto à

bile e transportado ao cólon a partir do intestino delgado, ou seguir diretamente às células

epiteliais do cólon via circulação na corrente sanguínea. Este metabólito é responsável

pela metilação de bases do DNA do tecido epitelial resultando em apoptose, aumento na

proliferação e surgimento de mutações nesse tecido (Chang, 1984; Perse and Cerar,

2011).

1.6. Biomarcadores e Câncer

Como importantes indicadores biológicos do estado de progressão tumoral e

condição fisiológica das células, os biomarcadores representam ferramentas poderosas no


22

monitoramento do câncer e aferição da eficácia e segurança de agentes quimioterápicos

(Duffy et al., 2003; Cho, 2007). Tais moléculas podem ser divididas pela habilidade de

auxiliar na prevenção, promover detecção precoce, estabelecer prognóstico e predizer a

resposta do paciente a terapias específicas (McLeod and Murray, 1999; Kulasingam and

Diamandis, 2008). A descoberta de biomarcadores também auxilia no entendimento de

mecanismos biológicos que ocorrem durante o desenvolvimento e progressão da doença.

A ação de circuitos regulatórios e a ocorrência de reações cruzadas entre as vias

envolvidas no processo bioquímico de estabelecimento do câncer dificulta o

entendimento e predição do funcionamento intracelular. Como nas células normais, a

maioria das células tumorais utiliza vias de sinalização redundantes para assegurar a

manutenção e viabilidade das funções críticas à sobrevivência (Cho, 2007).

O estadiamento convencional para o CCR não leva em conta a grande

variabilidade existente entre os pacientes e, alguns estágios de progressão não podem ser

preditos utilizando o critério histopatológico comum (Kahlenberg et al., 2003). Com o

avanço das técnicas de análise molecular e uma melhor compreensão dos mecanismos

envolvidos na tumorogênese, diversos fatores prognósticos moleculares têm sido

identificados.

Entre os marcadores proteicos conhecidos, o antígeno carcinoembrionário (CEA)

é utilizado atualmente na clínica para prognóstico molecular em câncer colorretal. A

concentração sérica desta molécula acima de 5 ng/mL está associada com a recorrência

da doença e metástase. O CEA é uma glicoproteína de membrana de alta massa molecular

pertencente à superfamília das imunoglobulinas. Esta molécula desempenha papéis na

adesão celular, imunidade e apoptose estando implicada na ocorrência de metástase

(Duffy et al., 2003; Kahlenberg et al., 2003).

Embora o CEA seja o biomarcador mais utilizado no CCR, sua detecção somente

torna-se possível em pacientes em estágio de desenvolvimento avançado, o que impede

que ele seja útil na detecção precoce deste tipo de câncer. Outros antígenos tumorais têm

sido estudados como potenciais biomarcadores para o CCR. Entre eles destacam-se o

CA19-9 (antígeno carboidrato 19-9), CA 242, CA-195, CA 50, CA 74-2, CD44 (Cluster

differentiation 44) e o TIMP-1 (inibidor tecidual de metaloproteinase-1). Entretanto,

assim como o CEA, esses marcadores possuem baixa sensibilidade e especificidade não

sendo adequados para propósitos de triagem ou diagnóstico precoce para o CCR (Cho et

al., 1997; Coppola et al., 1998; Li et al., 2001; Qiu et al., 2008).


23

Sendo assim, o entendimento das bases bioquímicas e alterações moleculares

envolvidas na carcinogênese pode facilitar a detecção de tumores em estágios iniciais e

lesões pré-cancerosas que apresentam risco de sofrer transformações malignas. A

detecção pré-sintomática desses estágios iniciais traz grande benefício na redução dos

níveis de mortalidade (Alquist, 2010).

1.6.1. Proteômica e Phage Display

As aberrações relacionadas aos tumores afetam os níveis genômicos,

transcricionais e pós-transcricionais (Hassaneim et al., 2011). Desde o sequenciamento

do genoma humano, vários esforços na aplicação das análises de expressão gênica na

pesquisa médica, especialmente em câncer, têm sido realizados. Estudos no nível de

expressão gênica resultam em melhor entendimento do comportamento celular tanto nas

células normais quanto nas células tumorais (Wulfkuhle et al., 2003). Entretanto,

geralmente não há relação direta entre alterações na expressão gênica e níveis de

expressão proteica.

As proteínas são os maiores elementos funcionais das células e os estudos de seus

perfis de expressão em processos regulatórios podem auxiliar no entendimento das

alterações moleculares presentes no câncer. Os estudos de interação de proteínas com

outras moléculas, indução e controle de vias metabólicas, proliferação celular,

crescimento, apoptose e senescência, oferecem uma visão única de sistemas biológicos

complexos (Chuthapisith et al., 2007).

Métodos proteômicos utilizados na identificação de marcadores tumorais tem

como objetivo buscar modificações específicas nas proteínas de tecidos tumorais para

permitir a realização de tratamentos individualizados para certos tipos de câncer

(Simpson and Dorow, 2001). Tradicionalmente, a análise do perfil proteômico de

misturas complexas como lisados celulares ou frações sub celulares enriquecidas, envolve

a combinação de diversas técnicas de fracionamento com a espectrometria de massas

(MS) para a identificação das proteínas que compõem a amostra (Cecconi and Zamò,

2011).

Além da identificação e análise dos níveis de expressão proteicos, há um grande

interesse na elucidação das redes de interação de proteínas relacionadas ao câncer. A

habilidade de utilizar bibliotecas sintéticas de peptídeos para obter ligantes específicos de


24

proteínas e entender suas interações permite uma maior compreensão das alterações

relacionadas ao proteoma tumoral (Sidhu and Koide, 2007).

A tecnologia de apresentação por fagos (Phage Display) consiste na fusão gênica

de sequências nucleotídicas que codificam proteínas ou peptídeos ao DNA de um vírus

bacteriófago e resultam na expressão heteróloga dessas sequências na superfície do

capsídeo viral (Smith, 1985). A construção de uma biblioteca peptídica com sequências

aleatórias (geralmente com mais de 1011 sequências) constitui uma população de ligantes

com diferentes capacidades de interação com moléculas alvo provenientes de tecidos ou

células (Scott and Smith,1990; Sidhu et al., 2000).

Técnicas combinatoriais permitem a seleção imparcial de ligantes em um ensaio

funcional sem conhecimento sobre a natureza do alvo na doença. Entretanto, é difícil

isolar ligantes específicos devido à complexidade de alvos expressos simultaneamente

em um tecido ou população celular. Estudos recentes detectaram um grande número de

alvos moleculares super regulados em células tumorais ou associadas a tumores (St Croix

et al., 2000; Ruoslahti, 2001; Vogelstein and Kinzler, 2004).

A identificação de receptores e seus ligantes correspondentes seletivamente

expressos em patologias específicas podem ser úteis no desenvolvimento de sistemas de

entrega de drogas, realização de terapia com o uso de vetores e drogas citotóxicas, o que

aumentaria a janela terapêutica até mesmo para os tratamentos já utilizados (Sergeeva et

al., 2006).

Justificativa

Silva, K.T.S. Justificativa

25

2- JUSTIFICATIVA

A importância dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e a escassez de estudos

toxicológicos relacionados às consequências da contaminação ambiental pelos agentes

Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona, colocam essas substâncias como importantes

objetos de investigação científica. Poucos trabalhos demonstram a caracterização

toxicológica desses compostos em modelos animais, especialmente em mamíferos,

ressaltando a relevância do presente estudo. No que se refere à exposição a substâncias

químicas com baixa solubilidade em água, e presentes em pequenas proporções no

ambiente, a avaliação de tratamentos crônicos utilizando baixas doses é de extrema

importância para uma real avaliação toxicológica. Nesse sentido, esse trabalho tem como

preocupação iniciar uma investigação voltada para a busca de biomarcadores proteicos

associados ao processo de indução crônica de câncer promovida por Dibenzotiofeno e

Dibenzotiofeno Sulfona.

Objetivos

Silva, K.T.S. Objetivos

27

3- OBJETIVOS

3.1- Objetivo Geral

Avaliar as alterações moleculares desenvolvidas após a administração crônica dos

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos sulfurados Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno

Sulfona em ratos Wistar.

3.1.1- Objetivos específicos

A) Avaliar possíveis alterações na estrutura tecidual de órgãos relacionados ao

metabolismo de xenobióticos após tratamento com Dibenzotiofeno e

Dibenzotiofeno Sulfona;

B) Avaliar alterações na expressão proteica de tecidos intestinais dos animais

tratados com Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona visando a

identificação de marcadores tumorais;

C) Selecionar peptídeos com capacidade de ligação a proteínas com expressão

alterada presentes nos pólipos intestinais resultantes dos tratamentos

empregados;

D) Identificar os alvos de ligação dos peptídeos isolados visando um melhor

entendimento do mecanismo de indução promovido;

E) Realizar estudos histoquímicos utilizando peptídeos sintéticos que

possibilitem a marcação e identificação específica de alterações neoplásicas

intestinais.

Material e Métodos

Silva, K.T.S. Material e Métodos

29

4- MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)

da Universidade Federal de Ouro Preto e catalogado sob o protocolo nº: 2010/14. Para a

realização do mesmo, o número de animais utilizados assim como o tratamento aplicado

restringiu-se ao estabelecido pelos objetivos delineados.

4.1. Material Biológico

4.1.1. Indução de Câncer em Ratos Wistar Tratados com DMH, DBT e

DBTO2

Ratos da linhagem Wistar, machos, com aproximadamente 60 dias de idade,

pesando 200-250 g, foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade

Federal de Ouro Preto, sendo mantidos à temperatura ambiente com ração e água ad

libitum e ciclo claro/escuro de 12 horas.

Os animais foram divididos em cinco grupos, a saber:

Grupo I: Controle salina (n=5);

Grupo II: Teste DMH 30 mg/kg (n=15);

Grupo III: Controle óleo (n=5);

Grupo IV: Teste DBT 30 mg/kg (n=15);

Grupo V: Teste DBTO2 30 mg/kg (n=10).

Nos animais pertencentes aos grupos I e III administraram-se, respectivamente,

injeções intraperitoneais semanais de salina e óleo vegetal durante 10 semanas. Os

animais dos grupos II, IV e V receberam injeções de soluções de DMH (Sigma-Aldrich)

em salina, DBT e DBTO2 (Sigma-Aldrich) em óleo vegetal na dose de 30 mg/kg no

mesmo regime de tempo dos grupos anteriores. Todos os grupos passaram por um período

de latência de 98 dias (14 semanas) após a última injeção (Fig. 13) para o

desenvolvimento das alterações patológicas, como esperado para a substância de

referência DMH (Newell and Heddle, 2004). Semanalmente, durante os seis meses de


30

execução do experimento, os animais foram pesados e avaliados quanto a aparência

corporal externa.

Figura 13: Esquema representativo do tempo de tratamento e espera para o desenvolvimento de alterações

patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2.

4.1.2. Necropsia

Decorridos os tempos de injeção e espera, os animais receberam dose letal de

associação quetamina 10% e xilazina 2% através de injeção intraperitoneal.

Posteriormente, realizou-se a coleta do baço, pulmão, fígado, estômago e intestinos para

a realização das análises histológicas, imunohistoquímicas e proteômicas, e do sangue

para análise do hemograma, e dosagens de enzimas hepáticas e pancreáticas.

4.2. Análise Histológica

Os segmentos de tecidos biopsiados foram fixados em formol tamponado e

posteriormente processados e incluídos em parafina. Para a análise histológica, secções

de 4 μm foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) e examinadas ao microscópio.

Avaliaram-se qualitativamente os seguintes parâmetros para os intestinos:

presença/ausência de atipias celulares nas camadas mucosa e média, inflamação na

mucosa, presença de necrose, atipias estruturais e hiperplasia de nódulos linfóides. Para

digitalização das imagens utilizou-se o microscópio Leica DM5000B com câmera

acoplada, por meio do programa Leica Application Suite (versão 2.4.0 R1, Leica

Microsystems).


31

4.2.1. Imunohistoquímica: CEA e CD44

A imunohistoquímica foi realizada utilizando-se anticorpos secundários

complexados com biotina seguida de estreptavidina ligada à peroxidase para permitir a

revelação. Para tal, secções histológicas de 4 μm fixadas em formol-parafina foram

desparafinizadas (lavagens sequenciais em xilol, etanol absoluto, etanol 90%, etanol 80%,

etanol 70% e água) e reativadas antigenicamente através do aquecimento das mesmas em

micro-ondas (5 ciclos de 3 minutos cada) em tampão citrato de sódio 0,1 M pH 6,0.

Lavaram-se as lâminas por 3 vezes de 5 min. cada com tampão fosfato de sódio 0,01 M

pH 7,4, NaCl 0,15 M (PBSS). A atividade da peroxidase endógena foi inibida por

incubação com H2O2 3,5% em PBSS por 30 minutos à temperatura ambiente e as lâminas

foram novamente lavadas com PBSS. Bloquearam-se as interações não específicas

utilizando leite em pó 14% em PBSS por 30 minutos em câmara úmida. Os anticorpos

primários anti-CEA e anti-CD44 foram diluídos separadamente na proporção de 1:1.000

sendo utilizados 100 μL por lâmina incubados a 4º C, overnight em câmara úmida.

Após nova lavagem com PBSS os cortes foram cobertos com quantidade

suficiente da solução link (anticorpo secundário-biotina) do kit para imunohistoquímica

LSAB Universal (Dako), e mantidos por 30 minutos à temperatura ambiente em câmara

úmida. Realizou-se a lavagem com PBSS como descrito anteriormente sendo os cortes

cobertos com a solução estreptavidina-peroxidase do kit LSAB, mantidos por mais 30

minutos à temperatura ambiente em câmara úmida.

A formação do precipitado marrom que indica a positividade da reação ocorre

após a adição de solução de cromogêneo DAB 0,05% (3-3’-Diaminobenzidine

Tetrahidrochloride Hidrate – Ambresco) em PBSS acrescido de 0,02% de peróxido de

hidrogênio. As lâminas foram contra coradas por imersão em hematoxilina e montadas

para avaliação.

4.3. Extração de Proteínas e Análise Proteômica

Para extração de proteínas dos tecidos obtidos após a necropsia dos animais foram

utilizados 100 mg de tecido (três amostras de diferentes animais por grupo) em 500 μL

de tampão de rehidratação (uréia 7 M, thio-uréia 2 M, CHAPS 2%, azul de bromofenol

0,002%) adicionados de 10 μL de tampão PIC (Coquetel de Inibidores de Proteases,

Sigma-Aldrich). Homogeneizou-se cada mistura em tubo de vidro com auxílio de motor


32

Potter S (B. Braun Biotech International) por 15 minutos a 1.000 x rpm em banho de gelo,

seguido por três ciclos de sonicação de 20 segundos a 25 W, com intervalos de 45

segundos entre cada ciclo (Sonifier 250, Branson). As suspensões resultantes foram

centrifugadas a 4ºC e 20.000 x g por 1 hora em centrífuga Mikro 200R (Hettich).

Após a centrifugação, separou-se o sobrenadante contendo a fração solúvel para a

realização de eletroforeses uni e bidimensionais e descartou-se os precipitados contendo

o debrit celular.

4.3.1. Eletroforese Uni e Bidimensional (1D/2D SDS-PAGE)

Anteriormente à confecção dos géis uni e bidimensionais, fez-se a dosagem de

proteínas solúveis obtidas conforme o item 4.3 através de densitometria comparativa de

canaletas (30 μg de Proteínas Solúveis) por meio do software Quantity One versão 4.6.9

(Bio-Rad).

Os extratos proteicos foram analisados por meio de eletroforese em gel de

poliacrilamida em condições desnaturantes (10%, 1D SDS-PAGE) como descrito por

Laemmli em 1970. Para o preparo das amostras, cerca de 30 μg de proteína foram

solubilizadas em 10 μL de tampão de amostra (tris-HCl 0,125 M pH 6,8, SDS 4%, glicerol

20%, azul de bromofenol 0,002%) e posteriormente fervidas em banho-maria por 5

minutos. Aplicou-se 20 mA de corrente por gel durante aproximadamente 1,5 horas. Para

coloração, utilizou-se solução de Coomassie Brilhant Blue G250 (Coomassie Brilhant

Blue G 250 0,2%, Etanol 40%, Ácido Acético 7%) por 2 horas e descoloração do

background com solução de Ácido Acético 7% e Etanol 10% overnight. As imagens dos

géis foram capturadas utilizando-se o scanner ImageScanner III (GE Healthcare).

Para a confecção de géis bidimensionais, solubilizaram-se 250 μg de proteína em

tampão de rehidratação contendo dithiotreitol (DTT) 1% e anfólitos pH 3-10 0,8%.

Acondicionou-se as amostras em sarcófagos de porcelana (Strip Holder 13 cm, GE

Healthcare) para incorporação e isoeletrofocalização das proteínas no gel de primeira

dimensão (Immobiline DryStrip Gels 13 cm pH 3-10 NL, GE Healthcare). Após a

focalização isoelétrica, as proteínas presentes nos géis de primeira dimensão foram

submetidas à redução com DTT 1% em solução de equilíbrio (uréia 6 M, tris-HCl 1,5 M

pH 8,8, glicerol 30%, SDS 2%, azul de bromofenol 1%) e, em seguida, alquiladas com

iodoacetamida 4% em solução de equilíbrio.


33

A separação de proteínas por massa molecular (segunda dimensão - 2D SDS-

PAGE) foi realizada em gel de poliacrilamida 10%. A eletroforese foi conduzida a 50

V/gel nos primeiros 10 minutos e, posteriormente a 100 V/gel por aproximadamente 2

horas. Para a coloração, utilizou-se Coomassie Brilhant Blue G 250 Coloidal (Sigma-

Aldrich) (três lavagens de 20 minutos cada com solução de ácido fosfórico 2% e etanol

30%; seguidas de adicionais três lavagens de 10 minutos com solução de ácido fosfórico

2%; e coloração em solução de ácido fosfórico 2%, etanol 18% e sulfato de amônio 15%

contendo Coomassie 0,02%). As imagens foram capturadas com o scanner ImageScanner

III (GE Healthcare) e analisadas através de sobreposição realizada pelo software

SameSpots (TotalLab Ltd. v. 20, UK).

4.3.2. Digestão in gel

Após a obtenção dos géis bidimensionais, os spots de interesse (proteínas

diferencialmente expressas entre os respectivos grupos Controles e Testes) foram

excisados e transferidos para tubos plásticos de 1,5 mL contendo 300 μL de solução

descorante (etanol 20%, ácido acético 7%) e mantidos a 37º C até a completa

descoloração. Retirou-se a solução descorante e lavou-se cada spot com 500 μL de água

mili-Q para remover o excesso da mesma. Em seguida, lavou-se cada spot por 3 vezes de

5 minutos cada com 300 μL de solução NH4HCO3 20 mM em acetonitrila (ACN) 50%.

Os spots foram desidratados em concentrador a vácuo (Speed Vac System –

Iss110, Thermo) durante 30 minutos e rehidratados com 15 μL de solução de tripsina 0,1

μg/μL (Promega) em NH4HCO3 20 mM. Após 20 minutos retirou-se o excesso de solução

de tripsina e recobriu-se os spots com 40 μL de NH4HCO3 20 mM. Os tubos foram

mantidos a 37ºC por 18 horas para digestão das proteínas. Recuperou-se o sobrenadante

da reação contendo peptídeos trípticos e adicionou-se 30 μL de solução de ácido

trifluoroacético (TFA) 2% e ACN 50% aos spots que permaneceram nos tubos para

extrair os fragmentos trípticos que ainda se encontravam no interior dos mesmos.

Decorridos 30 minutos da adição TFA/ACN retirou-se o sobrenadante e combinou-se

com o primeiro sobrenadante obtido para secagem em concentrador a vácuo.

Mantiveram-se as amostras secas a 4ºC para posterior análise por espectrometria de

massas.


34

4.3.3. Análise de Proteínas por Espectrometria de Massas

As amostras obtidas conforme a descrição do item anterior foram ressuspendidas

em 10 μL de ácido fórmico 0,1% para análise por espectrometria de massas. 4,5 μL de

cada preparação de peptídeos foram injetados em cromatógrafo nanoAcquity UPLC

(Waters) sendo direcionado primeiramente à pré-coluna de C18 Trap Symetry (5 μm,

180μm x 20 mm – Waters) e logo após, para a coluna analítica de C18 BEH130 (1,7 μm,

100μm x 100 mm – Waters) condicionada a 35ºC. A cromatografia ocorreu com fluxo

de 0,6 μL/min acoplada com espectrômetro de massas Q-Tof Premier (Waters) com fonte

nanoeletrospray. Foi aplicado um gradiente de 10 minutos com 10-90% de ACN em 0,1%

de ácido fórmico por spot. Os espectros MS e MS/MS foram adquiridos por meio do

software MassLynx v. 4.1.

Os experimentos foram executados utilizando tempo de escaneamento de 1

segundo e razão massa/carga de 100 a 2000 durante o processo cromatográfico. As

aquisições de dados MS/MS foram realizadas utilizando os primeiros cinco íons

precursores com carga +2, +3 ou +4. As buscas foram realizadas por meio do software

Mascot engine v.2.3.02 (Matrix Science Ltd.) utilizando o banco de dados não redundante

para Rattus sp. (NCBInr_012014 - com 61.059 sequências de proteínas).

Os parâmetros de busca utilizados incluíram carbamidometilação de cisteínas

como modificação fixa, oxidação de metionina como modificação variável, permissão

para ocorrência de perda de um sítio de clivagem e tolerância de 0,1 Da para os íons

precursores e fragmentados. A identificação de proteínas foi considerada válida caso a

taxa de falsos positivos fosse ≤ 3% e a porcentagem de cobertura fosse ≥ 8%.

Foram considerados significativos os peptídeos com valor de threshold p ≤ 0,05

sendo identificadas as proteínas cujas entradas mostraram uma porcentagem de cobertura

de sequência ≥ 15%, FDR ≤ 3% e ao menos um peptídeo único identificado.

4.3.4. Categorização Funcional e Mapa de Interação Proteica

Com o objetivo de se obter uma visão integrada das alterações observadas, as

proteínas identificadas por espectrometria de massas foram categorizadas em classes

distintas de acordo com sua função biológica, e submetidas a uma análise de interação

com outras proteínas e moléculas por meio do software STITCH v.4.0 (disponível em

http://stitch.embl.de/).


35

4.4. Western blotting

Realizou-se a técnica de Western blotting para a detecção da expressão das

proteínas ACTB, CANX, e CEA. Foi preparado um extrato total de proteínas solúveis

para os animais pertencentes a todos os grupos conforme descrito no item 4.3.1.

Submeteu-se as amostras de proteínas obtidas a eletroforeses em gel de poliacrilamida

10% e realizou-se a transferência para membranas de PVDF (Invitrogen) a 200 mA em

tampão tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, etanol 20% e SDS 10% sob refrigeração por

duas horas. Em seguida, as membranas foram bloqueadas overnight com tampão tris-HCl

50 mM pH 7,5, Tween-20 0,3% e leite em pó desnatado 5%, sendo posteriormente

lavadas por três vezes com tris-HCl 10 mM pH 7,5. Os anticorpos monoclonais anti-CEA

(1:1000); anti-β-actina (1:2000) e anti-calnexina (1:1000), todos Sigma Aldrich, foram

incubados no tampão de immunoblotting (tris-HCl 50 mM pH 7,5, Tween-20 0,013%,

leite em pó desnatado 5%) à temperatura ambiente por 3 horas e posteriormente

submetidos a detecção com o anticorpo secundário IgG anti-mouse conjugado com

fosfatase alcalina (1:2000) à temperatura ambiente por 2 horas. Após as lavagens com

tampão tris-HCl 10 mM pH 7,5, detectaram-se os sinais com os substratos enzimáticos

nitro-blue tetrazoluim chloride e 5-bromo-4-chloro-31-indolyphosphate p-toluidine salt

(Sigma Aldrich).

4.5. Biopanning (Phage Display)

4.5.1. Extração de Proteínas para Phage Display

A extração de proteínas para a execução da técnica de Phage Display foi realizada

através da maceração de 50 mg de tecido com nitrogênio líquido e suspensão do mesmo

em 1 mL de tampão tris-HCl 20 mM pH 7, sacarose 250 mM e PIC. As amostras foram

sonicadas como descrito no item 4.3, e centrifugadas a 20.000 x g, 4º C por 30 minutos.

A qualidade da extração foi verificada através da visualização das proteínas em 1D SDS-

PAGE corado com solução de Coomassie Brilhant Blue G250 como descrito no item

4.3.1.


36

4.5.2. Ciclos de Seleção de Phage Display

A seleção dos epítopos (expressos nas 5 cópias da proteína III - pIII - do capsídeo

de fagos filamentosos) foi realizada utilizando-se uma biblioteca de peptídeos de 12

aminoácidos (Ph.D.™-12 mer - New England Biolabs). As bibliotecas expressas em

fagos M13 são compostas por peptídeos randômicos seguidos por uma curta sequência

espaçadora Gly-Gly-Gly-Ser fusionada à região N - terminal da proteína capsídica pIII.

Esta biblioteca consiste de aproximadamente 2,0 x 1014 clones com redundância

de 105 clones, os quais representam 2,7 x 109 possíveis combinações entre os resíduos de

aminoácidos. Realizou-se o procedimento de seleção através de três ciclos sequenciais.

Primeiramente sensibilizou-se uma placa de microtitulação (Costar 3590, Corning

Incorporated) com 160 μL de extrato proteico de intestinos provenientes dos Grupos

Teste (1 poço/grupo) na concentração de 100 μg/mL em tampão bicarbonato de sódio 0,1

M pH 8,6 a 4ºC, overnight sob agitação lenta em câmara úmida.

A seguir, secou-se a placa batendo-a contra papel toalha autoclavado. Bloqueou-

se os sítios livres de interação por meio da adição de 250 μL/poço de tampão de bloqueio

(NaHCO3 0,1 M, BSA 5 mg/mL) mantido por 1 hora a 4ºC sob agitação lenta. Após a

incubação, o excesso de tampão de bloqueio foi descartado e a placa foi lavada por 6

vezes com 200 μL/poço de TBS-T (tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20

0,1%) por 1 minuto, sendo seca em seguida com papel toalha.

Realizou-se a diluição de 10 μL (aproximadamente 4 x 1010 fagos) da biblioteca

de fagos em 100 μL de TBS-T e adicionou-se aos poços contendo extrato proteico dos

Grupos Teste (100 μL/poço). Incubou-se a placa por 1 hora sob agitação lenta à

temperatura ambiente. Os fagos não ligantes (F1) foram recolhidos do sobrenadante com

o auxílio de pipeta e descartados. Realizou-se a lavagem com TBS-T 0,1% por 10 vezes

de 1 minuto cada.

A eluição dos fagos ligantes foi realizada com 100 μL de tampão glicina 200 mM

pH 2,2 por 10 minutos sendo os fagos (F2) recolhidos e armazenados em tubo plástico de

0,5 mL. A seguir, adicionou-se 15 μL de tris-HCl 1 M pH 9,1 nos tubos para neutralizar

o pH. Os fagos recuperados (F2) foram amplificados em E. coli ER2738 (OD600nm ≈ 0,3)

em meio Luria-Bertani (LB, triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 5 g/L) a

37ºC por 4,5 horas finalizando o primeiro ciclo de seleção (Fig. 14).

Para o segundo e terceiro ciclos de seleção, realizou-se uma pré-seleção

primeiramente utilizando poços contendo proteínas imobilizadas referentes aos grupos


37

Controle. Desta vez, os peptídeos não ligantes (F1) foram recolhidos, amplificados como

descrito anteriormente e então utilizados para a seleção frente aos extratos dos grupos

Testes.

Figura 14: Biopanning com a biblioteca de peptídeos Ph.D. Seleção de ligantes específicos.

4.5.3. Titulação dos Clones Obtidos no Phage Display

A titulação é um procedimento que permite o isolamento dos fagos para posterior

sequenciamento dos mesmos. Para a realização da titulação, 1 μL de solução de fagos foi

diluído em 9 μL de meio LB obtido ao fim do 3º ciclo de seleção e submetido a diluições

seriadas crescentes exponenciais sob log10 em meio LB. Para cada diluição

acrescentaram-se 200 μL de cultura de ER2738 em fase exponencial (OD600nm ≈ 0,5),

agitou-se a solução rapidamente e incubou-se por 5 minutos a temperatura ambiente. As

células bacterianas, agora infectadas, foram transferidas para tubos de cultura contendo 3

mL de Ágar-TOP (LB, MgCl2.6H2O 1 g/L) a 45ºC e espalhadas sobre placas de Petri

contendo meio LB sólido, com IPTG 0,5 mM, Xgal 40 μg/mL e tetraciclina 20 mg/mL.

Para cada diluição foi preparada uma placa. Incubaram-se as placas à 37ºC por 12 horas

para obtenção das colônias isoladas utilizadas no sequenciamento de DNA dos fagos.

4.5.4. Extração de DNA de Fagos e Sequenciamento

Aleatoriamente, 32 colônias referentes a cada grupo foram retiradas das placas de

Petri e transferidas individualmente para poços de placa deepwell contendo 1 mL de meio

LB autoclavado com tetraciclina 100 μL/mL. A placa foi vedada e incubada por 5 horas

a 37ºC sob forte agitação. Após a incubação, centrifugou-se a placa por 40 minutos a

2.500 x g e 800 μL do sobrenadante foram transferidos para outra placa Deepwell estéril.


38

Adicionou-se 200 μL de polietilenoglicol 8000 (PEG)/NaCl (20% PEG, NaCl 2,5 M)

estéril para precipitação dos fagos presentes na solução e incubou-se a temperatura

ambiente por 15 minutos. A placa foi novamente submetida à centrifugação a 2.500 x g

por 40 minutos, sendo o sobrenadante descartado por inversão.

Adicionou-se 100 μl de tampão iodeto (Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1 mM,

NaI 4 M) a cada poço da placa deepwell para se romper as cápsulas dos fagos e precipitar

o DNA. A placa foi vortexada fortemente por 5 minutos. Após a agitação, adicionou-se

250 μL de etanol e manteve-se a placa em repouso absoluto por 10 minutos à temperatura

ambiente. Novamente realizou-se a centrifugação da placa a 2.500 x g por 40 minutos e

descartou-se o sobrenadante por inversão da placa com secagem em papel absorvente.

Lavou-se cada poço com 500 μL de etanol 70% e procedeu-se nova centrifugação com

descarte do sobrenadante por inversão. O DNA purificado foi obtido após a adição de 20

μL de água mili-Q a cada poço. A qualidade do DNA extraído foi avaliada por meio de

eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com solução de brometo de etídeo.

Após a observação das bandas eletroforéticas obtidas no gel de agarose, pode-se

concluir que em média, extraiu-se 200-300 ng de DNA/3 μL de solução. Utilizaram-se

aproximadamente 400 ng de DNA molde por reação de sequenciamento acrescidos de 5

pmol de Primer -96 gIII (5’-OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’ Biolabs), Premix

4 μL (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle kit – Amersham Biosciences).

Realizou-se uma reação de 35 ciclos em termociclador de placas (MasterCycler

Eppendorf) nas seguintes condições: (1) Desnaturação – 95ºC por 20 segundos, (2)

Anelamento – 50ºC por 15 segundos, (3) Extensão – 60ºC por 1 minuto. O DNA

amplificado foi precipitado com 1 μL de Acetato de Amônio 7,5 M e 27,5 μL de etanol

absoluto por poço homogeneizando-se a placa com leves batidas sobre a bancada. A placa

foi centrifugada a 2.500 x g por 45 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi descartado por

inversão.

Adicionou-se 150 μL de etanol 70% ao precipitado e centrifugou-se a placa a

2.500 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o etanol remanescente foi

evaporado à temperatura ambiente no escuro. O precipitado resultante foi ressuspendido

em 10 μL de tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle kit – Amersham

Biosciences). Realizou-se o sequenciamento em um sequenciador automático

MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) nas seguintes condições: (1) Voltagem de

Injeção – 2kV, (2) Voltagem de Corrida – 7kV, (3) Tempo de Injeção – 120 segundos,

(4) Tempo de corrida – 200 minutos.


39

A identificação das sequências correspondentes aos peptídeos selecionados foi

realizada manualmente observando-se as sequências Start (ACCTCCACC) e End

(AGAGTGAGA) que indicam respectivamente o início e fim das sequências de

peptídeos de interesse. Selecionou-se as sequências de nucleotídeos obtidas (36

nucleotídeos) e converteu-se as mesmas em sequências de aminoácidos por meio do

software Expasy disponível em http://web.expasy.org/translate/ com frame de leitura 1

3’-5’.

4.5.5. Análise in silico dos Peptídeos Obtidos

Os peptídeos selecionados por Phage Display podem corresponder a um pequeno

fragmento de uma proteína maior que desempenha papel específico em processos

biológicos complexos. A simples seleção de peptídeos marcadores para uma determinada

patologia não fornece informações a respeito desse processo biológico. Sendo assim,

estratégias que utilizam bioinformática podem fornecer informações complementares,

auxiliar na compreensão da doença estudada e relacionar possíveis proteínas envolvidas

aos peptídeos selecionados.

Os métodos aplicados para a obtenção dessas informações foram baseados no

alinhamento das sequências por meio do software ClustalW

(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/), seleção de proteínas alvo por meio do

BlastP do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), análise das vias funcionais onde estão

inseridas as proteínas alvo através do software STITCH 4.0 (http://stitch.embl.de).

O BlastP foi selecionado por permitir alinhamento entre proteínas. A base de

dados utilizada foi a RefSeq por apresentar resultados com boa especificidade e

sensibilidade. O organismo selecionado foi Rattus norvegicus devido à espécie utilizada

nesse estudo, sendo os demais parâmetros, ajustados automaticamente pelo aplicativo. As

anotações dos primeiros 40 alvos com melhor score foram analisadas, sendo avaliadas

quais demonstram alguma relação com câncer. Esse número de alvos foi escolhido de

maneira arbitrária até que se obtivesse informação qualitativa significativa.

Devido ao grande número de peptídeos identificados e ao custo e tempo

necessários para que se realizasse a validação da seleção com todos eles, esta estratégia

permitiria selecionar, inicialmente, os peptídeos a serem sintetizados para a realização

dos experimentos subsequentes.

http://web.expasy.org/translate/

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

http://stitch.embl.de/


40

4.6. Síntese de Peptídeos

A síntese dos peptídeos propostos (Tab. 01) foi realizada sob a forma solúvel,

utilizando-se um protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1965),

com algumas modificações. Utilizou-se a resina Rink Amide Resin HL (Merck), obtendo-

se um rendimento de aproximadamente 40 µmoles de peptídeo por lote de síntese.

Tabela 01: Peptídeos selecionados por Phage display para síntese em fase sólida.

Grupo Tratamento Peptídeo Selecionado

DMH (Intestino Grosso) QPHKVFFPNLPR

DBT (Intestino Grosso)

EYQLPSRTVPRD

KDPTQFKPMSLW

FDTKAGLTSLVA

DBT (Intestino Delgado) TNTPPSQRVHLS

LAAQQYTSALKS

Para a ativação da resina adotou-se o seguinte procedimento: 40 µmoles de resina

(52 mg) foram adicionados em um tubo de síntese contendo dimetilformamida (DMF)

suficiente para cobrir toda a resina, permanecendo sob agitação constante por três horas

a 37º C. Para a liberação do grupamento Fmoc de proteção, cobriu-se a resina com 3 mL

de 4-metilpiperidina 20% em DMF e lavou-se por 3 vezes de 20 minutos cada, sob

agitação contínua a temperatura de 37º C. Em seguida, a resina foi lavada 3 vezes

alternadamente com metanol e DMF utilizando-se 2 mL de solvente por etapa. Todas as

lavagens foram realizadas com auxílio de uma bomba de vácuo.

Os aminoácidos e demais reagentes auxiliares foram adicionados em

concentrações quatro vezes superiores (160 µmoles) à quantidade de resina para favorecer

o acoplamento. Esses são ligados pelo seu grupamento carboxila ao grupamento amino

da resina, formando uma ligação peptídica. Adicionou-se o primeiro aminoácido ao tubo

de síntese em um volume de 2 mL de DMF, acrescido de 25 µL de di-isopropil

carbodiimida (DIPC) e 23 mg de oxima [ethyl 2-cyano-2-(hydroxyimino)acetate]. Após

2 horas de agitação a 37ºC, retirou-se todo o líquido do tubo de síntese, sendo o peptídeo

crescente submetido à acetilação para prevenção do crescimento de cadeias que não

reagiram com o aminoácido a ser incorporado. Dessa forma, 50 µL de uma solução 1:1

de DIPC e anidrido acético foram adicionados a 1 mL de DMF no tubo de síntese,

permanecendo sob agitação a 37ºC por 30 minutos. Ao fim desta etapa, lavou-se a resina


41

3 vezes alternadamente com metanol e DMF. O grupamento amino desse primeiro

aminoácido acoplado foi então desprotegido, lavando-se a resina com 3 mL de uma

solução de 4-metilpiperidina 20% em DMF, por três vezes de 10 minutos cada, com

agitação contínua a 37°C. Os demais aminoácidos foram processados conforme descrito

anteriormente para o acoplamento do primeiro aminoácido.

Terminados os 12 ciclos de acoplamento, eliminou-se o último grupamento Fmoc

com 4-metilpiperidina 20% em DMF, como descrito previamente, e lavou-se a resina por

4 vezes, durante 5 minutos, com 3 mL de diclorometano (DCM). As cadeias laterais foram

desprotegidas e o peptídeo dissociado da resina pelo uso de 5 mL de uma solução de

clivagem contendo 95% de TFA. O tubo de reação permaneceu sob agitação por quatro

horas. Coletou-se a solução contendo os peptídeos, transferiu-se para tubos de ensaio e

os produtos de síntese foram precipitados com 50 mL de éter etílico, permanecendo em

repouso durante a noite à 4º C. Posteriormente, lavou-se os precipitados com éter etílico

e centrifugou-se por 3 vezes a 1.500 x g por 5 minutos. Na última etapa, desprezou-se o

sobrenadante e ressuspendeu-se o peptídeo em 3 mL de água milli-Q.

Para a obtenção de peptídeos fluorescentes foi utilizado o mesmo protocolo

descrito anteriormente com a adição do fluoróforo 5,6-carboxifluoresceína (Sigma-

Aldrich) na região N-terminal do último aminoácido adicionado. A adição do fluoróforo

foi realizada da mesma maneira que a adição dos aminoácidos constituintes de cada

sequência. Os peptídeos obtidos foram liofilizados, analisados em sistema HPLC (High

Performance Liquid Chromatography) e caracterizados em espectrômetro de massas ESI

LCMS-IT-TOF e através do software BCEPRED (http://www.imtech.res.in).

4.6.1. Análise de Pureza e Confirmação de Identidade

Os peptídeos sintetizados em fase sólida foram submetidos à cromatografia em

fase reversa para a análise de sua pureza. As cromatografias foram realizadas em coluna

C18 (250 mm x 10 mm) (LiChroCART® 250-10 Purospher, Merk), em sistema HPLC

Shimadzu. A coluna foi previamente equilibrada com uma solução de água mili-Q e TFA

0,1%. Inicialmente, eluiram-se alíquotas de todos os peptídeos (20 μL) em um gradiente

de ACN de 20 a 60% e TFA 0,1% durante 80 minutos com um fluxo de 1 mL/minuto.

Monitorou-se a eluição a 280 nm, 260 nm ou 230 nm de maneira dependente da sequência

sintetizada.

http://www.imtech.res.in/


42

Após a purificação, os peptídeos foram caracterizados por espectrometria de

massas para confirmação de sua identidade. Para tal, utilizou-se o espectrômetro de

massas LCMS-IT-TOF (Liquid Chromatography Ion Trap Time Of Flight), que opera

por ionização do tipo electrospray (Shimadzu®). O equipamento foi calibrado utilizando

trifluoroacetato de sódio. A voltagem capilar foi de 4500 V no modo positivo de

ionização, com tempo de acumulação de 10 ms. Aplicaram-se as amostras através de

injeções diretas (alíquotas de 5 μL). Utilizou-se a ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw

tool (disponível em http://web.expasy.org/compute_pi/) para a predição das massas

moleculares dos peptídeos sintetizados.

4.7. Síntese de Colunas de Afinidade

Para a obtenção de colunas de afinidade com os peptídeos de interesse

imobilizados, realizaram-se as seguintes etapas de ativação/imobilização do suporte

cromatográfico Sepharose 4B (Sigma-Aldrich): ativação com epicloridrina, aminação,

succinilação, ativação com N-hidroxisuccinimida (NHS) e diciclohexilcarbodiimida

(DCC), imobilização dos peptídeos e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As reações

envolvidas nas etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Para a etapa de ativação, lavou-se a resina (Sepharose 4B) em funil de vidro

sinterizado com água destilada e suspendeu-se a mesma em 4 volumes de NaOH 0,4 M

contendo 5% de epicloridrina (Matsumoto, Mizuno et al. 1979). Manteve-se a suspensão

em banho-maria a 40º C por 2 horas sob agitação leve e novamente procedeu-se lavagem

com excesso de água destilada.

A sepharose epóxi-ativada foi aminada utilizando-se 1,5 volumes de solução de

hidróxido de amônio P.A., onde foi suspendida a resina lavada. Manteve-se a suspensão

por 1,5 horas em banho-maria a 40º C sob agitação. Decorrido o período de espera, lavou-

se novamente a resina aminada com água destilada em excesso e NaCl 0,1 M.

Suspendeu-se a resina aminada em 1,5 volumes de NaCl 0,1 M sendo

posteriormente adicionados 0,08 g de anidrido succínico por g de resina para que

ocorresse a succinilação da mesma. Manteve-se o pH da suspensão em 6 através da adição

gradual de NaOH 20%, e, após a estabilização do pH respeitou-se um tempo de espera de

cinco horas à temperatura ambiente. Realizou-se uma nova lavagem com NaOH 0,1 M e

a resina foi novamente suspendida nesta mesma solução por 30 minutos.

http://web.expasy.org/compute_pi/


43

A sepharose succinilada foi então lavada com 3 volumes de dioxano para tornar a

resina anidra e suspensa em dioxano onde adicionou-se NHS e DCC na concentração de

0,1 M cada para ativação. Esta suspensão foi mantida por 70 minutos sob agitação leve à

temperatura ambiente, sendo então lavada com 8 volumes de dioxano seguidos de 4

volumes de metanol e 3 volumes de dioxano.

Após a ativação, realizou-se uma lavagem rápida com 1 volume de água destilada

sendo a resina rapidamente transferida para um béquer com 3 volumes de solução

NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9% pH 7,5 contendo o peptídeo de interesse na concetração de

1 mg/mL. Após 1 hora à temperatura ambiente seguida de 12 horas sob refrigeração,

ocorreu a imobilização do mesmo.

A etapa final consistiu no bloqueio dos grupos carboxílicos livres com solução de

etanolamina 0,1 M pH 9,0 por 1 hora a temperatura ambiente. Após este procedimento,

procedeu-se nova lavagem com água destilada. Manteve-se o produto a 4º C até o

momento do uso.

4.7.1. Identificação de Proteínas Ligantes

Extratos proteicos de 100 mg de intestino foram preparados em 500 µL de tris-

HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,5 e PIC como descrito no item 4.5.1 e submetidos a

cromatografia de afinidade utilizando-se as resinas com peptídeos imobilizados conforme

o item 4.7.

Duas colunas de afinidade por peptídeo, contendo 3 mL de suporte, foram

montadas em seringas plásticas e equilibradas com 30 mL de tampão de equilíbrio tris-

HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,5. Amostras relativas aos grupos I e III foram

submetidas à seleção pelo peptídeo QPHKVFFPNLPR e amostras pertencentes aos

grupos II, IV e V foram submetidas à cromatografia com os demais peptídeos

(EYQLPSRTVPRD; KDPTQFKPMSLW; FDTKAGLTSLVA; TNTPPSQRVHLS e

LAAQQYTSALKS).

Os extratos foram expostos por 10 passagens cada um em suas respectivas colunas

de afinidade para assegurar a ligação com os peptídeos imobilizados. As colunas foram

então lavadas com 40 mL de tampão de equilíbrio para remoção das proteínas não ligadas.

A eluição das proteínas especificamente ligadas foi realizada com solução de 2,5 mL de

solução de NaCl 1 M também recromatografada por 10 vezes. As amostras eluídas foram

então dialisadas para remoção do excesso de sal (solução de acetato de amônio 0,01 M


44

pH 7,4 por 24 horas) e concentradas em liofilizador (Benchtop K - Virtis). O precipitado

obtido foi ressuspendido em tampão de amostra e submetido à eletroforese

unidimensional conforme descrito em 4.3.1.

As bandas eletroforéticas observadas para os grupos controle e teste eluídas para

cada peptídeo e coradas com Coomassie G250 foram excisadas para digestão in gel e

posterior identificação por espectrometria de massas como descrito nos itens 4.3.2 e 4.3.3.

4.7.2. Análise in silico da Interação Proteína/Peptídeo

Após a identificação das proteínas alvo ligadas por afinidade aos peptídeos

selecionados por Phage Display, foi realizada uma análise in silico para avaliação da

interação proteína/peptídeo. Para tal, as estruturas tridimensionais referentes às proteínas

disponíveis em RSCB PDB (http://www.rscb.org/pdb) foram utilizadas juntamente com

as estruturas tridimensionais dos peptídeos geradas por meio do software Mobyle@RPBS

(disponível em http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py). A predição de

interação foi realizada por meio do software PatchDock (disponível em

http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/) sem alteração dos parâmetros previamente

setados pelo servidor. As 5 primeiras soluções com melhores scores geométricos, energia

de dessolvatação e área de interface foram avaliadas para observação da região de

interação do peptídeo com a proteína. Tal avaliação poderia fornecer dados sobre o local

de interação dos peptídeos com a estrutura nativa das proteínas ligantes auxiliando no

delineamento de experimentos que utilizassem tais moléculas para a identificação de

alterações relacionadas ao processo carcinogênico.

4.8. Análise Estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada por meio do software Graph Pad

Prism (versão 5.0). Utilizou-se ANOVA para testar as diferenças entre os tratamentos,

seguido de pós-teste de Tukey para determinação das diferenças significativas entre os

grupos expostos e os grupos controle no que diz respeito às medições enzimáticas,

hemograma, relações entre os pesos dos animais e diferenças de intensidade entre spots

eletroforéticos. Para análise das diferenças entre os parâmetros histológicos observados

utilizaram-se os testes exato de Fisher e Qui-quadrado. Adotou-se o nível de significância

p < 0,05 para todas as análises.

Resultados e Discussão

Silva, K.T.S. Resultados e Discussão

46

5- RESULTADOS E DISCUSSÃO

Considerando a importância toxicológica do DBT e DBTO2, e devido à escassez

de estudos que empreguem estas moléculas nesse sentido, foram realizados experimentos

empregando-se doses sub letais destas substâncias, administradas de forma crônica pela

via intraperitoneal, com o intuito de observar efeitos tardios decorrentes da exposição

prolongada a esses compostos.

5.1- Efeitos Biológicos do Tratamento com DMH, DBT e DBTO2

Ao longo do tratamento, os animais foram observados quanto à aparência física e

medida do peso corporal. A Figura 15 apresenta o acompanhamento do peso de todos os

grupos ao longo de 24 semanas (tratamento/latência). Como pode ser observado, não

houve variação estatística significativa de peso entre os diversos grupos, indicando que a

inoculação dessas substâncias, no regime proposto, não interferiu no crescimento normal

dos animais. Além disso, não foi observada a presença de alterações macroscópicas

perceptíveis na superfície corporal externa.

Figura 15: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos controles e testes ao

longo de 24 semanas de tratamento/latência.


47

5.1.1- Hemograma e Dosagens Séricas de ALT, AST e Amilase

Os parâmetros hematológicos, dosagens séricas de enzimas pancreáticas e

hepáticas foram avaliadas durante a execução de meu trabalho de mestrado. Os gráficos

relacionados aos resultados obtidos nestes experimentos encontram-se nos Apêndices A

e B respectivamente (Apêndice A – Fig. 01.A e Apêndice B – Fig. 01.B).

Após a necropsia e coleta do sangue realizou-se o hemograma para avaliação de

possíveis alterações das células sanguíneas. O hematócrito foi o primeiro parâmetro

avaliado, não sendo observadas variações estatísticas significativas entre os grupos

controles e testes indicando que o volume globular não é afetado pelos tratamentos

realizados mesmo em doses mais elevadas.

Além do volume globular normal verificado, a observação dos esfregaços de

sangue total não evidenciou alterações morfológicas, presença de inclusões, presença de

hemácias nucleadas ou empilhamento dos glóbulos vermelhos indicando eritropoese

normal e ausência de processos inflamatórios. Tais achados demonstraram que os

tratamentos não interferiram na produção ou sobrevida na circulação das hemácias no

sangue periférico. As contagens globais e diferenciais de leucócitos do sangue periférico

também não demonstraram variações diante da análise estatística aplicada. Além disso,

quando avaliados os resultados individuais das contagens diferenciais de leucócitos não

foi possível detectar diferenças que possam indicar importância diagnóstica.

Determinaram-se também as atividades séricas das enzimas amilase, AST e ALT.

As atividades séricas das enzimas AST e ALT são comumente utilizadas como

marcadores de lesões hepáticas. Em conjunto, as duas enzimas (AST e ALT) são

consideradas os mais importantes parâmetros para detecção de lesões ao fígado

(Anderson et al., 2000).

Escolheu-se medir a atividade das enzimas AST, ALT e amilase por

representarem os principais meios de detecção sérica de alterações das funções hepática

e pancreática respectivamente. Como esses órgãos estão diretamente relacionados ao

metabolismo, as alterações nas funções normais dos mesmos representam informações

importantes a respeito da atividade toxicológica dessas substâncias.

Os resultados encontrados demonstraram que as atividades séricas individuais das

enzimas ALT e AST dos grupos controle salina e controle óleo não apresentaram

diferenças estatísticas significativas. Com relação aos testes DBT e DBTO2, os níveis de

ALT e AST encontraram-se diminuídas estatisticamente em aproximadamente 30%,


48

quando comparadas com o grupo controle óleo. Embora a relação AST/ALT tenha se

apresentado ligeiramente maior que 1 para todos os grupos avaliados de forma

indiscriminada entre os grupos controles e testes, não foram observadas lesões hepáticas

no exame histopatológico do fígado.

A atividade sérica de amilase foi avaliada com o objetivo de investigar a

integridade tecidual pancreática. Níveis alterados desta enzima também estão

relacionados à doença da vesícula biliar e alguns distúrbios gastrointestinais. A amilase é

produzida principalmente nas glândulas salivares e no pâncreas. Na pancreatite aguda, os

níveis de amilase podem alcançar valores de quatro a seis vezes o limite superior de

referência, elevando-se de 2 a 12 horas e retornando aos níveis normais após 3 a 4 dias.

A magnitude da elevação da atividade amilásica não se correlaciona com a gravidade da

lesão pancreática. As pancreatites crônicas, assim como o carcinoma pancreático, cursam

com níveis normais ou pouco elevados de amilase (Burtis and Ashwood, 1996).

Entre os grupos estudados não foram detectadas alterações nos níveis séricos de

amilase indicando que não houve a ocorrência de pancreatite aguda. Entretanto, não se

pode concluir que não houve alteração da função pancreática, sendo necessário que esses

dados sejam complementados com outros estudos clínicos para os animais em questão.

5.1.2- Avaliações Morfológicas Macro e Microscópicas de Tecidos Extraídos

Durante a Necropsia

Após avaliações macro e microscópicas do pulmão, fígado, baço e estômago,

observou-se que esses órgãos de todos os grupos estudados apresentaram aspecto e

coloração compatíveis com a normalidade (dados não mostrados). Nos intestinos, o

quadro de aparente normalidade foi observado nos animais dos grupos Controle I e III.

No grupo Teste DMH observou-se a presença de projeções papiliformes na mucosa para

a luz do intestino grosso, de aspecto avermelhado e consistência rígida, sugerindo a

formação de pólipos. Este aspecto não foi observado no intestino delgado desses animais

(Fig. 16 – A). Em contraste, nos animais pertencentes aos grupos Teste DBT e DBTO2

foram visualizadas projeções similares apenas no intestino delgado e em menor

intensidade quando comparadas àquelas visualizadas no intestino grosso dos animais

tratados com DMH (Fig. 16 – B).

O epitélio intestinal contém todas as enzimas envolvidas na ativação e

detoxificação dos HPA, embora essas atividades sejam geralmente menores que no


49

fígado. Tais níveis enzimáticos no trato gastrointestinal podem influenciar o

desenvolvimento ocasional de tumores nos intestinos delgado e grosso como

consequência do contato com agentes carcinógenos. Estudos realizados por Uno e col. e

Shi e col. demonstraram ainda que as isoenzimas CYP1A1 e CYP1B1 relacionadas à

metabolização de HPA apresentam maior expressão no intestino delgado de

camundongos quando comparadas aos níveis encontrados no intestino grosso (Uno et al.,

2004; Uno et al., 2008; Shi et al., 2010; Diggs et al., 2011). Tais fatos poderiam explicar

a maior frequência de desenvolvimento de pólipos no intestino delgado dos animais

tratados com DBT e DBTO2.

Figura 16: A) Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao Grupo III (Teste DMH 30

mg/kg) onde podem ser observadas as formações de pólipos. B) Fotografia de parte do intestino delgado

de animais pertencentes aos Grupos IV (acima) e V (abaixo) (Testes DBT 30 mg/kg e DBTO2 30 mg/kg

respectivamente) onde podem ser observados pólipos. As setas em vermelho indicam a localização dos

pólipos. As barras em preto representam 1 cm.

Para a avaliação microscópica das lesões realizou-se a análise histológica dos

intestinos, observando a ocorrência de alterações celulares, estruturais e inflamatórias

oriundas dos grupos Controles e Testes avaliados.

Com o objetivo de eliminar qualquer possibilidade de os efeitos observados nos

grupos tratados com DBT e DBTO2 serem decorrentes da administração crônica de óleo

vegetal pela via intraperitoneal, introduziu-se um grupo experimental controle de animais


50

tratados com salina para efeito de comparação com animais tratados com óleo. Nestes

grupos, o quadro geral foi compatível com a normalidade histológica onde foi possível a

plena observação das túnicas intestinais bem como de todas as estruturas histológicas do

órgão. No intestino delgado de poucos animais de ambos os grupos Controle observou-

se aumento de células inflamatórias que, quando presentes, se apresentavam de maneira

difusa e de intensidade leve. Além disso, no grupo Controle Óleo foram observadas

reações hiperplásicas dos nódulos linfoides do intestino delgado em apenas 25% dos

animais (Apêndice C – Tab. 01.C). Ao contrário, no intestino grosso de animais

pertencentes ao grupo controle salina foi observado certo grau de inflamação (40%)

(Apêndice C – Tab. 02.C). Porém, considerando o tratamento invasivo ao qual esses

animais foram submetidos, e a diferença estatística encontrada quando analisados esses

dados contra os dados de animais tratados com DMH, DBT e DBTO2, pode-se dizer que

para os animais dos grupos controle o quadro geral observado representa a referência

histológica.

A comparação entre os grupos Controle Salina e Teste DMH nos intestinos grosso

e delgado (Tab. 02 e 03) revelou aumento estatisticamente significativo para todas os

parâmetros avaliadas. As atipias observadas foram principalmente alterações na

morfologia das mucosas, presença de glândulas irregulares e de células com morfologia

irregular de difícil identificação. As áreas de necrose observadas apresentaram-se de

maneira geral focais atingindo principalmente as túnicas mucosas e médias. As

hiperplasias das regiões nodulares eram caracterizadas pelo aumento concêntrico de

linfócitos e macrófagos e apresentavam correlação com as projeções papiliformes

observadas macroscopicamente no intestino grosso (Fig.17).

Uma avaliação semelhante foi realizada com os grupos Controle Óleo, Teste DBT

e DBTO2 (Tab. 02 e 03) revelando também, aumento significativo para todas as alterações

observadas. Apesar de a avaliação macroscópica ter revelado somente a presença de

projeções no intestino grosso para o Grupo Teste DMH, e no intestino delgado para os

Grupos Teste DBT e DBTO2, pode-se observar que quando avaliados

microscopicamente, foram encontradas lesões com características similares em ambos os

intestinos dos 3 grupos de tratamento.


51

Tabela 02: Frequência de lesões observadas no intest. grosso dos animais pertencentes aos Grupos I-V.

Lesões Observadas Controle Salina (I)

% (n)

DMH (II)

% (n)

Controle Óleo (III)

% (n)

DBT (IV)

% (n)

DBTO2 (V)

% (n)

Atipia celular na mucosa 0 (0/5)a 64 (9/14)b 0 (0/4)a 29 (4/14)c 55 (5/9)b

Atipia celular na submucosa 0 (0/5)a 14 (2/14)b 0 (0/4)a 7 (1/14)c 33 (3/9)d

Inflamação na mucosa 40 (2/5)a 100 (14/14)b 0 (0/4)c 43 (6/14)a 55 (5/9)a

Necrose 20 (1/5)a 79 (11/14)b 0 (0/4)c 36 (5/14)d 55 (5/9)e

Atipia estrutural 0 (0/5)a 71 (10/14)b 25 (1/4)c 36 (5/14)c 55 (5/9)d

Hiperplasia de nódulos linfóides 20 (1/5)a 43 (6/14)b 25 (1/4)a 50 (7/14)b,c 55 (5/9)c

a,b,c,d,eLetras diferentes sinalizam diferenças estatíticas significativas (p ≤ 0.05) entre grupos para um dado

parâmetro.

Lâminas pertencentes a todos os animais controle e teste foram avaliadas.

Tabela 03: Frequência de lesões observadas no intest. delgado dos animais pertencentes aos Grupos I-V.

Lesões Observadas Controle Salina (I)

% (n)

DMH (II)

% (n)

Controle Óleo (III)

% (n)

DBT (IV)

% (n)

DBTO2 (V)

% (n)

Atipia celular na mucosa 20 (1/5)a 71 (10/14)b 25 (1/4)a 50 (7/14)c 55 (5/9)c

Atipia celular na submucosa 0 (0/5)a 43 (6/14)b 0 (0/4)a 36 (5/14)b 44 (4/9)b

Inflamação na mucosa 20 (1/5)a 71 (10/14)b 0 (0/4)c 79 (11/14)b 67 (6/9)b

Necrose 0 (0/5)a 64 (9/14)b 0 (0/4)a 64 (9/14)b 67 (6/9)b

Atipia estrutural 20 (1/5)a 57 (8/14)b 25 (1/4)a 29 (4/14)a 67 (6/9)b

Hiperplasia de nódulos linfóides 0 (0/5)a 43 (6/14)b 25 (1/4)c 79 (11/14)d 55 (5/9)b

a,b,c,d,eLetras diferentes sinalizam diferenças estatíticas significativas (p ≤ 0.05) entre grupos para um dado

parâmetro.


Em geral, o metabolismo de HPAs ocorre através da ativação do receptor aril-

hidrocarboneto (AHR). A ligação do hidrocarboneto ao receptor promove a formação de

um complexo que migra para o núcleo celular. O complexo ativa a expressão de diversos

genes alvo relacionados ao metabolismo de xenobióticos como as enzimas do citocromo

P450, aldeído desidrogenase e glutationa transferase (Shimada, 2006; Zhang and Walker,

2006). Tais enzimas podem converter os HPAs em diversos produtos hidrofílicos com o

objetivo de eliminá-los do organismo. Alguns dos metabólitos formados possuem a

capacidade de se ligar ao DNA e formar adutos com esta molécula podendo levar à

alterações na estrutura do próprio DNA e na expressão de proteínas codificadas por ele


52

(Marinkovic et al., 2013). Em particular, foi demonstrada a citotoxicidade dose

dependente promovida pelo DBT em cultura de células HepG2 e a formação de adutos

de DNA após 24 horas de exposição ao HPAS (Amat et al., 2004).

Diversos trabalhos constataram a presença do metabólito do DBT, o DBTO2, em

modelos animais. Apesar disso, o DBT, assim como outros HPAs de 2-3 anéis, é

considerado um ativador fraco do receptor AHR, consequentemente levando a uma baixa

expressão de enzimas CYP450 (Ciganek et al., 2004; Hecht et al., 2010). Devido a este

fato, tem sido especulado que a toxicidade do DBT ocorre através de outros mecanismos

diferentes da ativação de AHR, mas tais vias ainda permanecem desconhecidas

(Incardona et al., 2004).

A presença de inflamação e necrose aumentadas nos grupos Testes indica o

potencial irritativo e lesivo das drogas utilizadas. Tal observação corrobora com estudos

que demonstraram através da análise de transcritos de zebra fish tratados com DBT, um

aumento de quatro vezes nos níveis da enzima colesterol 25-hidroxilase. Esta molécula

desempenha um conhecido papel no desenvolvimento da resposta inflamatória (Goodale

et al., 2013). Diversos HPAs são conhecidamente capazes de induzir o estresse oxidativo

em culturas de células levando ao aumento da expressão de citocinas inflamatórias

(Suresh et al., 2009; Ovrevik et al., 2010). Além disso, as observações de crescimento

celular aumentado e alterações nas estruturas teciduais demonstram um estágio inicial de

displasia característico de lesões pré-neoplásicas (Fig. 17).

Diante da constatação de indução de lesões de natureza neoplásica nos animais

tratados com DBT e DBTO2 com características semelhantes àquelas provocadas pela

administração crônica de mesma dose de DMH, fica clara a importância desses resultados

como contribuição para a avaliação toxicológica dessas substâncias de irrefutável

relevância ambiental.


53

Figura 17: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados pela técnica de

HE. A, C, E, G, I 110x. B, D, F 220x. H, J 440x. A, B, E) Detalhes da túnica mucosa apresentando aspecto

histológico normal. F) Notar aumento de células inflamatórias na região glandular (setas). C) Observar

hiperplasia linfoide na região mucosa (estrela). D) Observar células displásicas (seta) determinando a

formação de estruturas irregulares e de difícil identificação e processo inflamatório associado (estrela). G)

Observar área de necrose (estrela) associada à atrofia mucosa. H, J) Observar glândulas com células atípicas

e grande polimorfismo nuclear e celular (seta). I) Aumento irregular da camada mucosa.



54

5.1.3- Marcação Imunohistoquímica: CEA e CD44

Com o objetivo de confirmar o diagnóstico obtido através da análise histológica

dos intestinos grosso e delgado dos animais pertencentes aos grupos Controles e Testes,

realizou-se a marcação imunohistoquímica com os antincorpos anti-CEA e anti-CD44.

Tais proteínas são conhecidos marcadores tumorais para CCR e outros tipos de câncer

encontrados em diferentes estágios do desenvolvimento tumoral (McLeod and Murray,

1999; Duffy et al., 2003; Wang et al., 2009b).

O Antígeno Carcinoembrionário (CEA) é o marcador proteico mais utilizado na

clínica para avaliação do câncer colorretal. A detecção de altos níveis de expressão desta

proteína no soro ou tecidos está relacionada a um prognóstico ruim da doença (Duffy et

al., 2003). O CEA é um membro da família de imunoglobulinas que atua na adesão

intercelular, função esta, que está intimamente ligada à ocorrência de metástases (Kitadai

et al., 1996).

A avaliação da capacidade celular de polarização do CEA também vem sendo

proposta como método auxiliar no estadiamento do CCR atualmente realizado pela

avaliação das características morfológicas do tumor (TNM). Tal proposta considera as

características morfológicas e funcionais e melhora o entendimento do comportamento

tumoral. Nos tecidos normais ocorre uma polarização da proteína CEA que geralmente

atinge a região apical da célula. Nos tecidos neoplásicos bem polarizados (estágio inicial)

ocorre manutenção parcial da capacidade de polarização, enquanto em estágios mais

avançados ocorre uma distribuição difusa desse antígeno (Priolli et al., 2007).

A proteína CD44 (Cluster of differentiation 44) é um receptor de membrana que

possui uma região ligante para o ácido hialurônico da matriz extracelular através da qual

participa de diversas vias de sinalização celular ligadas à progressão tumoral incluindo

invasão e metástase (Wang et al., 2009a). Essas moléculas de adesão controlam o

comportamento celular através da mediação de contato entre as células ou entre as células

e a matriz extracelular, sendo essenciais para a manutenção da integridade tecidual

(Orian-Rosseau, 2010).

Os membros da família CD44 podem ser encontrados na forma padrão (CD44s),

usualmente associada ao tecido linfóide, ou como isoformas (CD44v) em células

epiteliais embrionárias e em diversos carcinomas humanos (Coppola et al., 1998; de Paula

Carli et al., 2012). No CCR, a isoforma CD44v3 parece estar associada à promoção de

invasão e resistência a apoptose, enquanto a isoforma CD44v6 associa-se com a


55

ocorrência de metástase e diminuição na sobrevida do paciente (Kuniyasu et al., 2001;

Kuhn et al., 2007).

A expressão epitelial de CD44 em tecidos intestinais normais também ocorre de

maneira localizada. Rudzki e colaboradores demonstraram por imunohistoquímica que

essa proteína encontra-se limitada à porção interna do epitélio, não sendo observada na

superfície do mesmo. Em tecidos neoplásicos ocorre aumento de expressão das isoformas

CD44v, e esse padrão de distribuição torna-se alterado (Rudzki and Jothy, 1997).

Como pode ser observado na Figura 18, os gráficos 1 e 2 demonstram a contagem

de células intestinais marcadas com os anticorpos anti-CEA e anti-CD44. Em ambos os

gráficos foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos

Controles e seus respectivos grupos Testes. Além disso, os grupos Controle apresentaram

contagens semelhantes entre si para cada anticorpo utilizado, assim como os grupos

Testes demonstrando similaridade entre os efeitos promovidos pelo DBT, DMH e DBTO2

na alteração dos níveis de expressão desses antígenos. Em ambos os gráficos o aumento

encontrado entre os grupos Controle e Testes foi de aproximadamente 3 vezes,

confirmando o caráter neoplásico das lesões avaliadas histologicamente.

A distribuição celular das proteínas CEA e CD44 também foi avaliada de maneira

qualitativa para auxiliar na caracterização das alterações morfofuncionais observadas nos

animais dos grupos Testes. Pode-se observar que para os animais pertencentes aos grupos

Testes DMH, DBT e DBTO2 a marcação imunohistoquímica com anti-CEA apresentou-

se de maneira relativamente difusa no citoplasma celular quando comparada com a

marcação encontrada nos animais pertencentes aos grupos Controle. Quanto à marcação

obtida com o anticorpo anti-CD44 para os grupos Controle pode-se observar a localização

da expressão proteica no interior da camada submucosa, enquanto para os animais dos

grupos Testes tal marcação foi encontrada por toda a extensão tecidual. Em conjunto, as

duas observações parecem indicar um estágio leve a moderado de progressão tumoral

como descrito anteriormente.


56

Figura 18: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados pela técnica de

imunohistoquímica e contra corados com hematoxilina. Aumentos de 440x. A, C, E, G, I) Detalhes das

túnicas mucosa e sub mucosa reveladas com anticorpo anti-CEA (C, G, I animais dos grupos Testes DMH,

DBT e DBTO2 – notar marcação mais acentuada quando comparado com A, e E que são animais dos grupos

Controle Salina e Óleo). B, D, F, H, J) Detalhes das túnicas mucosa e sub mucosa reveladas com anticorpo

anti-CD44 (D, H, J animais dos Grupos Testes DMH, DBT e DBTO2 – notar marcação mais acentuada

quando comparado com B, F que são animais dos grupos Controle Salina e Óleo). 1 e 2) Análise estatística

mostrando as diferenças entre grupos Controles e Testes para o nº de células marcadas com anti-CEA e

anti-CD44. Contagem realizada por meio do software Image J.

Lâminas pertencentes a quatro animais de cada grupo controle e teste foram avaliadas.


57

5.2- Análise Proteômica

A relação entre biomarcadores tumorais e o CCR tem sido extensivamente

investigada. Proteínas envolvidas em diversos aspectos da progressão da doença

incluindo invasão, metástase, regulação do ciclo celular, fatores de crescimento e

apoptose têm sido descritas como potenciais marcadores (O’Dwyer et al., 2011). As vias

biológicas que podem formar a base para novos agentes terapêuticos têm sido

identificadas para diversos tipos de câncer. Embora algumas mutações de alta frequência

sejam alvos atrativos para o desenvolvimento de drogas, vias de sinalização comuns,

relacionadas a essas mutações, também podem ser alvos para terapia (Markowitz and

Bertagnolli, 2009).

Sendo assim, torna-se interessante um estudo molecular das lesões desenvolvidas

pelos animais tratados com os agentes carcinogênicos, considerando a similaridade entre

as alterações macro e microscópicas dos tecidos intestinais dos ratos tratados com DBT

e DBTO2, e aquelas encontradas nos animais tratados com DMH. Tal abordagem, poderia

auxiliar na verificação das possíveis relações entre as vias biológicas envolvidas no

estabelecimento do processo carcinogênico promovido por ambos os tratamentos. Sendo

assim, inicialmente foram extraídas proteínas solúveis de tecidos intestinais provenientes

de todos os grupos citados para identificação e análise da expressão diferencial das

mesmas.

As figuras 19, 20 e 21 apresentam os perfis eletroforéticos representativos de

triplicatas referentes aos extratos proteicos de fração solúvel obtidos por 2D SDS-PAGE

10% para os grupos III/IV, III/V e I/II, respectivamente. Mediante a análise da

sobreposição e densitometria das imagens realizada através do software SameSpots

(TotalLab), foi possível observar a expressão diferenciada de diversas proteínas entre os

grupos Controle e seus respectivos grupos Testes (indicada pelas setas numeradas).

Foram consideradas quantitativamente significativas, as diferenças de expressão para

cima ou para baixo, com valores de pelo menos 1,5 vez na triplicata biológica realizada,

com um desvio padrão máximo aceitável de 10%.

A qualidade das preparações pode ser atestada pela observação da cobertura de

toda a extensão da faixa de pH provida pela strip durante a isoeletrofocalização (pH3-

10), e também pela presença de spots representando diversas massas moleculares

indicando a manutenção da integridade proteica.


58

Figura 19: Géis 2D SDS-PAGE 10% representativos da extração de proteínas solúveis de intestinos delgados dos

A) Grupo Controle Óleo (III) e B) Teste DBT (IV). Nas setas numeradas estão marcados os spots identificados por

espectrometria de massas que apresentaram diferença de 1,5 vez na expressão. Coloração realizada com solução de

Coomassie Coloidal. Para cada experimento foi realizada uma triplicata biológica independente.


A) Grupo Controle Óleo (III) e B) Teste DBTO2 (V). Nas setas numeradas estão marcados os spots identificados

por espectrometria de massas que apresentaram diferença de 1,5 vez na expressão. Coloração realizada com solução

de Coomassie Coloidal. Para cada experimento foi realizada uma triplicata biológica independente.


59


A) Grupo Controle Salina (I) e B) Teste DMH (II). Nas setas numeradas estão marcados os spots identificados por

espectrometria de massas que apresentaram diferença de 1,5 vez na expressão. Coloração realizada com solução de

Coomassie Coloidal. Para cada experimento foi realizada uma triplicata biológica independente.

Em média, 1700 spots foram detectados por par de gel controle/teste analisado. A

grande maioria destas proteínas mostrou níveis equivalentes de expressão entre os grupos

avaliados. Entretanto, foi possível detectar alterações em 84 spots pertencentes aos grupos

Controle e Teste DBT e DBTO2. Destes, 16 spots relativos ao grupo IV e 20 relativos ao

grupo V demonstraram diminuição na expressão dos testes em relação ao controle e 68 e

64 spots revelaram aumento na expressão de proteínas relativas aos mesmos grupos (não

mostrado nas figuras), respectivamente. Quanto à avaliação dos géis preparados para os

grupos Controle Salina e Teste DMH foram detectados 88 spots com alteração na

expressão proteica. Destes, 19 mostraram diminuição e 69, aumento na densidade dos

spots avaliados.

Todos os spots que demonstraram algum tipo de alteração de expressão foram

excisados e digeridos com tripsina para identificação por espectrometria de massas. Após

o sequenciamento e aplicação dos critérios de seleção descritos no item 4.3.3, 22 proteínas

isoladas nos géis relativos aos grupos III, IV e V e 38 proteínas isoladas nos géis relativos

aos grupos I e II foram identificadas e agrupadas de acordo com as funções moleculares

por elas desempenhadas nas células (Tab. 04 e 05). Dados referentes à identificação dos

peptídeos trípticos encontram-se no Apêndice D ao fim deste trabalho (Apêndice D – Tab.

01.D e Tab. 02.D).


60

Tabela 04: Proteínas identificadas por spot nos géis referentes aos grupos Teste IV e V que apresentaram alteração na expressão ≥ 1,5 vezes em relação ao grupo Controle III.

Spot Gene Proteína Identificada Nº de acesso Peptídeos

Únicos

%

Cobertura pI

Massa Molecular

Esperada (kDa)

Massa Molecular

Observada (kDa)

Resposta a estresse

1

2

19

HSPA5

HSPA2

HSP70

GRP78

Chaperona hsp72-ps1

Proteína Heat shock 70

gi|25742763

gi|347019

gi|149038951

15

12

4

42

46

23

5.07

5.43

5.03

72.4

71.1

56.3

66

61.8

27.7

Citoesqueleto

20

26

44

82

TPM5

ACTB

CFL1

CORO1A

Tropomiosina 5

Actina subunidade beta

Cofilina 1

Coronina 1A

gi|9653293

gi|4501885

gi|8393101

gi|18426834

1

6

5

7

37

48

62

37

4.72

5.29

8.22

6.05

29.2

42.1

18.7

51.7

27.3

34.8

15.5

50.5

Atividade Antioxidante

43 PRDX1 Peroxiredoxina 1 gi|16923958 6 72 8.27 22.3 19.7

Sinalização Celular

22

57

ARHGDIA

GNB2L1

Inibidor de Dissociação-Rho GDP 1

Proteína ligante-nucleotídeo Guanina

gi|31982030

gi|5174447

6

15

49

77

5.12

7.6

23.5

35.5

23

28.4

Metabolismo de Carboidratos

32

37

54

59

64

PGK1

LDHA

AKR1B1

PGAM1

TKT

Fosfoglicerato quinase 1

L-lactato dehidrogenase A

Aldose redutase

Fosfoglicerato mutase 1

Transcetolase, isoforma CRA_a

gi|40254752

gi|8393706

gi|6978491

gi|114326546

gi|149034221

13

9

5

9

1

62

61

26

72

39

8.02

8.45

6.26

6.67

7.54

44.9

36.7

36.2

29.8

71.9

42.1

31.4

31.8

24.2

45.3

Metabolismo de Lipídeos

17

31

ANXA5

PNLIP

Anexina 5

Triacilglicerol lipase

gi|2981437

gi|6981376

1

15

8

53

4.99

6.31

33.9

52.1

29.5

44

Metabolismo de Nucleotídeos/Fosfato

48 CKB Creatina quinase B gi|401461784 15 66 5.39 42.9 40.3

Modelamento de Proteínas

41

79

RFESD

CANX

Proteína Rieske Fe-S

Calnexina

gi|149043682

gi|25282419

1

6

26

20

8.9

4.49

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61

Outros Processos

23

62

63

FCGBP

TF

TF

Fragmento Fc de IgG

Transferrina

Transferrina

gi|257467629

gi|1854476

gi|1854476

10

16

7

9

33

24

4.92

6.94

6.94

28.7

78.5

78.5

93

69.3

63.2

Tabela 05: Proteínas identificadas por spot nos géis referentes ao grupo Teste II que apresentaram alteração na expressão ≥ 1,5 vezes em relação ao grupo Controle I.

Spot Gene Proteína Identificada Nº de acesso Peptídeos

Únicos % Cobertura pI

Massa Molecular

Esperada (kDa)

Massa Molecular

Observada (kDa)

Síntese/Degradação de Proteínas

25

57

EEF2

MCPT1

Fator de elongação 2

Protease de mastócitos 1

gi|8393296

gi|8393764

19

11

38

68

6,41

6,55

96,2

27,6

86,1

20,5

Citoesqueleto

1

5/6

12

45

70

75

76

TPM1

ACTB

TAGLN

TPM5

MYL

KRT8

EZR

Tropomiosina 1, alfa

Actina subunidade beta

Transgelina

Tropomyosina 5

Miosina, cadeia leve

Citoqueratina 8

Ezrina

gi|149028892

gi|4501883

gi|13928744

gi|9653293

gi|71037403

gi|203734

gi|40804381

13

13

11

4

9

24

9

58

56

53

51

66

63

29

4.69

5,23

8,87

4,72

4,67

5,49

5,83

32,7

42,4

22,6

29,1

19,9

52,7

69,4

32,9

36,7

15,1

24,9

15,9

46,7

70,5

Atividade Antioxidante

36

38

44

PRDX1

ADH

SOD

Peroxiredoxina 1

Álcool Dehidrogenase

Superóxido Dismutase [Mn]

gi|16923958

gi|202727

gi|8394331

8

1

9

77

69

42

8,27

8,52

8,96

22.3

40,5

24,9

40,3

35,9

17,9

Sinalização Celular

60ª

60b

61a

61b

63

72

88

DPP7

TRA1

LUM

RBBP4

YWHAE

ARHGDIA

LGALS3

Dipeptidil peptidase 2

Proteína associada a transcrição 1

Lumican

Proteína ligante de histona RBBP4

14-3-3 proteína epsilon

Inibidor de Dissociação-Rho GDP 1

Galectina 3

gi|14010871

gi|51858886

gi|13591983

gi|5032027

gi|5803225

gi|31982030

gi|13929190

5

10

5

9

14

8

8

22

23

21

30

58

57

37

4,87

5,02

6

4,74

4,63

5.12

8,93

55,6

74,3

38,6

47,9

29,3

23,4

27,3

46,7

46,7

44,4

44,4

24,3

21,8

22,3

Metabolismo de Lipídeos

42 ANXA2 Anexina 2 gi|9845234 24 75 7,55 38,9 32,1

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62

Metabolismo de Carboidratos

30

31

33

39

41

54

55

83

TKT

PKM2

DLD

ALDOA

GAPDH

GAPDH

ENO1

PGK1

Transcetolase

Piruvato quinase M2

Dihidrolipoil dehidrogenase

Aldolase A

Glicerald.-3-fosf. Dehidrogenase

Glicerald.-3-fosf. Dehidrogenase

Enolase alfa

Fosfoglicerato quinase 1

gi|12018252 gi|206205

gi|40786469

gi|202837

gi|8393418

gi|56188

gi|38649320

gi|40254752

1

25

10

1

1

6

5

15

39

61

28

60

62

21

23

64

7,54

7,15

7,96

8,31

8,14

8,43

6,7

8

71,9

58,3

54,6

39,7

36,1

36,1

51,7

44,9

60,7

52

50,6

34,3

31,5

30,1

43,3

38,4

Metabolismo de Nucleotídeos/Fosfato

29

80

ATIC

CMPK

Biossíntese de purina bifunc. PURH

Citidina monofosfato quinase

gi|48675845

gi|150383503

16

10

41

62

6,69

5,66

64,6

22,4

53,5

17,5

Modelamento de Proteínas

18

20

29

CALR

HSP90B1

CCT6

Calreticulina

Endoplasmina

Proteína Complexo-T 1 sub. zeta

gi|11693172

gi|210032365

gi|76253725

15

19

14

52

30

48

4,33

4,72

6,63

48,2

92,9

58,4

50,6

88,9

53,5

Outros Processos

7

27

43

50

SELENBP

WDR1

VDAC2

IGG2A

Proteína ligante de selênio 1

Repetição WD contendo proteína 1

Canal seleção ânion voltagem dep.2

Imunogl. Gama-2a cadeia pesada

gi|18266692

gi|62078997

gi|13786202

gi|1220486

25

17

11

10

58

32

51

30

6,1

6,15

7,44

8,15

53,1

66,8

32,4

52,2

47,9

58,7

25,4

43,3

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63

Os níveis de alteração na expressão para cada proteína descrita nas tabelas

anteriores podem ser observados nas Figuras 22 e 24. As moléculas identificadas foram

categorizadas de acordo com sua função biológica em proteínas envolvidas na resposta

ao estresse, organização de citoesqueleto, atividade antioxidante, sinalização celular,

metabolismo de carboidratos, lipídeos e nucleotídeos, modelamento, síntese e degradação

de proteínas.

Figura 22: Diferença nos níveis de expressão proteica dos grupos Teste DBT IV (barras brancas) e Teste

DBTO2 V (barras pretas) em relação ao grupo Controle Óleo III. Os resultados representam a média ± SEM

de triplicatas biológicas independentes. Asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre

os grupos IV e V para uma dada proteína.

Na Figura 22 que compara as alterações encontradas nos grupos Teste IV e V em

relação ao grupo Controle III, podemos observar que apenas as proteínas HSPA2 e

HSPA5 tiveram seus níveis diminuídos para ambos os grupos. Interessantemente, os spots


64

identificados como ARHGDIA, PGK1 e CKB demonstraram níveis de expressão opostos

entre os dois grupos Testes em questão. As proteínas ACTB e CANX tiveram níveis

aumentados de expressão e foram utilizadas na validação dos resultados obtidos por

análise proteômica via 2D SDS-PAGE através de Western blotting (Apêndice E – Fig.

01.E).

Moléculas envolvidas na organização do citoesqueleto como cofilina 1, coronina

1, actina e tropomiosina 5, merecem atenção por estarem super expressas. Nesse contexto,

diversos trabalhos já demonstraram aumento nos níveis de expressão da proteína coronina

1 em tecidos tumorais de mama onde ela parece contribuir para invasão e migração das

células tumorais. A super expressão de CORO1A parece estar relacionada à translocação

de Rac1 para a membrana plasmática. Rac1 GTPase, por sua vez, controla diversos

processo gerais como a dinâmica do citoesqueleto, regulação de tamanho celular e entrada

no ciclo celular além da transcrição gênica. Para tal, Rac1 interage com efetores como

proteínas quinases, enzimas, proteínas de modelamento e reguladores diretos do

crescimento, estabilização e ramificação do filamento de actina. A atividade de Rac1 é

controlada através da transição do estado inativo, ligado a GDP, ao estado ativo, ligado a

GTP. Fatores de troca GDP/GTP, proteínas ativadoras de GTPases e inibidores de

dissociação de Rho GDP (RhoGDI) realizam esse controle. CORO1A parece estar

envolvida também na modulação da resposta imune desempenhando papel na

sobrevivência, migração, ativação e regulação de Ca2+ em células T além de suprimir a

ativação de NF-κB inibindo a degradação de IκBα e a translocação nuclear de p65 (Kim

et al., 2009; Castro-Castro et al., 2011; Kaminski et al., 2011; Liu et al., 2014).

Níveis aumentados de cofilina 1 parecem estar associados com um prognóstico

ruim em pacientes com câncer de pulmão. Esta proteína desempenha um papel central no

controle da polimerização de filamentos de actina. Sua atividade pode ser regulada por

fosforilação/defosforilação em resíduos de serina após a estimulação de receptores

ligados à proteína G regulados predominantemente por via dependente de Rac2 e GSK3.

PI3K pode promover ativação da fosfatase SSH1 induzida por insulina e defosforilação

de CFL1 em células de câncer de mama (Peng et al., 2011; Bravo-Cordero et al.,2013).

A diminuição da expressão da tropomiosina 5 em células de melanoma de

camundongos levou ao comprometimento e diminuição da motilidade, contribuindo para

a redução do potencial metastático dessas células, demonstrando o papel desempenhado

por essa proteína no estabelecimento e migração tumoral (Miyado et al., 1996). A

expressão alterada de isoformas celulares e nucleares de actina tem sido demonstrada


65

durante a tumorogênese como resultado de sinalização epigenética e perfil genético

alterado para as sequências específicas relacionadas com tais genes (Rao et al., 1997).

Interessantemente, a proteína ARHGDIA (Rho-GDI), que também apresentou

níveis aumentados de expressão celular, encontra-se relacionada à YWHAE atuando em

vias de sinalização relacionadas. ARHGDIA regula a troca GDP/GTP em proteínas

GTPases relacionadas a Ras (subfamília de proteínas Rho - CDC42, RAC1 e RHOA)

impedindo a dissociação de GDP e mantendo-as em estado inativado, protegendo-as de

degradação. Níveis elevados de Rho-GDI podem resultar em migração celular aumentada

e prevenção de apoptose contribuindo para a sobrevivência e migração tumoral como

descrito para câncer de pulmão e cólon, além de serem associados com quimioresistência

em diversas linhagens celulares. A força da interação Rac1/RhoGDI é modulada

negativamente por diversos sinais incluindo proteína quinase C (Adra et al., 1997; Faure

and Dagher, 2001; Wei et al., 2002; Dovas and Couchman, 2005; Zhao et al., 2008).

Enzimas envolvidas no metabolismo de lipídeos e carboidratos também

apresentaram aumento significativo nos tecidos displásicos avaliados. Um aumento

significativo na expressão da enzima triacilglicerol lipase aponta para um papel chave

desempenhado por essa proteína para sustentar a alta demanda energética requerida pelas

células proliferativas. Em paralelo, a super expressão de enzimas envolvidas no

metabolismo de carboidratos, particularmente aquelas relacionadas à via glicolítica,

podem permitir a utilização do glicerol proveniente do metabolismo lipídico aumentado.

O mapa de interação proteica observado na Figura 23, ilustra estas relações. Mais

de 50% das proteínas identificadas demonstram algum grau de interação intracelular. De

relevância particular, os altos níveis de triacilglicerol lipase e de enzimas envolvidas no

processamento de glicerol/carboidrato, fornecem um indício primário sobre o

metabolismo dos tecidos displásicos induzidos pela exposição ao DBT e DBTO2.

Ainda em concordância com o exposto anteriormente, os níveis aumentados

observados para peroxiredoxina 1 podem explicar seu papel no metabolismo de radicais

livres, particularmente peróxidos, gerados por β-oxidação de ácidos graxos. Um papel

adicional para o aumento de expressão para proteínas relacionadas ao estresse oxidativo,

incluindo HSP70, seria controlar o efeito tóxico promovido pelo intenso infiltrado

inflamatório observado. Membros da família da HSP70 relacionam-se com o

modelamento de proteínas contribuindo significativamente para a homeostase proteica.

A isoforma HSP70-1 é expressa em altos níveis em tecidos normais e tumorais

sendo simplesmente referida como HSP70 (Murphy, 2013). Em contraste, a expressão de


66

HSP70-2, conhecida como HSPA2, mostra níveis diminuídos em diversos tecidos, com

exceção descrita em literatura para testículos de ratos (Scieglinska et al., 2011).

Concordando com os resultados obtidos neste trabalho, Scieglinska e colaboradores

reportaram níveis indetectáveis de HSPA2 em três diferentes linhagens de células

tumorais incluindo HCT116 de CCR (Scienglinska et al., 2008). A proteína HSPA5

também demonstrou baixos níveis de expressão nos grupos Teste IV e V, mas seu papel

na progressão de neoplasias em intestino delgado continua obscuro.

Figura 23: Mapa de interação proteica para proteínas diferencialmente expressas entre grupos Teste IV e

V e Controle III. Linhas azuis indicam interações proteína-proteína. A espessura das linhas indica a força

das associações. Mapa montado utilizando o software STITCH v. 4.0.


67

A Figura 24 apresenta os resultados obtidos com a análise proteômica para o grupo

Teste II em relação ao grupo Controle I. Quando avaliadas as proteínas relacionadas à

organização do citoesqueleto, os spots identificados indicaram diferentes tipos de

regulação sendo sub expressas as proteínas ACTB, TPM1 e TAGLN e super expressas as

proteínas TPM5, MYL, KRT8 e EZR. TPM5 também apresentou níveis aumentados

quando avaliados os grupos Teste IV e V.

Figura 24: Diferença nos níveis de expressão proteica entre o grupo Teste DMH (II) e o grupo Controle

Salina (I). Os resultados representam a média ± SEM de triplicatas biológicas independentes.

Os spots identificados como PGK1 e ARHGDIA apresentaram resultados opostos

àqueles encontrados para as mesmas proteínas no grupo Teste V mas não no grupo IV. Já

as proteínas TKT, PRDX1 e ANXA apresentaram resultados semelhantes em relação ao

aumento de expressão observado para todos os tratamentos. As demais proteínas

identificadas relacionadas à atividade antioxidante, sinalização celular, metabolismo de


68

carboidrato, lipídeos, de nucleotídeo/fosfato e modelamento de proteínas apresentaram

níveis aumentados de expressão celular.

Assim como encontrado para os grupos Teste IV e V, diversas proteínas

relacionadas ao metabolismo de carboidratos (TKT, PKM2, ALDOA, GAPDH, ENO1,

PGK1, DLD) e a atividade antioxidante (PRDX1, ADH e SOD) mostraram aumento nos

níveis de expressão.

A proteína TAGLN está relacionada à manutenção da organização dos filamentos

de actina in vivo e a diminuição de sua expressão por inativação via Ras pode ser

observada em linhagens celulares tumorais como mama e cólon, sendo considerada um

marcador no início da transformação tumoral (Zhang et al., 2010; Thompson et al., 2012).

Em concordância com o achado de Mlakar e colaboradores observamos a sub expressão

da isoforma TPM1 em nossas amostras de CCR (Mlakar et al., 2009). Alterações no nível

de expressão da proteína EZR estão relacionados com a ocorrência de metástase e

prognóstico ruim em diversos tipos de câncer. Tal proteína interage com diversas

moléculas de sinalização intracelular envolvidas na progressão tumoral como receptor

Met de fator de crescimento de hepatócito (HGF), integrina β4 e membros da família de

quinases Src (Ghaffari et al., 2014).

Em relação à síntese e degradação de proteínas observou-se um aumento nos

níveis de EEF2 que realiza a translocação da cadeia polipeptídica crescente do sítio A ao

sítio P do ribossomo. A super expressão dessa proteína foi relatada em tumores gástricos,

intestinais, entre outros e parece desempenhar também um papel regulatório na

progressão do ciclo celular nas fases G2/M (Oji et al., 2014). MCPT1 é uma protease

envolvida na degradação de matriz extracelular e favorecimento da angiogênese. Alguns

trabalhos vêm relacionando os níveis de expressão desta e de outras proteases secretadas

com o comportamento tumoral. Foi observado que a presença de mastócitos MCPT1

negativos atuam inibindo o crescimento tumoral e a angiogênese por meio da liberação

de diferentes estímulos (Dyduch et al., 2012).

É importante ressaltar o aumento observado na expressão de diversas proteínas de

sinalização celular. Entre elas, TRA1 se destaca por ser um componente integral dos

complexos histona acetiltransferase STAGA, TFTC e PCAF, equivalentes encontrados

em mamíferos para SAGA, e TIP60, o equivalente para NuA4 de leveduras. TRA1 é um

membro da família de proteínas quinase fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), responsáveis

por regular diversas vias de sinalização por fosforilação de serina/treoninas além de ser

alvo de fatores de transcrição oncogênicos que incluem c-myc, E2F e E1a (Esseghir et


69

al., 2007; Helmlinger et al., 2011; Knutson and Hahn, 2011). A proteína de matriz

extracelular LUM está relacionada com a modulação do comportamento celular incluindo

migração e proliferação através da reorganização do citoesqueleto de actina e

desestabilização de complexos de adesão celular. Diversos estudos relatam a super

expressão desta proteína em tumores no útero, pâncreas e cólon intestinal, aparentemente

relacionada a estágios iniciais do desenvolvimento (Lu et al., 2012; Seya et al., 2006;

Pietraszek et al., 2013; Nikitovic et al., 2014).

A família de proteínas regulatórias 14-3-3 (YWHAE) possui mais de 100 ligantes

descritos incluindo moléculas de sinalização celular como a proteína quinase C (PKC),

PI3K e fosfatase cdc25 de maneira dependente de fosforilação. Sua ligação à Raf é

indispensável para a via de sinalização Ras/MAPK, enquanto a ligação à Bcl-2 está

relacionada à inibição de apoptose. A isoforma ε liga-se a p190RhoGEF através de

interação independente de fosforilação e modula a formação do citoesqueleto via FAK.

YWHAE demonstra super expressão nos cânceres de mama, pulmão, tireóide e cólon

sendo que a presença da isoforma ε parece proteger as células tumorais e endoteliais de

cólon de apoptose induzida por estresse oxidativo (Zhai et al., 2003; Satoh et al., 2004;

Liu et al., 2013).

A proteína Galectina-3 (LGALS3) atua como fator de splicing de pré-mRNAs no

núcleo além de estar envolvida na resposta inflamatória aguda incluindo ativação e adesão

de neutrófilos, quimioatração de monócitos e ativação de mastócitos. Parece participar da

regulação de diversas vias de sinalização celular: (1) envolvimento na translocação

nuclear de β-catenina juntamente com as proteínas importina-α/β, nucleoporinas e

FoxM1, na fosforilação de GSK3 e ativação de TCF na via Wnt/β-catenina; (2)

envolvimento na via de sinalização Notch através da interação com a proteína de

membrana Tumor-derived jagged-1 (Laubli et al, 2014; Nakajima et al., 2014; Shim et

al., 2015).

Como pode ser observado na Figura 25, mais de 85% das proteínas que

apresentaram algum grau de alteração na expressão encontram-se relacionadas

intracelularmente, reforçando a ideia de que elas participam de vias de sinalização ligadas

ao desenvolvimento tumoral nos animais estudados.


70

Figura 25: Mapa de interação proteína-metabólito para proteínas diferencialmente expressas entre grupos

Teste II e Controle I. Linhas azuis indicam interações proteína-proteína. A espessura das linhas indica a

força das associações. Mapa montado utilizando o software STITCH v. 4.0.


71

5.3- Identificação de Peptídeos Ligantes à Tecidos Neoplásicos Intestinais de

Animais Tratados com DMH, DBT e DBTO2

Além da abordagem proteômica que avaliou os extratos celulares das frações

solúveis através da digestão tríptica, buscamos marcadores moleculares utilizando a

técnica de Phage Display, que seleciona peptídeos ligantes às proteínas diferencialmente

expressas entre os Grupos Controles e Testes através da afinidade de ligação aos mesmos.

Sendo assim, realizou-se uma extração de proteínas solúveis com posterior

quantificação por densitometria e submeteu-se essas amostras à eletroforese

unidimensional para verificação da qualidade de extração. Como pode ser observado na

Figura 26, obteve-se uma ampla variedade de proteínas com perfis eletroforéticos bem

definidos demonstrando que a amostra encontrava-se adequada para a utilização no

experimento de Phage Display.

Figura 26: Perfis eletroforéticos representativos em 1D SDS-PAGE 12% de proteínas de Intestino Delgado

(Controle DBT; Teste DBT (D)) e de Intestino Grosso (Teste DBT (G); Controle DMH; Teste DMH) para

a verificação da qualidade da extração proteica. Coloração realizada com Coomassie.


72

5.3.1- Biopanning de Tecido Intestinal

A seleção de peptídeos foi realizada utilizando-se uma biblioteca expressa na

superfície de fagos filamentosos M13. Para tal, utilizaram-se 3 etapas de subtração

empregando amostras proteicas de tecidos intestinais de grupos Controle e Testes para

DMH e DBT. Como as alterações apresentadas pelo grupo Teste DBTO2 não

apresentaram diferenças substanciais do grupo Teste DBT diante da abordagem

proteômica, e, presumivelmente este tratamento promove alterações moleculares através

de vias semelhantes, o primeiro não foi utilizado para seleção de peptídeos por essa

técnica a fim de se simplificar o processo.

Finalizados os 3 ciclos de seleção para extratos provenientes do intestino grosso

dos grupos Controle/Teste DMH, intestino grosso Controle/Teste DBT e intestino

delgado Controle/Teste DBT, as colônias de ER2738 contendo os fagos relativos ao

último ciclo de seleção foram plaqueadas e tituladas para que se pudesse obter fagos

isolados para extração e sequenciamento do DNA. Como pode ser observado na Figura

27, não houve aparecimento de colônias brancas indicando ausência de contaminação das

bactérias por fagos do tipo selvagem, demonstrando que a infecção das bactérias ER2738

foi adequada (colônias azuis indicando a presença de fagos M13 que carregam o gene da

β-galactosidase).

Selecionaram-se de maneira randômica 32 colônias isoladas pertencentes a cada

grupo avaliado para nova amplificação e extração e sequenciamento do DNA a fim de se

obter as sequências de peptídeos específicas ligantes para os grupos testes. O DNA

extraído foi submetido à eletroforese em gel de agarose 0,8% para verificar sua qualidade

e estimar sua concentração. Realizou-se então a reação de PCR para amplificação do

DNA e sequenciamento utilizando-se o sequenciador automático MegaBACE 1000.

Foram obtidas ao todo 27 sequências para o grupo DMH sendo 16 delas sequências únicas

(não repetidas), 25 sequências para o grupo DBT intestino grosso, sendo 10 delas únicas

e 29 sequências para o grupo DBT intestino delgado sendo 11 únicas.


73

Figura 27: Fotografias representativas da titulação dos fagos obtidos no último ciclo de seleção de cada

grupo para isolamento das colônias de ER2738 e consequente amplificação e sequenciamento do DNA. A)

Titulações de 10-1 a 10-3 para o grupo DMH intestino grosso; B) Titulações de 10-1 a 10-3 para o grupo DBT

intestino delgado; C) Titulações de 10-1 a 10-3 para o grupo DBT intestino grosso.

5.3.2- Análise in silico de Peptídeos Selecionados

Os peptídeos obtidos a partir do sequenciamento de DNA de fagos foram

avaliados primeiramente quanto à similaridade da sequência de aminoácidos por meio do

software ClustalW. Após a realização do alinhamento foi observado que nenhuma das

sequências apresentou repetições de aminoácidos em posições semelhantes intra ou

intergrupos (Figura 28). O alinhamento das sequências poderia revelar a ocorrência de

epítopos e direcionar a seleção daqueles que seriam primariamente utilizados nos

experimentos subsequentes.


74

Figura 28: Alinhamento das sequências peptídicas obtidas após sequenciamento do DNA dos fagos

selecionados randomicamente ao fim do terceiro ciclo de biopanning para os três grupos avaliados.

Utilizado o software ClustalW. As cores iguais indicam a similaridade entre os resíduos alinhados.

Escolheram-se as sequências para a realização dos testes posteriores com base na

frequência de repetição das mesmas dentro de cada grupo e também na relação que cada

peptídeo apresentou com proteínas relacionadas ao câncer quando sua sequência foi

alinhada com sequências de proteínas através do software BLASTp e base de dados

RefSeq. Através de busca na literatura utilizando o banco de dados NCBI pode-se avaliar

a relação entre as proteínas que apresentaram regiões de similaridade com as sequências

peptídicas e diversos tipos de câncer. Considerando que os peptídeos selecionados com

base na frequência de repetição apresentaram de maneira geral, alinhamento com

proteínas que desempenham importantes papéis no desenvolvimento tumoral já relatado

por diversos pesquisadores (Apêndice F – Tab. 03.F), julgamos que a escolha de tais

peptídeos para a síntese e realização de testes posteriores, ainda que primariamente, é

adequada à realização dos objetivos propostos neste trabalho.


75

Sendo assim, as sequências escolhidas com base na frequência de repetição, como

mencionado anteriormente, foram: Grupo DMH (G) – QPHKVFFPNLPR (10x); Grupo

DBT (D) – TNTPPSQRVHLS (9x) e LAAQQYTSALKS (10x); Grupo DBT (G) –

EYQLPSRTVPRD (4x), KDPTQFKPMSLW (5x) e FDTKAGLTSLVA (5x).

5.3.3- Síntese de Peptídeos

Sintetizaram-se os seis peptídeos mencionados no item anterior considerando as

relações encontradas entre os mesmos e proteínas diretamente relacionadas ao câncer,

além da maior frequência de repetição quando comparados aos demais peptídeos

selecionados em cada grupo de tratamento.

A qualidade da síntese foi verificada após a observação do cromatograma obtido

em HPLC e todos os peptídeos apresentaram grau de pureza satisfatório para utilização

nos testes subsequentes. A massa molecular correspondente aos picos encontrados em

HPLC foi verificada por espectrometria de massas para confirmação da identidade do

peptídeo em questão. Como pode ser observado ao somarem-se as áreas dos picos

identificados como possuidores de massa igual àquela prevista pelo programa ExPASy –

Compute PI/Mw tool, obtivemos aproximadamente de 90% de pureza para cada peptídeo

(Fig. 29 e Tab. 06).

Tabela 06: Massas moleculares preditas e observadas para cada peptídeo sintetizado.

Peptídeo pI Massa

Predita

Massa observada

P1

Massa observada

P2

QPHKVFFPNLPR 11,0 1477,81 1477,83 1477,83

EYQLPRRTVPRD 6,17 1458,74 1458,76 -

KDPTQFKPMSLW 8,59 1475,74 1475,76 1475,76

FDTKAGLTSLVA 5,84 1220,66 1220,68 1220,68

TNTPPSQRVHLS 9,44 1334,69 1334,71 1334,70

LAAQQYTSALKS 8,59 1278,68 1278,70 -


76

Figura 29: Perfis cromatográficos em sistema HPLC dos peptídeos obtidos em fase reversa. Gradiente de

ACN de 20 a 60% e TFA 0,1% durante 80 minutos com um fluxo de 1 mL/minuto (coluna C18 250 mm x

10 mm (LiChroCART® 250-10 Purospher, Merk)). Os peptídeos representados por picos indicados por P1

e P2 nas figuras de A a F correspondem às massas preditas para cada peptídeo pelo software ExPASy –

Compute PI/Mw tool.

Tais peptídeos foram utilizados primeiramente na tentativa de isolamento de

proteínas alvo com as quais eles interagem através de sua imobilização em matriz

Sepharose 4B. Após a imobilização, foram construídas colunas cromatográficas para

seleção de proteínas que demonstrassem afinidade por cada peptídeo. Para tal, os extratos

proteicos de intestinos grosso e delgado dos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2

foram submetidos à cromatografia de afinidade. As proteínas isoladas foram

posteriormente submetidas a eletroforese unidimensional sendo posteriormente digeridas

com tripsina e identificadas por espectrometria de massas.


77

Além disso, realizou-se também o acoplamento do fluoróforo 5,6-

carboxifluoresceína a esses peptídeos para realizar uma histoquímica com fluorescência

que permitirá a avaliação da especificidade da ligação com tecidos neoplásicos intestinais.

5.3.4- Isolamento de Proteínas por Afinidade aos Peptídeos Selecionados por

Phage Display

Após realizar a síntese de colunas de afinidade e submeter amostras de extratos

proteicos à cromatografia de afinidade, foi possível identificar a ligação diferencial de

proteínas a quatro dos seis peptídeos imobilizados. A Figura 30 mostra os géis

unidimensionais com os perfis proteicos obtidos após a seleção pelos seis peptídeos

testados.

Figura 30: Perfis eletroforéticos de 1D SDS-PAGE de extratos proteicos referentes a grupos Controle e

Testes após cromatografia de afinidade. A) Bandas 1 a 5 selecionadas pelo peptídeo QPHKVFFPNLPR a

partir de extrato proteico de Intestino Grosso de animais pertencentes aos grupos Controle I (canaleta 1) e

Teste II (canaleta 2); B) Bandas 1 a 3 selecionadas pelo peptídeo KDPTQFKPMSLW a partir de extrato

proteico de Intestino Delgado de animais pertencentes aos grupos Controle III (canaleta 1) e Teste IV

(canaleta 2); C) Bandas 1 e 2 selecionadas pelo peptídeo FDTKAGLTSLVA a partir de extrato proteico de

Intestino Delgado de animais pertencentes aos grupos Controle III (canaleta 1) e Teste IV (canaleta 2); D)

Bandas 1 a 4 selecionadas pelo peptídeo TNTPPSQRVHLS a partir de extrato proteico de Intestino Delgado

de animais pertencentes aos grupos Controle III (canaleta 1) e Teste IV (canaleta 2); As bandas indicadas

pela numeração em vermelho foram excisadas digeridas e identificadas por espectrometria de massas como

descrito nos itens 4.3.2 e 4.3.3.


78

Na Figura 30 – A podemos observar cinco bandas de proteínas isoladas a partir de

cromatografia de afinidade utilizando o peptídeo QPHKVFFPNLPR e extratos proteicos

provenientes de intestino grosso dos animais Controle I e Teste II. A identificação das

proteínas por espectrometria de massas, revelou que as bandas 1 e 4 são compostas

principalmente por tropomiosina e as bandas 2 e 6 pela proteína ribossomal L10A. A

banda 3 visível somente na canaleta 2 e referente ao grupo Teste II é composta pela

proteína SET. Esta proteína pertence à classe das metiltransferases que estão envolvidas

na biossíntese de lipídeos, inativação hormonal, diferenciação tecidual e no controle

epigenético (Lehman et al., 2008; Albert and Helin, 2010; Eom et al., 2011). Uma parcela

significante de nossas proteínas (208 proteínas humanas) compreende as enzimas que

catalisam a transferência do grupo metil do cofator S-adenosil-L-metionina para um

substrato. Destas, aproximadamente 30% estão associadas a doenças sendo mais

frequentemente ligadas a desordens do sistema nervoso central e câncer (Martin and

McMillan, 2002; Schubert et al., 2003; Petrossian and Clarke, 2011).

Com base em seus arranjos estruturais, as metiltransferases podem ser agrupadas

em duas classes: membros que possuem o domínio SET e membros que possuem o

domínio DOT1 (Jones and Gelbart, 1993; Tschiersch et al., 1994; Stassen et al., 1995).

A função regulatória da metilação de proteínas não é restrita ao código de histonas, sendo

vinculada a diversos processos celulares. Esta modificação pode ocorrer também em

proteínas citosólicas e nucleares, sendo que os efeitos destas metilações ainda pouco

caracterizados (Egorova et al., 2010; Zhang et al., 2012).

Uma das modificações mais estudadas é a metilação do fator supressor de tumor

p53. Esta proteína possui papel central no controle do ciclo celular apoptose e reparo de

DNA em resposta a vários tipos de estresse (Brooks and Gu, 2010). A metilação dos

resíduos de lisina presentes no domínio regulatório C-terminal regula positiva e

negativamente sua função. A metilação realizada por SET7/9 em Lys372 promove

aumento de expressão dos genes alvo de p53. Em contraste, a metilação de Lys382 por

SET8 e Lys370 por SYMD2 suprime a atividade transcricional (Chuikov et al., 2004;

Huang et al., 2006; Shi et al., 2007).

A banda 3, referente à Figura 30 – B, apresentou ligação diferencial entre controle

e teste sendo identificada como histona H4 e H2. A unidade básica da cromatina

eucariótica, o nucleossomo, consiste em uma volta de DNA sobre um octâmero de

histonas (dímeros H2A/H2B e tetrâmero H3/H4). Modificações covalentes nestas

proteínas podem alterar o grau de compactação do DNA, inativar a eucromatina ou ativar


79

a heterocromatina. Essas modificações ocorrem na região N-terminal das histonas, são

reversíveis e incluem acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitinação. Diversas

famílias de proteínas podem realizar tais modificações (acetiltransferases, deacetilases,

metiltransferases, entre outras) (Wong et al., 2007).

Geralmente a estrutura ativa da cromatina que corresponde a atividade

transcricional aumentada está associada a aumento na acetilação de histonas. Um padrão

de alterações nas histonas H4 caracterizado pela perda de monoacetilação em Lys16 e de

trimetilação em Lys20 tem sido proposto como marcador universal de transformação

maligna. Além disso, as histonas podem ser substituídas por variantes com pequenas

variações de sequência que levam a alterações no padrão de expressão como por exemplo

a substituição de H2A por H2A.Z (Goel and Boland, 2012; Jia and Guo, 2013).

Ambos os extratos utilizados para cromatografia com o peptídeo

KDPTQFKPMSLW mostraram interação entre o peptídeo e a proteína dermicidina

(canaleta 1 e 2 – B). Tal proteína possui propriedades antimicrobianas e é

constitutivamente expressa em humanos pelas glândulas sudoríparas, leucócitos

periféricos, células neuronais e placenta. Ela pode estar também relacionada a outras

doenças humanas como câncer e aterosclerose (Schittek, 2012; Wang, 2014).

A cromatografia de afinidade com o peptídeo FDTKAGLTSLVA isolou as

proteínas ribossomais 60S P0 e L10A (Fig. 30 – C, 1 e 2). P0 é uma fosfoproteína

ribossomal que forma heterodímeros com as fosfoproteínas acídicas P1 e P2 localizadas

na parte ativa do ribossomo. O complexo formado atua interagindo com mRNAs, tRNAs

e fatores de tradução (EF2) sendo, a presença de P0, mas não de P1 e P2, essencial para

esta função. O aumento na expressão de P0 foi relatado em células tumorais de cólon e

fígado sugerindo que esta proteína exerça outras funções celulares além da tradução de

proteínas (Barnard et al., 1992; Kondoh et al., 1999). Chang e colaboradores

demonstraram que P0 pode interagir com a proteína GCIP (Grap2 and Cyclin D

Interacting Protein) levando ao aumento de proliferação celular por inibição da redução

de fosforilação de pRb (Retinoblastome protein) e aumentando a expressão de ciclina D1

(Chang et al., 2008).

Por último, após espectrometria de massas, foi possível identificar as proteínas

asporina e caseína quinase II (Fig. 30 – D, 1 e 2) isoladas por cromatografia utilizando o

peptídeo TNTPPSQRVHLS como ligante. A asporina é um proteoglicano de matriz

extracelular rica em leucinas. O aumento de expressão dessa proteína e de outros

proteoglicanos como decorina e biglicano foi encontrado em diversos pacientes com


80

câncer gástrico, pancreático, de mama e próstata. Quadros de inflamação também

demonstram elevação na expressão dessa molécula. A asporina parece coordenar invasão

de células cancerosas no tecido normal adjacente por meio da ativação de Rac1 via

interação com CD44 (Nakajima et al., 2007; Turtoi et al., 2011; Ding et al., 2015;

Satoyoshi et al., 2015).

Níveis elevados da proteína caseína quinase 2 (CK2) foram encontrados em

tumores de mama, próstata, rins, coloretal, cabeça e pescoço e pulmão. Sabe-se que essa

proteína está envolvida em diversas vias de sinalização que regulam a proliferação

celular, diferenciação e apoptose. A CK2 parece regular a via Wnt em múltiplos níveis

sendo capaz de fosforilar o co-fator β-catenina, Dvl, APC e também o fator de transcrição

TCF/LEF. Além disso, associações funcionais sugerem que CK2, NF-κB e a via Wnt

podem atuar em conjunto na promoção da tumorogênese na glândula mamária. CK2

promove degradação constitutiva de IκB e ativação de NF-κB, atuando também em

pontos posteriores da via (Dominguez et al., 2009; Montenarh, 2014).

Conclusões

Silva, K.T.S. Conclusões

82

6- CONCLUSÕES

O tratamento crônico a que os animais foram submetidos permitiu as seguintes

conclusões:

- Os perfis de células sanguíneas e de enzimas utilizadas na avaliação da função

hepática e pancreática não foram alterados, corroborando com a análise histológica e

observação de esfregaços sanguíneos;

- A dose de 30 mg/Kg utilizada para as substâncias DMH, DBT e DBTO2 foi

suficiente para induzir alterações de caráter neoplásico nos intestinos dos animais

tratados, porém, não provocou alterações hepáticas ou nos demais tecidos avaliados

histologicamente (estômago, pulmão e pâncreas);

- As lesões identificadas pelas análises histopatológicas dos intestinos grosso e

delgado indicaram a ocorrência de processo neoplásico em fase inicial de

desenvolvimento tanto para os animais tratados com DBT e DBTO2 quanto para os

animais tratados com DMH com características e intensidade similares. Tal fato situa os

agentes DBT e DBTO2 como indutores de câncer de expressão toxicológica;

- A análise comparativa dos perfis eletroforéticos dos extratos proteicos totais dos

grupos Controles e Testes revelou diferenças na expressão de algumas proteínas, levando

a identificação de marcadores proteicos para as alterações celulares consistentes com

alterações neoplásicas, decorrentes da exposição a esses agentes;

- A identificação de proteínas ligantes a peptídeos selecionados por Phage Display

por cromatografia de afinidade, juntamente com a identificação de proteínas

diferencialmente expressas selecionadas por 2D SDS-PAGE, proporcionou um avanço

no entendimento acerca das alterações bioquímicas e possíveis mecanismos envolvidos

no estabelecimento do processo neoplásico promovido pelo DBT e DBTO2. Foi possível

observar alterações em vias de sinalização gerais de maneira comum aos 3 grupos Teste

avaliados.

Perspectivas

Silva, K.T.S. Perspectivas

84

7- PERSPECTIVAS

Considerando a limitação no diagnóstico de lesões tumorais decorrentes de

indução química com os agentes estudados, e a importância ambiental dos mesmos, torna-

se atraente a busca por novos marcadores proteicos e o desenvolvimento de métodos

diagnósticos para a detecção dos mesmos. Sendo assim, pretende-se avançar com os

experimentos utilizando os peptídeos selecionados por Phage Display através da

realização de histoquímica com peptídeos fluorescentes. Pretende-se também empregar

tais peptídeos na avaliação de uma possível atividade antitumoral utilizando cultura de

células tumorais.

Referências Bibliográficas

Silva, K.T.S. Referências Bibliográficas

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8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Apêndice

Silva, K.T.S. Apêndice

99

Apêndice A

Figura 01.A: Contagens global e diferencial de leucócitos provenientes dos grupos Controles (I e III) e

Testes (II, IV e V) ao final do período de tratamento/latência. Os resultados representam média ± SD de

triplicatas biológicas independentes.


100

Apêndice B

Figura 01.B: Dosagens enzimáticas séricas: A) Razão AST/ALT; B) Amilase provenientes dos grupos

Controles (I e III) e Testes (II, IV e V) ao final do período de tratamento/latência. Os resultados representam

média ± SD de triplicatas biológicas independentes.


101

Apêndice C

Tabela 01.C: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos

Controle Óleo e Controle Salina.

Lesões Observadas Controle Óleo

% (n)

Controle Salina

% (n) p

Atipias Celulares na Mucosa 25 (1/4) 20 (1/5) 0,4985

Atipias Celulares na Submucosa 0 (0/4) 0 (0/5) -

Inflamação na Mucosa 0 (0/4) 20 (1/5) < 0,0001

Necrose 0 (0/4) 0 (0/5) -

Atipias Estruturais 25 (1/4) 20 (1/5) 0,4985

Hiperplasia de Nódulos Linfóides 25 (1/4) 0 (0/5) < 0,0001

Tabela 02.C: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle

Óleo e Controle Salina.

Lesões Observadas Controle Óleo

% (n)

Controle Salina

% (n) p

Atipias Celulares na Mucosa 0 (0/4) 0 (0/5) -

Atipias Celulares na Submucosa 0 (0/4) 0 (0/5) -

Inflamação na Mucosa 0 (0/4) 40 (2/5) < 0,0001

Necrose 0 (0/4) 20 (1/5) < 0,0001

Atipias Estruturais 25 (1/4) 0 (0/5) < 0,0001

Hiperplasia de Nódulos Linfóides 25 (1/4) 20 (1/5) 0,4985


102

Apêndice D

Tabela 01.D: Peptídeos sequenciados por proteína identificada através de espectrometria de massas para os grupos Teste IV e V em relação ao grupo Controle III no experimento

empregando 2D SDS-PAGE.

SPOT Identidade pI kDa Cobertura Acesso emPAI (M+H) obs (M+H) exp (M+H) calc delta (ppm) miss score expect Peptídeos

únicos Sequência de Peptídeo

1 HSPA5 5,07 72473 42

gi|25742763 1,32 467.7540 933.4934 933.4953 -0.0019 0 34 0.048 U R.STMKPVQK.V + Oxidation (M)

523.7904 1045.5662 1045.5655 0.0007 1 38 0.02 U K.VLEDSDLKK.S

537.7794 1073.5443 1073.5465 -0.0022 0 55 0.00035 U K.ITITNDQNR.L

596.3201 1190.6257 1190.6295 -0.0038 0 63 4.8e-005 U K.VYEGERPLTK.D

657.3116 1312.6086 1312.6122 -0.0035 0 68 1.1e-005 U K.FEELNMDLFR.S

658.8198 1315.6250 1315.6295 -0.0046 0 45 0.0028 U R.NELESYAYSLK.N

715.8490 1429.6834 1429.6838 -0.0003 0 63 4.1e-005 U R.TWNDPSVQQDIK.F

768.8981 1535.7816 1535.7905 -0.0089 0 90 8.1e-008 U K.TFAPEEISAMVLTK.M

776.8968 1551.7789 1551.7854 -0.0065 0 (85) 2.5e-007 U K.TFAPEEISAMVLTK.M + Oxidation (M)

783.8888 1565.7631 1565.7726 -0.0094 0 61 5.4e-005 U R.ITPSYVAFTPEGER.L

794.9267 1587.8389 1587.8468 -0.0079 1 52 0.00043 U K.KSDIDEIVLVGGSTR.I

830.4483 1658.8820 1658.8879 -0.0058 0 51 0.00049 U R.IINEPTAAAIAYGLDK.R

839.4007 1676.7867 1676.8006 -0.0138 0 68 8.9e-006 U K.NQLTSNPENTVFDAK.R

908.4982 1814.9819 1814.9890 -0.0070 1 (67) 9.7e-006 U R.IINEPTAAAIAYGLDKR.E

908.4982 1814.9819 1814.9890 -0.0070 1 79 6.3e-007 U R.IINEPTAAAIAYGLDKR.E

967.5069 1932.9993 1933.0058 -0.0065 0 (92) 3.1e-008 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G


967.5076 1933.0006 1933.0058 -0.0052 0 138 9.5e-013 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G


967.5093 1933.0040 1933.0058 -0.0018 0 (49) 0.00075 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G

1074.9993 2147.9840 2147.9899 -0.0058 0 77 6.3e-007 U R.IEIESFFEGEDFSETLTR.A

2 HSPA2 5,43 71112 46

gi|347019 1,76 402.7255 803.4365 803.4389 -0.0023 0 43 0.0077 K.ITITNDK.G

600.3397 1198.6648 1198.6670 -0.0021 0 57 0.00016 U K.DAGTIAGLNVLR.I

600.3412 1198.6679 1198.6670 0.0010 0 (47) 0.0018 U K.DAGTIAGLNVLR.I

614.8143 1227.6140 1227.6207 -0.0067 0 36 0.022 K.VEIIANDQGNR.T

618.3137 1234.6128 1234.6169 -0.0040 0 42 0.0056 U R.MVNHFIAEFK.R

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MKFTVVAAALLLLCAVRAEEEDKKEDVGTVVGIDLGTTYSCVGVFKNGRVEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDAAKNQLTSNPENTVFDAKRLIGRTWNDPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISAMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRIINEPTAAAIAYGLDKREGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDNGVFEVVATNGDTHLGGEDFDQRVMEHFIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQKLRREVEKAKRALSSQHQARIEIESFFEGEDFSETLTRAKFEELNMDLFRSTMKPVQKVLEDSDLKKSDIDEIVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRGINPDEAVAYGAAVQAGVLSGDQDTGDLVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVVPTKKSQIFSTASDNQPTVTIKVYEGERPLTKDNHLLGTFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFEIDVNGILRVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEEIERMVNDAEKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQIGDKEKLGGKLSPEDKETMEKAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKLYGSGGPPPTGEEDTSEKDEL&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MSKGPAVGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVAMNPTNTVFDAKRLIGRRFDDAVVQSDMKHWPFMVVNDAGRPKVQVEYKGETKSFYPEEVSSMVLTKMKEIAEAYLGKTVTNAVVTVPAYFNDSQRQAAKDAGTIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKVRAERNVLIFDLGGGTFDVSILTTEDGIFEVKSTAGDTHLGGEDFDNRMVNHFIAEFKRKHKKDISENKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASIEIDSLYEGIDFYTSITRARFEELNADLFRGTLDPVEKALRDAKLDKSQIHDIVLVGGSTRIPKIQKLLQDFFNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAILSGDKSENVQDLLLLDVTPLSLGIETAGGVMTVLIKRNTTIPTKQTQTFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGKFELTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSAVDKSTGKENKITITNDKGRLSKEDIERMVQEAEKYKAEDEKQRDKVSSKNSLESYAFNMKATVEDEKLQGKINDEDKQKILDKCNEIISWLDKNQTAEKEEFEHQQKELEKVCNPIITKLYQSAGGMPGGMPGGFPGGGAPPSGGASSGPTIEEVD&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes


103

627.3104 1252.6062 1252.6088 -0.0026 0 66 2.2e-005 U R.FEELNADLFR.G

627.3104 1252.6062 1252.6088 -0.0026 0 (61) 6.5e-005 U R.FEELNADLFR.G

639.3117 1276.6089 1276.6122 -0.0032 0 63 3.8e-005 U K.CNEIISWLDK.N

744.3528 1486.6910 1486.6940 -0.0030 0 67 1.4e-005 R.TTPSYVAFTDTER.L

808.8928 1615.7711 1615.7804 -0.0092 0 62 4e-005 U K.SFYPEEVSSMVLTK.M

816.8927 1631.7708 1631.7753 -0.0045 0 (50) 0.00059 U K.SFYPEEVSSMVLTK.M + Oxidation (M)

825.3951 1648.7757 1648.7879 -0.0122 0 (90) 6e-008 U K.NQVAMNPTNTVFDAK.R

833.3949 1664.7752 1664.7828 -0.0076 0 95 1.7e-008 U K.NQVAMNPTNTVFDAK.R + Oxidation (M)

846.3639 1690.7133 1690.7183 -0.0050 0 107 5.4e-010 U K.STAGDTHLGGEDFDNR.M

582.6064 1744.7973 1744.8016 -0.0043 1 35 0.018 U K.NQTAEKEEFEHQQK.E

596.6657 1786.9752 1786.9828 -0.0077 1 61 3.1e-005 U R.IINEPTAAAIAYGLDKK.V

991.4881 1980.9615 1980.9905 -0.0290 0 77 9.1e-007 U K.TVTNAVVTVPAYFNDSQR.Q

1130.5768 2259.1390 2259.1383 0.0008 0 159 6.4e-015 U K.SINPDEAVAYGAAVQAAILSGDK.S

755.0398 2262.0975 2262.1104 -0.0128 0 98 6.1e-009 U K.GPAVGIDLGTTYSCVGVFQHGK.V

925.4430 2773.3071 2773.3195 -0.0125 0 65 9e-006 K.QTQTFTTYSDNQPGVLIQVYEGER.A

1387.6656 2773.3166 2773.3195 -0.0029 0 (60) 3.1e-005 K.QTQTFTTYSDNQPGVLIQVYEGER.A

17 ANXA5 4,99 33944 8

gi|2981437 0,1 844.4426 1686.8707 1686.8788 -0.0081 0 147 1.2e-013 U R.EPGEGAITYLVTSVLR.V

K.GLGTDEDSILNLLTAR.S

19 HSP70 5,03 56324 23

gi|149038951 0,3 699.3947 1396.7749 1396.7813 -0.0064 0 42 0.0039 U K.ELEEIVQPIISK.L

918.9622 1835.9098 1835.9265 -0.0167 0 59 6.9e-005 U K.SQIFSTASDNQPTVTIK.V

967.5077 1933.0008 1933.0058 -0.0049 0 51 0.0004 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G

967.5095 1933.0044 1933.0058 -0.0013 0 (32) 0.035 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G

645.3436 1933.0091 1933.0058 0.0033 0 (47) 0.0011 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G

645.3436 1933.0091 1933.0058 0.0033 0 (36) 0.012 U K.DNHLLGTFDLTGIPPAPR.G

658.9720 1973.8941 1973.9007 -0.0065 0 30 0.035 U K.IEWLESHQDADIEDFK.A

20 TPM5 4,72 29158 37

gi|9653293 1,13 416.7258 831.4371 831.4338 0.0034 1 43 0.0071 R.ALKDEEK.M

447.7323 893.4501 893.4606 -0.0106 1 36 0.026 R.KYEEVAR.K

454.2117 906.4088 906.4117 -0.0028 0 35 0.031 K.CLSAAEEK.Y

578.8309 1155.6472 1155.6499 -0.0027 0 55 0.00029 K.LVIIEGDLER.T

578.8309 1155.6472 1155.6499 -0.0027 0 (35) 0.028 K.LVIIEGDLER.T

595.3195 1188.6245 1188.6238 0.0007 1 42 0.0064 K.TIDDLEDKLK.C

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104

642.8779 1283.7413 1283.7449 -0.0036 1 (48) 0.00091 R.KLVIIEGDLER.T

642.8785 1283.7425 1283.7449 -0.0024 1 84 2.2e-007 R.KLVIIEGDLER.T

658.8225 1315.6304 1315.6368 -0.0063 0 46 0.0021 U R.EQAEAEVASLNR.R

22 ARHGDIA 5,12 23450 49

gi|31982030 2,8 475.2759 948.5372 948.5392 -0.0020 1 38 0.018 U K.YKEALLGR.V

490.7470 979.4794 979.4875 -0.0081 0 47 0.0017 U K.YIQHTYR.K

825.9464 1649.8782 1649.9101 -0.0318 0 103 2.7e-009 U R.VAVSADPNVPNVIVTR.L

825.9578 1649.9010 1649.9101 -0.0090 0 (48) 0.00081 U R.VAVSADPNVPNVIVTR.L

892.4037 1782.7928 1782.8022 -0.0094 0 33 0.019 U R.AEEYEFLTPMEEAPK.G

788.7039 2363.0898 2363.1070 -0.0172 1 67 5.2e-006 U R.FTDDDKTDHLSWEWNLTIK.K

859.4381 2575.2924 2575.3091 -0.0167 0 (52) 0.00018 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFK.K

1288.6577 2575.3008 2575.3091 -0.0083 0 120 3.2e-011 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFK.K

902.1300 2703.3681 2703.4041 -0.0360 1 (93) 1.4e-008 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFKK.Q


902.1367 2703.3882 2703.4041 -0.0159 1 108 4.4e-010 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFKK.Q


23 FCGBP 4,92 287312 9

gi|257467629 0,24 458.2647 914.5148 914.5185 -0.0037 0 40 0.013 U R.NVVLQTNK.G

562.3104 1122.6062 1122.6073 -0.0011 0 54 0.00035 U K.VLSPLEYFR.Q

734.4457 1466.8769 1466.8821 -0.0052 0 100 2.4e-009 U R.VVVTVADQVVVLAR.G

734.4466 1466.8786 1466.8821 -0.0034 0 (70) 2.5e-006 U R.VVVTVADQVVVLAR.G

734.4484 1466.8823 1466.8821 0.0003 0 (36) 0.0053 U R.VVVTVADQVVVLAR.G

880.4096 1758.8046 1758.8141 -0.0096 0 61 3.9e-005 U R.AAGCPSGQVCEIQAGVR.Q

917.4774 1832.9403 1832.9495 -0.0092 0 36 0.014 U K.VHIFFQDGMVTVIPSK.G + Oxidation (M)

961.4407 1920.8668 1920.8716 -0.0049 0 99 5.3e-009 U R.YYVLGATFYPGPECER.L

669.0089 2004.0048 2004.0139 -0.0091 0 (65) 2e-005 U K.VLFDGDAHILMSIPSSFR.G

1003.0123 2004.0100 2004.0139 -0.0038 0 100 5.2e-009 U K.VLFDGDAHILMSIPSSFR.G

695.0338 2082.0796 2082.0898 -0.0102 0 46 0.00091 U R.QLQVNGEFVALPFHLDQK.L

885.7755 2654.3046 2654.3197 -0.0150 0 30 0.031 U R.GPDACGIITAPEGPLAPCHSLVPPTK.Y

1075.1135 3222.3187 3222.3298 -0.0111 0 22 0.011 U R.EGCVCDSGFVLSGDTCVPVGQCGCLYNGR.Y

26 ACTB 5,29 42052 48

gi|4501885 1,93 499.7437 997.4729 997.4790 -0.0061 0 43 0.0038 R.DLTDYLMK.I

499.7437 997.4729 997.4790 -0.0061 0 (34) 0.029 R.DLTDYLMK.I

566.7599 1131.5052 1131.5197 -0.0144 0 37 0.014 U R.GYSFTTTAER.E


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105

581.3012 1160.5878 1160.6111 -0.0233 0 42 0.0063 K.EITALAPSTMK.I

599.7554 1197.4961 1197.5150 -0.0188 0 58 6e-005 K.DSYVGDEAQSK.R

677.8100 1353.6054 1353.6161 -0.0107 1 84 2.3e-007 K.DSYVGDEAQSKR.G

977.5199 1953.0253 1953.0571 -0.0318 0 (48) 0.00065 U R.VAPEEHPVLLTEAPLNPK.A

652.0158 1953.0255 1953.0571 -0.0316 0 56 0.00011 U R.VAPEEHPVLLTEAPLNPK.A

1108.0183 2214.0220 2214.0627 -0.0406 0 (135) 1.2e-012 U K.DLYANTVLSGGTTMYPGIADR.M

1108.0183 2214.0220 2214.0627 -0.0406 0 173 1.7e-016 U K.DLYANTVLSGGTTMYPGIADR.M

1116.0242 2230.0338 2230.0576 -0.0238 0 (82) 2.6e-007 U K.DLYANTVLSGGTTMYPGIADR.M + Oxidation (M)

1116.0242 2230.0338 2230.0576 -0.0238 0 (122) 2.6e-011 U K.DLYANTVLSGGTTMYPGIADR.M + Oxidation (M)

1275.5795 2549.1444 2549.1665 -0.0221 0 (87) 4.1e-008 U K.LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK.S


1275.5795 2549.1444 2549.1665 -0.0221 0 131 1.6e-012 U K.LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK.S


1061.8711 3182.5915 3182.6071 -0.0156 0 (52) 0.00012 U R.TTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILR.L

1061.8711 3182.5915 3182.6071 -0.0156 0 81 1.5e-007 U R.TTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILR.L

1077.8177 3230.4313 3230.4545 -0.0232 0 91 9.1e-009 U R.CPEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMK.C

1083.1521 3246.4345 3246.4494 -0.0149 0 (67) 2e-006 U R.CPEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMK.C + Oxidation (M)

31 PNLIP 6,31 52149 53

gi|6981376 2,2 475.2485 948.4824 948.4876 -0.0052 0 57 0.00025 K.ITSDASSIR.N

479.2348 956.4551 956.4603 -0.0053 0 34 0.035 U K.FYLNTGDK.S

528.3134 1054.6123 1054.6175 -0.0052 0 33 0.036 U R.IIIHGFIDK.G

552.2552 1102.4959 1102.4978 -0.0019 0 47 0.0019 U R.DFAACNHLR.S

574.2940 1146.5735 1146.5782 -0.0047 0 48 0.0017 U K.GSLHPGDTHVK.E

612.3329 1222.6513 1222.6558 -0.0045 0 72 5.1e-006 U R.YQVTVTLSGQK.V

626.8112 1251.6078 1251.6208 -0.0130 0 58 0.00013 U R.ATYTQATQNVR.V

677.3606 1352.7066 1352.7201 -0.0135 0 67 1.7e-005 K.ALPWSPAQINTR.F

686.8125 1371.6105 1371.6242 -0.0136 0 68 9.2e-006 U R.VFNFCSQDTVR.E

686.8167 1371.6189 1371.6242 -0.0053 0 (63) 3.3e-005 U R.VFNFCSQDTVR.E

712.4380 1422.8613 1422.8810 -0.0196 0 101 1.4e-009 U R.VVGAEVALLVNVLK.S

712.4473 1422.8801 1422.8810 -0.0009 0 (66) 3.3e-006 U R.VVGAEVALLVNVLK.S

712.4486 1422.8826 1422.8810 0.0016 0 (24) 0.049 U R.VVGAEVALLVNVLK.S

712.4486 1422.8826 1422.8810 0.0016 0 (38) 0.002 U R.VVGAEVALLVNVLK.S

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106

749.8188 1497.6231 1497.6293 -0.0062 0 (55) 8.8e-005 U K.EFDSDMDVGDLQK.V

754.8357 1507.6568 1507.6799 -0.0232 0 101 3.5e-009 U K.VESVNCICVDWK.G

757.8127 1513.6109 1513.6243 -0.0133 0 64 8.8e-006 U K.EFDSDMDVGDLQK.V + Oxidation (M)

859.9476 1717.8806 1717.9192 -0.0386 0 78 1.1e-006 U K.FIWYNNVINPTLPK.V

859.9632 1717.9118 1717.9192 -0.0073 0 (36) 0.014 U K.FIWYNNVINPTLPK.V

895.4075 1788.8005 1788.8318 -0.0313 0 47 0.00089 R.FLLYTNENQDNYQK.I

964.9988 1927.9830 1928.0003 -0.0173 0 147 1e-013 U K.NILSQIVDIDGIWEGTR.D

965.0037 1927.9929 1928.0003 -0.0074 0 (129) 7.2e-012 U K.NILSQIVDIDGIWEGTR.D

1047.0117 2092.0088 2092.0113 -0.0024 0 (97) 9.4e-009 U R.ITGLDAAEPYFQGTPEEVR.L

1047.0117 2092.0088 2092.0113 -0.0024 0 127 9.8e-012 U R.ITGLDAAEPYFQGTPEEVR.L

712.3407 2134.0002 2134.0154 -0.0152 0 51 0.00032 K.LGCFSDDAPWSGTIDRPLK.A

1004.7790 3011.3152 3011.3284 -0.0132 0 30 0.0093 U K.YYTDSIVNPTGFSGFSCSSYNVFSANK.C

32 PGK1 8,02 44909 62

gi|40254752 2,84 610.3305 1218.6464 1218.6496 -0.0031 0 (40) 0.0098 U K.YSLEPVAAELK.S

610.3305 1218.6464 1218.6496 -0.0031 0 47 0.002 U K.YSLEPVAAELK.S

659.8656 1317.7167 1317.7180 -0.0013 0 (40) 0.0092 U K.ITLPVDFVTADK.F

659.8656 1317.7167 1317.7180 -0.0013 0 73 4.2e-006 U K.ITLPVDFVTADK.F

864.4448 1726.8750 1726.8786 -0.0036 0 81 4.9e-007 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V

870.9500 1739.8854 1739.9054 -0.0200 0 (40) 0.0057 U K.VSHVSTGGGASLELLEGK.V

580.9736 1739.8989 1739.9054 -0.0065 0 56 0.00016 U K.VSHVSTGGGASLELLEGK.V

872.4447 1742.8748 1742.8736 0.0013 0 (68) 1.1e-005 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V + Oxidation (M)

877.8921 1753.7696 1753.7798 -0.0101 0 122 3.2e-011 U R.GCITIIGGGDTATCCAK.W

880.4396 1758.8646 1758.8685 -0.0039 0 (71) 4.6e-006 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V + 2 Oxidation (M)

590.3331 1767.9774 1767.9883 -0.0109 0 (65) 1.2e-005 U K.ALESPERPFLAILGGAK.V

884.9961 1767.9777 1767.9883 -0.0106 0 91 3.2e-008 U K.ALESPERPFLAILGGAK.V

991.9688 1981.9230 1981.9302 -0.0072 0 (51) 0.00034 U K.VLNNMEIGTSLYDEEGAK.I

991.9688 1981.9230 1981.9302 -0.0072 0 (55) 0.00014 U K.VLNNMEIGTSLYDEEGAK.I

999.9667 1997.9189 1997.9252 -0.0063 0 94 1.9e-008 U K.VLNNMEIGTSLYDEEGAK.I + Oxidation (M)

675.0131 2022.0175 2022.0310 -0.0135 1 79 6.8e-007 U K.ITLPVDFVTADKFDENAK.T

1053.0319 2104.0492 2104.0531 -0.0038 0 (93) 2.4e-008 U K.QIVWNGPVGVFEWEAFAR.G


1053.0333 2104.0520 2104.0531 -0.0010 0 132 3.5e-012 U K.QIVWNGPVGVFEWEAFAR.G



107


870.4118 2608.2137 2608.2262 -0.0125 1 (31) 0.023 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSKK.Y

870.4118 2608.2137 2608.2262 -0.0125 1 41 0.0021 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSKK.Y

924.7741 2771.3004 2771.3218 -0.0214 0 (45) 0.00091 U K.DCVGSEVENACANPAAGTVILLENLR.F

924.7744 2771.3013 2771.3218 -0.0205 0 (58) 5e-005 U K.DCVGSEVENACANPAAGTVILLENLR.F


924.7774 2771.3103 2771.3218 -0.0115 0 (88) 4.7e-008 U K.DCVGSEVENACANPAAGTVILLENLR.F



924.7777 2771.3112 2771.3218 -0.0106 0 143 1.4e-013 U K.DCVGSEVENACANPAAGTVILLENLR.F

37 LDHA 8,45 36712 61

gi|8393706 1,37 392.6846 783.3546 783.3585 -0.0039 0 32 0.041 U R.YLMGER.L + Oxidation (M)

528.3200 1054.6255 1054.6386 -0.0131 0 42 0.0048 U K.DQLIVNLLK.E

528.3246 1054.6346 1054.6386 -0.0040 0 (37) 0.011 U K.DQLIVNLLK.E

559.7924 1117.5703 1117.5768 -0.0064 0 47 0.0022 U K.SADTLWGIQK.E

399.8953 1196.6642 1196.6700 -0.0058 1 39 0.0083 U R.RVHPISTMIK.G + Oxidation (M)

624.7982 1247.5818 1247.5928 -0.0111 0 40 0.0086 U R.VIGSGCNLDSAR.F

625.8283 1249.6421 1249.6554 -0.0133 0 73 4.9e-006 U K.QVVDSAYEVIK.L

625.8283 1249.6421 1249.6554 -0.0133 0 (68) 1.5e-005 U K.QVVDSAYEVIK.L

829.4225 1656.8304 1656.8458 -0.0154 0 119 8.6e-011 U K.DLADELALVDVIEDK.L

829.4279 1656.8411 1656.8458 -0.0046 0 (113) 3.7e-010 U K.DLADELALVDVIEDK.L



829.4290 1656.8435 1656.8458 -0.0023 0 (47) 0.0015 U K.DLADELALVDVIEDK.L

972.5612 1943.1078 1943.1132 -0.0053 0 (48) 0.0003 U K.LLIVSNPVDILTYVAWK.I

972.5636 1943.1126 1943.1132 -0.0006 0 126 4.6e-012 U K.LLIVSNPVDILTYVAWK.I

1064.5335 2127.0524 2127.0558 -0.0033 0 114 1.7e-010 U K.GYTSWAIGLSVADLAESIMK.N + Oxidation (M)

1064.5335 2127.0524 2127.0558 -0.0033 0 (107) 8.4e-010 U K.GYTSWAIGLSVADLAESIMK.N + Oxidation (M)

1064.5351 2127.0556 2127.0558 -0.0001 0 (61) 3.6e-005 U K.GYTSWAIGLSVADLAESIMK.N + Oxidation (M)

41 RFESD 8,9 27956 26

gi|206681 0,4 1065.5102 2129.0058 2129.0133 -0.0074 0 115 1.3e-010 U K.NAVSQFVSSMSASADVLAMSK.I

1065.5102 2129.0058 2129.0133 -0.0074 0 (89) 5.1e-008 U K.NAVSQFVSSMSASADVLAMSK.I

1073.5094 2145.0042 2145.0082 -0.0039 0 (30) 0.047 U K.NAVSQFVSSMSASADVLAMSK.I + Oxidation (M)

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108

43 PRDX1 8,27 22323 72

gi|16923958 4,36 444.7227 887.4308 887.4389 -0.0081 1 48 0.0023 K.SKEYFSK.Q

447.7189 893.4233 893.4243 -0.0010 0 45 0.0036 U K.ADEGISFR.G

447.7189 893.4233 893.4243 -0.0010 0 (44) 0.004 U K.ADEGISFR.G

460.7579 919.5013 919.5015 -0.0002 0 41 0.0089 R.GLFIIDDK.G

477.2553 952.4961 952.5130 -0.0169 0 53 0.00047 U K.IGHPAPSFK.A

554.2988 1106.5830 1106.5972 -0.0142 0 54 0.00041 U R.TIAQDYGVLK.A

590.7868 1179.5591 1179.5594 -0.0003 0 61 6.4e-005 U K.ATAVMPDGQFK.D + Oxidation (M)

598.8084 1195.6022 1195.6237 -0.0215 0 57 0.00016 R.LVQAFQFTDK.H

598.8151 1195.6156 1195.6237 -0.0081 0 (52) 0.00046 R.LVQAFQFTDK.H

613.3323 1224.6501 1224.6826 -0.0325 0 68 1.2e-005 U R.QITINDLPVGR.S

613.3447 1224.6748 1224.6826 -0.0078 0 (41) 0.0057 U R.QITINDLPVGR.S

613.3447 1224.6748 1224.6826 -0.0078 0 (43) 0.0041 U R.QITINDLPVGR.S

811.9293 1621.8440 1621.8498 -0.0057 0 (68) 9.3e-006 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R

819.9220 1637.8295 1637.8447 -0.0152 0 97 1.2e-008 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

819.9220 1637.8295 1637.8447 -0.0152 0 (83) 3.1e-007 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

598.9879 1793.9420 1793.9458 -0.0038 1 38 0.0073 U K.QGGLGPMNIPLVSDPKR.T + Oxidation (M)

798.0528 2391.1367 2391.1641 -0.0275 0 66 8.8e-006 K.HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVNK.S

44 CFL1 8,22 18749 62

gi|8393101 2,75 655.3428 1308.6711 1308.6748 -0.0037 1 67 1.5e-005 U K.AVLFCLSEDKK.N

669.3140 1336.6134 1336.6187 -0.0053 0 60 6.6e-005 R.YALYDATYETK.E

670.8919 1339.7692 1339.7711 -0.0019 0 (37) 0.012 U K.LGGSAVISLEGKPL.-

670.8923 1339.7701 1339.7711 -0.0010 0 107 9.6e-010 U K.LGGSAVISLEGKPL.-

597.6070 1789.7992 1789.8053 -0.0061 1 92 2.3e-008 U K.HELQANCYEEVKDR.C

597.6075 1789.8007 1789.8053 -0.0046 1 (41) 0.0032 U K.HELQANCYEEVKDR.C

995.5358 1989.0571 1989.0611 -0.0040 1 67 8.9e-006 K.KEDLVFIFWAPESAPLK.S

1098.5519 2195.0892 2195.0998 -0.0106 0 94 1.7e-008 U K.EILVGDVGQTVDDPYTTFVK.M

1031.5325 3091.5757 3091.5965 -0.0209 1 118 3.3e-011 U K.NIILEEGKEILVGDVGQTVDDPYTTFVK.M

48 CKB 5,39 42983 66

gi|401461784 3,4 439.7570 877.4994 877.5021 -0.0027 1 46 0.0027 U K.FSEVLKR.L

516.2761 1030.5376 1030.5481 -0.0105 0 (57) 0.00026 U K.LLIEMEQR.L

524.2771 1046.5396 1046.5430 -0.0034 0 64 4.3e-005 U K.LLIEMEQR.L + Oxidation (M)

387.1840 1158.5303 1158.5418 -0.0115 0 (41) 0.0075 U M.PFSNSHNTQK.L

580.2755 1158.5364 1158.5418 -0.0054 0 53 0.00047 U M.PFSNSHNTQK.L


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109

615.7762 1229.5378 1229.5434 -0.0056 0 35 0.019 U R.GFCLPPHCSR.G

616.8066 1231.5986 1231.6085 -0.0099 0 65 3e-005 U K.DLFDPIIEDR.H

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652.3626 1302.7106 1302.7183 -0.0077 0 (70) 9.2e-006 U K.VLTPELYAELR.A

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779.3946 1556.7747 1556.7909 -0.0161 0 118 1.1e-010 U R.FCTGLTQIETLFK.S

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801.9137 1601.8128 1601.8260 -0.0132 0 (36) 0.019 U K.LAVEALSSLDGDLSGR.Y

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801.9170 1601.8194 1601.8260 -0.0066 0 (59) 9.5e-005 U K.LAVEALSSLDGDLSGR.Y

801.9170 1601.8194 1601.8260 -0.0066 0 (90) 8e-008 U K.LAVEALSSLDGDLSGR.Y



836.4164 1670.8183 1670.8416 -0.0233 0 110 6.1e-010 U K.TFLVWINEEDHLR.V

557.9489 1670.8249 1670.8416 -0.0167 0 (49) 0.00092 U K.TFLVWINEEDHLR.V

557.9489 1670.8249 1670.8416 -0.0167 0 (50) 0.00063 U K.TFLVWINEEDHLR.V

841.9173 1681.8201 1681.8345 -0.0144 0 (53) 0.00032 U R.LEQGQPIDDLMPAQK.-

841.9214 1681.8282 1681.8345 -0.0063 0 (63) 2.8e-005 U R.LEQGQPIDDLMPAQK.-

841.9214 1681.8282 1681.8345 -0.0063 0 (63) 2.8e-005 U R.LEQGQPIDDLMPAQK.-

841.9214 1681.8282 1681.8345 -0.0063 0 67 1.1e-005 U R.LEQGQPIDDLMPAQK.-

616.9929 1847.9570 1847.9703 -0.0133 0 (100) 5e-009 U R.LGFSEVELVQMVVDGVK.L

924.9874 1847.9602 1847.9703 -0.0101 0 (44) 0.0018 U R.LGFSEVELVQMVVDGVK.L

924.9874 1847.9602 1847.9703 -0.0101 0 (57) 9.9e-005 U R.LGFSEVELVQMVVDGVK.L



932.9812 1863.9479 1863.9652 -0.0174 0 113 3.2e-010 U R.LGFSEVELVQMVVDGVK.L + Oxidation (M)

982.9314 1963.8483 1963.9236 -0.0753 0 117 4.5e-011 U R.GTGGVDTAAVGGVFDVSNADR.L

982.9648 1963.9151 1963.9236 -0.0085 0 (75) 1.3e-006 U R.GTGGVDTAAVGGVFDVSNADR.L

729.3194 2184.9365 2184.9534 -0.0169 0 68 2.7e-006 U R.FPAEDEFPDLSSHNNHMAK.V

1259.5820 2517.1494 2517.1619 -0.0125 0 150 2.6e-014 U K.TDLNPDNLQGGDDLDPNYVLSSR.V

985.1302 2952.3687 2952.4051 -0.0363 0 118 3e-011 U K.NYEFMWNPHLGYILTCPSNLGTGLR.A


110

54 AKR1B1 6,26 36230 26

gi|6978491 0,85 552.2965 1102.5784 1102.5845 -0.0061 0 63 5.9e-005 U K.MPTLGLGTWK.S

553.3133 1104.6121 1104.6291 -0.0170 1 43 0.0052 U K.RQDLFIVSK.L

752.8407 1503.6668 1503.6776 -0.0108 0 83 2.3e-007 U R.HIDCAQVYQNEK.E

779.4057 1556.7968 1556.8311 -0.0342 0 106 1.7e-009 U K.AIGVSNFNPLQIER.I

1132.5239 2263.0332 2263.0467 -0.0134 0 78 6.1e-007 U K.VFDFELSNEDMATLLSYNR.N

57 GNB2L1 7,6 35511 77

gi|5174447 3,98 430.7266 859.4386 859.4440 -0.0053 0 39 0.018 U K.IWDLEGK.I

517.7879 1033.5612 1033.5630 -0.0019 1 50 0.0011 U R.DKTIIMWK.L

530.2976 1058.5806 1058.5873 -0.0067 0 55 0.00039 U R.VWQVTIGTR.-

596.7792 1191.5439 1191.5520 -0.0081 0 73 4.7e-006 U R.DETNYGIPQR.A

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632.8217 1263.6289 1263.6459 -0.0170 0 70 9.1e-006 U R.LWDLTTGTTTR.R

655.3186 1308.6226 1308.6310 -0.0084 0 85 2.3e-007 U K.DVLSVAFSSDNR.Q

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655.3216 1308.6286 1308.6310 -0.0024 0 (38) 0.013 U K.DVLSVAFSSDNR.Q

683.8439 1365.6732 1365.6751 -0.0018 0 (41) 0.0067 U R.YWLCAATGPSIK.I

683.8452 1365.6758 1365.6751 0.0007 0 (60) 7.7e-005 U R.YWLCAATGPSIK.I

683.8452 1365.6758 1365.6751 0.0007 0 60 7.3e-005 U R.YWLCAATGPSIK.I

738.8386 1475.6626 1475.6715 -0.0089 0 (44) 0.0022 U K.DGQAMLWDLNEGK.H

738.8406 1475.6666 1475.6715 -0.0048 0 (68) 1.1e-005 U K.DGQAMLWDLNEGK.H

746.8386 1491.6626 1491.6664 -0.0038 0 74 2.2e-006 U K.DGQAMLWDLNEGK.H + Oxidation (M)

894.9966 1787.9787 1787.9880 -0.0094 1 30 0.039 U K.IIVDELKQEVISTSSK.A

954.4448 1906.8751 1906.8884 -0.0132 0 58 7.1e-005 U R.FSPNSSNPIIVSCGWDK.L

661.2935 1980.8586 1980.8636 -0.0050 0 75 9.4e-007 U K.YTVQDESHSEWVSCVR.F

759.3666 2275.0779 2275.1055 -0.0277 0 (100) 4e-009 U K.HLYTLDGGDIINALCFSPNR.Y

759.3666 2275.0779 2275.1055 -0.0277 0 (120) 4.4e-011 U K.HLYTLDGGDIINALCFSPNR.Y



1138.5560 2275.0974 2275.1055 -0.0081 0 145 1.5e-013 U K.HLYTLDGGDIINALCFSPNR.Y

876.4348 2626.2825 2626.2962 -0.0137 0 75 1.1e-006 U K.GHNGWVTQIATTPQFPDMILSASR.D

881.7681 2642.2824 2642.2911 -0.0087 0 (36) 0.0079 U K.GHNGWVTQIATTPQFPDMILSASR.D + Oxidation (M)

1023.4743 3067.4011 3067.4346 -0.0335 0 (89) 2.1e-008 U K.AEPPQCTSLAWSADGQTLFAGYTDNLVR.V

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111

1023.4743 3067.4011 3067.4346 -0.0335 0 112 1e-010 U K.AEPPQCTSLAWSADGQTLFAGYTDNLVR.V



59 PGAM1 6,67 28928 72

gi|114326546 1,97 384.7026 767.3907 767.3926 -0.0019 0 34 0.032 U K.HGEAQVK.I

488.2505 974.4864 974.4855 0.0009 0 44 0.0054 U K.AMEAVAAQGK.V

552.2957 1102.5769 1102.5804 -0.0035 1 58 0.00017 U R.KAMEAVAAQGK.V

575.8363 1149.6581 1149.6618 -0.0037 0 71 6.2e-006 U R.VLIAAHGNSLR.G

656.8041 1311.5937 1311.5956 -0.0019 0 49 0.00088 U R.HGESAWNLENR.F

842.4474 1682.8802 1682.9032 -0.0230 0 (64) 2.6e-005 U R.ALPFWNEEIVPQIK.E

842.4474 1682.8802 1682.9032 -0.0230 0 67 1.1e-005 U R.ALPFWNEEIVPQIK.E

842.4510 1682.8875 1682.9032 -0.0157 0 (60) 6.1e-005 U R.ALPFWNEEIVPQIK.E

890.3975 1778.7805 1778.7822 -0.0017 0 55 0.00012 U R.DAGYEFDICFTSVQK.R

890.3975 1778.7805 1778.7822 -0.0017 0 (43) 0.0022 U R.DAGYEFDICFTSVQK.R

660.6277 1978.8614 1978.8697 -0.0083 0 (64) 9.8e-006 U R.FSGWYDADLSPAGHEEAK.R

660.6277 1978.8614 1978.8697 -0.0083 0 81 2.3e-007 U R.FSGWYDADLSPAGHEEAK.R

705.7095 2114.1067 2114.1194 -0.0127 0 62 2.6e-005 U K.NLKPIKPMQFLGDEETVR.K

809.0508 2424.1306 2424.1478 -0.0172 1 68 4.8e-006 U R.YADLTEDQLPSCESLKDTIAR.A

62 TF 6,94 78538 33

gi|1854476 1 458.2360 914.4574 914.4610 -0.0036 0 48 0.0018 U K.VAQEHFGK.G

466.2049 930.3953 930.3978 -0.0025 0 43 0.0039 U K.SCHTGVDR.T

475.2819 948.5492 948.5505 -0.0012 0 46 0.0026 U R.IPSHAVVAR.N

507.7342 1013.4539 1013.4488 0.0051 0 35 0.024 U K.TSYQDCIK.A

559.7844 1117.5542 1117.5590 -0.0048 0 56 0.0003 U R.LLEACTFHK.S

604.8178 1207.6210 1207.6237 -0.0028 0 62 5.8e-005 U K.DFQLFGSPLGK.D

645.2750 1288.5354 1288.5329 0.0025 0 59 4.3e-005 U K.DCTGNFCLFR.S

674.8422 1347.6698 1347.6419 0.0279 0 75 2.7e-006 U K.ASDSSINWNNLK.G

696.8813 1391.7479 1391.7561 -0.0082 0 53 0.00039 U R.LYLGHSYVTAIR.N

712.3823 1422.7501 1422.7507 -0.0006 1 87 1.4e-007 U K.SKDFQLFGSPLGK.D

781.9050 1561.7955 1561.8075 -0.0120 0 78 1.4e-006 U R.TAGWNIPMGLLFSR.I

781.9077 1561.8008 1561.8075 -0.0067 0 (70) 8.1e-006 U R.TAGWNIPMGLLFSR.I

781.9077 1561.8008 1561.8075 -0.0067 0 (42) 0.005 U R.TAGWNIPMGLLFSR.I

789.9030 1577.7914 1577.8024 -0.0110 0 (60) 7.2e-005 U R.TAGWNIPMGLLFSR.I + Oxidation (M)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MAAYKLVLIRHGESAWNLENRFSGWYDADLSPAGHEEAKRGGQALRDAGYEFDICFTSVQKRAIRTLWTVLDAIDQMWLPVVRTWRLNERHYGGLTGLNKAETAAKHGEAQVKIWRRSYDVPPPPMEPDHPFYSNISKDRRYADLTEDQLPSCESLKDTIARALPFWNEEIVPQIKEGKRVLIAAHGNSLRGIVKHLEGLSEEAIMELNLPTGIPIVYELDKNLKPIKPMQFLGDEETVRKAMEAVAAQGKVKK&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes



112

795.3444 1588.6742 1588.6763 -0.0021 1 29 0.042 U K.GDKDCTGNFCLFR.S

826.8530 1651.6915 1651.6977 -0.0062 0 35 0.0088 U K.FDEFFSQGCAPGYK.K

918.4158 1834.8171 1834.8196 -0.0025 0 (81) 3.6e-007 U R.EGYNGYTGAFQCLVEK.G

918.4158 1834.8171 1834.8196 -0.0025 0 85 1.2e-007 U R.EGYNGYTGAFQCLVEK.G

862.7540 2585.2401 2585.2649 -0.0249 0 (69) 3.8e-006 U K.LPEGTTYEEYLGAEYLQAVGNIR.K

1293.6300 2585.2454 2585.2649 -0.0195 0 131 2.6e-012 U K.LPEGTTYEEYLGAEYLQAVGNIR.K

1649.4015 4945.1827 4945.1931 -0.0104 0 32 0.0018 U K.AVASFFSGSCVPCADPVAFPQLCQLCPGCGCSPTQPFFGYVGAFK.C

63 TF 6,94 78538 24

gi|1854476 0,57 656.8624 1311.7102 1311.7187 -0.0085 0 76 1.7e-006 U K.HTTIFEVLPQK.A

674.8430 1347.6714 1347.6419 0.0296 0 101 7.8e-009 U K.ASDSSINWNNLK.G

696.8804 1391.7463 1391.7561 -0.0098 0 37 0.016 U R.LYLGHSYVTAIR.N

712.3783 1422.7420 1422.7507 -0.0087 1 50 0.00065 U K.SKDFQLFGSPLGK.D

781.9057 1561.7967 1561.8075 -0.0108 0 91 6.4e-008 U R.TAGWNIPMGLLFSR.I

789.9053 1577.7960 1577.8024 -0.0064 0 (78) 1.2e-006 U R.TAGWNIPMGLLFSR.I + Oxidation (M)

826.8558 1651.6970 1651.6977 -0.0007 0 55 9.4e-005 U K.FDEFFSQGCAPGYK.K

826.8558 1651.6970 1651.6977 -0.0007 0 (53) 0.00013 U K.FDEFFSQGCAPGYK.K

918.4128 1834.8110 1834.8196 -0.0086 0 78 6.1e-007 U R.EGYNGYTGAFQCLVEK.G

64 TKT 7,54 71912 39

gi|149034221 1,04 378.1925 754.3705 754.3722 -0.0016 0 49 0.001 K.LGHASDR.I

489.7848 977.5550 977.5658 -0.0108 0 33 0.044 K.HQPTAIIAK.T

494.7818 987.5490 987.5535 -0.0045 1 44 0.0054 K.KLILDCAR.A

693.4014 1384.7882 1384.7966 -0.0084 0 59 7.1e-005 R.VLDPFTIKPLDK.K

701.8821 1401.7496 1401.7616 -0.0120 0 (44) 0.0028 K.LDNLVAIFDINR.L

701.8833 1401.7521 1401.7616 -0.0095 0 89 9.5e-008 K.LDNLVAIFDINR.L

701.8833 1401.7521 1401.7616 -0.0095 0 (86) 2e-007 K.LDNLVAIFDINR.L

775.9119 1549.8093 1549.8174 -0.0081 1 56 0.00018 K.MFGIDKDAIVQAVK.G + Oxidation (M)

826.3910 1650.7674 1650.7865 -0.0191 0 85 2e-007 R.TVPFCSTFAAFFTR.A

965.9537 1929.8928 1929.9030 -0.0102 0 80 4.3e-007 R.SVPMSTVFYPSDGVATEK.A + Oxidation (M)

1005.0006 2007.9866 2007.9935 -0.0069 0 (38) 0.0075 K.NMAEQIIQEIYSQVQSK.K

1010.5234 2019.0322 2019.0636 -0.0314 0 93 2.3e-008 K.ILATPPQEDAPSVDIANIR.M

1012.9932 2023.9718 2023.9884 -0.0166 0 61 3.9e-005 K.NMAEQIIQEIYSQVQSK.K + Oxidation (M)

675.6666 2023.9781 2023.9884 -0.0103 0 (45) 0.0016 K.NMAEQIIQEIYSQVQSK.K + Oxidation (M)

827.7318 2480.1736 2480.1931 -0.0196 0 35 0.01 R.TSRPENAIIYSNNEDFQVGQAK.V


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MDPVRQIQCDREGKRFPFLSAPPASTSSPDRAMEGYHKPDQQKLQALKDTANRLRISSIQATTAAGSGHPTSCCSAAEIMAVLFFHTMRYKALDPRNPHNDRFVLSKGHAAPILYAVWAEAGFLPEAELLNLRKISSDLDGHPVPKQAFTDVATGSLGQGLGAACGMAYTGKYFDKASYRVYCMLGDGEVSEGSVWEAMAFAGIYKLDNLVAIFDINRLGQSDPAPLQHQVDVYQKRCEAFGWHAIIVDGHSVEELCKAFGQAKHQPTAIIAKTFKGRGITGIEDKEAWHGKPLPKNMAEQIIQEIYSQVQSKKKILATPPQEDAPSVDIANIRMPTPPNYKVGDKIATRKAYGLALAKLGHASDRIIALDGDTKNSTFSELFKKEHPDRFIECYIAEQNMVSIAVGCATRDRTVPFCSTFAAFFTRAFDQIRMAAISESNINLCGSHCGVSIGEDGPSQMALEDLAMFRSVPMSTVFYPSDGVATEKAVELAANTKGICFIRTSRPENAIIYSNNEDFQVGQAKVVLKSKDDQVTVIGAGVTLHEALAAAEMLKKEKIGVRVLDPFTIKPLDKKLILDCARATKGRILTVEDHYYEGGIGEAVSAAVVGEPGVTVTRLAVSQVPRSGKPAELLKMFGIDKDAIVQAVKGLVTKG&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes


113

895.1294 2682.3664 2682.3898 -0.0234 1 38 0.0045 K.SKDDQVTVIGAGVTLHEALAAAEMLK.K + Oxidation (M)

1063.5333 3187.5781 3187.6037 -0.0257 0 63 1.1e-005 U R.ILTVEDHYYEGGIGEAVSAAVVGEPGVTVTR.L

79 CANX 4,49 67612 20

gi|25282419 0,77 616.3121 1230.6096 1230.6092 0.0004 1 80 9.5e-007 U K.SKSDTSTPPSPK.V

635.3107 1268.6068 1268.6111 -0.0043 0 42 0.0045 U K.TPYTIMFGPDK.C

723.8454 1445.6763 1445.6787 -0.0024 0 46 0.0019 U K.TSELNLDQFHDK.T

868.4186 1734.8226 1734.8253 -0.0027 0 50 0.0007 U K.IPNPDFFEDLEPFR.M

885.8948 1769.7750 1769.8261 -0.0511 0 103 2.1e-009 U K.APVPTGEVYFADSFDR.G

885.9169 1769.8193 1769.8261 -0.0068 0 (100) 6.5e-009 U K.APVPTGEVYFADSFDR.G

621.9790 1862.9152 1862.9203 -0.0051 1 (81) 5.1e-007 U R.KIPNPDFFEDLEPFR.M


932.4656 1862.9167 1862.9203 -0.0036 1 83 2.7e-007 U R.KIPNPDFFEDLEPFR.M


621.9795 1862.9167 1862.9203 -0.0036 1 (51) 0.00045 U R.KIPNPDFFEDLEPFR.M

82 CORO1A 6,05 51717 37

gi|18426834

1,15 513.8113 1025.6081 1025.6121 -0.0040 0 61 4.6e-005 U R.DAGPLLISLK.D

605.3255 1208.6364 1208.6401 -0.0037 0 42 0.0055 U R.EPVVTLEGHTK.R

817.8900 1633.7655 1633.7795 -0.0140 0 123 3.3e-011 U R.ATPEPSSTLSSDTVSR.L

898.9005 1795.7864 1795.8200 -0.0336 0 74 1.4e-006 U R.VSQTTWDSGFCAVNPK.F

1076.0667 2150.1188 2150.1268 -0.0080 0 (48) 0.00068 U K.FMALICEASGGGAFLVLPLGK.T

1076.0691 2150.1236 2150.1268 -0.0032 0 (86) 1e-007 U K.FMALICEASGGGAFLVLPLGK.T

1076.0691 2150.1236 2150.1268 -0.0032 0 134 1.6e-012 U K.FMALICEASGGGAFLVLPLGK.T

1084.0675 2166.1204 2166.1217 -0.0013 0 (59) 5e-005 U K.FMALICEASGGGAFLVLPLGK.T + Oxidation (M)

1084.0675 2166.1204 2166.1217 -0.0013 0 (37) 0.008 U K.FMALICEASGGGAFLVLPLGK.T + Oxidation (M)

799.7164 2396.1274 2396.1398 -0.0124 0 75 1.1e-006 U R.YFEITSEAPFLHYLSMFSSK.E

799.7164 2396.1274 2396.1398 -0.0124 0 (74) 1.4e-006 U R.YFEITSEAPFLHYLSMFSSK.E

805.0477 2412.1214 2412.1348 -0.0133 0 (49) 0.00036 U R.YFEITSEAPFLHYLSMFSSK.E + Oxidation (M)

1068.5213 3202.5421 3202.5459 -0.0038 1 (32) 0.011 U R.KSDLFQEDLYPPTAGPDPALTAEEWLSGR.D

1068.5213 3202.5421 3202.5459 -0.0038 1 54 7.7e-005 U R.KSDLFQEDLYPPTAGPDPALTAEEWLSGR.D

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114

Tabela 02.D: Peptídeos sequenciados por proteína identificada através de espectrometria de massas para o grupo Teste III em relação ao grupo Controle I no experimento

empregando 2D SDS-PAGE.

SPOT Identidade pI kDa Cobertura Acesso emPAI (M+H) obs (M+H) exp (M+H) calc delta (ppm) miss score expect Unique Sequência de Peptídeo

1 TPM1 4,69 32691 58

gi|149028892 5,27 423.7346 845.4547 845.4606 -0.0059 1 32 0.095 K.LKEAETR.A

423.7346 845.4547 845.4606 -0.0059 1 (31) 0.13 K.LKEAETR.A

424.2113 846.4081 846.4083 -0.0002 1 37 0.026 U R.AQKDEEK.M

424.2113 846.4081 846.4083 -0.0002 1 (17) 2.7 U R.AQKDEEK.M

434.2483 866.4821 866.4861 -0.0041 0 32 0.051 U R.VLEELHK.A

447.7235 893.4324 893.4606 -0.0282 1 40 0.011 R.KYEEVAR.K

449.2177 896.4209 896.4239 -0.0031 1 4 34 K.YSQKEDK.Y

463.7184 925.4223 925.4253 -0.0031 0 54 0.00027 U K.HIAEDADR.K

474.7263 947.4381 947.4447 -0.0067 0 43 0.0057 U K.SIDDLEEK.V

489.2156 976.4166 976.4210 -0.0043 1 (26) 0.22 U R.ASEDERDR.V

489.2163 976.4180 976.4210 -0.0030 1 (16) 2 U R.ASEDERDR.V

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489.2188 976.4230 976.4210 0.0021 1 (16) 2.3 U R.ASEDERDR.V

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495.2466 988.4787 988.4825 -0.0038 1 (20) 1.2 R.AEQAEADKK.A

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495.2479 988.4812 988.4825 -0.0013 1 60 0.00012 R.AEQAEADKK.A

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495.2484 988.4823 988.4825 -0.0001 1 (46) 0.0034 R.AEQAEADKK.A

523.2681 1044.5216 1044.5200 0.0016 0 53 0.0006 U K.AEADVASLNR.R

523.2681 1044.5216 1044.5200 0.0016 0 (47) 0.0024 U K.AEADVASLNR.R

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560.7661 1119.5177 1119.5117 0.0060 0 46 0.0024 U K.CAELEEELK.T




115

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622.3291 1242.6437 1242.6456 -0.0018 0 63 4.6e-005 R.IQLVEEELDR.A

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700.3794 1398.7443 1398.7467 -0.0024 1 (24) 0.27 R.RIQLVEEELDR.A

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1210.0423 2418.0700 2418.0865 -0.0164 0 (68) 3.2e-006 U K.EENLSMHQMLDQTLLELNNM.- + Oxidation (M)

1210.0440 2418.0734 2418.0865 -0.0130 0 (35) 0.0074 U K.EENLSMHQMLDQTLLELNNM.- + Oxidation (M)




807.0330 2418.0770 2418.0865 -0.0095 0 (0) 21 U K.EENLSMHQMLDQTLLELNNM.- + Oxidation (M)

1218.0421 2434.0696 2434.0814 -0.0118 0 (40) 0.0018 U K.EENLSMHQMLDQTLLELNNM.- + 2 Oxidation (M)



1218.0444 2434.0742 2434.0814 -0.0072 0 (8) 3 U K.EENLSMHQMLDQTLLELNNM.- + 2 Oxidation (M)

1226.0447 2450.0748 2450.0763 -0.0015 0 (1) 16 U K.EENLSMHQMLDQTLLELNNM.- + 3 Oxidation (M)

5 ACTB 5,23 42381 56 gi|4501883 3,49 488.7258 975.4370 975.4410 -0.0040 0 73 4.6e-006 U K.AGFAGDDAPR.A

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581.3152 1160.6158 1160.6111 0.0047 0 (42) 0.0062 U K.EITALAPSTMK.I

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594.2862 1186.5578 1186.5587 -0.0009 0 (38) 0.012 U R.HQGVMVGMGQK.D + Oxidation (M)

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116

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1268.5772 2535.1398 2535.1509 -0.0110 0 137 3.6e-013 U K.LCYVALDFENEMATAASSSSLEK.S

1268.5808 2535.1470 2535.1509 -0.0038 0 (33) 0.0096 U K.LCYVALDFENEMATAASSSSLEK.S


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1276.5815 2551.1484 2551.1458 0.0027 0 (25) 0.06 U K.LCYVALDFENEMATAASSSSLEK.S + Oxidation (M)

1063.4917 3187.4533 3187.4664 -0.0132 0 87 2.9e-008 U R.CPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK.C

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1066.2055 3195.5947 3195.6023 -0.0076 0 84 9.2e-008 U R.TTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMR.L

1066.2055 3195.5947 3195.6023 -0.0076 0 (59) 2.9e-005 U R.TTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMR.L

1068.8230 3203.4472 3203.4613 -0.0142 0 (37) 0.0028 U R.CPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK.C + Oxidation (M)



6 ACTB 5,31 42249 58 gi|4501889 2,86 488.7269 975.4392 975.4410 -0.0018 0 70 1e-005 U K.AGFAGDDAPR.A

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594.2862 1186.5578 1186.5587 -0.0009 0 (3) 43 U R.HQGVMVGMGQK.D + Oxidation (M)

594.2873 1186.5601 1186.5587 0.0014 0 62 6e-005 U R.HQGVMVGMGQK.D + Oxidation (M)

599.7651 1197.5156 1197.5150 0.0006 0 51 0.00037 U K.DSYVGDEAQSK.R



117

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501.2454 1500.7144 1500.7262 -0.0118 0 (23) 0.38 U K.IWHHSFYNELR.V

501.2454 1500.7144 1500.7262 -0.0118 0 (37) 0.015 U K.IWHHSFYNELR.V

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895.9358 1789.8571 1789.8846 -0.0276 0 (40) 0.0054 U K.SYELPDGQVITIGNER.F


895.9445 1789.8744 1789.8846 -0.0102 0 95 1.9e-008 U K.SYELPDGQVITIGNER.F

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1268.5753 2535.1360 2535.1509 -0.0148 0 119 2.5e-011 U K.LCYVALDFENEMATAASSSSLEK.S





1063.4914 3187.4524 3187.4664 -0.0141 0 97 2.9e-009 U R.CPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK.C

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1074.1537 3219.4393 3219.4563 -0.0170 0 (0) 11 U R.CPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK.C + 2 Oxidation (M)

1100.5401 3298.5985 3298.6076 -0.0091 0 5 6.9 U K.MTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGR.T + 3 Oxidation (M)

7 SELEBP 6,1 53069 58 gi|18266692 3,24 513.3011 1024.5876 1024.5917 -0.0041 0 (24) 0.3 U K.DGLIPLEIR.F

513.3011 1024.5876 1024.5917 -0.0041 0 28 0.099 U K.DGLIPLEIR.F

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118

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549.8442 1097.6738 1097.6808 -0.0070 0 57 9.5e-005 U K.LILPSIISSR.I

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575.3137 1148.6129 1148.6189 -0.0060 0 51 0.00082 U K.VIEPNEIHAK.C

612.3155 1222.6164 1222.6207 -0.0043 0 (15) 2.7 U K.SPHYSQVIHR.L

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612.3171 1222.6197 1222.6207 -0.0010 0 (22) 0.53 U K.SPHYSQVIHR.L

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632.3331 1262.6516 1262.6659 -0.0144 0 (18) 1.5 U K.LNPNFLVDFGK.E

632.3331 1262.6516 1262.6659 -0.0144 0 (4) 34 U K.LNPNFLVDFGK.E

651.8580 1301.7015 1301.7092 -0.0076 0 41 0.007 U K.EPLGPALAHELR.Y

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671.4050 1340.7954 1340.8027 -0.0073 1 31 0.036 U R.DKLILPSIISSR.I

685.2892 1368.5639 1368.5656 -0.0017 0 18 0.5 U R.YPGGDCSSDIWI.-

685.2892 1368.5639 1368.5656 -0.0017 0 (18) 0.55 U R.YPGGDCSSDIWI.-

705.8200 1409.6254 1409.6319 -0.0065 0 24 0.2 U K.CGPGYATPLEAMK.G + Oxidation (M)

727.8642 1453.7139 1453.7275 -0.0136 0 48 0.0011 U R.EEIVYLPCIYR.N

755.8888 1509.7630 1509.7715 -0.0086 0 (33) 0.037 U K.GGFVLLDGETFEVK.G

755.8904 1509.7662 1509.7715 -0.0053 0 69 9.3e-006 U K.GGFVLLDGETFEVK.G

755.8918 1509.7691 1509.7715 -0.0024 0 (52) 0.00047 U K.GGFVLLDGETFEVK.G

770.4101 1538.8056 1538.8127 -0.0070 0 (37) 0.014 U R.VPGGPQMIQLSLDGK.R

773.8876 1545.7606 1545.7715 -0.0109 0 90 8.9e-008 U R.LYVTTSLYSAWDK.Q

778.4055 1554.7965 1554.8076 -0.0111 0 70 7.5e-006 U R.VPGGPQMIQLSLDGK.R + Oxidation (M)

834.4166 1666.8186 1666.8256 -0.0070 0 43 0.0034 U R.FLYFSNWLHGDIR.Q

556.6146 1666.8221 1666.8256 -0.0035 0 (23) 0.3 U R.FLYFSNWLHGDIR.Q

848.4609 1694.9072 1694.9138 -0.0065 1 57 0.00011 U K.RVPGGPQMIQLSLDGK.R

571.3087 1710.9042 1710.9087 -0.0045 1 (46) 0.0012 U K.RVPGGPQMIQLSLDGK.R + Oxidation (M)

930.4531 1858.8916 1858.9036 -0.0120 0 2 34 U R.HNIMVSTEWAAPNVFK.D + Oxidation (M)

959.4615 1916.9083 1916.9367 -0.0284 0 90 4.6e-008 U R.NTGIEAPDYLATVDVDPK.S


119

959.4692 1916.9239 1916.9367 -0.0128 0 (2) 35 U R.NTGIEAPDYLATVDVDPK.S

959.4692 1916.9239 1916.9367 -0.0128 0 (17) 1.1 U R.NTGIEAPDYLATVDVDPK.S

809.0756 2424.2049 2424.2207 -0.0158 0 (19) 0.47 U K.GGSVQVLEDQELTCQPEPLVVK.G

809.0756 2424.2049 2424.2207 -0.0158 0 (4) 18 U K.GGSVQVLEDQELTCQPEPLVVK.G

1213.1123 2424.2100 2424.2207 -0.0106 0 53 0.0002 U K.GGSVQVLEDQELTCQPEPLVVK.G

849.7897 2546.3471 2546.3645 -0.0174 1 125 7.2e-012 U K.LNPNFLVDFGKEPLGPALAHELR.Y

931.1052 2790.2938 2790.3051 -0.0113 0 4 8.8 U K.DGFNPAHVEAGLYGSHIHVWDWQR.H

12 TAGLN 8,87 22645 53 gi|13928744 4,53 381.1715 760.3284 760.3252 0.0031 0 36 0.039 U K.NDGHYR.G

381.1715 760.3284 760.3252 0.0031 0 (32) 0.078 U K.NDGHYR.G

477.2313 952.4481 952.4502 -0.0021 0 35 0.026 U K.AAEDYGVTK.T

495.7904 989.5663 989.5698 -0.0035 0 45 0.0037 U R.LGFQVWLK.N

541.7359 1081.4571 1081.4563 0.0008 0 49 0.00062 U K.YDEELEER.L

595.8433 1189.6721 1189.6740 -0.0019 0 61 7.7e-005 U R.TVMALGSLAVTK.N

603.8420 1205.6695 1205.6690 0.0005 0 (12) 4.8 U R.TVMALGSLAVTK.N + Oxidation (M)

605.7826 1209.5506 1209.5513 -0.0007 1 (46) 0.0017 U K.KYDEELEER.L

605.7826 1209.5506 1209.5513 -0.0007 1 54 0.00031 U K.KYDEELEER.L

611.3181 1220.6216 1220.6223 -0.0007 0 (10) 8.4 U K.QMEQVAQFLK.A

611.3181 1220.6216 1220.6223 -0.0007 0 34 0.034 U K.QMEQVAQFLK.A

619.3147 1236.6148 1236.6172 -0.0025 0 (33) 0.041 U K.QMEQVAQFLK.A + Oxidation (M)

619.3147 1236.6148 1236.6172 -0.0025 0 (2) 47 U K.QMEQVAQFLK.A + Oxidation (M)

630.8177 1259.6208 1259.6220 -0.0012 0 24 0.4 U K.VPENPPSMVFK.Q + Oxidation (M)

641.3013 1280.5880 1280.5885 -0.0005 0 59 8.2e-005 U R.EFTDSQLQEGK.H

765.8552 1529.6958 1529.7072 -0.0114 0 76 1.4e-006 U K.TDMFQTVDLFEGK.D

765.8552 1529.6958 1529.7072 -0.0114 0 (26) 0.15 U K.TDMFQTVDLFEGK.D



765.8630 1529.7114 1529.7072 0.0042 0 (1) 47 U K.TDMFQTVDLFEGK.D

765.8630 1529.7114 1529.7072 0.0042 0 (10) 7.5 U K.TDMFQTVDLFEGK.D

773.8568 1545.6990 1545.7021 -0.0031 0 (50) 0.00068 U K.TDMFQTVDLFEGK.D + Oxidation (M)

773.8568 1545.6990 1545.7021 -0.0031 0 (36) 0.015 U K.TDMFQTVDLFEGK.D + Oxidation (M)

773.8578 1545.7010 1545.7021 -0.0011 0 (66) 1.8e-005 U K.TDMFQTVDLFEGK.D + Oxidation (M)

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120

773.8578 1545.7010 1545.7021 -0.0011 0 (71) 4.9e-006 U K.TDMFQTVDLFEGK.D + Oxidation (M)

709.6838 2126.0295 2126.0401 -0.0106 0 (33) 0.024 U R.LVEWIVMQCGPDVGRPDR.G

1064.0252 2126.0358 2126.0401 -0.0043 0 (13) 2.5 U R.LVEWIVMQCGPDVGRPDR.G

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18 CALR 4,33 48137 52 gi|11693172 1,21 369.2126 736.4106 736.4119 -0.0013 0 (12) 7.2 U K.FVLSSGK.F

369.2126 736.4106 736.4119 -0.0013 0 17 2.1 U K.FVLSSGK.F

487.7690 973.5234 973.5233 0.0001 0 22 0.72 U K.LFPGGLDQK.D

488.2467 974.4788 974.4781 0.0007 0 29 0.15 U K.GLQTSQDAR.F

488.2467 974.4788 974.4781 0.0007 0 (15) 3.7 U K.GLQTSQDAR.F

565.2631 1128.5116 1128.5087 0.0028 1 55 0.00022 U K.FYGDQEKDK.G

609.8081 1217.6017 1217.6000 0.0017 1 51 0.0008 U K.DKGLQTSQDAR.F

610.3520 1218.6895 1218.6972 -0.0078 0 60 8.4e-005 U K.GQTLVVQFTVK.H

726.3301 1450.6457 1450.6477 -0.0020 0 77 1.1e-006 U K.EQFLDGDAWTNR.W

738.8263 1475.6380 1475.6463 -0.0083 0 68 6.7e-006 U K.HEQNIDCGGGYVK.L

595.6178 1783.8315 1783.8377 -0.0062 1 69 6.1e-006 U K.IKDPDAAKPEDWDER.A

892.9239 1783.8333 1783.8377 -0.0044 1 (59) 6.5e-005 U K.IKDPDAAKPEDWDER.A

1196.0507 2390.0868 2390.0914 -0.0046 0 121 2.7e-011 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPK.K

1196.0520 2390.0894 2390.0914 -0.0020 0 (65) 1.1e-005 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPK.K

1196.0520 2390.0894 2390.0914 -0.0020 0 (31) 0.026 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPK.K

1196.0544 2390.0942 2390.0914 0.0028 0 (1) 27 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPK.K

825.0055 2471.9947 2472.0032 -0.0085 0 38 0.00083 U K.DMHGDSEYNIMFGPDICGPGTK.K + 2 Oxidation (M)

840.3968 2518.1685 2518.1864 -0.0178 1 76 8.5e-007 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPKK.I

840.3978 2518.1716 2518.1864 -0.0148 1 (57) 7.3e-005 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPKK.I

840.3978 2518.1716 2518.1864 -0.0148 1 (65) 1.2e-005 U K.IDNSQVESGSLEDDWDFLPPKK.I

952.7977 2855.3713 2855.3800 -0.0087 1 1 18 U R.CKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVK.I

1090.1683 3267.4831 3267.4884 -0.0053 0 67 3.1e-006 U K.SGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTK.A

1379.6700 4135.9882 4135.9843 0.0038 0 13 0.55 U K.GTWIHPEIDNPEYSPDANIYAYDSFAVLGLDLWQVK.S

20 HSP90B1 4,72 92998 30

gi|210032365 0,37 377.2083 752.4020 752.4068 -0.0048 1 28 0.15 U K.KSDYIK.L

502.7785 1003.5424 1003.5451 -0.0027 1 7 22 U K.KTFEINPR.H

541.2781 1080.5417 1080.5352 0.0065 0 9 12 U K.FAFQAEVNR.M

570.2937 1138.5729 1138.5731 -0.0002 0 72 6.6e-006 U K.LGVIEDHSNR.T

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121

575.7732 1149.5319 1149.5302 0.0017 0 42 0.0053 U K.EAESSPFVER.L

594.3406 1186.6667 1186.6710 -0.0043 0 35 0.028 U K.SILFVPTSAPR.G

645.3035 1288.5924 1288.5935 -0.0012 0 40 0.007 U K.DISTNYYASQK.K

653.8266 1305.6387 1305.6427 -0.0040 0 (25) 0.24 U K.EFEPLLNWMK.D

661.8253 1321.6361 1321.6376 -0.0015 0 31 0.076 U K.EFEPLLNWMK.D + Oxidation (M)

743.3795 1484.7444 1484.7471 -0.0027 0 (67) 1.6e-005 U K.GVVDSDDLPLNVSR.E

743.3803 1484.7459 1484.7471 -0.0012 0 110 7.2e-010 U K.GVVDSDDLPLNVSR.E

763.3632 1524.7118 1524.7195 -0.0076 0 84 2.5e-007 U K.EEASDYLELDTIK.N

897.9820 1793.9494 1793.9597 -0.0103 0 28 0.078 U K.TVMDLAVVLFETATLR.S + Oxidation (M)

897.9820 1793.9494 1793.9597 -0.0103 0 (6) 11 U K.TVMDLAVVLFETATLR.S + Oxidation (M)

939.9660 1877.9174 1877.9352 -0.0178 0 86 1.7e-007 U K.YSQFINFPIYVWSSK.T

939.9660 1877.9174 1877.9352 -0.0178 0 (23) 0.3 U K.YSQFINFPIYVWSSK.T



1015.5322 2029.0498 2029.0579 -0.0080 0 16 1.1 U R.LISLTDENALAGNEELTVK.I

750.6820 2249.0240 2249.0349 -0.0109 0 90 3.2e-008 U R.FQSSHHSTDITSLDQYVER.M

1178.5362 2355.0578 2355.0623 -0.0045 0 1 20 U R.LTESPCALVASQYGWSGNMER.I

842.7410 2525.2013 2525.2207 -0.0194 1 48 0.0005 U K.EDEDDKTVMDLAVVLFETATLR.S + Oxidation (M)

853.4316 2557.2730 2557.2787 -0.0057 0 (13) 1.8 U K.TVWDWELMNDIKPIWQRPSK.E + Oxidation (M)

853.4316 2557.2730 2557.2787 -0.0057 0 32 0.021 U K.TVWDWELMNDIKPIWQRPSK.E + Oxidation (M)

1474.7009 2947.3872 2947.3837 0.0035 0 17 0.49 U K.GYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGK.R

1026.1666 3075.4780 3075.4787 -0.0007 1 27 0.038 U K.KGYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGK.R

1035.4988 3103.4746 3103.4848 -0.0103 1 (0) 20 U K.GYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGKR.F

1035.4988 3103.4746 3103.4848 -0.0103 1 5 7.2 U K.GYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGKR.F

25 EEF2 6,41 96192 38 gi|8393296 0,63 475.2265 948.4385 948.4400 -0.0015 1 1 88 U K.LDSEDKDK.E

546.2952 1090.5759 1090.5771 -0.0012 0 19 1.4 U M.VNFTVDQIR.A

551.7667 1101.5189 1101.5165 0.0025 0 3 50 U K.QFAEMYVAK.F + Oxidation (M)

562.2849 1122.5553 1122.5591 -0.0038 0 48 0.0015 U K.STLTDSLVCK.A

637.8586 1273.7026 1273.7030 -0.0004 0 20 0.89 U K.EDLYLKPIQR.T

637.8586 1273.7026 1273.7030 -0.0004 0 (18) 1.3 U K.EDLYLKPIQR.T

654.8309 1307.6473 1307.6510 -0.0037 0 31 0.078 U K.DSVVAGFQWATK.E

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122

689.8606 1377.7067 1377.7075 -0.0007 0 (15) 2.5 U R.CLYASVLTAQPR.L

689.8606 1377.7067 1377.7075 -0.0007 0 26 0.22 U R.CLYASVLTAQPR.L

722.8864 1443.7583 1443.7609 -0.0027 1 (11) 6.9 U K.EGIPALDNFLDKL.-

722.8869 1443.7593 1443.7609 -0.0017 1 49 0.0011 U K.EGIPALDNFLDKL.-

722.8876 1443.7607 1443.7609 -0.0002 1 (8) 13 U K.EGIPALDNFLDKL.-

722.8888 1443.7630 1443.7609 0.0021 1 (42) 0.0053 U K.EGIPALDNFLDKL.-

722.8888 1443.7630 1443.7609 0.0021 1 (15) 2.4 U K.EGIPALDNFLDKL.-

747.9027 1493.7908 1493.7952 -0.0044 0 67 1.2e-005 U R.TFCQLILDPIFK.V

900.4497 1798.8848 1798.8890 -0.0042 0 91 5.1e-008 U K.AYLPVNESFGFTADLR.S

900.4501 1798.8856 1798.8890 -0.0034 0 (39) 0.0067 U K.AYLPVNESFGFTADLR.S

989.4881 1976.9617 1976.9666 -0.0050 0 12 3.7 U R.GHVFEESQVAGTPMFVVK.A + Oxidation (M)

1053.0219 2104.0292 2104.0300 -0.0007 0 62 3.3e-005 U K.IWCFGPDGTGPNILTDITK.G

715.0288 2142.0646 2142.0705 -0.0059 1 48 0.00077 U K.ARPFPDGLAEDIDKGEVSAR.Q

715.0288 2142.0646 2142.0705 -0.0059 1 (38) 0.0069 U K.ARPFPDGLAEDIDKGEVSAR.Q

1102.5595 2203.1044 2203.1048 -0.0004 0 5 14 U K.STAISLFYELSENDLNFIK.Q

867.4749 2599.4030 2599.4196 -0.0166 0 (3) 9 U R.WLPAGDALLQMITIHLPSPVTAQK.Y

867.4749 2599.4030 2599.4196 -0.0166 0 (22) 0.11 U R.WLPAGDALLQMITIHLPSPVTAQK.Y

867.4767 2599.4082 2599.4196 -0.0114 0 54 6.9e-005 U R.WLPAGDALLQMITIHLPSPVTAQK.Y

872.8090 2615.4051 2615.4145 -0.0095 0 (44) 0.00076 U R.WLPAGDALLQMITIHLPSPVTAQK.Y + Oxidation (M)

920.4790 2758.4153 2758.4252 -0.0099 0 79 3.1e-007 U R.YVEPIEDVPCGNIVGLVGVDQFLVK.T

939.8032 2816.3879 2816.3981 -0.0102 0 96 6e-009 U K.DGSGFLINLIDSPGHVDFSSEVTAALR.V

997.1884 2988.5432 2988.5453 -0.0021 0 (15) 0.69 U R.LMEPIYLVEIQCPEQVVGGIYGVLNR.K

1002.5195 3004.5367 3004.5402 -0.0035 0 80 2.3e-007 U R.LMEPIYLVEIQCPEQVVGGIYGVLNR.K + Oxidation (M)

1415.6648 4243.9726 4243.9771 -0.0045 0 3 4.2 U R.SNTGGQAFPQCVFDHWQILPGDPFDNSSRPSQVVAETR.K

27 WDR1 6,15 66824 32 gi|62078997 0,87 370.1959 738.3773 738.3773 0.0001 0 14 3.9 U K.IQDAHR.L

396.2084 790.4023 790.4007 0.0015 0 19 1.9 U K.VCALGGSK.A

396.2084 790.4023 790.4007 0.0015 0 (18) 2.4 U K.VCALGGSK.A

397.7004 793.3863 793.3905 -0.0042 0 26 0.27 U R.FVNCVR.F

444.2633 886.5121 886.5124 -0.0003 0 20 1.3 U K.VINSVDIK.Q

449.7257 897.4369 897.4417 -0.0048 0 31 0.074 U K.GHTNQVSR.M

463.2619 924.5092 924.5141 -0.0049 0 48 0.0015 U K.NNPSKPLR.V

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123

532.8203 1063.6260 1063.6277 -0.0017 0 31 0.061 U R.VYSILGATLK.D

543.2917 1084.5688 1084.5699 -0.0011 0 23 0.48 U K.SIQCLTVHK.N

551.7634 1101.5123 1101.5131 -0.0008 0 19 1.2 U K.YEYQPFAGK.I

573.3180 1144.6215 1144.6241 -0.0026 0 42 0.0067 U K.VFASLPQVER.G

610.7989 1219.5832 1219.5833 -0.0001 1 50 0.0009 U K.DIAWTEDSKR.I

747.4133 1492.8120 1492.8137 -0.0017 1 (19) 0.7 U R.VYSILGATLKDEGK.L

747.4133 1492.8120 1492.8137 -0.0017 1 28 0.1 U R.VYSILGATLKDEGK.L

852.4140 1702.8135 1702.8203 -0.0067 0 66 1.3e-005 U R.FATASADGQIFIYDGK.T

1022.4557 2042.8968 2042.9044 -0.0076 0 (97) 6e-009 U R.LATGSDDNCAAFFEGPPFK.F

1022.4574 2042.9002 2042.9044 -0.0042 0 146 8e-014 U R.LATGSDDNCAAFFEGPPFK.F

1022.4591 2042.9036 2042.9044 -0.0008 0 (69) 3.9e-006 U R.LATGSDDNCAAFFEGPPFK.F

1022.4591 2042.9036 2042.9044 -0.0008 0 (72) 1.9e-006 U R.LATGSDDNCAAFFEGPPFK.F

741.3640 2221.0701 2221.0804 -0.0103 0 27 0.073 U K.FGAVFLWDTGSSVGEITGHNK.V

1147.5382 2293.0618 2293.0685 -0.0067 0 (9) 3.8 U K.GPVTDLAYSHDGAFLAVCDASK.V

1147.5382 2293.0618 2293.0685 -0.0067 0 (33) 0.015 U K.GPVTDLAYSHDGAFLAVCDASK.V

765.3613 2293.0621 2293.0685 -0.0064 0 35 0.01 U K.GPVTDLAYSHDGAFLAVCDASK.V

862.4097 2584.2073 2584.2194 -0.0121 0 16 0.77 U K.AHDGGIYAISWSPDSTHLLSASGDK.T

29 CCT6 6,63 58437 48 gi|76253725 0,93 420.7488 839.4830 839.4865 -0.0034 0 34 0.034 U K.HTLTQIK.D

469.2633 936.5120 936.5141 -0.0021 0 34 0.041 R.GLVLDHGAR.H

469.2633 936.5120 936.5141 -0.0021 0 (27) 0.19 R.GLVLDHGAR.H

503.7667 1005.5187 1005.5165 0.0023 0 25 0.37 K.MLVSGAGDIK.L + Oxidation (M)

539.7931 1077.5716 1077.5706 0.0010 0 63 5.2e-005 U R.IITEGFEAAK.E

596.2882 1190.5619 1190.5608 0.0011 0 (1) 69 U K.TEVNSGFFYK.S

596.2882 1190.5619 1190.5608 0.0011 0 9 10 U K.TEVNSGFFYK.S

623.8356 1245.6567 1245.6605 -0.0038 0 63 4.5e-005 U K.GIDPFSLDALAK.E

628.3588 1254.7030 1254.7044 -0.0013 0 71 5.1e-006 U R.AQAALAVNISAAR.G

429.5601 1285.6584 1285.6626 -0.0042 1 19 1.2 U K.HKSETDTSLIR.G

833.4176 1664.8207 1664.8192 0.0015 1 1 49 U K.VCGDSDKGFVVINQK.G

881.4679 1760.9212 1760.9309 -0.0096 0 72 4.2e-006 U K.VLAQNSGFDLQETLVK.V

884.5183 1767.0221 1767.0294 -0.0073 0 34 0.0078 U R.AQLGVQAFADALLIIPK.V

884.5183 1767.0221 1767.0294 -0.0073 0 (13) 1.1 U R.AQLGVQAFADALLIIPK.V

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124

772.4075 2314.2006 2314.2103 -0.0097 0 (6) 9.9 U K.DGNVLLHEMQIQHPTASLIAK.V

777.7385 2330.1936 2330.2052 -0.0117 0 33 0.022 U K.DGNVLLHEMQIQHPTASLIAK.V + Oxidation (M)

818.0909 2451.2509 2451.2679 -0.0170 0 17 0.59 U K.NAIDDGCVVPGAGAVEVALAEALIK.Y

1226.6387 2451.2628 2451.2679 -0.0051 0 (10) 3.2 U K.NAIDDGCVVPGAGAVEVALAEALIK.Y

819.1024 2454.2854 2454.2974 -0.0121 0 12 1.9 U K.QLLHSCTVIATNILLVDEIMR.A + Oxidation (M)

819.1024 2454.2854 2454.2974 -0.0121 0 (3) 15 U K.QLLHSCTVIATNILLVDEIMR.A + Oxidation (M)

848.7821 2543.3244 2543.3330 -0.0087 0 (68) 4.7e-006 U K.VATAQDDITGDGTTSNVLIIGELLK.Q

1272.6733 2543.3320 2543.3330 -0.0010 0 141 2.1e-013 U K.VATAQDDITGDGTTSNVLIIGELLK.Q

1309.2958 3924.8656 3924.8550 0.0106 0 39 0.0012 U R.LTLACGGIALNSFDDLNPDCLGHAGLVYEYTLGEEK.F

29 ATIC 6,69 64681 41 gi|48675845 0,81 504.7890 1007.5634 1007.5651 -0.0018 0 18 1.3 U K.SLFSNIVTK.N

609.7759 1217.5373 1217.5346 0.0027 0 48 0.0011 U R.NIPEDAADMAR.L + Oxidation (M)

660.7968 1319.5790 1319.5816 -0.0026 0 48 0.00095 U K.YTQSNSVCYAK.D

669.3653 1336.7160 1336.7213 -0.0053 0 66 1.7e-005 U R.VVVCNLYPFVK.T

693.3587 1384.7028 1384.7059 -0.0031 0 52 0.00055 U K.DGQVIGIGAGQQSR.I

779.9420 1557.8694 1557.8726 -0.0032 0 121 3.9e-011 U R.NLASLGLSLVASGGTAK.A

779.9430 1557.8714 1557.8726 -0.0012 0 (78) 7.3e-007 U R.NLASLGLSLVASGGTAK.A

804.3931 1606.7717 1606.7661 0.0056 0 (20) 0.69 U R.DVSELTGFPEMLGGR.V

804.3931 1606.7717 1606.7661 0.0056 0 (3) 30 U R.DVSELTGFPEMLGGR.V

808.4045 1614.7944 1614.8042 -0.0098 0 127 1.5e-011 U K.LSGVSVSSDAFFPFR.D

808.4084 1614.8021 1614.8042 -0.0021 0 (56) 0.00017 U K.LSGVSVSSDAFFPFR.D

808.4084 1614.8021 1614.8042 -0.0021 0 (30) 0.067 U K.LSGVSVSSDAFFPFR.D

812.3861 1622.7577 1622.7610 -0.0033 0 55 0.00022 U R.DVSELTGFPEMLGGR.V + Oxidation (M)

859.4471 1716.8797 1716.8821 -0.0024 0 15 2 U K.ALFEEVPELLTEAEK.K

615.9995 1844.9767 1844.9771 -0.0004 1 66 1.3e-005 U K.ALFEEVPELLTEAEKK.E

615.9995 1844.9767 1844.9771 -0.0004 1 (65) 1.7e-005 U K.ALFEEVPELLTEAEKK.E

615.9997 1844.9774 1844.9771 0.0003 1 (9) 6.3 U K.ALFEEVPELLTEAEKK.E

1017.9598 2033.9050 2033.9119 -0.0069 0 19 0.38 U K.AFTHTAQYDEAISDYFR.R

678.9766 2033.9079 2033.9119 -0.0041 0 (10) 3.3 U K.AFTHTAQYDEAISDYFR.R

708.3767 2122.1084 2122.1092 -0.0008 0 11 3 U K.VVIEACDELGIVLAHTDLR.L

1081.4904 2160.9662 2160.9708 -0.0045 0 123 1.9e-011 U R.MSSFGDFVALSDVCDVPTAK.I + Oxidation (M)

777.4004 2329.1795 2329.1850 -0.0055 0 (1) 32 U R.VCMVYDLYPTLTPLAIAYAR.A

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125

1165.6014 2329.1882 2329.1850 0.0032 0 54 0.00014 U R.VCMVYDLYPTLTPLAIAYAR.A

1204.5963 2407.1780 2407.1755 0.0026 0 18 0.48 U R.AEVSNAIDQYVTGTIGEGEDLVK.W

1204.5963 2407.1780 2407.1755 0.0026 0 (12) 2.1 U R.AEVSNAIDQYVTGTIGEGEDLVK.W

851.7937 2552.3592 2552.3698 -0.0106 0 135 8.5e-013 U K.TVASPDVTVEAAVEQIDIGGVTLLR.A

851.7955 2552.3646 2552.3698 -0.0052 0 (9) 3.1 U K.TVASPDVTVEAAVEQIDIGGVTLLR.A

851.7955 2552.3646 2552.3698 -0.0052 0 (8) 3.5 U K.TVASPDVTVEAAVEQIDIGGVTLLR.A

1277.1926 2552.3706 2552.3698 0.0009 0 (73) 1.2e-006 U K.TVASPDVTVEAAVEQIDIGGVTLLR.A

30 TKT 7,54 71940 39 gi|12018252 1,12 375.2001 748.3857 748.3868 -0.0011 0 23 0.74 R.AFDQIR.M

378.1925 754.3705 754.3722 -0.0016 0 49 0.001 K.LGHASDR.I

482.2322 962.4499 962.4531 -0.0033 0 28 0.18 R.MPTPPNYK.V + Oxidation (M)

489.7848 977.5550 977.5658 -0.0108 0 33 0.044 K.HQPTAIIAK.T

494.7818 987.5490 987.5535 -0.0045 1 44 0.0054 K.KLILDCAR.A

462.6026 1384.7859 1384.7966 -0.0107 0 (15) 1.9 R.VLDPFTIKPLDK.K

693.4014 1384.7882 1384.7966 -0.0084 0 59 7.1e-005 R.VLDPFTIKPLDK.K

701.8821 1401.7496 1401.7616 -0.0120 0 (44) 0.0028 K.LDNLVAIFDINR.L

701.8833 1401.7521 1401.7616 -0.0095 0 89 9.5e-008 K.LDNLVAIFDINR.L

701.8833 1401.7521 1401.7616 -0.0095 0 (86) 2e-007 K.LDNLVAIFDINR.L

767.9130 1533.8114 1533.8225 -0.0111 1 (14) 2.5 K.MFGIDKDAIVQAVK.G

775.9119 1549.8093 1549.8174 -0.0081 1 56 0.00018 K.MFGIDKDAIVQAVK.G + Oxidation (M)

826.3910 1650.7674 1650.7865 -0.0191 0 85 2e-007 R.TVPFCSTFAAFFTR.A

826.3981 1650.7816 1650.7865 -0.0049 0 (15) 2 R.TVPFCSTFAAFFTR.A

826.3981 1650.7816 1650.7865 -0.0049 0 (19) 0.71 R.TVPFCSTFAAFFTR.A

957.9539 1913.8933 1913.9081 -0.0148 0 (17) 0.96 R.SVPMSTVFYPSDGVATEK.A

965.9537 1929.8928 1929.9030 -0.0102 0 80 4.3e-007 R.SVPMSTVFYPSDGVATEK.A + Oxidation (M)

965.9543 1929.8941 1929.9030 -0.0089 0 (23) 0.21 R.SVPMSTVFYPSDGVATEK.A + Oxidation (M)



1010.5234 2019.0322 2019.0636 -0.0314 0 93 2.3e-008 K.ILATPPQEDAPSVDIANIR.M

1012.9932 2023.9718 2023.9884 -0.0166 0 61 3.9e-005 K.NMAEQIIQEIYSQVQSK.K + Oxidation (M)



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126

827.7318 2480.1736 2480.1931 -0.0196 0 35 0.01 R.TSRPENAIIYSNNEDFQVGQAK.V

1241.0976 2480.1806 2480.1931 -0.0125 0 (20) 0.33 R.TSRPENAIIYSNNEDFQVGQAK.V

895.1294 2682.3664 2682.3898 -0.0234 1 38 0.0045 K.SKDDQVTVIGAGVTLHEALAAAEMLK.K + Oxidation (M)

895.1294 2682.3664 2682.3898 -0.0234 1 (8) 4.5 K.SKDDQVTVIGAGVTLHEALAAAEMLK.K + Oxidation (M)

1072.8780 3215.6122 3215.6351 -0.0229 0 (7) 4.2 U R.ILTVEDHYYEGGIGEAVSAVVVGEPGVTVTR.L

1072.8780 3215.6122 3215.6351 -0.0229 0 28 0.034 U R.ILTVEDHYYEGGIGEAVSAVVVGEPGVTVTR.L

1209.5630 3625.6672 3625.6786 -0.0114 0 0 10 R.ISSIQATTAAGSGHPTSCCSAAEIMAVLFFHTMR.Y + Oxidation (M)

31 PKM2 7,15 58314 61 gi|206205 2 353.2171 704.4196 704.4221 -0.0025 0 19 1.8 U K.VFLAQK.M

377.7340 753.4534 753.4609 -0.0075 0 21 0.46 U K.KPRPTR.A

377.7340 753.4534 753.4609 -0.0075 0 (15) 2.1 U K.KPRPTR.A

384.7059 767.3972 767.4038 -0.0066 0 (7) 16 U R.SAHQVAR.Y

384.7059 767.3972 767.4038 -0.0066 0 (16) 2 U R.SAHQVAR.Y

384.7076 767.4007 767.4038 -0.0032 0 28 0.13 U R.SAHQVAR.Y

442.7390 883.4634 883.4698 -0.0064 0 33 0.046 U R.MQHLIAR.E + Oxidation (M)

467.2643 932.5141 932.5154 -0.0013 0 26 0.32 U R.GIFPVLCK.D

477.2420 952.4695 952.4726 -0.0031 0 37 0.02 U K.IENHEGVR.R

510.2600 1018.5055 1018.5083 -0.0028 0 6 29 U K.GDYPLEAVR.M

510.2600 1018.5055 1018.5083 -0.0028 0 (1) 81 U K.GDYPLEAVR.M

512.7766 1023.5387 1023.5461 -0.0074 1 45 0.0032 U R.KAADVHEVR.K

512.7766 1023.5387 1023.5461 -0.0074 1 (32) 0.062 U R.KAADVHEVR.K

571.3067 1140.5988 1140.6026 -0.0038 0 37 0.018 U R.GDLGIEIPAEK.V

586.3188 1170.6229 1170.6244 -0.0015 0 77 2e-006 U R.LDIDSAPITAR.N

599.2922 1196.5698 1196.5747 -0.0049 0 57 0.00015 U K.ITLDNAYMEK.C

611.3157 1220.6167 1220.6257 -0.0090 0 99 1.2e-008 U K.CCSGAIIVLTK.S

680.3516 1358.6887 1358.6976 -0.0089 0 48 0.0015 U R.NTGIICTIGPASR.S

731.9062 1461.7979 1461.8079 -0.0100 0 (80) 6.1e-007 U K.IYVDDGLISLQVK.E

731.9062 1461.7979 1461.8079 -0.0100 0 102 3.9e-009 U K.IYVDDGLISLQVK.E

731.9080 1461.8015 1461.8079 -0.0064 0 (47) 0.0014 U K.IYVDDGLISLQVK.E

734.8385 1467.6625 1467.6704 -0.0079 0 92 3.6e-008 U K.CDENILWLDYK.N

794.3795 1586.7444 1586.7576 -0.0132 0 77 1.3e-006 U K.DAVLDAWAEDVDLR.V

794.3806 1586.7466 1586.7576 -0.0111 0 (7) 14 U K.DAVLDAWAEDVDLR.V

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127

794.3806 1586.7466 1586.7576 -0.0111 0 (19) 0.82 U K.DAVLDAWAEDVDLR.V

833.4126 1664.8107 1664.8080 0.0028 0 4 27 U R.FDEILEASDGIMVAR.G

882.9904 1763.9662 1763.9781 -0.0119 1 36 0.011 U K.KGVNLPGAAVDLPAVSEK.D

930.4481 1858.8816 1858.8924 -0.0108 0 (109) 6.6e-010 U K.FGVEQDVDMVFASFIR.K

938.4415 1874.8685 1874.8873 -0.0188 0 (114) 2.2e-010 U K.FGVEQDVDMVFASFIR.K + Oxidation (M)



938.4448 1874.8750 1874.8873 -0.0123 0 125 1.6e-011 U K.FGVEQDVDMVFASFIR.K + Oxidation (M)

625.9675 1874.8808 1874.8873 -0.0065 0 (15) 1.7 U K.FGVEQDVDMVFASFIR.K + Oxidation (M)

625.9675 1874.8808 1874.8873 -0.0065 0 (12) 3.7 U K.FGVEQDVDMVFASFIR.K + Oxidation (M)

942.4462 1882.8778 1882.8962 -0.0184 0 (28) 0.071 U R.LNFSHGTHEYHAETIK.N

628.6347 1882.8824 1882.8962 -0.0138 0 97 8.5e-009 U R.LNFSHGTHEYHAETIK.N

644.6622 1930.9647 1930.9788 -0.0141 0 (7) 10 U R.EAEAAIYHLQLFEELR.R

644.6622 1930.9647 1930.9788 -0.0141 0 (21) 0.42 U R.EAEAAIYHLQLFEELR.R

966.4911 1930.9677 1930.9788 -0.0111 0 53 0.00025 U R.EAEAAIYHLQLFEELR.R

1073.0475 2144.0804 2144.1001 -0.0197 0 162 2.9e-015 U R.LAPITSDPTEAAAVGAVEASFK.C

1073.0529 2144.0912 2144.1001 -0.0089 0 (72) 2.4e-006 U R.LAPITSDPTEAAAVGAVEASFK.C

1073.0529 2144.0912 2144.1001 -0.0089 0 (31) 0.032 U R.LAPITSDPTEAAAVGAVEASFK.C

760.3867 2278.1382 2278.1529 -0.0147 0 7 11 U K.GDVVIVLTGWRPGSGFTNTMR.V + Oxidation (M)

812.4176 2434.2309 2434.2744 -0.0435 0 53 0.00019 U R.AATESFASDPILYRPVAVALDTK.G

1255.5648 2509.1150 2509.1312 -0.0162 0 52 0.00011 U R.AEGSDVANAVLDGADCIMLSGETAK.G + Oxidation (M)

33 DLD 7,96 54574 28 gi|40786469 0,60 749.3873 748.3800 748.3789 0.0011 0 30 0.17 U K.TVCIEK.N

455.2328 908.4510 908.4504 0.0006 0 28 0.18 U K.FPFAANSR.A

534.2354 1066.4562 1066.4601 -0.0039 0 33 0.031 U K.TNADTDGMVK.I + Oxidation (M)

564.3313 1126.6480 1126.6499 -0.0019 0 58 0.00012 U K.ALTGGIAHLFK.Q

762.8713 1523.7281 1523.7303 -0.0022 0 8 11 U R.VCHAHPTLSEAFR.E

896.4527 1790.8909 1790.9010 -0.0101 0 61 5.3e-005 U K.NQVTATTADGSTQVIGTK.N

910.4369 1818.8592 1818.8604 -0.0012 0 137 1.2e-012 U K.NETLGGTCLNVGCIPSK.A

655.0296 1962.0669 1962.0761 -0.0092 0 (29) 0.039 U K.IPNIFAIGDVVAGPMLAHK.A



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128


660.3621 1978.0644 1978.0710 -0.0066 0 (48) 0.00058 U K.IPNIFAIGDVVAGPMLAHK.A + Oxidation (M)

660.3621 1978.0644 1978.0710 -0.0066 0 (61) 2.9e-005 U K.IPNIFAIGDVVAGPMLAHK.A + Oxidation (M)

660.3623 1978.0651 1978.0710 -0.0059 0 (8) 4.9 U K.IPNIFAIGDVVAGPMLAHK.A + Oxidation (M)

660.3623 1978.0652 1978.0710 -0.0058 0 77 7.5e-007 U K.IPNIFAIGDVVAGPMLAHK.A + Oxidation (M)

660.3623 1978.0652 1978.0710 -0.0058 0 (64) 1.5e-005 U K.IPNIFAIGDVVAGPMLAHK.A + Oxidation (M)

723.7206 2168.1400 2168.1477 -0.0077 0 (33) 0.017 U R.RPFTQNLGLEELGIELDPK.G

1085.0802 2168.1458 2168.1477 -0.0019 0 51 0.00025 U R.RPFTQNLGLEELGIELDPK.G

848.7679 2543.2818 2543.2942 -0.0124 0 21 0.27 U R.LGADVTAVEFLGHVGGIGIDMEISK.N + Oxidation (M)

36 PRDX1 8,27 22323 77 gi|16923958 7,16 376.2006 750.3867 750.3912 -0.0045 1 15 4.5 U R.AEEFKK.L

831.4591 830.4519 830.4498 0.0021 0 25 0.47 R.SVDEILR.L

831.4591 830.4519 830.4498 0.0021 0 (15) 4.4 R.SVDEILR.L

444.7255 887.4364 887.4389 -0.0024 1 50 0.0013 K.SKEYFSK.Q

447.7201 893.4255 893.4243 0.0013 0 48 0.0016 U K.ADEGISFR.G

460.7576 919.5007 919.5015 -0.0008 0 47 0.0023 R.GLFIIDDK.G

477.2629 952.5112 952.5130 -0.0018 0 33 0.042 U K.IGHPAPSFK.A

554.3020 1106.5894 1106.5972 -0.0077 0 50 0.0012 U R.TIAQDYGVLK.A

590.7882 1179.5618 1179.5594 0.0024 0 56 0.00022 U K.ATAVMPDGQFK.D + Oxidation (M)

598.8184 1195.6222 1195.6237 -0.0015 0 35 0.025 R.LVQAFQFTDK.H

613.3470 1224.6794 1224.6826 -0.0032 0 (34) 0.028 U R.QITINDLPVGR.S

613.3470 1224.6794 1224.6826 -0.0032 0 44 0.0027 U R.QITINDLPVGR.S

680.4025 1358.7904 1358.7922 -0.0018 1 52 0.00035 U R.GLFIIDDKGILR.Q

811.9309 1621.8473 1621.8498 -0.0025 0 (62) 3.7e-005 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R

819.9282 1637.8419 1637.8447 -0.0028 0 (21) 0.51 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

819.9282 1637.8419 1637.8447 -0.0028 0 (15) 1.9 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

819.9329 1637.8512 1637.8447 0.0065 0 81 4.4e-007 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

819.9329 1637.8512 1637.8447 0.0065 0 (77) 1.3e-006 U K.QGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

883.9745 1765.9345 1765.9397 -0.0051 1 23 0.26 U K.KQGGLGPMNIPLVSDPK.R + Oxidation (M)

798.0522 2391.1348 2391.1641 -0.0293 0 53 0.00017 K.HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVNK.S

1196.5863 2391.1580 2391.1641 -0.0061 0 (2) 23 K.HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVNK.S

1196.5863 2391.1580 2391.1641 -0.0061 0 (2) 24 K.HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVNK.S



129

923.1147 2766.3222 2766.3370 -0.0148 0 21 0.22 U K.LNCQVIGASVDSHFCHLAWINTPK.K

38 ADH 8,52 40532 69 gi|202727 2,80 372.7165 743.4183 743.4177 0.0006 1 23 0.77 K.SKDAVPK.L

447.2195 892.4245 892.4259 -0.0014 0 47 0.0023 K.MVATGVCR.S

447.7402 893.4658 893.4681 -0.0022 0 39 0.013 K.LVADFMAK.K

455.2180 908.4214 908.4208 0.0006 0 (18) 1.7 K.MVATGVCR.S + Oxidation (M)

457.2520 912.4895 912.4916 -0.0022 0 (16) 2.1 K.IDAAAPLDK.V

457.2520 912.4895 912.4916 -0.0022 0 40 0.0085 K.IDAAAPLDK.V

545.7912 1089.5679 1089.5818 -0.0139 0 80 1.3e-006 K.INEAFDLLR.A

545.7912 1089.5679 1089.5818 -0.0139 0 (6) 32 K.INEAFDLLR.A

545.7912 1089.5679 1089.5818 -0.0139 0 (10) 11 K.INEAFDLLR.A

564.8306 1127.6466 1127.6550 -0.0084 1 55 0.0003 K.IIAVDINKDK.F

623.3352 1244.6558 1244.6587 -0.0030 0 48 0.0015 K.VIPLFSPQCGK.C

687.2961 1372.5777 1372.5864 -0.0087 0 (6) 10 K.HPESNLCCQTK.N

687.2984 1372.5822 1372.5864 -0.0042 0 75 1.5e-006 K.HPESNLCCQTK.N

594.0042 1778.9907 1778.9971 -0.0064 0 57 6.2e-005 K.FPLEPLITHVLPFEK.I

594.0049 1778.9930 1778.9971 -0.0041 0 (21) 0.25 K.FPLEPLITHVLPFEK.I

636.6996 1907.0770 1907.0920 -0.0151 1 (84) 8.8e-008 K.KFPLEPLITHVLPFEK.I

636.6998 1907.0776 1907.0920 -0.0144 1 (64) 9e-006 K.KFPLEPLITHVLPFEK.I




954.5480 1907.0815 1907.0920 -0.0105 1 98 3.5e-009 K.KFPLEPLITHVLPFEK.I



636.7017 1907.0834 1907.0920 -0.0087 1 (30) 0.019 K.KFPLEPLITHVLPFEK.I







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130


1037.5033 2072.9920 2073.0024 -0.0103 0 (146) 1.1e-013 K.VCLIGCGFSTGYGSAVQVAK.V

1037.5033 2072.9920 2073.0024 -0.0103 0 180 4.2e-017 K.VCLIGCGFSTGYGSAVQVAK.V

1037.5061 2072.9976 2073.0024 -0.0047 0 (50) 0.00044 K.VCLIGCGFSTGYGSAVQVAK.V

779.0695 2334.1868 2334.2076 -0.0209 0 (86) 9.2e-008 K.VTPGSTCAVFGLGGVGLSVVIGCK.T

1168.1031 2334.1916 2334.2076 -0.0160 0 136 8.1e-013 K.VTPGSTCAVFGLGGVGLSVVIGCK.T

829.7741 2486.3006 2486.3209 -0.0203 0 61 2.6e-005 K.AAVLWEPHKPFTIEDIEVAPPK.A

1244.1660 2486.3174 2486.3209 -0.0035 0 (13) 1.4 K.AAVLWEPHKPFTIEDIEVAPPK.A

954.4936 2860.4591 2860.4760 -0.0169 0 (17) 0.48 U R.GKPIHHFLSTSTFSQYTVVDDIAVAK.I

954.4945 2860.4616 2860.4760 -0.0144 0 81 2.2e-007 U R.GKPIHHFLSTSTFSQYTVVDDIAVAK.I

1368.3499 4102.0279 4102.0318 -0.0039 0 (23) 0.056 R.SDDHAVSGSLFTPLPAVLGHEGAGIVESIGEGVTCVKPGDK.V

1368.3499 4102.0279 4102.0318 -0.0039 0 24 0.042 R.SDDHAVSGSLFTPLPAVLGHEGAGIVESIGEGVTCVKPGDK.V

1419.7131 4256.1175 4256.1313 -0.0139 0 (5) 2.7 R.LDTMTSALLSCHSACGVSVIVGVPPSAQSLSVNPMSLLLGR.T + 2

Oxidation (M)


Oxidation (M)


Oxidation (M)

1419.7158 4256.1256 4256.1313 -0.0058 0 25 0.024 R.LDTMTSALLSCHSACGVSVIVGVPPSAQSLSVNPMSLLLGR.T + 2

Oxidation (M)

39 ALDOA 8,31 39691 60 gi|202837 2,06 462.7451 923.4756 923.4825 -0.0069 0 45 0.0032 K.ELADIAHR.I

464.2148 926.4150 926.4168 -0.0018 0 2 42 R.CQYVTEK.V

522.7861 1043.5576 1043.5611 -0.0035 0 46 0.0025 R.QLLLTADDR.V

671.8531 1341.6916 1341.7041 -0.0125 0 36 0.025 K.ADDGRPFPQVIK.S

823.9015 1645.7885 1645.8019 -0.0135 1 21 0.53 R.LQSIGTENTEENRR.F

549.6054 1645.7943 1645.8019 -0.0077 1 (2) 40 R.LQSIGTENTEENRR.F

549.6054 1645.7943 1645.8019 -0.0077 1 (0) 70 R.LQSIGTENTEENRR.F

826.9132 1651.8118 1651.8239 -0.0121 0 (100) 7.1e-009 K.FSNEEIAMATVTALR.R

834.9062 1667.7978 1667.8188 -0.0211 0 100 6.2e-009 K.FSNEEIAMATVTALR.R + Oxidation (M)

603.6506 1807.9299 1807.9443 -0.0145 0 44 0.0023 K.CPLLKPWALTFSYGR.A

904.9727 1807.9308 1807.9443 -0.0135 0 (25) 0.21 K.CPLLKPWALTFSYGR.A

696.6955 2087.0646 2087.0874 -0.0228 0 99 6.9e-009 R.VNPCIGGVILFHETLYQK.A

1044.5422 2087.0698 2087.0874 -0.0175 0 (35) 0.015 R.VNPCIGGVILFHETLYQK.A

697.7048 2090.0925 2090.1120 -0.0195 0 88 5.9e-008 U K.IGEHTPSSLAIVENANVLAR.Y

1046.0555 2090.0964 2090.1120 -0.0155 0 (1) 27 U K.IGEHTPSSLAIVENANVLAR.Y

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131

1046.0555 2090.0964 2090.1120 -0.0155 0 (1) 31 U K.IGEHTPSSLAIVENANVLAR.Y

1129.5122 2257.0098 2257.0287 -0.0189 0 115 1.1e-010 K.YTPSGQSGAAASESLFISNHAY.-

1136.5637 2271.1128 2271.1343 -0.0214 0 85 1.5e-007 K.GVVPLAGTNGETTTQGLDGLSER.C

1013.8507 3038.5303 3038.5560 -0.0258 0 91 1.8e-008 R.TVPPAVPGVTFLSGGQSEEEASINLNAINK.C

1013.8512 3038.5318 3038.5560 -0.0243 0 (80) 2.5e-007 R.TVPPAVPGVTFLSGGQSEEEASINLNAINK.C



1013.8528 3038.5366 3038.5560 -0.0195 0 (30) 0.022 R.TVPPAVPGVTFLSGGQSEEEASINLNAINK.C

1059.5349 3175.5829 3175.5972 -0.0143 1 61 1.9e-005 R.YASICQQNGIVPIVEPEILPDGDHDLKR.C

41 GAPDH 8,14 36090 62 gi|8393418 4,31 391.2005 780.3865 780.4017 -0.0153 1 18 2 K.YDDIKK.V

406.2096 810.4046 810.4058 -0.0012 0 33 0.039 K.LTGMAFR.V + Oxidation (M)

407.2270 812.4394 812.4392 0.0002 0 51 0.00076 K.QAAEGPLK.G

614.3069 1226.5992 1226.6039 -0.0047 0 78 1.4e-006 R.VVDLMAYMASK.E

622.3042 1242.5939 1242.5988 -0.0049 0 (69) 9.9e-006 R.VVDLMAYMASK.E + Oxidation (M)

622.3084 1242.6022 1242.5988 0.0034 0 (62) 4.8e-005 R.VVDLMAYMASK.E + Oxidation (M)

622.3084 1242.6022 1242.5988 0.0034 0 (77) 1.5e-006 R.VVDLMAYMASK.E + Oxidation (M)

630.3043 1258.5939 1258.5937 0.0002 0 (43) 0.0037 R.VVDLMAYMASK.E + 2 Oxidation (M)

678.8300 1355.6454 1355.6465 -0.0011 1 (26) 0.2 R.VVDLMAYMASKE.-

685.3564 1368.6982 1368.7361 -0.0379 0 75 2.5e-006 R.GAAQNIIPASTGAAK.A

694.8259 1387.6373 1387.6363 0.0009 1 58 0.0001 R.VVDLMAYMASKE.- + 2 Oxidation (M)

778.8924 1555.7702 1555.8029 -0.0326 0 (36) 0.017 R.VPTPNVSVVDLTCR.L

778.8924 1555.7702 1555.8029 -0.0326 0 (45) 0.0027 R.VPTPNVSVVDLTCR.L

778.9049 1555.7952 1555.8029 -0.0077 0 84 2.8e-007 R.VPTPNVSVVDLTCR.L

778.9075 1555.8004 1555.8029 -0.0025 0 (73) 3.6e-006 R.VPTPNVSVVDLTCR.L

890.3998 1778.7851 1778.7900 -0.0049 0 71 3.6e-006 K.LISWYDNEYGYSNR.V

738.3636 2212.0690 2212.1020 -0.0330 0 97 8.8e-009 R.VIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y

1107.0531 2212.0916 2212.1020 -0.0104 0 (29) 0.069 R.VIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y

743.6953 2228.0640 2228.0970 -0.0330 0 (81) 3.2e-007 R.VIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y + Oxidation (M)

749.0348 2244.0825 2244.0919 -0.0094 0 (47) 0.0009 R.VIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y + 2 Oxidation (M)

1123.0528 2244.0910 2244.0919 -0.0008 0 (6) 11 R.VIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y + 2 Oxidation (M)

1139.0201 2276.0256 2276.0307 -0.0051 0 104 1.1e-009 U K.WGDAGAEYVVESTGVFTTMEK.A

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132

795.7347 2384.1824 2384.1981 -0.0157 1 21 0.3 K.RVIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y + Oxidation (M)

801.0709 2400.1908 2400.1930 -0.0022 1 (1) 27 K.RVIISAPSADAPMFVMGVNHEK.Y + 2 Oxidation (M)

865.7849 2594.3327 2594.3527 -0.0200 0 (117) 6.6e-011 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T


865.7849 2594.3330 2594.3527 -0.0197 0 (9) 4.5 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T


865.7882 2594.3428 2594.3527 -0.0098 0 (40) 0.0032 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T

871.1054 2610.2942 2610.3476 -0.0534 0 152 2.4e-014 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T + Oxidation (M)

871.1162 2610.3267 2610.3476 -0.0209 0 (126) 8.3e-012 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T + Oxidation (M)

871.1170 2610.3292 2610.3476 -0.0184 0 (100) 3.6e-009 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T + Oxidation (M)

871.1198 2610.3375 2610.3476 -0.0101 0 (22) 0.19 K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T + Oxidation (M)

1108.8552 3323.5438 3323.5519 -0.0081 0 (12) 1 K.VDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGK.F + Oxidation (M)

1114.1878 3339.5416 3339.5468 -0.0052 0 (39) 0.0019 K.VDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGK.F + 2 Oxidation (M)

1114.1878 3339.5416 3339.5468 -0.0052 0 54 5.2e-005 K.VDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGK.F + 2 Oxidation (M)

1350.6143 4048.8211 4048.8385 -0.0175 0 (44) 0.00029 K.GILGYTEDQVVSCDFNSNSHSSTFDAGAGIALNDNFVK.L

1350.6150 4048.8232 4048.8385 -0.0154 0 (91) 6.9e-009 K.GILGYTEDQVVSCDFNSNSHSSTFDAGAGIALNDNFVK.L



1350.6159 4048.8259 4048.8385 -0.0127 0 127 1.4e-012 K.GILGYTEDQVVSCDFNSNSHSSTFDAGAGIALNDNFVK.L



42 ANXA2 7,55 38939 75 gi|9845234 6,08 364.2568 726.4990 726.5003 -0.0013 0 (37) 0.0096 U K.LLVALAK.G

364.2568 726.4990 726.5003 -0.0013 0 52 0.00035 U K.LLVALAK.G

372.7158 743.4171 743.4178 -0.0006 1 22 0.92 U R.KGTDVPK.W

386.6806 771.3467 771.3473 -0.0006 0 25 0.27 U R.LYDSMK.G + Oxidation (M)

411.2080 820.4014 820.4000 0.0014 0 (6) 34 U R.SEVDMLK.I

419.2046 836.3947 836.3950 -0.0003 0 24 0.45 U R.SEVDMLK.I + Oxidation (M)

436.2246 870.4345 870.4382 -0.0036 0 21 0.87 U R.SVCHLQK.V

488.7477 975.4809 975.4735 0.0074 1 14 5.2 U R.VYKEMYK.T + Oxidation (M)

488.7477 975.4809 975.4735 0.0074 1 (3) 59 U R.VYKEMYK.T + Oxidation (M)

525.7803 1049.5460 1049.5505 -0.0046 1 31 0.096 U R.ELYDAGVKR.K

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133

526.2664 1050.5183 1050.5168 0.0015 0 22 0.63 U K.WISIMTER.S + Oxidation (M)

544.3036 1086.5927 1086.5921 0.0006 0 53 0.00059 U R.DALNIETAIK.T

544.3036 1086.5927 1086.5921 0.0006 0 (39) 0.015 U R.DALNIETAIK.T

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556.2791 1110.5436 1110.5458 -0.0022 0 (54) 0.00031 U R.QDIAFAYQR.R

611.7996 1221.5846 1221.5877 -0.0031 0 (55) 0.00027 U K.TPAQYDASELK.A

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611.8002 1221.5859 1221.5877 -0.0018 0 73 4.6e-006 U K.TPAQYDASELK.A

622.8040 1243.5934 1243.6156 -0.0222 0 64 3.5e-005 U R.TNQELQEINR.V

622.8144 1243.6143 1243.6156 -0.0014 0 (26) 0.21 U R.TNQELQEINR.V

684.3417 1366.6689 1366.6729 -0.0040 1 42 0.0049 U K.DIISDTSGEFRK.L

703.3467 1404.6788 1404.6925 -0.0137 0 (54) 0.00032 U K.SLYYFIQQDTK.G

703.3508 1404.6870 1404.6925 -0.0055 0 63 4.1e-005 U K.SLYYFIQQDTK.G

730.8267 1459.6389 1459.6653 -0.0263 0 (24) 0.21 U K.SYSPYDMLESIR.K

730.8267 1459.6389 1459.6653 -0.0263 0 62 3e-005 U K.SYSPYDMLESIR.K

730.8383 1459.6620 1459.6653 -0.0033 0 (41) 0.0052 U K.SYSPYDMLESIR.K

738.8346 1475.6546 1475.6602 -0.0056 0 (24) 0.24 U K.SYSPYDMLESIR.K + Oxidation (M)

771.9227 1541.8309 1541.8413 -0.0104 0 110 5.9e-010 U K.GVDEVTIVNILTNR.S

771.9230 1541.8314 1541.8413 -0.0099 0 (75) 2.3e-006 U K.GVDEVTIVNILTNR.S

771.9257 1541.8368 1541.8413 -0.0046 0 (54) 0.00025 U K.GVDEVTIVNILTNR.S

834.9610 1667.9075 1667.9280 -0.0205 0 (104) 2e-009 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T

556.9800 1667.9180 1667.9280 -0.0100 0 (68) 6.7e-006 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T

834.9669 1667.9192 1667.9280 -0.0088 0 (124) 1.6e-011 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T

834.9669 1667.9192 1667.9280 -0.0088 0 126 1e-011 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T

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834.9680 1667.9215 1667.9280 -0.0065 0 (44) 0.0017 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T

842.9589 1683.9033 1683.9229 -0.0196 0 (85) 1.8e-007 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T + Oxidation (M)

562.3127 1683.9164 1683.9229 -0.0066 0 (57) 0.0001 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T + Oxidation (M)


842.9660 1683.9175 1683.9229 -0.0054 0 (3) 26 U K.SALSGHLETVMLGLLK.T + Oxidation (M)



134

886.4948 1770.9750 1770.9840 -0.0089 1 126 1.1e-011 U K.TKGVDEVTIVNILTNR.S

591.3344 1770.9813 1770.9840 -0.0027 1 (58) 6.9e-005 U K.TKGVDEVTIVNILTNR.S

889.4324 1776.8503 1776.8564 -0.0060 0 (79) 8e-007 U K.GLGTDEDSLIEIICSR.T

889.4324 1776.8503 1776.8564 -0.0060 0 (18) 0.81 U K.GLGTDEDSLIEIICSR.T

889.4330 1776.8515 1776.8564 -0.0048 0 110 6.3e-010 U K.GLGTDEDSLIEIICSR.T

889.4330 1776.8515 1776.8564 -0.0048 0 (83) 2.6e-007 U K.GLGTDEDSLIEIICSR.T



913.4381 1824.8616 1824.8741 -0.0125 1 70 4.5e-006 U K.TDLEKDIISDTSGEFR.K

609.2995 1824.8768 1824.8741 0.0027 1 (7) 11 U K.TDLEKDIISDTSGEFR.K

609.2995 1824.8768 1824.8741 0.0027 1 (7) 11 U K.TDLEKDIISDTSGEFR.K

954.9329 1907.8512 1907.8748 -0.0237 0 114 1.2e-010 U R.AEDGSVIDYELIDQDAR.E

954.9329 1907.8512 1907.8748 -0.0237 0 (16) 0.88 U R.AEDGSVIDYELIDQDAR.E

954.9329 1907.8512 1907.8748 -0.0237 0 (21) 0.25 U R.AEDGSVIDYELIDQDAR.E

946.7966 2837.3679 2837.4170 -0.0492 0 (63) 1.4e-005 U K.GDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L

946.7966 2837.3679 2837.4170 -0.0492 0 88 4.1e-008 U K.GDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L

946.7966 2837.3679 2837.4170 -0.0492 0 (47) 0.00051 U K.GDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L



1419.7116 2837.4086 2837.4170 -0.0084 0 (55) 8.5e-005 U K.GDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L

980.1291 2937.3656 2937.3781 -0.0124 0 34 0.0085 U K.LSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAER.D

1065.5442 3193.6108 3193.6230 -0.0122 1 (36) 0.0044 U K.EVKGDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L

1065.5442 3193.6108 3193.6230 -0.0122 1 105 5.6e-010 U K.EVKGDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L

1065.5442 3193.6108 3193.6230 -0.0122 1 (27) 0.038 U K.EVKGDLENAFLNLVQCIQNKPLYFADR.L

43 VDAC2 7,44 32353 51 gi|13786202 1,93 409.1988 816.3831 816.3878 -0.0047 0 46 0.0037 U K.SFNAGGHK.L

417.7309 833.4472 833.4494 -0.0022 0 49 0.002 U K.VSGTLETK.Y

457.2275 912.4405 912.4454 -0.0048 0 25 0.26 U R.SNFAVGYR.T

508.8012 1015.5878 1015.5914 -0.0036 0 58 0.00015 U K.LTLSALVDGK.S

508.8022 1015.5899 1015.5914 -0.0015 0 (24) 0.38 U K.LTLSALVDGK.S

508.8022 1015.5899 1015.5914 -0.0015 0 (40) 0.011 U K.LTLSALVDGK.S

647.3336 1292.6527 1292.6612 -0.0085 0 (20) 0.81 U K.YQLDPTASISAK.V

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135



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714.8458 1427.6771 1427.6933 -0.0162 0 98 1.1e-008 U K.LTFDTTFSPNTGK.K

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714.8547 1427.6948 1427.6933 0.0015 0 (87) 1.6e-007 U K.LTFDTTFSPNTGK.K

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954.3980 1906.7815 1906.7851 -0.0036 0 (3) 5.7 U K.SCSGVEFSTSGSSNTDTGK.V

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701.7186 2102.1341 2102.1484 -0.0143 0 73 1.7e-006 U K.VNNSSLIGVGYTQTLRPGVK.L

1217.0223 2432.0300 2432.0373 -0.0073 0 66 3.2e-006 U K.VCEDFDTSVNLAWTSGTNCTR.F

1260.1061 2518.1976 2518.2010 -0.0033 0 35 0.011 U K.WNTDNTLGTEIAIEDQICQGLK.L

44 SOD 8,96 24887 42 gi|8394331 0,88 415.1902 828.3658 828.3654 0.0004 0 28 0.13 U R.DFGSFEK.F

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502.7751 1003.5356 1003.5451 -0.0094 0 33 0.053 U K.NVRPDYLK.A

514.8078 1027.6011 1027.6026 -0.0014 1 31 0.069 U K.GELLEAIKR.D

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720.8957 1439.7768 1439.7984 -0.0216 0 108 1.1e-009 U K.GDVTTQVALQPALK.F

720.9030 1439.7915 1439.7984 -0.0069 0 (74) 2.3e-006 U K.GDVTTQVALQPALK.F

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864.9261 1727.8376 1727.8743 -0.0367 0 85 1.8e-007 U K.AIWNVINWENVSQR.Y




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590.2908 1767.8504 1767.8540 -0.0036 0 (41) 0.0045 U K.HHATYVNNLNVTEEK.Y

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136

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45 TPM5 4,72 29158 51 gi|9653293 1,37 388.1993 774.3840 774.3871 -0.0032 0 51 0.0013 R.AELAESR.C

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447.7344 893.4542 893.4606 -0.0065 1 (34) 0.047 R.KYEEVAR.K

447.7353 893.4561 893.4606 -0.0045 1 36 0.026 R.KYEEVAR.K

470.7254 939.4363 939.4410 -0.0047 0 22 0.59 K.HIAEEADR.K

534.7739 1067.5332 1067.5359 -0.0027 1 6 22 K.HIAEEADRK.Y

536.7418 1071.4690 1071.4767 -0.0077 0 51 0.00051 K.EEHLCTQR.M

536.7441 1071.4736 1071.4767 -0.0032 0 (15) 2.7 K.EEHLCTQR.M

566.3029 1130.5913 1130.6005 -0.0092 0 41 0.0073 K.MELQEIQLK.E

595.3139 1188.6133 1188.6238 -0.0105 1 34 0.043 K.TIDDLEDKLK.C

622.3268 1242.6390 1242.6456 -0.0066 0 50 0.001 R.IQLVEEELDR.A

642.8757 1283.7368 1283.7449 -0.0081 1 70 5.5e-006 R.KLVIIEGDLER.T

658.8166 1315.6186 1315.6368 -0.0182 0 63 4.1e-005 U R.EQAEAEVASLNR.R

700.3756 1398.7367 1398.7467 -0.0099 1 0 70 R.RIQLVEEELDR.A

718.3401 1434.6656 1434.6734 -0.0078 0 22 0.43 R.MLDQTLLDLNEM.-

731.3295 1460.6444 1460.6500 -0.0056 1 (3) 22 K.CTKEEHLCTQR.M

731.3295 1460.6444 1460.6500 -0.0056 1 46 0.0012 K.CTKEEHLCTQR.M

821.8998 1641.7851 1641.7958 -0.0107 0 31 0.053 U K.IQVLQQQADDAEER.A

885.9455 1769.8765 1769.8908 -0.0143 1 (14) 2.7 U R.KIQVLQQQADDAEER.A

885.9455 1769.8765 1769.8908 -0.0143 1 16 1.6 U R.KIQVLQQQADDAEER.A

50 IGG2A 8,15 52243 30 gi|1220486 1,66 536.2912 1070.5678 1070.5720 -0.0042 0 (3) 53 U K.SISKPEGTPR.G

536.2912 1070.5678 1070.5720 -0.0042 0 22 0.66 U K.SISKPEGTPR.G

536.2912 1070.5678 1070.5720 -0.0042 0 (14) 4 U K.SISKPEGTPR.G

594.8048 1187.5950 1187.6009 -0.0059 0 23 0.5 U R.GPQVYTMAPPK.E

604.7661 1207.5177 1207.5291 -0.0114 0 36 0.015 U K.MNGQPQENYK.N

654.8328 1307.6510 1307.6577 -0.0068 0 (53) 0.00047 U K.SNSMVTLGCLVK.G


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137

662.8310 1323.6474 1323.6527 -0.0053 0 60 7.9e-005 U K.SNSMVTLGCLVK.G + Oxidation (M)

665.3979 1328.7813 1328.7915 -0.0102 1 78 8.2e-007 U K.TKDVLTITLTPK.V

758.3563 1514.6981 1514.7082 -0.0101 0 57 0.00013 U K.GFYPPDIYTEWK.M

758.3563 1514.6981 1514.7082 -0.0101 0 (27) 0.12 U K.GFYPPDIYTEWK.M

758.3596 1514.7045 1514.7082 -0.0036 0 (38) 0.0093 U K.GFYPPDIYTEWK.M

915.4479 1828.8813 1828.8989 -0.0176 0 115 1.9e-010 U K.VTCVVVDISQNDPEVR.F

915.4479 1828.8813 1828.8989 -0.0176 0 (14) 2.4 U K.VTCVVVDISQNDPEVR.F

968.9272 1935.8399 1935.8560 -0.0161 0 87 5.2e-008 U K.NTPPTMDTDGSYFLYSK.L

976.9283 1951.8421 1951.8510 -0.0089 0 (9) 3.6 U K.NTPPTMDTDGSYFLYSK.L + Oxidation (M)

786.3709 2356.0910 2356.1124 -0.0215 0 69 3.7e-006 U R.FSWFIDDVEVHTAQTHAPEK.Q

1186.5161 2371.0176 2371.0283 -0.0107 0 (109) 2e-010 U R.ECNPCGCTGSEVSSVFIFPPK.T

1186.5168 2371.0190 2371.0283 -0.0093 0 (89) 1.8e-008 U R.ECNPCGCTGSEVSSVFIFPPK.T

1186.5168 2371.0190 2371.0283 -0.0093 0 129 2.1e-012 U R.ECNPCGCTGSEVSSVFIFPPK.T


1186.5180 2371.0214 2371.0283 -0.0069 0 (46) 0.00043 U R.ECNPCGCTGSEVSSVFIFPPK.T







54 GAPDH 8,43 36098 21 gi|56188 0,3 455.2450 908.4755 908.5192 -0.0436 1 (28) 0.16 U K.AGAHLKGGAK.R

455.2450 908.4755 908.5192 -0.0436 1 54 0.00041 U K.AGAHLKGGAK.R

890.3974 1778.7802 1778.7900 -0.0098 0 23 0.19 U K.LISWYDNEYGYSNR.V

910.4499 1818.8853 1818.8968 -0.0115 0 51 0.00048 U K.IVSNASCTTNCLAPLAK.V

865.7851 2594.3335 2594.3527 -0.0191 0 (15) 1 U K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T

871.1190 2610.3352 2610.3476 -0.0124 0 44 0.0012 U K.VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK.T + Oxidation (M)

55 ENO1 6,7 51736 23 gi|38649320 0,36 405.7256 809.4366 809.4395 -0.0029 0 12 5.1 K.AVEHINK.T

452.7328 903.4511 903.4549 -0.0037 0 19 1.6 U R.IEEELGSK.A

504.2531 1006.4916 1006.4940 -0.0023 0 19 1.4 U K.SCNCLLLK.V

703.8609 1405.7073 1405.7089 -0.0016 0 58 0.00014 U R.GNPTVEVDLYTAK.G

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138

817.4066 1632.7986 1632.8141 -0.0155 0 104 2.7e-009 U K.VNQIGSVTESLQACK.L

817.4066 1632.7986 1632.8141 -0.0155 0 (16) 1.7 U K.VNQIGSVTESLQACK.L



902.9590 1803.9034 1803.9366 -0.0332 0 (44) 0.0027 R.AAVPSGASTGIYEALELR.D

902.9590 1803.9034 1803.9366 -0.0332 0 107 1.1e-009 R.AAVPSGASTGIYEALELR.D

902.9736 1803.9326 1803.9366 -0.0041 0 (2) 32 R.AAVPSGASTGIYEALELR.D

980.9535 1959.8925 1959.9174 -0.0249 0 (26) 0.092 U K.DATNVGDEGGFAPNILENK.E

980.9535 1959.8925 1959.9174 -0.0249 0 117 8.5e-011 U K.DATNVGDEGGFAPNILENK.E

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980.9627 1959.9109 1959.9174 -0.0065 0 (29) 0.06 U K.DATNVGDEGGFAPNILENK.E

1177.0784 2352.1422 2352.1519 -0.0097 0 (0) 39 R.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIK.T

1177.0784 2352.1422 2352.1519 -0.0097 0 (1) 30 R.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIK.T

1177.0786 2352.1426 2352.1519 -0.0093 0 158 6.4e-015 R.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIK.T

57 MCPT1 6,55 27603 68 gi|8393764 2,92 452.7229 903.4313 903.4298 0.0015 0 62 8.2e-005 U K.DPTSDTLR.E

476.7459 951.4772 951.4774 -0.0001 1 23 0.5 U K.REYTQQK.I

476.7459 951.4772 951.4774 -0.0001 1 (20) 1.1 U K.REYTQQK.I

563.2695 1124.5245 1124.5285 -0.0040 0 61 6.2e-005 U K.DSCGGFLITR.Q

601.7977 1201.5809 1201.6026 -0.0217 0 70 9.1e-006 U R.QFVLTAAHCR.G

645.3394 1288.6642 1288.6623 0.0019 1 43 0.0051 U R.TGVKDPTSDTLR.E

771.4398 1540.8649 1540.8766 -0.0116 0 (54) 0.00017 U R.IAPYVPWINTVLR.E

771.4425 1540.8704 1540.8766 -0.0062 0 62 2.7e-005 U R.IAPYVPWINTVLR.E

771.4425 1540.8704 1540.8766 -0.0062 0 (60) 4.7e-005 U R.IAPYVPWINTVLR.E

528.2871 1581.8395 1581.8475 -0.0079 1 40 0.0055 U R.GREITVTLGAHDVSK.R

905.4159 1808.8173 1808.8264 -0.0091 0 38 0.0059 U R.HYDNNFQVCVGLSTR.L

922.9821 1843.9496 1843.9654 -0.0158 0 (32) 0.042 U K.NYNFLPNLHDIMLLK.L




922.9896 1843.9647 1843.9654 -0.0007 0 69 6.6e-006 U K.NYNFLPNLHDIMLLK.L

930.9823 1859.9500 1859.9604 -0.0103 0 (37) 0.013 U K.NYNFLPNLHDIMLLK.L + Oxidation (M)

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139

620.9913 1859.9520 1859.9604 -0.0084 0 (43) 0.0031 U K.NYNFLPNLHDIMLLK.L + Oxidation (M)

1201.5993 3601.7761 3601.8028 -0.0268 0 (76) 5e-007 U K.QVELTPAVDVVPLPSPSDFIHPGTLCWTAGWGR.T

1201.5993 3601.7761 3601.8028 -0.0268 0 92 1.2e-008 U K.QVELTPAVDVVPLPSPSDFIHPGTLCWTAGWGR.T

1201.6038 3601.7896 3601.8028 -0.0133 0 (2) 12 U K.QVELTPAVDVVPLPSPSDFIHPGTLCWTAGWGR.T

1201.6038 3601.7896 3601.8028 -0.0133 0 (6) 4.7 U K.QVELTPAVDVVPLPSPSDFIHPGTLCWTAGWGR.T

1201.6047 3601.7923 3601.8028 -0.0106 0 (32) 0.01 U K.QVELTPAVDVVPLPSPSDFIHPGTLCWTAGWGR.T

1294.6430 3880.9072 3880.9207 -0.0135 0 124 4.6e-012 U R.LQTAYTGDSGGPLLCAGVVHGIVSYGHPDATPPAVFTR.I

60 DPP7 4,87 55649 22 gi|14010871 0,33 584.3106 1166.6067 1166.6084 -0.0017 0 (11) 6.4 U K.DLTQLFGFAR.N

584.3106 1166.6067 1166.6084 -0.0017 0 29 0.097 U K.DLTQLFGFAR.N

1130.0544 2258.0942 2258.1080 -0.0137 0 46 0.00094 U K.AASNIIFSNGDLDPWAGGGIQR.N

926.4395 2776.2966 2776.3014 -0.0048 0 58 4.8e-005 U K.DLFLQGAYDTISQNFGTCQSLSSPK.D

1389.1619 2776.3092 2776.3014 0.0078 0 (51) 0.00024 U K.DLFLQGAYDTISQNFGTCQSLSSPK.D

1389.1619 2776.3092 2776.3014 0.0078 0 (7) 5.5 U K.DLFLQGAYDTISQNFGTCQSLSSPK.D

974.8522 2921.5349 2921.5552 -0.0203 0 58 3.5e-005 U K.YPHLVAGALAASAPVIAVAGLGNPDQFFR.D

974.8522 2921.5349 2921.5552 -0.0203 0 (47) 0.00045 U K.YPHLVAGALAASAPVIAVAGLGNPDQFFR.D

994.4981 2980.4725 2980.4867 -0.0142 0 1 19 U R.NAFTVLAMMDYPYPTNFLGPLPANPVK.V

TRA1 5,02 74390 23 gi|51858886 0,47 377.2113 752.4080 752.4068 0.0012 1 35 0.034 U K.KSDYIK.L

541.2767 1080.5389 1080.5352 0.0037 0 (2) 59 U K.FAFQAEVNR.M

541.2767 1080.5389 1080.5352 0.0037 0 17 1.8 U K.FAFQAEVNR.M

594.3420 1186.6694 1186.6710 -0.0016 0 60 7.3e-005 U K.SILFVPTSAPR.G

743.3757 1484.7368 1484.7471 -0.0103 0 75 2.6e-006 U K.GVVDSDDLPLNVSR.E

893.4493 1784.8841 1784.8904 -0.0063 0 18 1 U R.EEEAIQLDGLNASQIR.E

939.9692 1877.9238 1877.9352 -0.0114 0 58 9.4e-005 U K.YSQFINFPIYVWSSK.T

1015.5318 2029.0490 2029.0579 -0.0088 0 21 0.32 U R.LISLTDENALAGNEELTVK.I

848.0983 2541.2730 2541.2838 -0.0108 0 10 3.3 U K.TVWDWELMNDIKPIWQRPSK.E

910.1118 2727.3136 2727.3311 -0.0175 1 18 0.42 U R.TDDEVVQREEEAIQLDGLNASQIR.E

1109.1886 3324.5440 3324.5497 -0.0057 0 41 0.0014 U K.MTEAQEDGQSTSELIGQFGVGFYSAFLVADK.V

61 LUM 6 38654 21 gi|13591983 0,51 613.2940 1224.5734 1224.5735 -0.0000 0 52 0.00052 U R.NNQIDHIDEK.A

613.2940 1224.5734 1224.5735 -0.0000 0 (23) 0.39 U R.NNQIDHIDEK.A

691.3438 1380.6729 1380.6674 0.0056 0 57 0.00017 U K.ITNIPDEYFNR.F

837.9032 1673.7919 1673.7970 -0.0052 0 66 1.5e-005 U K.SLEYLDLSFNQMSK.L

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140

845.8993 1689.7841 1689.7920 -0.0079 0 (1) 52 U K.SLEYLDLSFNQMSK.L + Oxidation (M)

972.0414 1942.0682 1942.0775 -0.0093 0 77 7.7e-007 U K.LPAGLPTSLLTLYLDNNK.I

972.0414 1942.0683 1942.0775 -0.0092 0 (7) 7.6 U K.LPAGLPTSLLTLYLDNNK.I




1153.5395 2305.0644 2305.0719 -0.0074 0 (2) 23 U R.LDGNPLTQSSLPPDMYECLR.V

1153.5428 2305.0710 2305.0719 -0.0008 0 35 0.012 U R.LDGNPLTQSSLPPDMYECLR.V

1153.5428 2305.0710 2305.0719 -0.0008 0 (18) 0.6 U R.LDGNPLTQSSLPPDMYECLR.V

RBBP4 4,74 47911 30 gi|5032027 0,30 387.6975 773.3804 773.3820 -0.0016 0 22 0.99 U K.DFSIHR.L

447.7344 893.4543 893.4494 0.0049 0 (5) 31 U R.VINEEYK.I

447.7344 893.4543 893.4494 0.0049 0 9 13 U R.VINEEYK.I

487.2765 972.5384 972.5393 -0.0008 0 (8) 19 U K.TVALWDLR.N

487.2765 972.5384 972.5393 -0.0008 0 18 1.8 U K.TVALWDLR.N

534.2635 1066.5125 1066.5155 -0.0031 0 48 0.0013 U K.INHEGEVNR.A

564.7704 1127.5262 1127.5248 0.0014 0 14 3.2 U K.GEFGGFGSVSGK.I

736.3668 1470.7191 1470.7242 -0.0051 0 81 5.4e-007 U K.TPSSDVLVFDYTK.H

903.4134 1804.8122 1804.8162 -0.0040 0 (11) 3.3 U K.HPSKPDPSGECNPDLR.L

903.4134 1804.8122 1804.8162 -0.0040 0 (18) 0.7 U K.HPSKPDPSGECNPDLR.L

602.6128 1804.8165 1804.8162 0.0002 0 79 5.2e-007 U K.HPSKPDPSGECNPDLR.L

958.4527 2872.3363 2872.3515 -0.0152 0 24 0.078 U K.IGEEQSPEDAEDGPPELLFIHGGHTAK.I

1275.9778 3824.9116 3824.9236 -0.0120 0 2 11 U K.NTPFLYDLVMTHALEWPSLTAQWLPDVTRPEGK.D

63 YWHAE 4,63 29326 58 gi|5803225 1,93 453.7169 905.4192 905.4178 0.0014 1 (22) 0.7 U K.MKGDYHR.Y

453.7169 905.4192 905.4178 0.0014 1 (20) 1.2 U K.MKGDYHR.Y

454.2636 906.5126 906.5174 -0.0049 0 48 0.0016 U R.NLLSVAYK.N

459.2676 916.5207 916.5229 -0.0023 0 27 0.28 U R.IISSIEQK.E

459.2676 916.5207 916.5229 -0.0023 0 (5) 46 U R.IISSIEQK.E

461.7091 921.4037 921.4127 -0.0090 1 26 0.23 U K.MKGDYHR.Y + Oxidation (M)

461.7091 921.4037 921.4127 -0.0090 1 (25) 0.26 U K.MKGDYHR.Y + Oxidation (M)

489.2509 976.4872 976.4899 -0.0027 0 11 9.9 U R.QMVETELK.L

595.3293 1188.6440 1188.6536 -0.0096 0 (61) 7.3e-005 U K.DSTLIMQLLR.D

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141

595.3296 1188.6446 1188.6536 -0.0090 0 (20) 1.1 U K.DSTLIMQLLR.D

595.3296 1188.6446 1188.6536 -0.0090 0 (57) 0.00019 U K.DSTLIMQLLR.D

595.3312 1188.6478 1188.6536 -0.0059 0 (30) 0.11 U K.DSTLIMQLLR.D

595.3312 1188.6478 1188.6536 -0.0059 0 (27) 0.21 U K.DSTLIMQLLR.D

603.3304 1204.6463 1204.6485 -0.0023 0 79 1.3e-006 U K.DSTLIMQLLR.D + Oxidation (M)

603.3309 1204.6473 1204.6485 -0.0012 0 (57) 0.00018 U K.DSTLIMQLLR.D + Oxidation (M)

603.3309 1204.6473 1204.6485 -0.0012 0 (51) 0.00076 U K.DSTLIMQLLR.D + Oxidation (M)

619.3262 1236.6378 1236.6462 -0.0085 0 73 4e-006 U K.HLIPAANTGESK.V

692.8375 1383.6605 1383.6783 -0.0177 1 15 2.5 U R.YLAEFATGNDRK.E

709.3769 1416.7392 1416.7460 -0.0067 1 32 0.055 U R.IISSIEQKEENK.G

724.3541 1446.6935 1446.7024 -0.0089 0 70 7.3e-006 U K.VAGMDVELTVEER.N

738.8568 1475.6990 1475.7364 -0.0374 0 (87) 1.6e-007 U K.LICCDILDVLDK.H

738.8568 1475.6990 1475.7364 -0.0374 0 (28) 0.12 U K.LICCDILDVLDK.H



738.8727 1475.7309 1475.7364 -0.0055 0 95 2.7e-008 U K.LICCDILDVLDK.H




910.4619 1818.9091 1818.9298 -0.0206 0 87 1.3e-007 U K.AASDIAMTELPPTHPIR.L

607.3137 1818.9191 1818.9298 -0.0107 0 (37) 0.013 U K.AASDIAMTELPPTHPIR.L


910.4671 1818.9197 1818.9298 -0.0100 0 (83) 3.2e-007 U K.AASDIAMTELPPTHPIR.L



1044.4782 2086.9418 2086.9582 -0.0164 0 (61) 2.9e-005 U K.AAFDDAIAELDTLSEESYK.D

1044.4782 2086.9418 2086.9582 -0.0164 0 (10) 3.8 U K.AAFDDAIAELDTLSEESYK.D

1044.4782 2086.9418 2086.9582 -0.0164 0 (30) 0.04 U K.AAFDDAIAELDTLSEESYK.D



1044.4812 2086.9478 2086.9582 -0.0104 0 132 2.3e-012 U K.AAFDDAIAELDTLSEESYK.D


142

1090.9677 2179.9208 2179.9328 -0.0119 0 (9) 2 U R.DNLTLWTSDMQGDGEEQNK.E

1090.9677 2179.9208 2179.9328 -0.0119 0 11 1.3 U R.DNLTLWTSDMQGDGEEQNK.E

899.1254 2694.3542 2694.3721 -0.0178 1 35 0.01 U K.LICCDILDVLDKHLIPAANTGESK.V

70 MYL 4,67 19940 66 gi|71037403 3,09 400.7271 799.4397 799.4439 -0.0043 1 (21) 0.87 U R.EAPIDKK.G

400.7271 799.4397 799.4439 -0.0043 1 26 0.3 U R.EAPIDKK.G

518.2604 1034.5062 1034.5066 -0.0004 0 46 0.0025 U R.ELLTTMGDR.F

614.8114 1227.6082 1227.6095 -0.0013 0 58 0.00014 U K.LNGTDPEDVIR.N

619.2841 1236.5537 1236.5557 -0.0020 0 (57) 0.00012 U K.EAFNMIDQNR.D

619.2854 1236.5563 1236.5557 0.0006 0 (26) 0.16 U K.EAFNMIDQNR.D

619.2854 1236.5563 1236.5557 0.0006 0 (6) 17 U K.EAFNMIDQNR.D

627.2826 1252.5506 1252.5506 0.0000 0 58 9.7e-005 U K.EAFNMIDQNR.D + Oxidation (M)

630.8025 1259.5904 1259.5935 -0.0031 0 32 0.048 U K.GNFNYIEFTR.I

708.3180 1414.6214 1414.6252 -0.0038 0 72 2.7e-006 U R.FTDEEVDELYR.E

708.3182 1414.6218 1414.6252 -0.0034 0 (45) 0.0014 U R.FTDEEVDELYR.E

679.9789 2036.9149 2036.9183 -0.0034 1 5 12 U R.DGFIDKEDLHDMLASMGK.N + Oxidation (M)

1045.9845 2089.9544 2089.9779 -0.0234 0 93 2e-008 U R.ATSNVFAMFDQSQIQEFK.E

1045.9943 2089.9740 2089.9779 -0.0038 0 (10) 3.9 U R.ATSNVFAMFDQSQIQEFK.E

1053.9902 2105.9658 2105.9728 -0.0070 0 (6) 9.3 U R.ATSNVFAMFDQSQIQEFK.E + Oxidation (M)

1053.9902 2105.9658 2105.9728 -0.0070 0 (16) 0.92 U R.ATSNVFAMFDQSQIQEFK.E + Oxidation (M)

1181.5344 2361.0542 2361.0583 -0.0041 0 (95) 8.3e-009 U R.NAFACFDEEAIGTIQEDYLR.E

1181.5344 2361.0542 2361.0583 -0.0041 0 (55) 8.4e-005 U R.NAFACFDEEAIGTIQEDYLR.E

1181.5345 2361.0544 2361.0583 -0.0039 0 161 1.8e-015 U R.NAFACFDEEAIGTIQEDYLR.E

72 ARHGDIA 5,12 23450 57 gi|31982030 3,97 475.2748 948.5351 948.5392 -0.0041 1 3 59 U K.YKEALLGR.V

490.7500 979.4854 979.4875 -0.0021 0 31 0.072 U K.YIQHTYR.K

490.7536 979.4927 979.4875 0.0052 0 (1) 83 U K.YIQHTYR.K

490.7536 979.4927 979.4875 0.0052 0 (13) 4.5 U K.YIQHTYR.K

623.2823 1244.5501 1244.5496 0.0005 0 33 0.036 U K.TDYMVGSYGPR.A

825.9578 1649.9010 1649.9101 -0.0091 0 94 2e-008 U R.VAVSADPNVPNVIVTR.L

892.4036 1782.7927 1782.8022 -0.0094 0 (44) 0.0016 U R.AEEYEFLTPMEEAPK.G

892.4036 1782.7927 1782.8022 -0.0094 0 (28) 0.059 U R.AEEYEFLTPMEEAPK.G

892.4045 1782.7944 1782.8022 -0.0078 0 66 1.1e-005 U R.AEEYEFLTPMEEAPK.G

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143

900.3989 1798.7833 1798.7971 -0.0138 0 (36) 0.0081 U R.AEEYEFLTPMEEAPK.G + Oxidation (M)

959.4658 1916.9170 1916.9327 -0.0157 1 111 4.6e-010 U K.SIQEIQELDKDDESLR.K

639.9828 1916.9267 1916.9327 -0.0060 1 (36) 0.013 U K.SIQEIQELDKDDESLR.K

788.7036 2363.0891 2363.1070 -0.0179 1 73 1.5e-006 U R.FTDDDKTDHLSWEWNLTIK.K

1182.5588 2363.1030 2363.1070 -0.0039 1 (5) 9.5 U R.FTDDDKTDHLSWEWNLTIK.K

859.4392 2575.2958 2575.3091 -0.0134 0 (34) 0.013 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFK.K

1288.6589 2575.3032 2575.3091 -0.0059 0 40 0.003 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFK.K

902.1254 2703.3545 2703.4041 -0.0496 1 105 9.6e-010 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFKK.Q


902.1373 2703.3900 2703.4041 -0.0140 1 (32) 0.015 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFKK.Q





902.1395 2703.3966 2703.4041 -0.0075 1 (0) 21 U R.LTLVCSTAPGPLELDLTGDLESFKK.Q





75 KRT8 5,49 52678 63 gi|203734 1,64 368.1749 734.3352 734.3381 -0.0029 0 36 0.033 U -.MSTSGPR.A

368.1749 734.3352 734.3381 -0.0029 0 (17) 2.8 U -.MSTSGPR.A

434.7206 867.4266 867.4311 -0.0045 1 (15) 3 U K.HGDDLRR.S

434.7206 867.4266 867.4311 -0.0045 1 20 0.83 U K.HGDDLRR.S

435.7196 869.4247 869.4243 0.0004 0 11 6.4 U R.ISSSSFSR.V

435.7196 869.4247 869.4243 0.0004 0 (10) 7.9 U R.ISSSSFSR.V

440.2189 878.4233 878.4246 -0.0013 0 11 10 U R.SFTSGPGAR.I

457.2215 912.4284 912.4301 -0.0017 0 77 1.6e-006 U R.VGSSSSSFR.G

508.2750 1014.5355 1014.5345 0.0009 0 14 5.1 U R.QLEALGQEK.L

508.2750 1014.5355 1014.5345 0.0009 0 (11) 8.8 U R.QLEALGQEK.L

527.2678 1052.5211 1052.5250 -0.0039 0 20 0.92 U R.QIHEEEIR.E

533.7593 1065.5040 1065.5090 -0.0050 1 17 2.1 K.YEDEINKR.T

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144

547.2652 1092.5159 1092.5199 -0.0040 0 44 0.0046 U R.AQYEEIANR.S

558.7981 1115.5817 1115.5822 -0.0005 1 21 0.88 U K.DANAKLEDLK.N

592.2887 1182.5628 1182.5590 0.0037 0 6 19 U R.AEAETMYQIK.Y

598.2950 1194.5754 1194.5802 -0.0048 0 80 8.2e-007 U K.LVSESSDIMSK.-

627.3431 1252.6717 1252.6775 -0.0058 0 43 0.0042 U K.LEVDPNIQAVR.T

639.3552 1276.6959 1276.7027 -0.0067 0 79 1.1e-006 K.LALDIEIATYR.K

674.8364 1347.6583 1347.6704 -0.0121 0 88 1.5e-007 U R.SLDMDSIIAEVR.A

676.8372 1351.6598 1351.6693 -0.0095 0 (81) 6.4e-007 U R.TEMENEFVLIK.K

676.8372 1351.6598 1351.6693 -0.0095 0 89 1e-007 U R.TEMENEFVLIK.K

676.8397 1351.6647 1351.6693 -0.0046 0 (3) 46 U R.TEMENEFVLIK.K

679.8431 1357.6716 1357.6837 -0.0121 0 105 2.7e-009 U R.ATLEAAIADAEQR.G

682.8386 1363.6627 1363.6653 -0.0026 0 (13) 3.9 U R.SLDMDSIIAEVR.A + Oxidation (M)

710.3687 1418.7229 1418.7405 -0.0176 0 90 7.2e-008 U R.LEGLTDEINFLR.Q

710.3687 1418.7229 1418.7405 -0.0176 0 (69) 9.4e-006 U R.LEGLTDEINFLR.Q

710.3687 1418.7229 1418.7405 -0.0176 0 (72) 4.9e-006 U R.LEGLTDEINFLR.Q

710.3687 1418.7229 1418.7405 -0.0176 0 (51) 0.00059 U R.LEGLTDEINFLR.Q

713.8530 1425.6914 1425.6922 -0.0008 1 18 1.1 U R.SRAEAETMYQIK.Y

910.9514 1819.8883 1819.9026 -0.0143 0 145 1.8e-013 U K.LEVELGNMQGLVEDFK.N

924.3975 1846.7804 1846.7978 -0.0174 0 89 2.5e-008 U R.SNMDNMFESYINNLR.R

940.3966 1878.7786 1878.7876 -0.0090 0 (78) 3e-007 U R.SNMDNMFESYINNLR.R + 2 Oxidation (M)

668.6363 2002.8872 2002.8989 -0.0117 1 35 0.01 U R.SNMDNMFESYINNLRR.Q

688.0287 2061.0644 2061.0816 -0.0172 1 20 0.5 U K.LKLEVELGNMQGLVEDFK.N

1055.0050 2107.9954 2108.0056 -0.0101 0 22 0.29 U R.ELQSQISDTSVVLSMDNSR.S

862.1333 2583.3781 2583.4021 -0.0240 0 119 2.3e-011 U R.GSLGGFGGAGVGGITAVTVNQSLLNPLK.L

1292.7013 2583.3880 2583.4021 -0.0140 0 (61) 1.2e-005 U R.GSLGGFGGAGVGGITAVTVNQSLLNPLK.L

1273.6896 3818.0470 3818.0691 -0.0221 1 2 3.2 U R.GSLGGFGGAGVGGITAVTVNQSLLNPLKLEVDPNIQAVR.T

1403.9512 4208.8318 4208.8546 -0.0228 0 17 0.077 U K.TTSGYAGGLSSSYGGLTSPGFSYGMSSFQPGFGSVGGSSTYSR.T

+ Oxidation (M)

1403.9512 4208.8318 4208.8546 -0.0228 0 (10) 0.37 U K.TTSGYAGGLSSSYGGLTSPGFSYGMSSFQPGFGSVGGSSTYSR.T

+ Oxidation (M)

76 EZR 5,83 69477 29 gi|40804381 0,59 545.2825 1088.5505 1088.5462 0.0043 1 6 33 U R.ITEAEKNER.V

552.7913 1103.5680 1103.5764 -0.0084 0 56 0.00026 K.IGFPWSEIR.N

552.7948 1103.5751 1103.5764 -0.0012 0 (35) 0.033 K.IGFPWSEIR.N

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145

558.7989 1115.5833 1115.5822 0.0011 1 69 1.4e-005 U R.AKEAQDDLVK.T

588.3086 1174.6026 1174.5996 0.0031 0 38 0.015 U R.IQVWHAEHR.G

591.7983 1181.5820 1181.5869 -0.0049 0 60 9.2e-005 K.APDFVFYAPR.L

591.7995 1181.5844 1181.5869 -0.0026 0 (51) 0.00073 K.APDFVFYAPR.L

496.9324 1487.7755 1487.7766 -0.0011 1 10 7.7 R.RKPDTIEVQQMK.A + Oxidation (M)

830.8983 1659.7821 1659.7933 -0.0112 0 72 3.7e-006 U R.EVWYFGLQYVDNK.G

973.9730 1945.9315 1945.9495 -0.0180 0 82 3e-007 U K.IAQDLEMYGINYFEIK.N

989.0173 1976.0201 1976.0255 -0.0054 0 3 29 U K.GTDLWLGVDALGLNIYEK.D

1012.4932 2022.9718 2022.9786 -0.0067 0 (34) 0.023 U K.FYPEDVADELIQDITQK.L

1012.4957 2022.9768 2022.9786 -0.0017 0 58 9.2e-005 U K.FYPEDVADELIQDITQK.L



1033.5052 2064.9958 2065.0038 -0.0079 0 92 2.9e-008 R.VTTMDAELEFAIQPNTTGK.Q

779.0619 2334.1637 2334.1743 -0.0106 1 14 1.4 U K.GTDLWLGVDALGLNIYEKDDK.L

941.8051 2822.3936 2822.4048 -0.0112 0 81 2.5e-007 U K.EGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAK.F

1412.2064 2822.3982 2822.4048 -0.0065 0 (21) 0.25 U K.EGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAK.F



80 CMPK 5,66 22383 62

gi|150383503 3,03 354.6788 707.3430 707.3490 -0.0060 1 1 1.1e+002 U K.IFDKEG.-

482.7647 963.5149 963.5178 -0.0029 0 37 0.025 U K.FLIDGFPR.N

608.7867 1215.5589 1215.5632 -0.0043 0 (40) 0.0081 U R.NQDNLQGWNK.T

608.7891 1215.5637 1215.5632 0.0005 0 58 0.00013 U R.NQDNLQGWNK.T

613.2913 1224.5680 1224.5697 -0.0017 0 45 0.0024 U K.SVDEVFGDVMK.I

621.2891 1240.5636 1240.5646 -0.0010 0 (13) 2.8 U K.SVDEVFGDVMK.I + Oxidation (M)

662.9206 1323.8266 1323.8377 -0.0111 0 72 1.1e-006 U K.IVPVEITISLLK.R

662.9246 1323.8346 1323.8377 -0.0032 0 (45) 0.00046 U K.IVPVEITISLLK.R

662.9246 1323.8346 1323.8377 -0.0032 0 (50) 0.00013 U K.IVPVEITISLLK.R

669.2916 1336.5687 1336.5751 -0.0064 0 (0) 40 U R.EMDQTMAANAQK.N

677.2925 1352.5704 1352.5700 0.0004 0 43 0.002 U R.EMDQTMAANAQK.N + Oxidation (M)

685.2865 1368.5585 1368.5649 -0.0064 0 (34) 0.011 U R.EMDQTMAANAQK.N + 2 Oxidation (M)

493.9230 1478.7472 1478.7518 -0.0046 0 28 0.12 U K.YGYTHLSAGELLR.D




146

740.3818 1478.7491 1478.7518 -0.0026 0 (3) 36 U K.YGYTHLSAGELLR.D

740.9764 1479.9381 1479.9388 -0.0007 1 10 0.65 U K.IVPVEITISLLKR.E

760.8803 1519.7460 1519.7518 -0.0058 1 10 7.1 U R.KNPDSQYGELIEK.Y

785.4580 1568.9015 1568.9113 -0.0098 0 (39) 0.0049 U -.MKPLVVFVLGGPGAGK.G

785.4610 1568.9073 1568.9113 -0.0039 0 76 9.3e-007 U -.MKPLVVFVLGGPGAGK.G

791.0707 2370.1902 2370.2028 -0.0126 0 (41) 0.0028 U R.IQTYLESTKPIIDLYEEMGK.V

796.4023 2386.1852 2386.1977 -0.0125 0 49 0.00045 U R.IQTYLESTKPIIDLYEEMGK.V + Oxidation (M)

796.4023 2386.1852 2386.1977 -0.0125 0 (10) 3.8 U R.IQTYLESTKPIIDLYEEMGK.V + Oxidation (M)

83 PGK1 8,02 44909 64 gi|40254752 5,78 460.7394 919.4643 919.4685 -0.0042 0 43 0.0062 U K.SLMDEVVK.A

468.7379 935.4613 935.4634 -0.0021 0 (28) 0.17 U K.SLMDEVVK.A + Oxidation (M)

483.2414 964.4682 964.4688 -0.0006 0 44 0.0041 R.VDFNVPMK.N + Oxidation (M)

487.7282 973.4418 973.4505 -0.0087 0 52 0.00061 R.FHVEEEGK.G

487.7331 973.4517 973.4505 0.0012 0 (31) 0.09 R.FHVEEEGK.G

487.7331 973.4517 973.4505 0.0012 0 (16) 3 R.FHVEEEGK.G

522.8146 1043.6146 1043.6227 -0.0081 1 66 2.2e-005 U K.LTLDKLDVK.G

551.2713 1100.5280 1100.5323 -0.0043 0 51 0.00085 K.NNQITNNQR.I

387.1911 1158.5514 1158.5669 -0.0156 1 (12) 6.5 R.FHVEEEGKGK.D

580.2841 1158.5536 1158.5669 -0.0133 1 50 0.0011 R.FHVEEEGKGK.D

601.3310 1200.6473 1200.6536 -0.0063 0 70 9.5e-006 U K.IQLINNMLDK.V

601.3311 1200.6476 1200.6536 -0.0060 0 (19) 1.1 U K.IQLINNMLDK.V

610.3160 1218.6174 1218.6496 -0.0321 0 58 0.00016 U K.YSLEPVAAELK.S

610.3324 1218.6502 1218.6496 0.0006 0 (37) 0.018 U K.YSLEPVAAELK.S

610.3324 1218.6502 1218.6496 0.0006 0 (35) 0.027 U K.YSLEPVAAELK.S

659.8625 1317.7105 1317.7180 -0.0075 0 62 4.8e-005 U K.ITLPVDFVTADK.F

692.3537 1382.6928 1382.6976 -0.0049 0 16 1.9 U R.AHSSMVGVNLPQK.A + Oxidation (M)

817.8944 1633.7742 1633.7849 -0.0107 0 (54) 0.0003 K.LGDVYVNDAFGTAHR.A

817.8944 1633.7742 1633.7849 -0.0107 0 (59) 8.5e-005 K.LGDVYVNDAFGTAHR.A

545.5989 1633.7748 1633.7849 -0.0101 0 68 1e-005 K.LGDVYVNDAFGTAHR.A

864.4420 1726.8695 1726.8786 -0.0091 0 103 2.8e-009 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V

864.4437 1726.8727 1726.8786 -0.0059 0 (41) 0.0044 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V

870.9564 1739.8982 1739.9054 -0.0072 0 53 0.00033 K.VSHVSTGGGASLELLEGK.V



147

870.9564 1739.8982 1739.9054 -0.0072 0 (50) 0.00054 K.VSHVSTGGGASLELLEGK.V

872.4370 1742.8594 1742.8736 -0.0141 0 (102) 4.3e-009 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V + Oxidation (M)

872.4438 1742.8731 1742.8736 -0.0005 0 (92) 4.2e-008 U K.VNEMIIGGGMAFTFLK.V + Oxidation (M)


884.9849 1767.9552 1767.9883 -0.0331 0 93 2.4e-008 U K.ALESPERPFLAILGGAK.V

590.3284 1767.9634 1767.9883 -0.0248 0 (53) 0.00021 U K.ALESPERPFLAILGGAK.V









991.9617 1981.9089 1981.9302 -0.0213 0 (109) 5.4e-010 U K.VLNNMEIGTSLYDEEGAK.I

991.9617 1981.9089 1981.9302 -0.0213 0 120 3.8e-011 U K.VLNNMEIGTSLYDEEGAK.I

991.9658 1981.9171 1981.9302 -0.0131 0 (102) 2.6e-009 U K.VLNNMEIGTSLYDEEGAK.I

1012.0066 2021.9986 2022.0310 -0.0323 1 98 8.6e-009 U K.ITLPVDFVTADKFDENAK.T

675.0145 2022.0217 2022.0310 -0.0092 1 (65) 1.6e-005 U K.ITLPVDFVTADKFDENAK.T

675.0148 2022.0224 2022.0310 -0.0086 1 (9) 6.7 U K.ITLPVDFVTADKFDENAK.T

675.0151 2022.0235 2022.0310 -0.0075 1 (70) 6.2e-006 U K.ITLPVDFVTADKFDENAK.T

679.0152 2034.0238 2034.0391 -0.0153 0 55 0.00016 U K.SVVLMSHLGRPDGVPMPDK.Y

684.3480 2050.0222 2050.0340 -0.0118 0 (9) 7 U K.SVVLMSHLGRPDGVPMPDK.Y + Oxidation (M)


1053.0153 2104.0160 2104.0531 -0.0370 0 125 1.8e-011 U K.QIVWNGPVGVFEWEAFAR.G

1053.0221 2104.0296 2104.0531 -0.0234 0 (8) 8.2 U K.QIVWNGPVGVFEWEAFAR.G

1241.0654 2480.1162 2480.1312 -0.0149 0 (19) 0.3 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSK.K


1241.0654 2480.1162 2480.1312 -0.0149 0 130 2.7e-012 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSK.K

827.7132 2480.1178 2480.1312 -0.0134 0 (99) 2.9e-009 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSK.K



148



870.4095 2608.2068 2608.2262 -0.0194 1 (36) 0.0079 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSKK.Y

870.4095 2608.2068 2608.2262 -0.0194 1 48 0.00046 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSKK.Y

875.7429 2624.2068 2624.2211 -0.0143 1 (17) 0.61 U K.TGQATVASGIPAGWMGLDCGTESSKK.Y + Oxidation (M)



924.7743 2771.3012 2771.3218 -0.0206 0 (75) 1e-006 U K.DCVGSEVENACANPAAGTVILLENLR.F





1386.6615 2771.3084 2771.3218 -0.0134 0 180 3.1e-017 U K.DCVGSEVENACANPAAGTVILLENLR.F




981.5071 2941.4994 2941.5115 -0.0121 1 49 0.00028 U K.IQLINNMLDKVNEMIIGGGMAFTFLK.V + 2 Oxidation (M)

1079.2326 3234.6760 3234.6781 -0.0021 1 4 6.1 U K.SVVLMSHLGRPDGVPMPDKYSLEPVAAELK.S

88 LGALS3 8,93 27269 37 gi|13929190 4,78 417.2276 832.4406 832.4477 -0.0070 0 24 0.48 U R.VIVCNTK.Q

445.1950 888.3755 888.3838 -0.0084 0 (9) 12 U K.QDNNWGR.E

445.1950 888.3755 888.3838 -0.0084 0 9 10 U K.QDNNWGR.E

475.2256 948.4367 948.4525 -0.0158 1 8 17 U R.FNENNRR.V

644.3113 1286.6080 1286.6156 -0.0076 0 71 5.9e-006 U K.GNDIAFHFNPR.F

433.5722 1297.6948 1297.7030 -0.0083 0 (37) 0.014 U K.IQVLVEADHFK.V

433.5722 1297.6948 1297.7030 -0.0083 0 (32) 0.052 U K.IQVLVEADHFK.V

649.8562 1297.6978 1297.7030 -0.0052 0 49 0.0009 U K.IQVLVEADHFK.V

649.8562 1297.6978 1297.7030 -0.0052 0 (45) 0.0023 U K.IQVLVEADHFK.V

735.3671 1468.7196 1468.7351 -0.0155 0 79 9.5e-007 U R.QSAFPFESGKPFK.I

1085.5595 2169.1044 2169.1351 -0.0307 0 (83) 2e-007 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.-

1085.5595 2169.1044 2169.1351 -0.0307 0 (86) 1.1e-007 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.-

1085.5703 2169.1260 2169.1351 -0.0091 0 (90) 3.9e-008 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.-

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MADGFSLNDALAGSGNPNPRGWPGAWGNQPGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGGYPGQAPPSAYPGPTGPSAYPGPTAPGAYPGPTAPGAFPGQPGGPGAYPSAPGAYPSAPGAYPATGPFGAPTGPLTVPYDMPLPGGVMPRMLITIIGTVKPNANSITLNFKKGNDIAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKQDNNWGREERQSAFPFESGKPFKIQVLVEADHFKVAVNDVHLLQYNHRMKNLREISQLGIIGDITLTSASHAMI&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes


149

1085.5703 2169.1260 2169.1351 -0.0091 0 (100) 4e-009 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.-

1093.5639 2185.1132 2185.1300 -0.0168 0 111 3.3e-010 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.- + Oxidation (M)

729.3799 2185.1179 2185.1300 -0.0121 0 (79) 5.4e-007 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.- + Oxidation (M)

1093.5676 2185.1206 2185.1300 -0.0094 0 (22) 0.23 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.- + Oxidation (M)

1093.5676 2185.1206 2185.1300 -0.0094 0 (17) 0.85 U R.EISQLGIIGDITLTSASHAMI.- + Oxidation (M)

763.4295 2287.2667 2287.2973 -0.0306 0 (88) 2.9e-008 U R.MLITIIGTVKPNANSITLNFK.K

1144.6518 2287.2890 2287.2973 -0.0083 0 (2) 8.1 U R.MLITIIGTVKPNANSITLNFK.K

768.7652 2303.2739 2303.2923 -0.0184 0 (42) 0.0011 U R.MLITIIGTVKPNANSITLNFK.K + Oxidation (M)

768.7652 2303.2739 2303.2923 -0.0184 0 (30) 0.016 U R.MLITIIGTVKPNANSITLNFK.K + Oxidation (M)

768.7657 2303.2752 2303.2923 -0.0170 0 102 1.2e-009 U R.MLITIIGTVKPNANSITLNFK.K + Oxidation (M)

768.7657 2303.2752 2303.2923 -0.0170 0 (101) 1.3e-009 U R.MLITIIGTVKPNANSITLNFK.K + Oxidation (M)

Tabela 03.D: Peptídeos sequenciados por proteína identificada através de espectrometria de massas para as bandas isoladas por cromatografia de afinidade e selecionadas em

1D SDS-PAGE. SPOT Identidade pI kDa Cobertura Acesso emPAI (M+H) obs (M+H) exp (M+H) calc delta (ppm) miss score expect Unique Sequência de Peptídeo

A 1 Tropomiosina 4,63 32995 47 gi|66730475 1,87 585.8379 1169.6612 1169.6656 -0.0044 0 (35) 0.022 K.LVILEGELER.S

585.8379 1169.6613 1169.6656 -0.0043 0 (34) 0.028 K.LVILEGELER.S

585.8383 1169.6621 1169.6656 -0.0035 0 37 0.013 K.LVILEGELER.S

622.3158 1242.6170 1242.6456 -0.0286 0 75 2.9e-006 R.IQLVEEELDR.A

622.3249 1242.6353 1242.6456 -0.0103 0 (64) 3.6e-005 R.IQLVEEELDR.A

622.3269 1242.6393 1242.6456 -0.0063 0 (69) 1.1e-005 R.IQLVEEELDR.A

649.8854 1297.7563 1297.7605 -0.0042 1 62 3e-005 R.KLVILEGELER.S

666.8143 1331.6141 1331.6317 -0.0176 0 111 6.1e-010 K.ATDAEADVASLNR.R

672.3400 1342.6655 1342.6728 -0.0073 0 40 0.0082 U K.QLEEEQQALQK.K

678.8245 1355.6344 1355.6456 -0.0112 0 83 3.4e-007 U K.SLIASEEEYSTK.E

678.8245 1355.6344 1355.6456 -0.0112 0 (69) 9.4e-006 U K.SLIASEEEYSTK.E

700.3783 1398.7421 1398.7467 -0.0045 1 (33) 0.037 R.RIQLVEEELDR.A

700.3794 1398.7442 1398.7467 -0.0025 1 59 0.00011 R.RIQLVEEELDR.A

703.3428 1404.6711 1404.6984 -0.0273 0 103 3.7e-009 U K.TIDDLEETLASAK.E

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MDAIKKKMQMLKLDKENAIDRAEQAEADKKQAEDRCKQLEEEQQALQKKLKGTEDEVEKYSESVKDAQEKLEQAEKKATDAEADVASLNRRIQLVEEELDRAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIENRAMKDEEKMELQEMQLKEAKHIAEDSDRKYEEVARKLVILEGELERSEERAEVAESRARQLEEELRTMDQALKSLIASEEEYSTKEDKYEEEIKLLEEKLKEAETRAEFAERSVAKLEKTIDDLEETLASAKEENVEIHQTLDQTLLELNNL&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes


150

703.3510 1404.6874 1404.6984 -0.0110 0 (75) 2.6e-006 U K.TIDDLEETLASAK.E

703.3510 1404.6874 1404.6984 -0.0110 0 (54) 0.00037 U K.TIDDLEETLASAK.E

730.8693 1459.7241 1459.7267 -0.0025 1 (37) 0.016 K.KATDAEADVASLNR.R

730.8693 1459.7241 1459.7267 -0.0025 1 43 0.0041 K.KATDAEADVASLNR.R

1183.0906 2364.1666 2364.1808 -0.0142 0 (78) 5.2e-007 U K.EENVEIHQTLDQTLLELNNL.-

1183.0906 2364.1666 2364.1808 -0.0142 0 110 3.7e-010 U K.EENVEIHQTLDQTLLELNNL.-


A 2 Proteína ribossomal 60S L10a

9,94 24987 52 gi|13592009 2,04 408.7065 815.3983 815.4038 -0.0055 0 1 1.3e+002 U K.NWQNVR.A

633.3719 1264.7293 1264.7326 -0.0033 0 52 0.00032 U K.VLCLAVAVGHVK.M

678.8443 1355.6740 1355.6972 -0.0233 0 66 1.9e-005 U K.YDAFLASESLIK.Q

678.8545 1355.6945 1355.6972 -0.0028 0 (61) 7e-005 U K.YDAFLASESLIK.Q

726.3774 1450.7403 1450.7490 -0.0087 0 (43) 0.0041 U K.AVDIPHMDIEALK.K

726.3774 1450.7403 1450.7490 -0.0087 0 61 6.4e-005 U K.AVDIPHMDIEALK.K


734.3771 1466.7397 1466.7439 -0.0042 0 (44) 0.0026 U K.AVDIPHMDIEALK.K + Oxidation (M)

742.8977 1483.7808 1483.7922 -0.0114 1 120 6.6e-011 U K.KYDAFLASESLIK.Q

742.9050 1483.7955 1483.7922 0.0033 1 (106) 1.7e-009 U K.KYDAFLASESLIK.Q

790.4233 1578.8320 1578.8439 -0.0119 1 (59) 7.8e-005 U K.AVDIPHMDIEALKK.L

790.4273 1578.8400 1578.8439 -0.0039 1 70 6.5e-006 U K.AVDIPHMDIEALKK.L

790.4273 1578.8400 1578.8439 -0.0039 1 (56) 0.00015 U K.AVDIPHMDIEALKK.L

800.9078 1599.8010 1599.8079 -0.0068 0 (38) 0.011 U K.FPSLLTHNENMVAK.V

800.9089 1599.8032 1599.8079 -0.0047 0 65 2.4e-005 U K.FPSLLTHNENMVAK.V

808.9052 1615.7959 1615.8028 -0.0069 0 (59) 9.6e-005 U K.FPSLLTHNENMVAK.V + Oxidation (M)

808.9064 1615.7983 1615.8028 -0.0045 0 (49) 0.001 U K.FPSLLTHNENMVAK.V + Oxidation (M)

631.6011 1891.7814 1891.8193 -0.0379 0 (31) 0.013 U K.FSVCVLGDQQHCDEAK.A


946.9152 1891.8157 1891.8193 -0.0036 0 (72) 1.7e-006 U K.FSVCVLGDQQHCDEAK.A


946.9161 1891.8176 1891.8193 -0.0017 0 (85) 8.4e-008 U K.FSVCVLGDQQHCDEAK.A

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&AUTO_FORMAT=Semiauto&CDD_SEARCH=on&CLIENT=web&COMPOSITION_BASED_STATISTICS=on&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=(none)&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_BLOCK_ON_RESPAGE=None&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&GAPCOSTS=11+1&I_THRESH=0.001&LAYOUT=TwoWindows&MATRIX_NAME=BLOSUM62&NCBI_GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&QUERY=MSSKVSRDTLYEAVREVLHGNQRKRRKFLETVELQISLKNYDPQKDKRFSGTVRLKSTPRPKFSVCVLGDQQHCDEAKAVDIPHMDIEALKKLNKNKKLVKKLAKKYDAFLASESLIKQIPRILGPGLNKAGKFPSLLTHNENMVAKVDEVKSTIKFQMKKVLCLAVAVGHVKMTDDELVYNIHLAVNFLVSLLKKNWQNVRALYIKSTMGKPQRLY&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=9&SET_DEFAULTS.y=5&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=3&END_OF_HTTPGET=Yes


151

946.9161 1891.8176 1891.8193 -0.0017 0 99 3.5e-009 U K.FSVCVLGDQQHCDEAK.A

A 3 SET 4,21 33419 29 gi|60499029 0,61 604.7978 1207.5811 1207.5972 -0.0161 0 60 0.0001 U R.VEVTEFEDIK.S

637.3293 1272.6440 1272.6561 -0.0121 0 (31) 0.085 U R.LNEQASEEILK.V

637.3339 1272.6532 1272.6561 -0.0029 0 93 4.9e-008 U R.LNEQASEEILK.V

723.8250 1445.6355 1445.6423 -0.0068 0 64 1.9e-005 K.EFHLNESGDPSSK.S

920.8943 1839.7741 1839.7992 -0.0250 0 96 5.1e-009 R.IDFYFDENPYFENK.V

920.9027 1839.7908 1839.7992 -0.0083 0 (45) 0.00082 R.IDFYFDENPYFENK.V

920.9063 1839.7981 1839.7992 -0.0011 0 (91) 2.4e-008 R.IDFYFDENPYFENK.V

732.3346 2193.9820 2194.0138 -0.0318 0 (97) 5.6e-009 U K.EQQEAIEHIDEVQNEIDR.L

732.3346 2193.9820 2194.0138 -0.0318 0 102 1.8e-009 U K.EQQEAIEHIDEVQNEIDR.L

732.3410 2194.0011 2194.0138 -0.0127 0 (81) 2.8e-007 U K.EQQEAIEHIDEVQNEIDR.L

A 4 Tropomiosina 4,63 32995 47 gi|66730475 2,16 537.2719 1072.5293 1072.5513 -0.0219 1 55 0.00038 U K.LDKENAIDR.A

537.2728 1072.5311 1072.5513 -0.0202 1 (52) 0.00083 U K.LDKENAIDR.A

574.2936 1146.5726 1146.5768 -0.0042 1 54 0.0004 U K.LKGTEDEVEK.Y

585.8330 1169.6515 1169.6656 -0.0141 0 67 1.4e-005 K.LVILEGELER.S

585.8383 1169.6621 1169.6656 -0.0035 0 (31) 0.058 K.LVILEGELER.S

585.8383 1169.6621 1169.6656 -0.0035 0 (33) 0.036 K.LVILEGELER.S

585.8397 1169.6649 1169.6656 -0.0006 0 (54) 0.00027 K.LVILEGELER.S

585.8397 1169.6649 1169.6656 -0.0006 0 (65) 2.3e-005 K.LVILEGELER.S

622.3038 1242.5930 1242.6456 -0.0525 0 (34) 0.031 R.IQLVEEELDR.A

622.3038 1242.5930 1242.6456 -0.0525 0 (75) 2.7e-006 R.IQLVEEELDR.A

622.3205 1242.6265 1242.6456 -0.0191 0 (68) 1.5e-005 R.IQLVEEELDR.A

622.3205 1242.6265 1242.6456 -0.0191 0 75 3.1e-006 R.IQLVEEELDR.A

622.3269 1242.6392 1242.6456 -0.0063 0 (63) 4.8e-005 R.IQLVEEELDR.A

649.8818 1297.7491 1297.7605 -0.0114 1 (60) 4.9e-005 R.KLVILEGELER.S

649.8856 1297.7567 1297.7605 -0.0038 1 (65) 1.5e-005 R.KLVILEGELER.S

649.8856 1297.7567 1297.7605 -0.0038 1 70 4.5e-006 R.KLVILEGELER.S

666.8023 1331.5901 1331.6317 -0.0416 0 (85) 1.7e-007 K.ATDAEADVASLNR.R

666.8193 1331.6241 1331.6317 -0.0076 0 (79) 9e-007 K.ATDAEADVASLNR.R

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152

666.8205 1331.6265 1331.6317 -0.0052 0 121 6.4e-011 K.ATDAEADVASLNR.R

666.8205 1331.6265 1331.6317 -0.0052 0 (106) 2.1e-009 K.ATDAEADVASLNR.R

666.8222 1331.6298 1331.6317 -0.0019 0 (35) 0.024 K.ATDAEADVASLNR.R

666.8222 1331.6298 1331.6317 -0.0019 0 (42) 0.0046 K.ATDAEADVASLNR.R

672.3338 1342.6530 1342.6728 -0.0198 0 52 0.00052 U K.QLEEEQQALQK.K

678.8146 1355.6146 1355.6456 -0.0310 0 (74) 2.4e-006 U K.SLIASEEEYSTK.E

678.8302 1355.6458 1355.6456 0.0002 0 83 3.8e-007 U K.SLIASEEEYSTK.E

700.3769 1398.7392 1398.7467 -0.0075 1 (46) 0.0021 R.RIQLVEEELDR.A

700.3787 1398.7428 1398.7467 -0.0038 1 70 7e-006 R.RIQLVEEELDR.A




703.3349 1404.6552 1404.6984 -0.0432 0 107 1.5e-009 U K.TIDDLEETLASAK.E



730.8680 1459.7215 1459.7267 -0.0051 1 (51) 0.00067 K.KATDAEADVASLNR.R

730.8684 1459.7223 1459.7267 -0.0043 1 100 8.3e-009 K.KATDAEADVASLNR.R


1183.0624 2364.1102 2364.1808 -0.0706 0 114 1.3e-010 U K.EENVEIHQTLDQTLLELNNL.-


1183.0825 2364.1504 2364.1808 -0.0304 0 (42) 0.0021 U K.EENVEIHQTLDQTLLELNNL.-


A 5 Proteína ribossomal 60S L10a

9,94 24987 42 gi|13592009 2,51 633.3723 1264.7300 1264.7326 -0.0026 0 57 0.00011 U K.VLCLAVAVGHVK.M

678.8466 1355.6786 1355.6972 -0.0186 0 67 1.9e-005 U K.YDAFLASESLIK.Q

726.3787 1450.7428 1450.7490 -0.0062 0 51 0.00065 U K.AVDIPHMDIEALK.K


734.3757 1466.7368 1466.7439 -0.0071 0 (36) 0.019 U K.AVDIPHMDIEALK.K + Oxidation (M)

742.8994 1483.7842 1483.7922 -0.0080 1 94 2.7e-008 U K.KYDAFLASESLIK.Q

742.9022 1483.7899 1483.7922 -0.0023 1 (59) 9.2e-005 U K.KYDAFLASESLIK.Q


153

790.4269 1578.8393 1578.8439 -0.0047 1 52 0.00038 U K.AVDIPHMDIEALKK.L



800.9078 1599.8011 1599.8079 -0.0068 0 70 6.7e-006 U K.FPSLLTHNENMVAK.V

800.9078 1599.8011 1599.8079 -0.0068 0 (63) 3.3e-005 U K.FPSLLTHNENMVAK.V





946.9141 1891.8137 1891.8193 -0.0056 0 71 2e-006 U K.FSVCVLGDQQHCDEAK.A

B 1 Dermicidina 6,08 11391 10 gi|16751921 0,30 564.7658 1127.5171 1127.5207 -0.0036 0 26 0.2 U K.ENAGEDPGLAR.Q

B 2 Dermicidina 6,08 11391 10 gi|16751921 0,30 564.7658 1127.5171 1127.5207 -0.0036 0 26 0.2 U K.ENAGEDPGLAR.Q

B 3 Histona H2A type 1-C

11,05 14097 21 gi|4504245 0,24 966.0853 1930.1561 1930.1615 -0.0054 0 (25) 0.021 U R.VTIAQGGVLPNIQAVLLPK.K

966.0853 1930.1561 1930.1615 -0.0054 0 (32) 0.0044 U R.VTIAQGGVLPNIQAVLLPK.K

966.0870 1930.1595 1930.1615 -0.0020 0 82 4.1e-008 U R.VTIAQGGVLPNIQAVLLPK.K

Histona H4 11,36 11360 9 gi|4504301 0,30 590.8129 1179.6111 1179.6135 -0.0024 0 50 0.00092 U R.ISGLIYEETR.G

C 1 Proteína ribossomal 60S P0

5,91 34365 25 gi|11693176 0,74 609.3381 1216.6616 1216.6703 -0.0088 0 44 0.0034 U K.IIQLLDDYPK.C

611.3118 1220.6091 1220.6149 -0.0058 0 40 0.01 U R.GHLENNPALEK.L

633.8085 1265.6025 1265.6074 -0.0049 0 53 0.00039 U K.CFIVGADNVGSK.Q

657.3534 1312.6922 1312.7027 -0.0105 0 71 6.7e-006 U K.TSFFQALGITTK.I

714.9151 1427.8156 1427.8235 -0.0079 0 (40) 0.0054 U R.GTIEILSDVQLIK.T

714.9154 1427.8162 1427.8235 -0.0073 0 58 8e-005 U R.GTIEILSDVQLIK.T

1090.5537 2179.0928 2179.0943 -0.0015 0 48 0.00076 U R.AGAIAPCEVTVPAQNTGLGPEK.T

C 2 Proteína ribossomal 60S L10a

9,94 24987 42 gi|13592009 1,4 678.8520 1355.6895 1355.6972 -0.0078 0 61 7.7e-005 U K.YDAFLASESLIK.Q

726.3789 1450.7431 1450.7490 -0.0058 0 38 0.011 U K.AVDIPHMDIEALK.K

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154

742.9014 1483.7882 1483.7922 -0.0040 1 99 9e-009 U K.KYDAFLASESLIK.Q

800.9090 1599.8035 1599.8079 -0.0043 0 57 0.00015 U K.FPSLLTHNENMVAK.V


631.6070 1891.7991 1891.8193 -0.0203 0 33 0.0097 U K.FSVCVLGDQQHCDEAK.A

D 1 Asporina 8,51 43139 22 gi|62078745 0,25 655.8281 1309.6417 1309.6455 -0.0038 0 33 0.042 U K.YWEIQPATFR.C

767.4305 1532.8465 1532.8562 -0.0097 0 49 0.00081 U K.GLTSLYALILNNNK.L

772.0505 2313.1296 2313.1424 -0.0127 0 32 0.022 U R.VVHCSDLGLTSVPSNIPFDTR.M

D 2 Caseína quinase 2

7,29 45159 30 gi|16758674 0,33 764.8819 1527.7493 1527.7569 -0.0076 0 51 0.00053 U K.QLYQTLTDYDIR.F

866.4364 1730.8583 1730.8628 -0.0045 0 35 0.018 U R.TPALVFEHVNNTDFK.Q

885.9264 1769.8383 1769.8472 -0.0089 0 84 2.6e-007 U K.YSEVFEAINITNNEK.V

848.7479 2543.2218 2543.2431 -0.0214 1 48 0.00057 U K.VLGTEDLYDYIDKYNIELDPR.F

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155

Apêndice E

Figura 01.E: Validação dos experimentos de imunohistoquímica e análise proteômica. A) SDS-PAGE 1D

de extratos de proteína total de intestino delgado dos animais pertencentes aos grupos III, IV e V. B)

Western bloting para detecção de CEA, Calnexina e β-actina.


156

Apêndice F

Tabela 01. F: Relação de proteínas que apresentaram região de similaridade com os peptídeos selecionados por Phage display através do alinhamento de sequências realizado

por BLASTp. Peptídeo (Grupo)

Similaridade protéica (BLASTp)

Função Bibliografia

QPHKVFFPNLPR (DMHg1)

NME5 (Nucleoside diphosphate kinase homolog 5)

Metástase tumoral, atenuação de apoptose. (Desvignes et al., 2009) (Li et al., 2012)

MYO7A (Unconventional myosin-VIIa)

Maior susceptibilidade à mielomas malignos. (Fernandez et al., 2009)

SPATA22 Sem relação com câncer. -

SCAND3 Sem relação com câncer. -

LAAQQYTSALKS (DBTd1)

MUC4 (Mucin-4 precursor)

Potencializa progressão e metástase tumoral, reprime apoptose. (Rachagani et al., 2012)

LIM FHL1B (Four and a half LIM domains protein 1)

Proto-oncogene, diferenciação celular, inibição de Notch. (Surendran et al., 2010)

UBR2 (E3 ubiquitin-protein ligase UBR2)

Degradação de proteínas. (Sultana et al., 2012)

ENOX 1 e 2 (Ecto-ENOX disulfide-thiol exchanger 1 e 2)

Relacionadas à oxidação e trocas de tióis dissulfetos em proteínas.

(Morre et al., 2008)

SIAH1 (E3 ubiquitin-protein ligase SIAH1)

Supressora de tumores e ativadora de apoptose. (Wen et al., 2010)

TTC21A Sem relação com câncer. -

TNTPPSQRVHLS (DBTd2)

GPR50 (Probable G-protein coupled receptor 150)

STAT4 (Signal transducer and activator of transcription 4)

Proliferação e migração tumoral. (Liu et al., 2012) (Uluer et al., 2012)

VGLL1 (Transcription cofactor vestigial-like protein 1)

Proliferação celular independente de ancoragem. (Pobbati et al., 2012)

LIPE Sem relação com câncer. -

MICAL1 (NEDD9-interacting protein with calponin and LIM)

Favorecimento de apoptose e proliferação celular. (Ashida et al., 2006) (Zhou et al., 2011)

FERM Favorecimento de migração e invasão dependentes de adesão celular.

(Song et al., 2012) (Wang et al., 2012)

ANK1 (Ankyrin-1)

Resistência à apoptose. (Liao et al., 2011)


157

FDTKAGLTSLVA (DBTg1)

WIZ Sem relação com câncer. -

ABCD1 (ATP-binding cassette sub-family D member

1)

Redução da toxicidade de quimioterápicos com consequente resistência.

(Chen et al., 2009) (Hour et al., 2009)

AGRN (Agrin precursor)

Super expressa em diversos tipos de câncer. (Fernebro et al., 2006) (Rajkumar et al., 2011)

HDC (Histidine decarboxylase)

Estímulo de síntese de histamina. (Francis et al., 2012)

CYP2T1 (Cytochrome P450, fam. 2, subfam.T,

polypeptide 1) Metabolismo de xenobióticos. (Wang et al., 2009)

KIAA1598 Sem relação com câncer. -

KDPTQFKPMSLW (DBTg2)

FAM129B (Niban-like protein 1)

Promoção de invasão celular. (Chen et al., 2011)

FOXO1 (Forkhead Box protein O1)

Controle de proliferação celular e apoptose. (Sangodkar et al., 2012) (Xie et al., 2012)

COMMD5 (COMM domain-containing protein 5 )

Controle de proliferação celular. (Solban et al., 2000)

POLR2A (RNA polymerase II subunit RPB1)

Super expresso em células tumorais. (Markaverich et al., 2011)

POMT2 Sem relação com câncer. -

EYQLPSRTVPRD (DBTg3)

SKIV2L Sem relação com câncer. -

PKD1L3 Sem relação com cancer. -

DOK3 (Docking protein 3)

Ativação celular mediada por imunoreceptores e supressora de tumor.

(Lemay et al., 2000) (Berger et al., 2010)

CLK2 (Dual specificity protein kinase)

Relacionada ao ciclo celular, apoptose e replicação do DNA. (Jiang et al., 2003)

TWF1 (Twinfilin-1)

Super expressa em diversos tipos de câncer, moduladora de citoesqueleto.

(Baniwal et al., 2010)

PER2 (Period circadian protein homolog 2)

Desenvolvimento, invasão e metástase. (Wang et al., 2011)

DLC1 (Rho GTPase-activating protein 7)

Proliferação, polarização e remodelamento de citoesqueleto celular.

(Lukasik et al., 2011)

LMNA (Pre-lamin A/C precursor)

Super expressa em câncer gastro intestinal. Adesão Celular. (Belt et al., 2011) (Lee et al., 2012)

MSX2 (Homeobox protein MSX2)

Invasão e sobrevivência celular tumoral. (Gremel et al., 2011) (Zhai et al., 2011)


158

Referências bibliográficas – Apêndice F

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Apêndice G

Artigo publicado – Revista: Journal of Proteome Research

Fator de Impacto: 5,001. Qualis CAPES Área CBIOL I: A1


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IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À …