Aula 9 - Técnicas de Diagnóstico (Parte 2)

VirologiaFonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-2&user_login=HugoSousa1

Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Detecção do genoma viral

Futuro do diagnóstico de vírus

Necessidade de equipamento e pessoal treinado

Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2

TÉCNICAS

Métodos de Amplificação Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação

Métodos de Hibridização Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS


Molecular


Extração de Ácidos Nucléicos

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

4

Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


Lise alcalina; Neutralização; Precipitação de Proteínas e detritos celulares; Purificação Ácidos Nucleicos

Precipitação Eluição em colunas

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Molecular



Molecular



Molecular


Add DNase

Add RNase

+ DNase (protein)

+ RNase (protein)

Utilização Nucleases Remoção DNA Remoção RNA

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Molecular


Avaliação Ácidos Nucléicos por Espectofotometria UV

Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)

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Técnicas de Amplificação AN


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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


Amplifica um fragmento de DNA especifico;

Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de cópias do fragmento pretendido;

Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de sequência conhecida;

Região Alvo

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’


Molecular



Molecular

MISTURA DE REAÇÃO:

DNA

Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples com sequência complementar às sequências alvo do DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos);

Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;

Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleotídeos e estabilidade da Taq;

dNTPs: Nucleotideos livres (A, T, C, G);

Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC) que efetua a cópia da sequência alvo do DNA.



Molecular

PROCEDIMENTO

1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC);

2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC);

3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC);

3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ATCCGAT (…) – 5’

5’ – (…) ATGCGTA



Molecular

PROCEDIMENTO

4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;

FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.



Molecular

Electroforese em Gel de Agarose:

Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu peso molecular;

DNA e RNA possuem carga elétrica negativa migram para o pólo positivo (quanto mais pequenas mais migram);

Brometo de Etídeo: corante fluorescente que se vai intercalar na dupla hélice de DNA e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV; ( cuidado=> carcinógeno!)

Amostras da PCR carregadas no gel;


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Molecular

Pólo Positivo (+)

Pólo Negativo (-)


Polymerase Chain Reaction

APLICAÇÕES

Detecção de sequências específicas de DNA viral Detecção AdV em amostras respiratórias Detecção EBV em biópsias Nasofaringe Detecção JCV em LCR ...

DESVANTAGENS Altamente sensível à contaminação com quantidades residuais de DNA. Falsos positivos e artefatos.


Molecular


RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia

real-time PCRTécnicasMolecular


Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia


Baseada na técnica da PCR;

Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);

Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)

Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.

5’ – (…) ACTGA (…) – 3’3’ – (…) TGACT (…) – 5’











APLICAÇÕES

Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com patologias Detecção variantes EBV – Associação com agressividade ...

DESVANTAGENS Todas as do PCR Sensível a contaminação por DNAses Artefactos

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia






Análise de polimorfismos/mutações;

Diferenças de sequência de um único nucleotídeo são suficientes para que cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional diferente;

Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia simples/desnaturadas) em função da sua conformação.


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Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)



Molecular

APLICAÇÕES

Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com agressividade ...

DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Leitura gel poliacrilamida

Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular



Molecular


Análise de expressão de mRNA;

Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;

Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA;

Molécula Alvo

mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’TTTTTTTTTT – 5’



Molecular



Molecular

VANTAGENS

Permite fazer análise quantitativa da expressão de mRNA.



Molecular


APLICAÇÕES

Expressão mRNA viral Avaliação da replicação viral

DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações

Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular



Molecular

PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels

Limitations of end-point PCR: Poor precision Low sensitivity Short dynamic range Low resolution Size-based discrimination Ethidium bromide for staining does not allow

for accurate quantitation Requires post-PCR processing


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Monitora a fluorescência emitida durante a reação de PCR como um indicador da produções de amplicons em cada ciclo de PCR;

Monitorização em tempo real;

Detecção da amplificação nos estádios precoces da reação – maior precisão;

Alvo: DNA ou RNA


Molecular


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Molecular



Molecular



Molecular

SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan


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PCR phases in linear view

Cycle #

[DNA]

ExponentialIf 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise

LinearHigh variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade.

PlateauEnd-point analysis. The reaction has stopped and if left for long – degradation of PCR products.


Molecular

Exponential

Linear

Plateau


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Molecular

Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument.Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically

CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold

Rn – (Rn-baseline)NTC – no template controlDRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value.


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CT = threshold cycle

Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual é detectado sinal


Molecular

Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct


Real Time PCR

Aplicações Quantificação carga viral Monitoração carga viral Monitoração terapêutica

VANTAGENS Amplificação monitorizada em tempo real Ausência de processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação) Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA) Rápido, específico, sensível e reprodutível Quantitativo Barato


Molecular


Sequenciação Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular

Usada para determinar a sequência de nucleotídeos

Método de sequenciamento mais utilizado – método dideoxi

Adição de dideoxinucleotideos que terminam a reação de polimerização

3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte


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Molecular



Molecular


Técnicas de HibridizaçãoAula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

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Alvo – DNA ou RNA

Utilização de sondas específicas

Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus

Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS

Técnicas de Hibridização



Molecular

Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular



Molecular

Principio da técnica Hibridização de Ácidos Nucleicos Amplificação sinal por Quimioluminescência Método semi-quantitativo

Método Hibridização amostras positivas com sondas específicas Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca Reação com anticorpo secundário conjugado com FA Adição de reagente e detecção por quimioluminescência



Molecular

45 minutesat 65ºC

60 minutesat 65ºC

60 minutesagitação

30 minutes

15 minutes


Southern Blot Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


Southern Blot Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


Hibridização em tiras Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


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Hibridização em tiras



Molecular

Chips Biologiareal-time PCRTécnicas

Molecular


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Chips



Molecular

Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV

Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo

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Chips



Molecular

Professor Mark Pallen

We ask the lab for a diagnosis, expecting a yes or no, but often end up

with just a maybe…


VirologiaAno Lectivo 2010/11

Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II

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