Técnicas Microbiológicas Parte 1

8/2/2019 Tcnicas Microbiolgicas Parte 1

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PROLOGO

El presente libro tiene la finalidad de dar apoyo a las asignaturas relacionadas con el cultivomanejo, aislamiento, conservacin e identificacin de microorganismos para los estudiantes deeducacin media y superior del rea biolgica.

Se presentan algunas tcnicas bsicas microbiolgicas el cual tiene como principal objetivoponer en prctica el mtodo cientfico para despertar el inters y seguir estimulando en algunoscasos al estudiante por esta rama de la ciencia.

Como una aportacin a las estructuras didcticas de este libro, colocamos una serie deimgenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderloscomparar.

NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________

PROFESOR DE TEORA: ___________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________

GRUPO: _______________________________________________________

PERIODO LECTIVO: _____________________________________________

CARRERA: _____________________________________________________

ESCUELA: _____________________________________________________


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NDICE

Pasos a seguir para trabajo diario de un laboratorio de microbiologa _________________________________ 4

Procedimiento para la realizacin de un medio de cultivo___________________________________________ 13

Realizacin de una preparacin en fresco y fija___________________________________________________ 19

Tcnicas de tincin _________________________________________________________________________ 22

Microscopia_______________________________________________________________________________ 27

Preparacin de material utilizado en microbiologa ________________________________________________ 35

Diluciones y diluyentes _____________________________________________________________________ 43

Aislamiento por estra cruzada y vaciado en placa________________________________________________ 47

Cultivo de microorganismos _________________________________________________________________ 52

Microcultivo_______________________________________________________________________________ 59

Conservacin de cepas _____________________________________________________________________ 67

Pruebas bioqumicas _______________________________________________________________________ 72

Toma de muestras _________________________________________________________________________ 88

Determinacin de OMA ____________________________________________________________________ 97

Determinacin de OCT _____________________________________________________________________ 100

Determinacin de mohos y levaduras _________________________________________________________ 106

Aplicaciones de la temperatura (pasteurizacin de leche y control de calidad) __________________________ 109

Preparacin de reactivos __________________________________________________________________ 114

Medidas de seguridad _____________________________________________________________________ 120


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PASOS A SEGUIR PARA TRABAJO DIARIO DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

La calidad en nuestro trabajo en un laboratorio de Microbiologa depende de una secuencia de pasos a seguirestrictamente por todo el personal que labora el, para ello sugerimos seguir los siguientes pasos para tratar deuniformar criterios.

PASOS A SEGUIR:

1.- Preparacin del rea de trabajo

2.- Preparacin de medios de cultivo

3.- Preparacin de reactivos

4.- Preparacin de material

5.- Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras para su anlisis microbiolgico

6.- Realizacin de la tcnica

7.- Incubacin de la muestra

8.- Recuento

9.- Realizacin de los clculos

10.- Presentacin del informe.

El personal de nuevo ingreso al laboratorio de Microbiologa deber de leer el manual de aseguramiento de lacalidad y pondr ms inters en su rea de trabajo.

PREPARACIN DEL REA DE TRABAJO

Las caractersticas del rea de trabajo son las siguientes:

1.- La mesa debe ser de acero inoxidable con instalaciones de agua, luz, drenaje y gas, cada una de estasinstalaciones deber de tener los siguientes cdigos de colores segn la NOM-026-STPS, Colores y seales deseguridad e higiene e identificacin de riesgos por fluidos conducidos en tuberas.

LUZ ROJO IDENTIFICACIN DE TUBERAS CONTRA INCENDIO

AGUA VERDE IDENTIFICACIN DE FLUIDOS DE BAJO RIESGO

GAS AMARILLO IDENTIFICACIN DE FLUIDOS PELIGROSOS

2.- El rea de trabajo cuenta con luz natural principalmente y/o luz artificial.

3.- Una campana de flujo laminar para la realizacin del sembrado con instalaciones de luz.

4.- Siempre al inicio y al final de nuestras actividades la mesa se limpiar con una solucin de benzal al 10 % paradesinfectarla, para ello siempre se debe tener una esponja y un atomizador con benzal, adems se debe de tenerun frasco de con benzal para cuando se necesite, este reactivo hay que prepararlo frecuentemente para evitar quese contamine.

5.- La mesa debe tener dos mecheros con manguera en buen estado y una balanza granataria de 600 g decapacidad para el pesado de las muestras.

6.- En el cajn de la mesa se debe tener papel aluminio, cucharas de plstico nuevas, esptulas, frasco contorundas de algodn, hisopos, cuchillos, tijeras, pinzas, tenedores, ligas, (algunos estriles y otros no porque sepueden esterilizar con alcohol cuando se requieran)


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7.- Debe existir un frasco de 2 litros de capacidad con 1 litro de benzal para colocar las puntas de las pipetas quese estn utilizando durante el anlisis perfectamente etiquetado (PUNTAS DE PIPETAS SUCIAS).

8.- En la mesa procurar distribuir el material que se necesita de tal manera que contemos con el espacio suficientepara manipular las muestras tanto en el pesado de la muestra como el sembrado, de tal forma que sugerimosapilar las placas de Petri del lado izquierdo para irlas corriendo al lado derecho.

9.- Debajo de la mesa se tendr un recipiente con una bolsa de plstico para desechar lo que no sirve, nunca lasmuestras, estas se guardan hasta que el anlisis y reporte estn terminados.

10.- El rea de trabajo estril no debe tener corrientes de aire para evitar contaminaciones.

11.- El analista debe traer una bata de preferencia blanca, limpia y en buen estado, con el pelo recogido y cubiertocon una cofia, adems de utilizar un cubrebocas y guantes al manipular la muestra.

12.- Se debe de programar la fecha y hora de dar mantenimiento a las instalaciones as como la hora para lalimpieza de este.

13.- El analista debe evitar en lo posible la entrada de personal ajeno al laboratorio o en zonas donde se preparenmedios, reactivos, o rea de sembrado de muestras.

14.- Al final de cada da de trabajo el analista indicar al personal de lavado de material cual es el que tendr quelavar y esterilizar para ser utilizado nuevamente.

15.- Al desechar las muestras sobre todo las slidas utilizar una coladera para evitar que las partculas slidas degran tamao se vayan por el drenaje.


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PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

El personal encargado de la preparacin de medios de cultivo debe conocer la NOM-065-SSA1-1993, Queestablece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo para poder clasificarlos, para ellomencionaremos lo siguiente:

Un Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos,as como efectuar pruebas de susceptibilidad, proporcionndoles las condiciones ambientales adecuadas para sudesarrollo, estos requieren elementos que se encuentran en su composicin qumica. Los factores que se debenregular durante el crecimiento son los nutrientes, pH, temperatura, aireacin, concentracin de sales, y potenciainica del medio.

Los componentes necesarios que debe contener un medio de cultivo deben ser:

a.- Fuente de carbono

Los microorganismos obtienen su energa a travs de la fotosntesis o de la oxidacin de compuestos orgnicosson capaces de utilizar el CO2 como fuente principal de carbono. El carbono se suministra generalmente en formade carbohidratos

b.- Fuente de nitrgeno

El nitrgeno es un componente de primer orden de las protenas y cidos nucleicos, las fuentes pueden ser losnitratos, nitritos, nitrgeno, amonio y aminocidos.

c.- Fuentes de azufre

El azufre es uno de los constituyentes orgnicas de la clula, constituye parte de la estructura de diversascoenzimas y se encuentra formando parte de la metionina y cistena, la mayora de las bacterias toman el azufredel in sulfato, otros ms lo pueden obtener a partir del H2S.

d.- Fuente de fsforo

Se requiere fosfato como componente de ATP, cidos nucleicos y coenzimas como el NAD, NADH y flavinas. Elfosfato se asimila como fosfato inorgnico.

e.- Fuentes minerales

Algunos microorganismos requieren de iones Mg2+ y ferroso Fe2+, el magnesio es un componente de la molculade clorofila y el hierro es parte de las coenzimas de los citocromos y las peroxidasas. El potasio se requiere para lafuncin de los ribosomas y el calcio es un constituyente de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas

f.- Factores de crecimiento

Se llama factor de crecimiento a la sustancia que favorece el crecimiento pero que el microorganismo es incapazde sintetizar. Los factores de crecimiento pueden ser vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxinabiotina), algunas de estas sustancias se pueden obtener del suero, yema de huevo o sangre.

g.- Agar

El agar utilizado en bacteriologa es un medio que esta libre de metales txicos, compuestos nitrogenados, salesinsolubles, azcares libres, microorganismos muertos, bacterias termfilas y pigmentos.

El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas,particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaiday Acanthopeltis, qumicamente el agar es unamezcla de dos polisacridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como polmeros de lagalactosa en sus distintas formas. La proporcin de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, segn la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fra tiene

un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocosminutos. La tendencia a la unin de sus partculas, que en fro se mantienen independientes producen un gel limpioy transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumentapaulatinamente a medida que la solucin disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 40 C.

Los cidos diluidos en fro, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivocomo agente gelificante ha resultado muy bueno debido a :

a.- Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas soncapaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.


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b.- Su estabilidad qumica, le permite mantener el medio al estado slido prcticamente en cultivos de cualquiebacteria

c.- Su punto de fusin, superior a 80 C, permite cultivar en medio slido bacterias termfilas que se incuban hastatemperaturas de 65 C.

d.- Su temperatura de gelificacin, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma lquida.

e.- Su elevado poder gelificante permite su utilizacin a muy bajas concentraciones, generalmente del orden del 1al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos

f.- Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtencin de medios semislidos en los cuales se puedenrealizar pruebas de movilidad

En algunas ocasiones un medio de cultivo posee algunas otras sustancias como colorantes o inhibidores parafavorecer o inhibir el crecimiento de un microorganismo.

Los colorantes e indicadores son de importancia en la preparacin de la mayor parte de los medios de cultivodiferenciales pues, pueden actuar de la siguiente manera:

a.- Como agentes bacteriostticos

b.- Como indicadores de los cambios de acidez o alcalinidad

c.- Como indicadores redox en ciertos medios de cultivo.

CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Segn la NOM los clasifica por:

A.- Su aspecto fsico, los medios de cultivo preparados pueden ser:

a.- Lquidos,

b.- Semislidos,

c.- Slidos.

a.- Medios lquidos.

Se emplean fundamentalmente para:

- Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitosespecficos.

- Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.

- Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas.

b.- Medios semislidos.

- Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidostienen una consistencia blanda.

c.- Medios slidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte delos medios de cultivo que se emplean en Microbiologa.

B.- Su uso, se clasifican en:

a.- Medios selectivos.Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una floramixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters.

b.- Medios selectivos de enriquecimiento.Son medios lquidos que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden o inhiben lareproduccin de otros.

c.- Medios diferenciales.


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- Nmero de Registro SSA.

- Nombre y domicilio del fabricante.

- Nombre y domicilio del distribuidor.

- Mtodo de preparacin y pH final.

- Frmula.

Por lo tanto haciendo uso de la reglamentacin mexicana tenemos ejemplos de los medios de cultivo por suaspecto fsico.

a) Medios lquidos.- Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades demicroorganismos o bien para la produccin de algn metabolito adems de estimular y promover la seleccin dealgn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, se puede obtener el tubo o en matraz y encaso de cultivar a los mohos se puede hacer por agitacin o sin agitacin.

Figura 1: Cultivo en medio liquido (caldo nutritivo y caldo glucosa sales)

b) Medios semislidos.-Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad y su contenido de agar esde 13 g/l

Figura 2: Medio semislido (medio SIM), para observar la movilidad de un microorganismos

c) Medios slidos.- Se elaboran en una placa para obtener colonias aisladas de microorganismos y laconcentracin de agar es de 15 g/l, tambin lo utilizamos en medios slidos inclinados y cuando se trata desembrar en tubo se colocan en ellos y despus de la esterilizacin se inclinan sobre una varilla de vidrio para dejaruna superficie de aproximadamente 3 cm.


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Figura: 3 Medio slido inclinado, slido en placa y en matraz para vaciado en placa

B.- Por su uso se clasifican en:

a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunosmicroorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenesde inters.

Figura 4: Medios selectivo agar eosina azul de metileno.

b) Medios selectivos de enriquecidos.- Son medios que estimulan la multiplicacin de algn germendeterminado e impiden la reproduccin de otros como por ejemplo el agar Baird Parker que sirve para elaislamiento de S. aureus, estos medios de cultivo le adicionamos una sustancias enriquecida de composicindesconocida como suero, sangre, huevo, leche, extracto de hgado, etc.

Figura 5 Medio enriquecido

c) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores de cido base para detectar cambios en emedio o en las caractersticas tpicas de la colonia.


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Fig. 9 Medio de transporte para la realizacin de exudados farngeos.

C.- Tambin podemos clasificar a los medios de acuerdo a nuestras necesidades y lo podemos hacer de lasiguiente forma.

A.- POR SU COMPOSICIN

a).- Medio sinttico.- Si un medio se le conoce el 100 % de su composicin qumica.

b).- Medio complejo.- Si un medio de cultivo no conocemos su composicin qumica.

La calidad del trabajo microbiolgico en el anlisis de muestras se encuentra vinculada tanto con la idoneidad de los me

cultivo y reactivos, como de la limpieza del material de vidrio y/o plstico que se utilizan durante su preparacin y/o env

Las mejores instalaciones y equipo disponible y la habilidad del analista pierden todo su valor si la composicin de los

de cultivos no corresponde a la requerida y si durante la preparacin de stos no se respetan las indicaciones del fabric

NOTAS:

-Leer siempre las instrucciones del fabricante, las cuales estn en la etiqueta del frasco

-Realizar los clculos para pesar exactamente lo solicitado.

-Se debe siempre de fundir el medio (agar), a la temperatura de ebullicin y sobre un soporte con rejilla o sobreuna parrilla de calentamiento.

-Utilizar un recipiente al doble de la capacidad que se vaya a preparar

-Verificar el pH con un potencimetro

-Una vez preparado el medio de cultivo, si son placas y ya estn solidificadas se colocan en bolsas de plsticonuevas y en posicin invertida para evitar la deshidratacin y se colocaran en el refrigerador hasta su uso.

-Si son tubos se tienen que inclinar, para ello se coloca una pipeta en una mesa plana y se sujeta con un masking,posteriormente se acomodan los tubos, de tal manera que al solidificarse quede un rea de aproximadamente 3 cmde longitud. Una vez solidificados se colocan dentro de un bote de lmina y este se introduce en una bolsa deplstico, para ser guardados en el refrigerador

-Los medios que son lquidos se quedan en el interior del bote y una vez fros se colocan en el refrigerador.

- No olvidar colocar en la incubadora, al menos una muestra de cada medio para testigo.

-Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasin.

-El cido tartrico se esteriliza por filtracin con membrana.


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Figura 10 Medio de cultivo donde podemos preparar el medio siguiendo las instrucciones del fabricante

Fig. 11 Medios de cultivo preparados.

Los cuales llevan un control de calidad y son probados con cepas ATCC, por ejemplo para el agar de sal y manitoles probado con:

Microorganismo Cepa de referencia ResultadoE. coli ATCC 25922 Crecimiento inhibidoS. aureus ATCC 25923 Colonias con pigmento amarillo caracterstico y halo de

color amarillo (manitol positivo)S. epidermidis ATCC12228 Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo)P. mirabilis ATCC 12453 Inhibicin parcial

Tabla No. 1 cepas de referencia para control positivo y negativo del agar de sal y manitol.

MTODO DE PRUEBA

La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (ColeccinAmericana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia)

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS

Los medios de cultivo debern almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador


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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DE UN MEDIO DE CULTIVO

1.- Asegurarse que el frasco que contiene el medio de cultivo est bien cerrado, no presente grumos, no esthidratado y se encuentre dentro de su vigencia.

2.- Leer cuidadosamente las especificaciones del fabricante, generalmente son las siguientes:

2.1 Contenido de humedad (medio deshidratado).

2.2 Composicin del medio.

2.3 Mtodo de preparacin

2.4.- Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado

2.5.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.

2.6.- Caractersticas de desarrollo de los microorganismos en el medio.

2.7.- Advertencia sobre la conservacin del medio preparado.

2.8 Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.

2.9 Resultado de las pruebas de viabilidad del medio.

2.10 pH del medio preparado.

3.- Calcular NICAMENTE la cantidad de medio de cultivo que se necesita y anotar los clculos en la bitcora.

4.- Abrir el frasco y auxilindose de un esptula o cucharilla, pesar en balanza, previamente calibrada, la cantidadcalculada.

5.- Colocar la pesada en un recipiente cuya capacidad sea por lo menos dos veces mayor a la del volumen demedio que se desea preparar.

6.- Adicionar el volumen de agua deseado, agitar vigorosamente y dejar reposar para iniciar su disolucin. NOTAAntes de usar el agua, verificar el pH de la misma.

7.- Si para la disolucin completa se requiere calentar, efectuar esta operacin en platina caliente o sobre unarejilla de asbesto calentando con mechero. NO APLICAR CALOR DIRECTO AL MEDIO DE CULTIVO, porquepuede sufrir alteracin.

8.- Ajustar el pH a 25 C con potencimetro ajustado. NO USAR PAPEL INDICADOR EN ESTA OPERACIN.

9.- Esterilizar los medios y/o soluciones preparadas, usando calor hmedo a temperaturas y tiempos establecidospor el fabricante, dicho valor lo obtenemos de la etiqueta del frasco de medio. Controlar el proceso de esterilizacinusando como bioindicadores al Geobacillus stearothermophilus y para calor seco utilizar al B. subtilis. Parasustancias termolbiles, esterilizar mediante el proceso de filtracin y el bioindicador utilizado es Pseudomonasdiminuta,

a.- Medios slidos en placa

Cuando se necesite preparar placas de medios de cultivo, efectuar el proceso de vaciado en campana de flujolaminar o bien en la zona de trabajo bacteriolgico del mechero, siguiendo las siguientes recomendaciones.

1.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a unatemperatura de 45 2C.

2.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y proceder a vaciar el medio


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Fig. 12 Medio slido a 45 C y vaciado en placa del medio

3.- Dejar entreabiertas las placas un momento para que el agua se evapore y no se condense en la tapa, una vezdesplazada el agua tapar rpidamente.

Fig.13 Diferentes placas con medio de cultivo

El medio slido tambin es utilizado para realizar el recuento y aislamiento de microorganismos por la tcnica deextensin con varilla, en esta tcnica contamos con el medio ya solidificado y adicionamos 0,1 ml del inoculo en lasuperficie del medio, posteriormente esterilizamos la varilla y dejamos enfriar para extender la muestra.


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Fig. 14 Tcnica de extensin con varilla

Medio slido en placa, dejar entreabierta la tapa de la caja de lo contrario se formar agua de condensacin, tal ycomo se muestra en la figura. 14

4.- En caso de existir burbujas en el medio hay que flamear con la flama del mechero, procurando agarrar elcollarn para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.

Fig. 14 Cuando al vaciar nos queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobreellas (Nunca hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra)

5.- Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas deplstico.

6.- Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparacin.

7.- De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 C durante 48 horas como prueba deesterilidad.

b.- Medios en matraz para vaciado en placa

Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle untapn de algodn con gasa y fundir el medio.

1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante.

2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a unatemperatura de 45 2C.

3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio.

4.- Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparadomezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentidocontrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin deinculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y dejar solidificar.


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Fig. 15Tcnica de vaciado en placa

Fig. 16 Medios de cultivo a temperatura de 45C para realizar la tcnica de vaciado en placa

c.- Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras.

Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle untapn de algodn con gasa y fundir el medio.

1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante.

2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a unatemperatura de 45 2C y adicionarle 1.4 ml de cido tartrico al 10 % por 100 mL de medio.


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3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio

d.- Medios lquidos en tubo.

1.- Preparar el medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 mL y procolocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapn de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una camp

Durham.

2.- Procurar no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten.

3.- Colocar los tubos en un bote de lmina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las condque indica el fabricante.

4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la evaporac

5.- Cuando se requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros

Fig. 17 Preparacin de medios de cultivo lquido en tubo

Las principales causas de error en la preparacin de medios de cultivo son:

Diferencias en la medicin o peso de los medios y /o ingredientes.

Falta de frescura del medio por estar bastante tiempo almacenado en el refrigerador el cual genera ladeshidratacin del medio

Presencia de residuos de detergente en el material utilizado.

Efecto germicida de algunas sustancias presentes en el material de vidrio por mal lavado y enjuagado.

Que la calidad del agua destilada utilizada no sea la indicada o que presente ciertas trazas de impurezas.

Diferencias en el ajuste del pH antes de la esterilizacin o disminucin de este despus de la esterilizacin porefecto del calentamiento o bien por parte del analista.

Aunque los medios sean de buena calidad podra en un momento dado tener sustancias que inhiban elcrecimiento de los microorganismos.

Al vaciar los medios si no se hace a la temperatura sugerida puede tener agua de condensacin y al sembrarlopuede generarnos colonias extendidas.

Una mala esterilizacin por parte del personal que lo realice ya sea un sobrecalentamiento del medio trayendocomo consecuencia que se desnaturalicen algunas sustancias y en ocasiones pueden perder su poder diferencia

o su consistencia.

Siempre que la tcnica indique esterilizar por separado alguna sustancia se deber de realizar nunca mezclarlosporque es una causa de error, que pudiera repercutir en el resultado de manera muy significativa.

El esterilizar los medios ms de una vez corremos el riego de perdida de agua por lo que el medio estar msduro de lo que debe estar, por lo tanto se deben de pesar solo cantidades necesarias.

Revisar frecuentemente el funcionamiento del manmetro de la autoclave.


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EXPRESIN DE RESULTADOS

Los bioindicadores no deben presentar desarrollo alguno a las 48 horas de incubacin en el bao Mara

INFORME DE LA PRUEBA

Del lote elaborado el 5 % de las cajas d Petri o matraces preparados para el vaciado en placa no deben de presentar des

alguno. Esta prueba se debe realizar siempre que se prepare material.


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Elaboracin de una preparacin en fresco y una preparacin fija

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopiospticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las tcnicas ms comnmente usadas pararealizar preparaciones para microscopios pticos.

A.- Preparacin en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es precisoque no est fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobreun portaobjetos y cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa a

microscopio de contraste de fases, pero antes debemos limpiar los portaobjetos de la siguientemanera.

Limpieza de los portaobjetos y cubreobjetos

Es preferible utilizar material nuevo, pero en ocasiones presentan algo de grasa por lo que debemosdesengrasarlos con alcohol y secarlos con un pao fino que no deje pelusa, si no se utilizan en el momento sedeben de envolver con papel higinico, de esta manera quedan protegidos del polvo y nicamente se abre epaquete en el momento de hacerlos servir.

B.- Preparacin de Frotis:

Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodn y que contenga alcohol.

a) Etiquetar la preparacin, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta ser preferentementepegada a la izquierda de la preparacin, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiquetallevar el nombre del microorganismos, el nombre de la tincin, el equipo, el grupo y la fecha.

Mtodo A

a) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ah tomar con el asa unapequea gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. (para este paso no se necesitaque el agua sea estril y que se tenga que esterilizar el asa)

b) Encender el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo deensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre lagradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender elinoculo aproximadamente un cm2 para obtener una pelcula delgada de microorganismos. Flamear el asa paraesterilizarla.

c) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rpidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de lamano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operacin una vez ms. El calor deseable esaquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en el dorso de la mano. Dejarenfriar el portaobjetos antes de teir.

Fig. 18 Preparacin de un frotis para una preparacin

Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inculo de lo contrario quedar un frotis grueso, la luz no pasar yno observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis


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Mtodo B

a) Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero.

b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inculo de la suspensin.

c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla

d) Colocar el inculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inculo por lo menos 1 cm 2, y flamear easa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

OBSERVACIN DE UNA PREPARACIN EN FRESCO DE UN MOHO

a) En un portaobjetos limpio coloca una gota pequea de azul de algodn lactofenol

b) Con el asa coloca un poco del micelio del moho y colcale un cubreobjetos. Observa al microscopio a 40 X yrealiza un esquema de lo observado.

Fig. 19 Preparacin de una muestra de mohos con azul de algodn lactofenol


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TCNICAS DE TINCIN

Las bacterias no teidas muestran pocos detalles morfolgicos; el diagnstico bacteriolgico generalmente se basaen las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos esnecesario teir la clula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoqumicos muy complejos, algunasreacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teido en exceso puedeneliminarse con disolventes adecuados.

La mayora de los colorantes utilizados en microbiologa son derivados de la anilina, los colorantes estn formadospor uno o ms anillos bencnicos conectados por uniones qumicas bien definidas (cromforos) que estn bien

asociados con la produccin de color, tericamente ciertos radicales qumicos poseen la propiedad de absorber laluz de diferentes longitudes de onda, adems poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unina componentes con carga contraria presentes en la clula.

Los colorantes se designan como cidos o bsicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de pHen solucin, sino ms bien si una parte significativa de la molcula es aninica o catinica. Desde el punto de vistaprctico, los colorantes bsicos tienen estructuras de naturaleza cida.

En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensin,fijacin, tratamiento con colorantes y observacin.

Extensin: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra eslquida se hace directamente y, si es slida, hay que resuspenderla previamente en una gota de

H2O.Fijacin: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las protenas parafacilitar la accin del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestrarepetidamente a 10 cm de la llama del mechero.

Tincin: Se realiza aadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a losprocesos anteriores. Puede ser de varios tipos:

TINCIN NEGATIVA:

Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su

contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).

TINCIN SIMPLE:

Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tincin negativa, slonos permite observar la forma, el tamao y el tipo de agrupacin de las clulas.

Tomar la preparacin y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado

Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de diseccin sacarlo del recipiente.

Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua

Dejar secar la preparacin y observarla al microscopio.

Fig. 20 Pasos para la realizacin de una tincin simple, donde se pueden colocar varias preparaciones en unmismo portaobjetos


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Fig. 22 Pasos a seguir para realizar la tincin de Gram

Resultados en una tincin de Gram

Fig. 23 Tincin de Gram

TINCIN DIFERENCIAL: Tincin de Ziehl Neelsen

Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener unapared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de lasMycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agenteshidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los reactivosutilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o

negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen(Tincin Acido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezclade etanol y cido clorhdrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a ladecoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes(BAAR).

Los microorganismos del gnero Mycobacterium contienen una membrana citoplasmticaformada por una bicapa lipdica similar a las restantes eubacterias. Por encima de estamembrana se encuentra el rgido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurmico en lugar deN-acetilglucosamina. Por medio de una unin fosfodister, el peptidoglicano se halla unidocovalentemente al arabinogalactano, un polmero de arabinosa y galactosa. En la porcin msdistal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los cidos miclicos que tienen

cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolpidos son un grupo de compuestos(micolatos de trealosa, sulfolpidos, micsidos, etc) que se encuentran asociados nocovalentemente a los cidos miclicos y se ubican perifricamente en la pared. Los micolatosde trealosa (llamados factores de cordn porque su presencia produce cultivos que tienen formade cordones serpenteantes) y sulfolpidos se encuentran principalmente en las cepas deMycobacterias ms virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se hallaanclado en la membrana citoplasmtica. El LAM es considerado como el equivalentemycobacteriano del lipopolisacrido de las Gram negativas debido a que provoca una


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importante respuesta antimicrobiana en macrfagos. En las cepas de Mycobacterias msvirulentas la arabinosa terminal del LAM est recubierta con residuos de manosa (manLAM) adiferencia de las cepas no virulentas no estn recubiertas (AraLAM). Adems, el LAM tambinpodra servir como poro para el paso de los nutrientes a travs de la pared celular. En la paredcelular tambin se encuentran protenas inmunoreactivas que son utilizadas con finesdiagnsticos (PPD).

El Mycobacterium tuberculosises el agente etiolgico de la tuberculosis, una enfermedad queprimariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos estratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en ehombre. El M. bovistambin causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por Mavium, M. kansakii, M. fortuitumy M. cheloneison consideradas oportunistas y no tuberculosasLa lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium lepraeque es un parsito intracelularobligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias mononucleares como loshistiocitos de la piel y en las clulas de Shwan de los nervios.

La tuberculosis es una enfermedad de distribucin mundial pero con consecuenciasdevastadoras en los pases en desarrollo. En el ao 1993 la Organizacin Mundial de la Salud(OMS-WHO World Health Organization) declar a la tuberculosis una "Emergencia Global"Se estima que un tercio de la poblacin mundial est infectada con el M. tuberculosis, y que en

la prxima dcada sern infectadas ms de 300 millones de personas de las cuales 90 millonesdesarrollarn la enfermedad y 30 millones morirn por ella.

La Tincin de los microorganismos requiere una pared celular en buen estado, el interior de la clula, rico enlpidos conserva el colorante, pero la pared no. La funcin de sta, y el fenmeno de resistencia a los cidos, sedebe a la insensibilidad de la pared frente a la accin del aclarador, en este casi el cido.

A fin de que el colorante primario, la carbolfucsina, penetre a travs de las cpsulas cerosas de los bacilosacidorresistentes, se requiere de cierto tipo de tratamiento fsico como el calor.

El calor favorece la fusin de las ceras por lo que el colorante puede penetrar, luego al dejar enfriar nuevamentelas ceras solidifican, de modo que el colorante ya no puede salir. Como el tratamiento es muy enrgico cualquierbacteria que no tenga un alto contenido de lpidos como Mycobacterium y Nocardiaperdern el colorante primariodurante la decoloracin por lo que se teir con el colorante de contraste que es el azul de metileno. Las bacteriasque resisten a la decoloracin por alcohol cido se denominan bacterias cido alcohol resistente (BAAR positivas)y los vemos al microscopio de color rojo y las BAAR negativas las vemos de color azul.

Procedimiento en la tincin de Ziehl-Neelsen.

Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloracin

Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vaporesaplicar calor peridicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparacin y esperar a que seenfre.

Enjuagar con agua de la llave.

Cubrir los frotis con alcohol cido por un minuto.

Enjuagar con agua de la llave.

Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto

Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersin


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Fig. 24 Pasos a seguir para la realizacin de la tincin de Zhiel-neelsen

TINCIN SELECTIVA DE ESPORAS: Tincin de Shaeffer y Fulton.

Una Tincin selectiva tiene por objetivo poner de manifiesto algunas estructuras de la clula bacteriana. Lasendosporas son resistentes al calor y difciles de destruir, las bacterias formadoras de endosporas son del gneroBacillus y Clostridium. Las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que a veces se ven comoregiones sin teir dentro de las clulas que han sido teidas

Procedimiento en la tincin selectiva de ShaefferFulton

Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lmpara de alcohol, hasta queemita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparacin.

Dejar que el frotis se enfre.

Lavar con agua de la llave.

Cubrir el frotis con safranina por un minuto.

Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersin.

Diferentes tipos de esporas que podemos observar al microscopio


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Fig. 25 Observacin microscpica de la espora (verde)

Fig. 26 Diferentes tipos de posicin de las esporas

En la realizacin de las tinciones podemos tener ciertos errores como son:

Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismomicroorganismos, si sufre dao en la pared por alguna causa, se vuelve Gram negativo. Esto indica la importanciade la pared para la retencin o el escape del colorante.

Tincin de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por ms de 30 segundos el alcohol cetonaentonces la preparacin nos va a resultar un Gram negativa.

Fig. 27 Formas bacterianas


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MICROSCOPIA

El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Es el instrumento que msse usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes deiluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos demiles de veces el tamao original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaosformas y composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras medianteinstrumentos.

Fig. 27 Tamaos aproximados de clulas y molculasPara poder observar a la clula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversasvariedades, los cuales estn diseados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:

Un microscopio ptico

Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite laobservacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple esuna lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esadistancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la

informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor deespcimen, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mximaresolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud de onda de 540nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetoscondensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero nopuede aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y deinvestigacin que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin deespcimen, la alteracin fsica de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que seaplican a la imagen final.

El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminacin; 2. Sistema ptico y 3Sistema mecnico.

El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente lapreparacin y esta formado principalmente por la lmpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lentefrontal, diafragma de iris y lente auxiliar)

El sistema ptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandala imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.

El sistema mecnico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento ycambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin y esta formado por la base, estativo, tornillosmacromtrico y micromtrico, platina, revolver y portarevolver.


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b.- Sistema de iluminacin

Lmpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes caractersticas: 6V, 5-15 W 12V, 50-100 W

Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su funcin es la de regular el dimetro de laemisin de la luz a fin de que se ilumine solo el rea de campo visual, es decir controla la cantidad de luz queatraviesa la preparacin.

Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto aobservar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite

aprovechar toda la luz posible que inciden sobre l y los dirige hacia el plano focal del objeto.

Fig. 29 Esquema de un condensador. 1) Lente frontal, 2) lente auxiliar y 3) diafragma de iris

c. Sistema ptico

Oculares

El ocular es la parte ptica final externa, situados en el tubo a travs de los cuales se obtiene la imagen final, elocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocularconsta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.

Datos importantes grabados sobre la periferia de un ocular: 1) Correccin esfrica (CPL); 2) Ocular de gran campo(W); 3) aumentos (10X); 4) distancia focal amplia (1,8) y 5) Para observacin con gafas.

Tubo

El tubo es la parte ptica mecnica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular obinocular, adems esta adaptada para poderle colocar una cmara fotogrfica una cmara de televisin. El tubogeneralmente esta diseado para trabajar a una distancia mecnica fija entre ellos y este valor puede ser de 160mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular elaumento total.

1.- Smbolo de lentes

2.- Dioptras

3.- Aumento del tubo

4.- Oculares

5.- aumento del ocular

6.- Tubo del ocular

Fig. 30 Vista frontal de los oculares de un microscopio


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Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, estn construidos de cristal o fluorita, poseen aumentopropio, apertura numrica y esta diseada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillosde colores y nmeros grabados sobre el tubo metlico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, ladisposicin de estos caracteres es la siguiente:

1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 2)

2.- El lado superior izquierdo indica el nmero de aumentos

3.- El lado superior derecho la apertura numrica.

4.- El lado inferior la distancia mecnica

5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos

6.- El anillo de color inferior indica en qu medio se hace la inmersin del objetivo (tabla 3)

1.- Anillo de color superior

2.- Aumento de 10X

3.- Aumento de 40 X

4.- Aumento de 100 X

5.- Espesor del cubreobjetos

6.- Apertura numrica

7.- Aceite de inmersin8.- Anillo inferior

Fig. 31 Informacin contenida en los objetivos:

En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el nmero 1, el cual indica que:

Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,

10= No requiere cubreobjetos

0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.

Anillo superiorLos anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:

Aumentos totales:

El nmero total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el nmero deaumentos que tiene el ocular por el nmero de aumentos que tiene el tubo y por el nmero de aumentos que tiene

Tabla 2. Correspondencia entre losaumentos y los anillos de colores grabadosAumentos Color anillo superior1.0X Negro

2.5 X Pardo4.0 X Rojo6.3 X Anaranjado10 X Amarillo

16 X Verde claro25 X Verde oscuro40 X Azul claro63 X Azul oscuro100X Blanco

Tabla 3. Colores para el anillo inferior queindican en qu medio se debe hacer lainmersin del objetivo

Carcter Sustancia ndice derefraccin

Color delanillo

Oil Aceite 1.515 NegroW Agua 1.333 Blanco

Glyz Glicerina 1.455 AnaranjadoMetileno Yoduro demetileno

1.740 Amarillo


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el objetivo con el que se esta observando.

Distancia mecnica:

Se llama distancia mecnica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra porel objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecnica se mide desde lasuperficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de160 mm.

Poder de resolucin:

El poder de resolucin de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muycercanos entre s y que puedan verse separada.

El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio ptico de 0,2 y el microscopio electrnico de6 ngstrom.

Apertura numrica:

Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, yasea del condensador o del objetivo.

Microscopio de contraste de fase

Permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas.

Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes deuna clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones demayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al hazprincipal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera defase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitudde la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Laspartes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partesclaras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopiosse utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuroporque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas

individuales ms pequeas en las imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Estil para observar autorradiografas, cristales en la orina y para detectar espiroquetas enparticular el Treponema pallidummicroorganismo causante de la sfilis.

Cada uno de los microscopios tiene una funcin determinada, en este y en este caso este tipo de microscopioutiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, adems en este tipo de microscopio tambin se realiza la tcnica deiluminacin de Khler.

Figura 32 Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde

Microscopio estereoscpico


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Son aparatos con poca capacidad de amplificacin, pero muy tiles para observar especimenes ms grandes quelos que se pueden observar con un microscopio ptico

Microscopio de fluorescencia

la muestra se tie con una sustancia fluorescente que absorbe la energa de las ondas cortasde la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas ms largas (verde). Se utiliza eninmunofluorescencia, tcnica en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpoespecfico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo

este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.Microscopio de luz ultravioleta

La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por lasmolculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, polo tanto puede alcanzar una resolucin de 0,1 m. La microscopia ultravioleta no es muydiferente del funcionamiento de un espectrofotmetro pero sus resultados son registrados enfotografas. La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luzultravioleta puede daar la retina.

Microscopio de polarizacin

Este microscopio es una simple modificacin del microscopio ptico, contiene un filtro

polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundopolarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador.

Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se usapara determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidadque tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denominabirrefringencia.

Exhiben birrefringencia el msculo estriado o esqueltico y las inclusiones cristaloides de lasclulas intersticiales testiculares.

Microscopio electrnico

Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permitetener un poder de resolucin muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo).Es posible con el microscopio electrnico resolver objetos separados por una distancia de 0,003m, comparado con los 0,25 m de uno ptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un millnde veces.

A causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgadosincluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que,para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales decortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol oacetona). Despus de la deshidratacin, la muestra se incluye en una resina y es aqu donde serealizan cortes finos con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla dediamante. Una sola clula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Sislo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas porlo que se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). Ehaz de electrones es dirigido sobre la preparacin y los electrones dispersados por el metapesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. A la primera tcnica se ladenomina Microscopa Electrnica de Transmisin (MET) y a la segunda MicroscopaElectrnica de Barrido (MEB).


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Microscopio electrnico de barrido

Se asemeja ms que al microscopio electrnico de transmisin a los tubos de televisin dedonde deriva la microscopia electrnica. Para analizar la mayora de los tejidos se deja lamuestra, se deshidrata por desecacin de punto crtico, se cubre con una pelcula evaporada deoro-carbn, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cmara de muestras demicroscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con unaleja y analizar las caractersticas estructurales del mineral.

Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a travs de lasuperficie un tubo de televisin. Los electrones reflejados desde la superficie y los electronesforzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o ms detectores yreprocesados para formar una imagen tridimensional en un televisin.

Se pueden tomar fotografas para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Muchosmicroscopios combinan las caractersticas de un microscopio electrnico de transmisin y debarrido, el cual permite microanlisis porrazos X con sonda electrnica. Se pueden adosardetectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el cortehistolgico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra ladistribucin en los cortes de los elementos que tienen nmero atmico mayor de 12, enconcentracin suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar

El microscopio es un instrumento ptico que se emplea para obtener imgenes amplificadas de pequeasestructuras que no son posibles verlos a simple vista.

Cuidado y limpieza del microscopio

Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:

a.- Para limpiar la parte ptica, se elimina primero las partculas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, unpincel o soplando fuertemente sobre la lente.

b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y an el cemento de lasmolduras y los objetivos compuestos, por lo no se deben usar.

c.- Las guas mecnicas deben mantenerse lubricadas.

Se enlistan algunos compuestos recomendados slo para ciertas partes del microscopio.a.- Espuma de jabn suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos

b.- Agua destilada con algn detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la ptica.

c.- Solucin para limpiar la ptica.- etanol al 40 %, ter al 20 %, para limpiar superficies de la ptica o removerresiduos de aceite de inmersin.

TCNICA DE ILUMINACIN SEGN KHLER

A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lmparas de filamento espirilado, Khler propone unmtodo que actualmente es utilizado. Su iluminacin comporta dos diafragmas: un diafragma denominado decampo, situado generalmente a nivel de la lmpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situadogeneralmente debajo del condensador.

Pasos a seguir para la iluminacin de Khler.

1.- Luz amarilla (bajo voltaje)

2.- Ajustar la distancia interpupilar

3.- Ajustar las dioptras

4.- Abrir el diafragma de campo e iris

Tabla No. 4 Pasos a seguir para la iluminacin de Khler en un microscopio


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PREPARACIN DE MATERIAL PARA SER UTILIZADO EN MICROBIOLOGA

La esterilizacin se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie, existenvarios mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin, para seleccionar el ms adecuado es necesario conocer lanaturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilizacin.

AGENTES FSICOS

Calor hmedo:

La aplicacin de calor es el mtodo ms simple para esterilizar un material, a condicin de que no sufra dao en smismo. Una temperatura de 100 C matar a todas las formas vegetativas, pero no las esporas, para matar a estases necesario una temperatura de 121 C, 15 minutos y 15 libras de presin. Generalmente se utiliza vapor, tantoporque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran hmedas como porque el vaporproporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente.

Calor seco:

Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos elctricos por los que circula airecaliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 170 Cdurante una h.

Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor acta desnaturalizando las protenas

y los cidos nucleicos de la clula y fragmentando las membranas celulares.

Flameo:

La llama es un agente esterilizador eficaz, y el ms simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar easa bacteriolgica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dichaasa lleve grandes cantidades de material biolgico, pues ste podra saltar diseminndose partculas infectantes.

A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bistur o pinzas, se puede esterilizar el material mojndolo conalcohol y encendindolo ste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilizacin completa. El mtodo esrpido pero produce carbonizacin y prdida del filo.

Fig. 33 Autoclave para esterilizar por calor hmedo, horno para esterilizar por calor seco y flama del mechero paraincineracin.


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Fig. 34 Olla de presin con manmetro para verificar la presin de esterilizacin

Radiaciones ionizante y no ionizante:

La radiacin ultravioleta provoca dao en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinasadyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucletidos, formando dmeros pirimidnicos, las radiacionesionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.

Pueden emplearse tambin ondas supersnicas o ultrasnicas para romper o desintegrar a la clula.

Filtracin a travs de MembranasAlgunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor hmedo o seco pues son termolbiles, es decir que sedesnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtracin demembranas para retener a los microorganismos. Aqu debemos de conocer las dimensiones del microorganismo aeliminar para poder utilizar el filtro adecuado (dimetro)

Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto oesteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como bioindicador a Pseudomonasdiminutapara filtros con un dimetro de poro de 0,45 m

Fig 35 Filtro (Millex) y Swinnex para filtracin a travs de membrana.


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Fig. 36 Diferentes tipos de filtro

MTODOS QUMICOS

Gases (oxido de etileno) y lquidos (formaldehdo ypropiolactona)

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgeno lbiles como los que tiene grupos carboxilosamino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacuticasirve para esterilizar material termosensible como el plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias. Esmuy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y adems cancerigeno, por lo que se suministranormalmente con una concentracin entre el 10 y el 20 % de CO 2. La concentracin de xido de etileno, lahumedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilizacin. Un objeto limpio puede esterilizarse si se

trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y laconcentracin de oxido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear paraeliminar el oxido de etileno residual porque es muy txico.

La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva despus devarias h y, por ello, no es tan difcil de eliminar. Destruye a los microorganismos ms rpidamente que el oxido deetileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancergena.

Mtodos bacteriolgicos para verificar las tcnicas de esterilizacin.

En todo lugar en donde se realice esterilizacin se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten quela esterilizacin se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estril, para ello existen en emercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambiode color o turbidez de la ampolleta.

Mtodo de la tira de papel

Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Bacillus stearothermophylus se presentan en unaenvoltura con dos compartimientos. En el primero est la tira testigo, que se ha esterilizado (testigo negativo) y enel otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca (problema y testigo positivo) y se coloca enun recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual. Luego las tiras se vuelven a su compartimientocorrespondiente y se incuban por 7 das a 55 C en caldo de soya y tripticasena. Las esporas sobre las tirastestigos se desarrollan, pero si la esterilizacin no fue la correcta habr desarrollo en la tira testigo.

Fig. 37 Muestra de una tira de esporas utilizada para diferentes tipo de esterilizacin

Mtodo de la ampolleta:


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Son ampolletas que contiene una suspensin de Bacillus stearothermophylusen medio de cultivo. La temperaturaptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65C; dentro del medio lquido seencuentra un indicador que es el prpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar la ampolleta en el interior decompartimiento que va a esterilizar el material, despus de terminar la esterilizacin, las ampolletas (sin abrir) seincuban entre 55 y 65 C durante 24 h, el enturbamiento y la aparicin de un color amarillo indica una esterilizacindefectuosa, en cambio si el color permanece igual durante varios das de incubacin el equipo esta funcionandobien. Debe llevarse el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismascondiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

Fig. 38 Diferentes formas de comprobar la esterilizacin

NOTAS:

-Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.

-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo, nunca seesterilizan por calor seco

-Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, ste debe ser esterilizado enautoclave a 121 oC, 1,05 atm de presin durante 15 minutos

- Recolectar los desechos del material esterilizado en bolsas de plstico de alto punto de fusin para su posteriodesecho

PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN

Lavado de material de vidrio e instrumental

a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material planoy el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando dextran.

b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave

c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.

PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

TUBOS DE ENSAYO

a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodn siguiendo las indicaciones del profesor

b) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha,equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.


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Fig. 39 Formas de preparacin de tubos de ensaye para esterilizacin por calor seco y hmedo

CAJAS DE PETRI

a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidadde cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo de laboratorio y grupo.

Fig. 40 Pasos a realizar para preparar cajas de Petri para ser esterilizado por calor hmedo

PIPETAS

a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muycompactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip

b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodn

c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de equipo de laboratorio. Conuna fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.

Fig. 41 Pasos a realizar para la preparacin de pipetas para ser esterilizadas por calor humedo.


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MATRACES

a) Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa, siguiendo lasinstrucciones del profesor.

b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn.

c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar losdatos sobre el gorro de papel.

Fig. 42 Colocacin del tapn de algodn al matraz y gorro de papel Kraf para matraz para ser esterilizado por calorhmedo

PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la punta.

b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

Fig. 43 Preparacin de pinzas o tijeras para ser esterilizado por calor hmedo

PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR SECO

TUBOS DE ENSAYE

a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica.

b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.

CAJAS DE PETRI

a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posicin invertidaperfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO)

b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fechaColocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.


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Fig. 44 Cilindro de acero inoxidable para esterilizar cajas de Petri

PIPETAS

a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado.

b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn, antes colocar en el interiorun poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas.

c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.

d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la

tapa del cilindro pipetero.

Fig. 45 Cilindro de acero inoxidable para esterilizar pipetas

MATRACES

a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.

b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndolo conmasking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.

Fig. 46 Formas de esterilizar matraces vacos


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PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.

b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura

Fig. 47 Envoltura en papel aluminio de objetos metlicos sin filo

En la actualidad se utilizan pipetas automticas para pipetear las suspensiones microbianas, soluciones yreactivos, por lo que se tienen que esterilizar solo las puntas.

Fig. 48 Utilizacin de pipetas automticas.


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PREPARACIN DE DILUCIONES

La utilizacin de la norma en nuestro laboratorio es la de proporcionar las guas generales para la preparacin dediluciones para el examen microbiolgico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campode aplicacin, estas guas pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otros requerirseotros mtodos diferentes. Sin embargo en todos los casos donde sea posible se recomienda apegarse a estasguas y modificarse nicamente cuando sea necesario.

La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismoscontenidos en la muestra destinada para el anlisis.

La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero demicroorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba enel caso de tubos y la cuenta de colonias en el caso de placas.

Definiciones

Para nuestro trabajo tenemos que:

1.- Dilucin primaria, es la suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del productobajo examen y mezclarda con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente.

2.- Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumende la dilucin primaria con un volumen de nueve veces

un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie dediluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo.

Procedimiento

1 Preparacin de la dilucin primaria.

1.1 A partir de muestras lquidas:

Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de microorganismoses homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).

Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua de40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.

Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de lamuestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en untiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a unatemperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi anteriormente

1.2 A partir de muestras slidas o semislidas.

Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 horasy no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis.

1.2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estriles detamao adecuado.

1.2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.

1.2.3 Operar la licuadora de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea para cadaalimento. An en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2 a 5 minutos, tambien podemos utilizaun Stomacher.


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Figura 49 Stomacher para disgregar una muestra slida

1.2.4 Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capassuperiores de la suspensin.

Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en cuentapara las operaciones subsecuentes o en la expresin de resultados.

2.2 Preparacin de las diluciones decimales adicionales.

2.2.1 Transferir 1 ml o un mltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilucin primaria 1 + 9 (10-1

), en otro recipienteconteniendo nueve veces el volumen del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre lapipeta y el diluyente.

2.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se mencionoanteriormente.

2.2.3 La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen denmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de lainformacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacintrabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

2.2.4 Utilizar una pipetas para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan seleccionado. Evolumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

2.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad total, escurriraplicando la punta de la pipeta una sola vez en una rea de la caja Petri sin lquido.

2.2.6 Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco ymantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario.

En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.

El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos esperado es:

Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos, donde sea posible demostrar el microorganismo en 10ml de la dilucin ms alta.

Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en unmnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros

grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.2.3 Duracin del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y stas debenser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparacin.


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Fig. 50 Esquemas que muestras las diferentes formas de realizar las dilcuiones

La finalidad en la realizacin de diluciones es encontrar conteos en la placa para bacterias de 25 a 250 UFC/ml ypara mohos y levaduras de 10 a 150 UFC/ml


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Fig. 51 Placas que muestran la conveniencia de realizar diluciones

Fig. 52 Placa que muestra el intervalo de lectura para mohos que es de 10 a 150 UFC y para bacterias de 25 a250 UFC


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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro se realiza principalmente en un medio slido. Seinicia por la separacin de una sola clula a partir de una poblacin y requiere tambin que la colonia que surja deesta clula se mantenga separada de otras clulas o colonias.

El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse tambin en medios lquidos, siempre que el organismo predomineen el material de partida. Por una dilucin en serie de la suspensin en un medio se consigue que en la ltimadilucin se encuentren unas cuantas que al ser sembradas quedarn separadas.

En la naturaleza generalmente existen poblaciones mixtas de microorganismos, y entre ellas se establecen

interrelaciones, estas se basan en la competencia por el sustrato comn, la tcnica utilizada y el tipo de medioseleccionado dependen de la naturaleza de la investigacin, en general podemos tener: a) se puede necesitatener una cosecha de clulas; b) puede ser necesario determinar el nmero y tipos de microorganismos presentesen una muestra o c) se puede aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural.

La siembra en placas, con una serie de condiciones, de una muestra del material, permitir producir colonias a ungrupo seleccionado de formas, pero har que muchos otros tipos pasen inadvertidos. Por esta razn es costumbresembrar en placas muestras del material usando tantos medios y condiciones de incubacin diferentes como seaposible.

El sembrado en placa en un medio slido nos proporciona clulas inmviles o dentro del medio, las cuales estarnseparadas y de ah los podremos tener en un tubo con agar inclinado para su conservacin.

Cultivo puro

Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola clula, generalmente lo realizamos para poderestudiar las siguientes propiedades.

a.- Aislamiento por estra simple para muestras con poca cantidad de microorganismos

Fig. 53 Placas con agar nutritivo y agar eosina azul de metileno (urocultivo)

b.- Aislamiento por estra cruzada

Inocular con el asa la placa y realizar las estras tal y como se muestra en el siguiente esquema


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Fig. 54 Siembra por estra cruzada en un medio selectivo y en un medio no selectivo.En ocasiones existen microorganismos que por poseer muchos flagelos invaden la capa y nos losp odemosasilaren ese medio, tal es el caso de Proteusen el medio agar sangre.

Fig.55 Placas de agar sangre sembrada por estra cruzada, en la segunda placa se puede observar el crecimientoinvasivo de un microorganismo mvil.

c.- Aislamiento por extensin con varilla

Para el asilamiento de bacterias, mohos y levaduras podemos realizar la tcnica de extensin con varilla, donde e

inculo sobre la placa con el medio es de 0,1 ml.La tcnica consiste en colocar el inculo sobre el medio de cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio ode acero inoxidable del que tenga la longitud del dimetro de la placa de Petri

Esta varilla se introduce en un frasco con alcohol y se flamea a la flama del mechero por lo menos tres veces paraesterilizarla, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar

Se deja en posicin vertical derecha por 5 minutos, y se incuba

Fig. 56 Extensin con varilla

d.- Aislamiento por la tcnica de vaciado en placa

1.- Colocar 1 mL de la dilucin que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado.

2.- Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estndar, mantenido a 45C.

3.- Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6en el sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completaincorporacin del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja.

4.- El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmentese adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.


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5.- Dejar solidificar el medio e incubar a 35 C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas, para el casode bacterias y para el caso de los mohos y levaduras de 3 a 5 das.

6.- Para el caso del Agar de papa y dextrosa se debe de acidificar el medio mediante la adicin de 1,4 ml decido tartrico al 210 % esterilizado por filtracin a cada 100 ml de medio para que el pH sea de 3,5, esteprocedimeitno se debe realizar cuando el medio este a 45C y ahora si se puede utilizar.

Fig. 57 Vaciado en placa

Los movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribucin homognea del inoculo, claro esta que con la ayudade las diluciones de tal forma que el recuento para bacterias sea de 25 a 250 Unidades Formadoras de colonias(UFC)y para mohos y levaduras de 15 a 150 UFC

En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que deseamos esver la produccin de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos productores de amilasasse utiliza el medio denominado agar almidn.

Fig. 58 Aislamiento de cepas silvestres mediante medios selectivos, por medio de halos de inhibicin, produccinde amilasas o produccin de hidrlisis

El aislamiento nos sirve para obtener la morfologa colonial, microscpica y observar alguna caracterstica comohidrlisis o hemlisis.

A. MORFOLOGA COLONIAL

Morfologa colonial en placa para bacterias

Una vez sembrada la placa la descripcin de cada una de las colonias debe incluir:

1. TAMAO: Dimetro en mm, los lmites de tamao de las colonias varan desde fracciones de milmetros hasta10 mm de dimetro. La mayora de los microorganismos forman colonias de tamao limitado al tiempo deincubacin.


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2. FORMA: Es la apreciacin general de su figura la cual puede ser: 3.- ELEVACIN: Que puede ser:

Fig. 59 esquemas de diferentes formas y elevaciones en una colonia

4. BORDE O MARGEN: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenadofilamentoso o rizado.

Fig. 60 Esquema de algunos bordes que puede presentar una colonia.

5. COLOR: Blanco, amarillo, negro, marrn, anaranjado, etc.

Fig. 61 Colonias de diferentes colores

6. SUPERFICIE: Lisa o rugosa

7. ASPECTO: Hmedo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso, granuloso

8. CONSISTENCIA: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura, esta prueba se tiene que realizar con la ayudade una asa.

9. LUZ REFLEJADA: Las colonias pueden ser brillantes o mate

10. LUZ TRANSMITIDA: Las colonias pueden ser translcidas o transparentes


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Fig. 62 Colonias con morfologias coloniales diferentes, durante el aislamiento


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CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Tanto en los cultivos estticos como continuos pueden establecerse condiciones definidas, y pueden determinarssucesiones de distintos organismos y acumulaciones de productos metablicos. A partir de aqu pueden extraerselos productos producidos por los microorganismos. Los cultivos mixtos pueden obtenerse tambin por la unin dcultivos puros, tal es el caso de las cepas que producen el Yogurt.

En ocasiones es muy difcil cultivar a los microorganismos sobre todo los parsitos y creciendo en un mediartificial, sin embargo se han ideado medios adecuados reproduciendo cuidadosamente las condiciones en el que emicroorganismo se encuentra en su medio natural, estos parmetros son el pH, tensin de oxgeno, temperaturalos nutrientes, etc.

Para los requerimientos de sales minerales y factores de crecimiento al medio se le adiciona extractos de algtejido, yema de huevo, sangre, plasma, etc.

Una vez recibida la muestr

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Técnicas Microbiológicas Parte 1