SadeSade Intestinal: Intestinal:ProbiticosProbiticos

Alda LuizaAlda Luiza Santos Santos LerayerLerayer

Centro de P & D de Laticnios -TECNOLAT ITALCentro de P & D de Laticnios -TECNOLAT ITAL

alerayeralerayer@ital.sp.@ital.sp.govgov..brbr1

Composio da Flora IntestinalComposio da Flora IntestinalEfeitos Nocivos/Patognicos Funes Promotoras de Sade

P. aeruginosaProteus

StaphylococciClostridia

Veillonellae

Streptococci

E. coliLactobacilli

BifidobacteriaEubacteria

Bacteroides

Enterococci

Inibio do Crescimentode Bactrias Nocivas

Estimulaodo SistemaImunolgico

Absoro deMinerais

Sntese de vitaminasSntese de vitaminas

Produo de toxinas Diarria/infeces Danos ao fgado Cncer Encefalopatias

Produo deCarcinognicos

PutrefaoIntestinal

2

4

8

11UFC./g de fezes - escala log10

(G.R.Gibson;M.B.Roberfroid)

Patognicas

3

Patognicos e Compostos TxicosPatognicos e Compostos Txicos

Escherichia coli e Clostridia:Amnia: toxina que ataca o fgado e crebroAminas: carcinognicasNitrosoaminas: carcinognicasFenis e Cresis: promotores de cncerIndol e Escatol: carcinognicoscido Bilitico Secundrio: carcinognico e ativo promotor de cncer de colo. Atransformao de primrio para secundrio depende do pH do clonAgliconas: mutagnicas

Bacteroidaceae e Streptococcus faecalis: Nitrosoaminas cido Bilitico Secundrio

AgliconasProteus: Amnia

AminasIndol

(Mizota)

Escherichia coli e Clostridia:Amnia: toxina que ataca o fgado e crebroAminas: carcinognicasNitrosoaminas: carcinognicasFenis e Cresis: promotores de cncerIndol e Escatol: carcinognicoscido Bilitico Secundrio: carcinognico e ativo promotor de cncer de colo. Atransformao de primrio para secundrio depende do pH do clonAgliconas: mutagnicas

Bacteroidaceae e Streptococcus faecalis: Nitrosoaminas cido Bilitico Secundrio

AgliconasProteus: Amnia

AminasIndol

(Mizota)

4

DISBIOSE INTESTINAL:desequilbrio da flora do trato GI

102

104 c

1011

ProteusStaphylococci

ClostridiaVeilionellae

Enterococci

Lactobacilli

108

StreptococciBifidobacteria

Probiticos interagem no organismo juntamente Probiticos interagem no organismo juntamentecom a flora intestinalcom a flora intestinal

Mais de 400 espciesMais de 400 espciesbacterianas no nossobacterianas no nossotrato GI (10trato GI (1014 14 m.o./g)m.o./g)

Competio paraCompetio paraocupar os 200 mocupar os 200 m22

superfcie mucosa - asuperfcie mucosa - amaior rea do corpomaior rea do corpointeragindo com ointeragindo com o

ambienteambiente

Equilbrio pode ser afetado por: dieta

antibiticos estresse

tratamentos quimoterpicos

BalanceamentoBalanceamentoentre efeitosentre efeitosbenficos ebenficos e

potencialmentepotencialmentenocivos.nocivos.

PrebiticosPrebiticos

Alim en to s Fu n c ioAlim en to s Fu n c io

ProbiticosProbiticos

Potencial de trazer benefcios sade ou de reduzir o risco de

doenas crnicas, alm das suasfunes nutritivas bsicas

5

Mtodos moleculares usados para avaliar diretamente a diversidade de espcies e para enumerarmicrorganismos presentes em amostras gastrointestinais.

A informao originada dos genes 16S rRNA amplificados diretamente das amostras usando PCR pode ser usada paracaracterizar as espcies, desenhar grupos especficos de primers para D/TGGE (denaturing ou temperature gradient gelelectrophoresis) ou construir sondas (oligonucleotdeos) para enumerao direta dos grupos filogeneticamente relacionadosde bactrias usando hobridizao in situ (FISH) ou dot blot.

Estudos genEstudos genticosticos de dehumanoshumanos e e

microrganismosmicrorganismosdeterminardeterminaroo::

como tais interaespodem afetar a sade elongevidade humanas

que sistemas decomunicao so usados

e como podero serinfluenciados para

beneficiar os hospedeiros

DefinioDefinio

Conceito Probitico: mais de 100 anos

Probiticos so organismos vivos que, quando ingeridos em ingeridos emconcentraes adequadas, afetam beneficamente a sade do consumidorconcentraes adequadas, afetam beneficamente a sade do consumidor

(Reid et al., 2003)

Conhecim ento cientfico e ferram entas para avaliaode efeitos benficos sade e potencial para prevenir

doenas so recentes

Probiticos - FatosProbiticos - Fatos

Habitat e local de ao: mucosas F intestino

Interagem no organismo juntamente com a floraintestinal

Lactobacillus e Bifidobacterium

Exercem efeitos benficos no hospedeiro

12

PrebiticoPrebiticoIngrediente alimentar nodigervel pela maioria dos

microrganismos do intestino,que afeta beneficamente ohospedeiro pelo estmulo

seletivo do crescimento e/ouatividade de um nmero

limitado de bactriasprobiticas que tm

potencialidade de melhorar asade do hospedeiro(Sanders et al., 1999).

3. Deve ter ummetabolismo seletivo

1. Deve permanecerestvel sobcondies

cidas e com assecrees do

intestino delgado

2. Deve setransferirintacto no

clon

Prebiticos possuem ligaes qumicasdiferenciadas entre as unidades de acares,resistentes hidrlise pela acidez do estmago eenzimas digestivas do trato gastrointestinal superiore do intestino

No hidrolisados nem absorvidos no intestino delgado No so utilizados pela flora bucal (baixa cariogenicidade) No intestino grosso so fonte de carbono para bactrias bfidas

FATORES BIFIDOGNICOS

Simbitico =Simbitico = Probiticos + prebiticos

So alimentos funcionais que em geralSo alimentos funcionais que em geraldeveriam conter um componente prebiticodeveriam conter um componente prebitico

que favorea o efeito do probiticoque favorea o efeito do probiticoassociado.associado.

Dose efetiva: Dose efetiva:

- crian - crianas: as: 1 a 3 g/d1 a 3 g/d

- adultos: 5 a 15 g/d - adultos: 5 a 15 g/d

Prebiticos contm misturas decarboidratos com cadeias de diferentestamanhos dificultando determinao da

dose dos componentes ativos

Estudos adicionais so necessrios

Caractersticas desejveis nosmicrorganismos Probiticos

PARA QUE AFETEM BENEFICAMENTE A SADE DOPARA QUE AFETEM BENEFICAMENTE A SADE DOCONSUMIDOR DEVEMCONSUMIDOR DEVEM::

Ser habitantes normais do trato gastrointestinalSer habitantes normais do trato gastrointestinal

,

XXSobreviver aps passagem pelo estmago (resistncia ao sucoSobreviver aps passagem pelo estmago (resistncia ao sucogstrico e bile)gstrico e bile)

- linhagens variam - linhagens variam seleo - seleo - encapsulaencapsulaoo

16

Bio after 14 days conservation

Bio after 24 days conservation

Product n2 after 14 days conservation

f

i

30

2

60

Time (minutes)

0

1

3

4

5

67

8

90

Bifidobacterium animalis DN-173 010 survives in the human stomach

n=10

Log

10 (B

ifido

bact

eria

cfu

/g)

Bio after 14 days conservation

Bio after 24 days conservation

Product n2 after 14 days conservation

f

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30

2

60

Time (minutes)

0

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3

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90

Bifidobacterium animalis DN-173 010 survives in the human stomach

n=10

Log

10 (B

ifido

bact

eria

cfu

/g)

SobrevivnciaSobrevivncia de de linhagenslinhagens de deBifidobacterium Bifidobacterium no estmago humanono estmago humano

Produto 1 com 14 dias

Produto 1 com 24 dias

Produto 2 com 14 dias

N=10

Tempo (minutos)

Caractersticas Desejveis nos MicrorganismosCaractersticas Desejveis nos MicrorganismosProbiticosProbiticos

Caractersticas Desejveis nos Microrganismos ProbiticosCaractersticas Desejveis nos Microrganismos Probiticos

Ter identificaTer identificao taxono taxonmica precisamica precisa

Colonizar a mucosa intestinalColonizar a mucosa intestinal

Manter viabilidade e atividade no intestinoManter viabilidade e atividade no intestino

Estar ativos no alimento antes de seu consumoEstar ativos no alimento antes de seu consumo

Ser continuamente ingeridosSer continuamente ingeridos

Dose mnima: 10Dose mnima: 1077 ufcufc/g/g

Quantos probiticos viveis atingem Quantos probiticos viveis atingem os os stiosstios--alvo alvo ??????

18

Efeitos BenficosEfeitos Benficos tratamento e preveno de tratamento e preveno dediarria aguda causada pordiarria aguda causada porrotavrus em crianasrotavrus em crianas

Inibio de crescimento e Inibio de crescimento eadeso deadeso de enteropatgenos enteropatgenos

Bifidobacteria

(4)

Reduzcolesterol

(2)

Influncia positiva na floraintestinal

Inibe crescimento depatognicos e putrefativos

Protege contra infecesintestinais

(6)

Produzvitaminas docomplexo B,cido flico

(9)

Restaura flora intestinalnormal aps uso de

antibiticos balanceamentoda flora especialmente em

criancas e idosos

(1)

Reduz pH intestinal

(3)

Melhora do funcionamentointestinal

Elimina constipao leve(7)

Reduz amnia eoutros compostos

txicos

(8)

Estimula resposta dosistema imunolgico

Imunomoduladoras-ao contra clulas

malgnas

(adaptado de Gibson; Roberfroid -1994)

(5)

Aumento datolerncia edigesto da

lactose

Estudos Estudos in vitroin vitro e e in vivoin vivocom com L.L. rhamnosus rhamnosus GG, GG,bifidobactrias ebifidobactrias ePropionibacteriumPropionibacterium sp., sp.,mostraram decrscimo domostraram decrscimo docancergeno aflatoxinacancergeno aflatoxina

Atividade suprimida Referncia

Crescimento celular edeficincia de clulas emcultura de tecido

Barricault et al., 1995

Criptas aberrantes em culturade tecido de animais

Rowland et al., 1998; Rao etal.,1999

Tumores em ratos (clon,fgado, mama)

Reddy & Riverson, 1993; Goldinet al., 1996; Adachi, 1992

Atividades enzimticas(nitroredutase, -glucuronidase,azoredutase, 7-- dehidroxilase, etc)involvidas na converso deprocarcingenos nas fezes deanimais de lab. e de humanos;nem todos os parmetros forampositivamente influenciados emtodos os estudos

Ling et al., 1994

McConnel & Tannock, 1993Goldin et al., 1980

Atividade mutagnica Renner & Munzner, 1991

Genotoxicidade Venturi et al., 1997

Atividades

dos

probiticos

que podem

interferir

na reduo

do risco de

cncer

Sanders (1999)

Atividadeanticancergena

Efeitos Profilticos e TeraputicosEfeitos Profilticos e Teraputicos

No h evidncias clnicas suficientes para provar uma correlaoNo h evidncias clnicas suficientes para provar uma correlaoentre probiticos e efeitos entre probiticos e efeitos anticancergenosanticancergenos..

BiomarcadoresBiomarcadores

bioqumicos, moleculares ou baseados em alteraes patolgicasbioqumicos, moleculares ou baseados em alteraes patolgicas

(proliferao aumentada de clulas) e gua fecal(proliferao aumentada de clulas) e gua fecal

Validao da Validao da genotoxicidade genotoxicidade da gua fecal necessria, porm:da gua fecal necessria, porm:

gua fecal de voluntrios sadios que se alimentaram com iogurtegua fecal de voluntrios sadios que se alimentaram com iogurte

probitico (probitico (L. L. acidophilusacidophilus, , B. longumB. longum, 300g/dia) apresentou, 300g/dia) apresentou

genotoxicidadegenotoxicidade modificada em relao a amostras de indivduos que modificada em relao a amostras de indivduos que

consumiram iogurte no probitico consumiram iogurte no probitico ((OberreutherOberreuther--Moschner Moschner et et alal., 2004)., 2004)

Mecanismo envolvido no efeito Mecanismo envolvido no efeito anticnceranticncer dos probiticos? dos probiticos?

Helicobacter pylori na mucosa gstricawww.galenored.com/socgastro/ images/BatchImage9.jpg

Helicobacter pylori

Bacilo espiralado Gram negativo Coloniza a mucosa gstrica

Associada ao des. de gastrite crnica, lcera ecncer de estmago

in vitroin vitro e em animais e em animais: : Lactobacilos e bifidobactriasinibiram o crescimento ou adeso do patgeno e patgeno ediminuir a atividade da enzimadiminuir a atividade da enzima urease urease, necessria para, necessria paraa sua permanncia no ambiente estomacal.a sua permanncia no ambiente estomacal.

UreaseUria Amnia

Aumento de pH no estmago,promovendo colonizao do m.o.

Tratamento normal: inibidoresantimicrobianos. Levam aoaparecimento de bactrias

resistentes.

Por Porm, a erradicam, a erradicao de o de H.H. pylori pylori n no podeo podeser confirmada por biser confirmada por bipsias do estpsias do estmagomago

Efeitos Profilticos e TeraputicosEfeitos Profilticos e Teraputicos

Efeitos Profilticos e TeraputicosEfeitos Profilticos e Teraputicos

. REDUO DOS NVEIS DE COLESTEROL. REDUO DOS NVEIS DE COLESTEROL

.. MODULAO DA ABSORO DE AMNIA MODULAO DA ABSORO DE AMNIA

.. SNTESE DE VITAMINAS DO COMPLEXO BSNTESE DE VITAMINAS DO COMPLEXO B

.. ABSORO DE CLCIOABSORO DE CLCIO

.. MODULAO DO SISTEMA IMUNOLGICOMODULAO DO SISTEMA IMUNOLGICO

ImunomodulaImunomodulao o In vitroIn vitro e e In In vivovivo por por linhagenslinhagens probi probiticasticasMercenier et al., 2002

Probitico Alvo Avaliao Efeito Referncia Bifidobacteria, lactobacilli , L. lactis

PBMC In vitro TNF-, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, IFN-.Bactria viva > morta. Especificidade de linhagens. Correlao mRNA - protenas (exceto IL-18)

Miettinen et al., 1996; Miettinen et al., 1998

Lactobacilli Clulas dendrticas

In vitro IL-12, IL-6, TNF- e MHC II (L. casei > outras LAB >L.reuteri). Alta variao entre linhagens

Christensen et al, 2002

L. casei. L. acidophilus

Ratos (ig) In vivo Ex vivo

Fagocitose e atividade linfocitria Perdigon et al., 1988

Lactobacilli, bifidobacteria. S.thermophilus

Ratos (ig)

In vivo Ex vivo

Pequena variao de TNF-, IL 12, INF-, NO, IgA, IgG in vivo. CK de clulas peritoniais reestimuladas in vitro.

Tejada- Simon et al., 1999

Lactobacilli Ratos (oral) In vitro IEL, IgA + clulas (todas as linhagens) CD4+ (L.casei), CD8+ (L.plantarum)

Vitini et al., 2000

L. casei Ratos (ig) In vitro Proteo contra S. typhimurium especifidade intestinal, IgA

Perdigon et al., 1991

L. casei Shirota Ratos (ig) + OVA

Ex vivo IgE anti-OVA,Th1 CK, Th2 CK in vitro Matsuzaki et al.,1998 B. bifidum, L. johnsonii Lal

Humanos (oral) In vivo Ex vivo

fagocitose de granulcitos e moncitos Schiffrin et al., 1995; Schinffrin et al 1997

L. johnsonii Lal Humanos (oral) In vivo Ex vivo

fagocitose Donnet-Hughes et al., 1999

B. lactis Idosos (oral) In vivo Ex vivo

INF (PBMC), fagocitose (PMN) Arunachalam et al., 2000 B. lactis Humanos (oral) In vivo

Ex vivo fagocitose (PMN) e atividade NK Chiang et al., 2000

L. rhamnosus GG

Crianas (oral) Enterite por rotavrus

In vivo IgA, IgM, IgG, anti-rotavirus IgA Kaila et al., 1992; Kaila et al., 1995

Bifidobacteria L. johnsonii Lal

Humano (oral)+ S.typhi

In vivo IgA total e IgA anti-S.typhi Link-Amster et al., 1994

L. rhamnosus GG

Humano (oral) Saudvel ou alrgico

In vivo Indivduos saudveis receptores de fagocitose (neutrfilos,moncitos). Indivduos alrgicos a leite:Regulao

Pelto et al., 1998

: induo ou aumento; : inibio ou decrscimo; G+: gram positiva; G-: gram negativa; Th: T helper; NK: natural killer; CK: citocinas; M: macrfago;ig: intragstrico; ip: intraperitonial; iv: intravenoso; PBMC: clulas sanguneas mononuclerares perifricas; PMN: clulas mononucleares polimrficasPP: Peyers Patch, OVA: ovoalbumina.

Mercado de Mercado de Produtos Produtos ProbiticosProbiticos

Alimentos Funcionais no mundo: 1998: US$ 22 bi 2010: US$ 250 bi

Aumentando mundialmente e no Brasil procura maior por alimentos que promovem sade foco estratgico de marketing

Probiticos:Probiticos: 2 3% do mercado de funcionais (diversos produtos) 10 20% do mercado de queijos - devendo ser togrande quanto esse mercado em poucos anos

Para Para issoisso:: - Necessidade de novas culturas probiticas isolamento, seleo ecaracterizao;- Comprovao das alegaes funcionais Biomarcadores Garantia de permannciade bactrias viveis durante toda vidacomercial do produto.

25

D

D

DN

DLLLLLFP

Tcnicas para Tcnicas para a a identificao deidentificao debactriasbactrias

Cultivo em meio seletivo

Testes bioqumicos

Perfil metablicoPerfil metablico ( (BiologBiolog))

Perfil Gentico (PCR-DGGE do rDNA 16S)Perfil Gentico (PCR-DGGE do rDNA 16S)

RAPDRAPD

Hibridizao DNA DNA Mtodos de referncia

B. longumL. paracasei

L. paracasei

B.longum L.acidophilus

L.acidophilus

L. paracasei

Taxonomia molecularTaxonomia molecular

IdentificaIdentificaooconclusivaconclusiva

Rastreamento

ProdutoProdutoprobiticoprobitico

InvestigaInvestigaesesclclnicasnicas

Assegura integridade Assegura integridade do do estudoestudo//produtoproduto

Biomarcadores(enzimas, cidos orgnicos -

monitorados por microarray demRNA - chip de proteoma)

PrebiticoProbiticosimbitico

AvaliaAvaliao o global da global da expressexpresso go gnica nica de de bactbactriasriasprobiprobiticas durante ticas durante trtrnsitonsito nono TI por TI por transcriptomatranscriptoma

((Corthier Corthier & & AnbaAnba, 2003), 2003)

Bactria lctica ou probitica

Ingesto via alimento lctico

Sequncia do Genoma da bactria conhecido

DNA totalisolado dacondio I

DNA totalisolado dacondio II

Marcao com fluorescncia RT

Marcao com fluorescncia RT

HibridizaHibridizao no o no Chip de DNA Chip de DNA

Anlise

28

Purificao e concentrao do DNA marcado

RNA Sntese de cDNA purificao

marcao com Cy3 ou Cy5

Hibridizao em lmina de array para a bactria em estudo

Bactria Linhagem Tamanho (Mb)

Responsvel Instituio

Finalizados Lactobacillus johnsonii NCC533 2,0 D. Pridmore Nestl, CH L. acidophilus ATCC700396 2,0 T. Klaenhammer NCSU, EUA NCFM WCFS, NL L. plantarum WCFS1 3,3 M. Kleerebezem Nestl, CH Bifidobacterium longum NCC2705 2,3 F. Arigoni Em andamento L. casei BL23 2,6 J. Deutscher, A Hartke INRA/CNRZ L. helveticus CNRZ32 2,4 J. Steele Univ. Caen, FR L. rhamnosus LAN001 2,4 M. Lubbus Univ. Winconsin, EUA Bifidobacterium breve NCIMB8807 2,4 D. Jan Sinderen Univ. College Cork, IRL Propionibacterium

freudenreichii ATCC6207 2,6 H. Pel, J. Sikkema DSM, Frierland C. Dairy

Food, NL

Projeto conjunto: Genome Institute/LAB Genome Consortium (JGI/LABGC) L. gasseri ATCC33323 1,8 T. Klaenhammer NCSN, EUA L. casei ATCC334 >2,2 J. Broadbent Utah Univ., EUA Bifidobacterium

longum DJ010A 2,1 D.OSullivan Univ. Minnesota, EUA

SeqnciamentoSeqnciamento de de genomasgenomas de de bactriasbactrias probiticas probiticas

Fonte: Klaenhammer, T. et al. (2002); Reid, G. et al. (2003)

33

Funo proposta Potencial envolvimento de genes

Produto do gene Referncias

Resistncia a pH cido atpBEFHAGDC F1F0-ATPase Kullen and

Klaenhammer, 1999 Resistncia a Bile bsh Hidrlise de sais biliares Moser and Savage,

2001

Alivio da intolerncia

lactose lacZ -galactosidase Mustapha et al., 1997

Excluso de patgenos pln operon Produo de plantaricina Diep et al., 1996 Colonizao / Adeso cnb Protena ligada colgeno Roos et al., 1996 bspA Proteina de superfcie A Turner et al., 1999

dlt cido lipoteicico Granato et al., 1999 mub Adeso/muco Roos, 1999 slpA/B Protena de camada S Boot and Pouwels,

1996 Aglutinao aggH Auto-aglutinao Roos et al., 1999

Genes com potencial probitico funcional identificados

Agregao Auto agregao

Estudos feitos na Blgica:Estudos feitos na Blgica: 55 produtos probiticos do

mercado foram examinados(alimentos funcionais esuplementos).

Somente 11 de 55 (20%)continham todostodos osorganismos listados naembalagem

9 dentre os 55 (16%), nonocontinham nenhum dosingredientes funcionaislistados

11 dentre 30 (37%) produtossecos nono continhamingredientes vivosClemens, 2001

Sade Intestinal:ProbiticosPatognicos e Compostos TxicosDefinioProbiticos - FatosPrebiticoSimbitico =Caractersticas desejveis nos microrganismos ProbiticosCaractersticas Desejveis nos Microrganismos ProbiticosEfeitos BenficosAtividade anticancergenaEfeitos Profilticos e TeraputicosTcnicas para a identificao de bactrias