aula6+PCR+e+sequenciamento

7/24/2019 aula6+PCR+e+sequenciamento

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QBQ 126 Biologia Molecular

PCR

Sequenciamento de DNA


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1 molcula DNA 109 molculas

30 ciclosde PCR

Tcnica foi criada por Karry Mullis em 1983.

Prmio Nobel em Qumica em 1993.

A tcnica explora as caractersticas da

eplicao do DNA.

Objetivo: produzir milhes de cpias de DNApartir de quantidades iniciais muito pequenase DNA.

Histrico

The PCR method acopying machine for

DNA molecules

PCR (Reao em cadeia da polimerase


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Hotsprings at Yellowstone National Park

DNA polimerase termicamente estvelda bactria Thermus aquaticus


Taq DNA polimerase:

~700C, temperatura tima da Taq DNA polimerase


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1-DENATURAO (950C)

2-HIBRIDIZAO DOS PRIMERS (550

C3-EXTENSO (720C)

Ciclo de PCR e suas etapas



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-Primers: ~18-20 nucleotdeos

-Regio amplificada: em geral 50-2000 pb, ma

pode ser maior

-Duas caractersticas importantes da PCR:sensibilidade e especificidade


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PCR em tempo real quantitativa (qPCR)


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Aplicaes

Mdica- testes genticos para identificao deoenas, diagnsticos de doenas infecciosas,studos de mutaes, teste pr-natal etc.

Anlise Fornsica

Teste de Paternidade

Pesquisa bsica e aplicada- clonagem e

mplificao do DNA, anlise da expressonica etc.



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Uso da PCR para se clonar um gene ou cDNA

Aplicaes


RT-PCR


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Anlise de sequncia microsatlite hipervarivelou VNTR (nmero varivel de repetiesn tandem)

Aplicaes



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Anlise de sequncia microsatlite hipervarivelou VNTR (nmero varivel de repetiesn tandem)

Aplicaes



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Anlise fornsica

Aplicaes



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SEQUENCIAMENTO DE DNA


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Gilbert Sanger

Sequenciamento qumico Sequenciamento enzimti

No final da dcada de 70 dois mtodos de sequenciamento deDNA foram desenvolvidos:


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Mtodo de Sanger ou de terminao de cadeia comdidesoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTPs)


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(Mtodo manual)


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(Mtodo automtico)


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(Mtodo automtico)

Eletroforeseem capilar


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Sequenciamento de Genomas


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Marcos no sequenciamento genmico


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O genoma humano


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SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)

Variaes na sequncia genmica entre indivduos

CNVs:Copy Number Variation)

Quando o nmero de cpias de umeterminado gene varia de um

ndivduo para outro.


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Variaes na sequncia genmica entre indivduos

Anemia falciforme: exemplo onde SNPs causa alterao nasequncia de aminocidos


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Sequenciamentode nova gerao

quencing centers producing the Sanger sequence

a for mammalian genome projects are factory-like

fits with a large number of personnel.

ria Nemenuk, Broad Institute Nature Methods - 5, 16 - 18 (2008)

The latest next-generation sequencing instrumentscan generate as much data in 24 h as several

hundred Sanger-type DNA capillary sequencers,

but are operated by a single person.

Sequenciamentoautomtico de DNA

ovas tcnicas de sequenciamento de DNA permitemsequenciamento de milhes de pares de bases em

ma nica corrida


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Next generation sequencingsequenciamento de nova gerao)

Sequenciamento automtico de Sanger (1 gerao).Tecnologias desenvolvidas aps esta so conhecidas comequenciamento de nova gerao.

lataformas mais comuns:

54 (Roche)OLiD (Applied Byosysthems)olexa (Illumina)

Bioinformtica!!


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