Avanços na Transformação Agrícola na Era da Edição de Genomas

Giancarlo Pasquali

Universidade Federal do Rio Grande do SulInstituto de Biociências & Centro de Biotecnologia

Biossegurança frente às Novas Metodologias de Melhoramento Genético de Plantas como a Edição de DNA

Tópicos

1.Edição de DNA: principais metodologias

2.Vantagens e aplicações das técnicas de edição de DNA a vegetais

3.Exemplos de plantas geradas por edição de DNA

4.Organizações envolvidas

5.Biossegurança relativa à edição de DNA em plantas

Edição de DNA: Principais Metodologias

Meganucleases - 2001 - Engineered Meganuclease Re-engineered Homing

Endonucleases

ZFN - 2003 - Zinc Finger Nucleases (Nucleases do Tipo “Dedos-de-Zinco”)

TALENs - 2009 - Transcription Activator-like Effector Nucleases (Nucleases Efetoras

Semelhantes a Ativadores da Transcrição)

CRISPR/Cas9 - 2012/2013 - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

/Cas9 System (Agrupamentos de Repetições Palindrômicas Curtas

Interespaçadas Regularmente/Sistema Cas9)

CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Genome Editing with CRISPR-Cas9Published on Nov 5, 2014

This animation depicts the CRISPR-Cas9 method for genome editing – a powerful new technology with many applications in biomedical research, including the potential to treat human genetic disease. Feng Zhang, a leader in the development of this

technology, is a faculty member at MIT, an investigator at the McGovern Institute for Brain Research, and a core member of the Broad Institute. Further information can be found on Prof. Zhang’s website at http://zlab.mit.edu.

https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8

Wiedenheft et al. (2012) RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature 15: 331 (doi: 10.1038/nature10886)

Mali et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339: 823(doi:10.1126/science.1232033)

Ann Ran et al. (2013) Nature Protocols 8: 2281 (doi:10.1038/nprot.2013.143)

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology

New England Biolabs Inc. - CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing

http://www.artofthecell.com/animation/crispr-cas9-gene-editing

ZFNsZinc Finger Nucleases

Urnov et al. (2010) Genome editing with engineered zinc fingernucleases. Nature Reviews Genetics 11: 636

Isalan (2012) Zinc-finger nucleases: how to play two good handsNature Methods 9: 32

ZFNsZinc Finger Nucleases

http://cen.acs.org/articles/87/i30/Knockout-Rats-Easy-Way.html

Each zinc finger protein (Zn is silver) iscoupled to a FokI domain (central ribbonstructures). When two of the proteins bindto their target sequence, the FokI domainsjoin and create a double-strand break.

Credit: Sangamo Biosciences

TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)

Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors:customizable proteins for DNA targeting.Science 333: 1843(doi: 10.1126/science.1204094)

TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)

Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333: 1843 (doi: 10.1126/science.1204094)

Structure of a TAL effector protein wrapped arounda DNA double helix. Image based on data fromMak et al. (2012) Science

http://mcgovern.mit.edu/news/?attachment_id=1807#sthash.xuVcALVi.dpuf

Engineered Meganuclease Re-engineeredHoming Endonucleases

Meganucleases are endodeoxyribonucleases characterized by a large recognition site:

double-stranded DNA sequences of 12 to 40 base pairs.

Grizot et al. (2009) Nucleic Acids Research 38: 2006 (doi:10.1093/nar/gkp1171)

Crystal structure of I-DmoI meganuclease in complex with its target DNA.

Marcaida et al. (2008) PNAS 105: 16888

Cientistas da Cellectis(França) desenvolveram umacoleção de mais de 20.000 domínios proteicos a partirda meganucleasehomodiméricaI-CreI, assim como para outros arcabouços de meganucleases.

Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA

Edição direta de sequências cromossômicas sem extensos

programas de melhoramento

vs

Melhoramento genético tipicamente obtido por métodos

aleatórios seguido de seleção, incluindo:

Indução de mutações aleatórias

Cruzamentos genéticos

Transformação genética mediada por agrobactérias, biobalística, etc.

Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA

Silenciamento por “deleção”: as nucleases direcionadas a sítios

específicos do genoma promovem quebras de dupla fita (DSB).

Ao reparar a quebra de DNA, a célula inadvertidamente rompe a

sequência gênica, adicionando ou removendo alguns

nucleotídeos (união terminal não-homóloga ou nonhomologous

end-joining - NHEJ).

Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA

Correção de genes: ao combinar ao sistema da nuclease um

fragmento de DNA exógeno com complementaridade às

extremidades do DNA clivado, a sequência-alvo pode ser

reescrita por reparação dirigida por homologia (homology

directed repair - HDR).

Especificidade: a tecnologia CRISPR/Cas9 potencialmente possui

uma razão de um erro a cada 100 bilhões de bp (teoria), ou seja,

especificidade suficiente para aplicações em pesquisa.

Edição de DNA – Vetores

Integração de DNA: plantas transgênicasTransformação mediada por agrobactérias.

Injeção de 3 RNAs ou Cas9 + 2 RNAsEletroporação, choque osmótico, biobalística.

Exemplos de Plantas Geradas por Edição de DNA

1....

http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2015.01.010

Araki & Ishii

Disease R

Oil Qlity

Disease R

Herbicide

Nutrition

Exemplos de Organizações Atuando em Edição de DNA

http://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/genome-editing/genome-editing-publications/genome-engineering-poster.html#

Exemplos de Organizações Comerciais(ordem alfabética)

Cellectis – Meganucleases

Dow – ExZact™ – ZNF

Horizon Discovery – GENASSIST™ – CRISPR/Cas9

New England Biolabs – CRISP/Cas9

OriGene – CRISPR/Cas9

Precision Biosciences – Meganucleases

Sigma (Aldrich) Life Science – CompoZr™ – ZNF & CRISPR/Cas9

Thermo Fisher Scientific – CRISPR/Cas9

Addgene – TAL Effectors & CRISPR/Cas9

Life Technologies – GeneArt® Precision TALs – TALENs & CRISPR/Cas9

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

A edição de DNA permite o melhoramento vegetal sem a

introdução de transgenes. Permite gerar plantas semelhantes ou

essencialmente idênticas àquelas geradas por técnicas

convencionais de melhoramento, criando fronteiras indistinguíveis

para a regulamentação de OGMs.

Transgênese vs Cisgênese vs Intragênese: a engenharia genética

convencional é trabalhosa e requer longa e intensa seleção para

encontrar os vegetais mutantes desejados.

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

Off-target effects: a ocorrência de mutações não-alvo é a mais

forte crítica ao emprego das tecnologias de edição de DNA.

Pesquisadores vem desenvolvendo estratégias que permitirão

reduzir a um mínimo a possibilidade de mutações não-alvo.

Aumento do tamanho de RNAs guias

Emprego de duas CRISPR/Cas9 combinadas com quebras

de fitas-simples

Canela et al. (2015) Collateral DNA damage produced by genomeediting drones: exception or rule? (Review)Molecular Cell 58: 565

Translocations Discovered by LAM-PCR HTGTS (human DNA-edited)

(A) Top: CRISPR/Cas9 wild-type (left) and D10A nickase (right) generates DSBs and DNA nicks, respectively, leading to on-target and potentially off-target DSBs; aberrant fusions of the DNA ends can cause chromosomal translocations. Bottom: scheme of LAM-PCR HTGTS technology to detect novel translocation partners. Cartoon illustrates the arrangement of chromosomes into three distinct territories within the nucleus. The highlighted square indicates the enlarged view of the on-target (red) and off-target (green) DSBs that are in proximity to each other, thus promoting translocations. Following DNA extraction and shearing, a biotinylated primer specific to the bait DSB is extended, amplifying the hybrid fragment on-target-off-target (bait-prey). The product is subsequently purified with streptavidin and ligated to an adaptor, allowing PCR amplification followed by the identification of the off-targets by next-generation sequencing.

(B) Circos plot illustrating the different type of translocations discovered by the HTGTS method, including off-targets DSB ‘‘hotspots,’’ widespread DSBs reflecting non-specific and endogenous DSBs, and inter-homologous fusions involving DSBs generated on both homologous chromosomes. CRISPR/Cas9 (D10A nickase) suppresses translocation hotspots and reduces widespread DSBs in contrast to wild-type CAS9, although inter-homologous fusions at the bait chromosome still persist.

(C) Combination of a known DNA break instigator (CRISPR/Cas9; leading to translocation pattern depicted by red lines, bottom) together with an uncharacterized genomic mutator (e.g., TALEN or AID, top) reveal novel translocation partner induced by the latter (blue lines, bottom).

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

Off-target effects: plantas mutantes geradas por agentes

mutagênicos clássicos (raios X ou químicos) apresentam

(inúmeras) mutações não-alvo (e raríssimamente investigadas).

Qual é a diferença entre produtos?

Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança: “Organismo vivo

modificado é qualquer organismo vivo que possua uma nova

combinação de material genético obtida por meio do uso da

biotecnologia moderna.”

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

Plantas geradas por edição de DNA podem gerar segregantes

nulos, isto é, linhagens sem quaisquer transgenes ou insertos de

DNA exógeno integrados nos cromossomos e, assim, escapariam

da definição do Protocolo e das regulamentações sobre OGMs.

Lei Brasileira de Biossegurança (No 11.105): “Organismo

Geneticamente Modificado - OGM: organismo cujo material

genético – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica

de engenharia genética.”

Process-based GMO Regulations:

União Europeia, Austrália e Nova

Zelândia: mais exigentes

A adição de sequências/genes mediada

por HDR (reparação dirigida por

homologia) será regulamentada.

A introdução de indels por NHEJ (união

terminal não-homóloga) será

regulamentada na EU, mas não na Nova

Zelândia (Suprema Corte vs EPA).

Product-based GMO Regulations:

EUA, Argentina e Canadá: menos

restritivas

A adição de sequências/genes mediada

por HDR (reparação dirigida por

homologia) será regulamentada.

A introdução de indels por NHEJ (união

terminal não-homóloga) não será

regulamentada.

Araki & Ishii (2015) Trends in Plant Science 20: 145

Araki & Ishii (2015) Towards social acceptance of plant breeding by genome editing. Trends in Plant Science 20: 145 http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2015.01.010

The presumed regulatory relevance of crop mutants generated with genome editing technology.