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Biologia Molecular
Básica e AplicadaPrimeira Oficina de Trabalho das Redes Nacionais de Laboratórios
Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini
Pesquisadora do Depto. de Clínica Médica da FMB
Responsável pelo Lab. de Biologia Molecular do Hemocentro-Botucatu
Biologia Molecular
Básica e AplicadaPrimeira Oficina de Trabalho das Redes Nacionais de Laboratórios
Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini
Pesquisadora do Depto. de Clínica Médica da FMB
Responsável pelo Lab. de Biologia Molecular do Hemocentro-Botucatu
H
A* A* T* T* C*C* G*G*
CTGACTTCGACAAGACTAAA
CTGACTTCGACAAGACTAAA
CTGACTTCGACAAGACTAAA
CTGACTTCGACAAGACTAAA
CTGACTTCGACAAGACTAAA
GAC
GAC
GAC
GAC
GACTGAAGC*
TGAAGCTGTTCTG*
TGA*
TGAAGCTGTTCTGATTT*
T*
TGAAGCTGTTCTG*CTGACTTCGACAAGACTAAAGAC
GACTGAAGC*
GACTGAAGCTGTTCTG*
GACTGA*
GACTGAAGCTGTTCTGATTT*
GACT*
TGAAGCTGTTATG*GAC
TGAAGCTGTTA*GAC
GACTGAAGC*GACT*
GACT*
GACTGAAGC*GACT*
GAC TGAAGCT*
GAC TGAAGCT*
GACTGAAGCTGTTCTGATTT*
GACTGAAGCTGTTCTGATTT*
GACTGAAGC*
DNA Fita Simples
5’
3’
3’
5’
Fragmentosmaiores
Fragmentosmenores
3’ 5’
3’ 5’
Eletroforese
Complementaridade
de
Cadeias
A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES NO
GENÓTIPO VIRAL
GENOTIPAGEM
A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES NO
GENÓTIPO VIRAL
GENOTIPAGEM
Genes Estruturais
Genes Regulatórios
Genes Estruturais
Genes Regulatórios
HETERODÍMERO
P51
450 aa
P66
560 aa
RNA
cDNA
cDNA
DNA
Asp – Thr - Gly
TRATAMENTO
INIBIDORES DA TRANSCRIPTASE
REVERSA
FASES PRECOCES
INIBIDORES DA PROTEASE
FASESTARDIAS
INIBIDORES DA PROTEASE
VÍRUS SELVAGEM (WILD TYPE)
VÍRUS MUTANTE
MUTAÇÕESSILENCIOSAS ALTERAÇÕES DE AA
RESISTÊNCIARESISTÊNCIA
FENOTIPAGEM
GENOTIPAGEM
INTPR TR
Extração de RNAExtração de RNA
RT- PCRRT- PCR
Extração de DNAExtração de DNA
PCR PCR
DNA genômicoTaq polimerasePrimers Tampão
dCTPdATPdGTPdTTP
94ºC 72ºC57ºC
PRODUTO DA PCRPRODUTO DA PCR
NESTED PCRPR
NESTED PCRTR
Descrita por Sanger et al em 1977
nucleotídeo análogoPCR
Dideoxinucleotídeo
4,66
2,76
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (semanas)
Ca
rga
Vir
al
(lo
g)
Transcriptase Reversa Protease
Mutações ausentes L10V
Resistência ausentesTerapia InstituídaCategoria
AZT-ddI-IDVVirgem de terapia
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO
Estudos de comparação da expressão em diferentesEstudos de comparação da expressão em diferentestecidos tecidos ou diferentes condições em ou diferentes condições em que umaque umapopulação de células possa estar submetida.população de células possa estar submetida.
MICROARRAYSMICROARRAYS ((biochipsbiochips, chips de DNA), chips de DNA)..
Princípio: Complementaridade entre as duas fitas.Princípio: Complementaridade entre as duas fitas.
MICROARRAYSMICROARRAYS
Lâmina de vidroFita SimplesDNA, cDNA
MICROARRAYSMICROARRAYS
Robô de alta precisãoRobô de alta precisãoCoordenadas XYZCoordenadas XYZ
SpotsSpots criados por agulhas criados por agulhas 8080--150 150 uum m
Até 80.000 Até 80.000 spotsspots
10.00010.000--20.000 20.000 spotsspotsmais comunsmais comuns
MICROARRAYSMICROARRAYS
mRNA - cDNA tecido normal mRNA - cDNA tecido tumoral
Marcadores
Fluorescentes
Mistura em concentrações iguais.
Desnaturação
MICROARRAYSMICROARRAYS
Verde Verde –– tecido normaltecido normal
Vermelho Vermelho –– tecido tecido tumoraltumoral
AmareloAmareloTecido normal + tecido Tecido normal + tecido tumoraltumoral
Preto - não houve hibridização
As cores do microarray
Diferentes AplicaçõesDiferentes Aplicações
Monitorar as condutas clínicasMonitorar as condutas clínicas
e os procedimentos cirúrgicos.e os procedimentos cirúrgicos.
Arte gráfica: Adriana, Rejane, minhas alunas.
