Testes utilizados em Imunologia Clínica

Profa Alessandra Pardini

SISTEMA IMUNOLÓGICO

RESPOSTA ESPECÍFICA

RESPOSTA HUMORALLy B - anticorposRESPOSTA CELULARLyT - CD4+/CD8+

AntígenosDefinição

São substâncias químicas capazes de induzir resposta imune específica, pois são estranhas ao sistema imune, normalmente induzem a formação de anticorpos ou de resposta celular, ou ambas

Antígeno é toda a estrutura capaz de reagir com as células do sistema imune (fagócitos, ly T e B)

É qualquer molécula que possa ser reconhecida pelos elementos do sistema imune inato ou adaptativo

Características:Imunogenicidadeé a capacidade de induzir resposta imune específica

Antigenicidadeé a capacidade de interagir com anticorpos (Ac) ou linfócitos T (lyT) sensibilizados

Obs: imunógeno: substância que possuí epítopos estranhos ao organismo, são substâncias ativadoras específicas) (depende de quanto a substância é estranha ao organismo)

Determinante Antigênico ou Epítopo- É a menor porção da molécula antigênica responsável pela propriedade de estimular a produção dos anticorpos, são responsáveis pela interação com o sítio combinatório de anticorpo ou do receptor de antígeno (TCR) de lyT- Tamanho médio de 7x14x34u, correspondendo a 4-6 resíduos de aminoácidos- Cada antígeno pode conter um ou mais epítopos, sendo iguais ou diferentes

Anticorpos

Molécula de Ac Sítio de ligação do Ag símbolo

Sítio de ligação do AgSítio de ligação do Ag

antígeno Determinante antigênico (epítopo)

Cadeia leve

Cadeia pesada

Fab

Fc Região de dobradiça

- liga-se a mastócitos e basófilos - liga-se a mastócitos e basófilos liberação de liberação de histaminahistamina

- presente no soro e superfície de mastócitos - presente no soro e superfície de mastócitos - marcador de alergia e helmintíases- marcador de alergia e helmintíases- monômero- monômero

IgE

IgA

- aglutinação- aglutinação- neutralização- neutralização- presente em secreções – leite, lágrima- presente em secreções – leite, lágrima- dímero ou monômero - dímero ou monômero

IgMIgM

- ativação de complemento- ativação de complemento- aglutinação- aglutinação- neutralização- neutralização- presente no soro - presente no soro - marcador de fase aguda- marcador de fase aguda- pentâmero- pentâmero

IgGIgG

- ativação de complemento- ativação de complemento- aglutinação- aglutinação- opsonização e neutralização- opsonização e neutralização- atravessa a placenta - atravessa a placenta - presente no soro e fluido intercelular- presente no soro e fluido intercelular- marcador de imunidade e de fase crônica- marcador de imunidade e de fase crônica

Tempo (dias)

Primeira exposição ao

Ag

Segunda exposição ao

Ag

Resposta secundária

Resposta primária

Títu

lo d

e A

c no

sor

o

( u

nida

des)

Dinâmica de produção de Antocorpos durante a infecção

Durante a infecção Durante a infecção realiza-se pesquisa realiza-se pesquisa de IgG e IgM para de IgG e IgM para diferenciar a fase em diferenciar a fase em que se encontra a que se encontra a doençadoença

Introdução- Os testes sorológicos ou imunoensaios são

técnicas para a detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos

- drogas, hormônios, ácidos nucléicos- Utilizam reagentes não marcados (ppt,

aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos)

- Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica- Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas

- Anticorpos monoclonais e Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento

(a) Ac monoclonais: produção, homogêneos, caracterizáveis

(b) Ag recombinantes: caracterizáveis, produção em larga escala, especificidade

Métodos:- aperfeiçoamento, consolidação do que já existe,

tecnologias emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação

- métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente

- Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso

- Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) =

temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados - As metas para o laboratório clínico devem

melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados

TÉCNICAS COM REAGENTES NÃO

MARCADOS

INTRODUÇÃO

• Técnicas rápidas Técnicas rápidas

• Sistema homogêneoSistema homogêneo

• Sensibilidade reduzidaSensibilidade reduzida

• Boa especificidadeBoa especificidade

• Direta – detecção de AgDireta – detecção de Ag

• Indireta – detecção de AcIndireta – detecção de Ac

• Baixo custoBaixo custo

• Dificultam automaçãoDificultam automação

• Problemas com reprodutibilidadeProblemas com reprodutibilidade

• Não permite detectar Ac de uma classe específica que Não permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vezsó vez

- quantificação de complexo - quantificação de complexo Ag-AcAg-Ac

- depende de [ ] relativas de - depende de [ ] relativas de Ag e AcAg e Ac

- excesso - dissolução do - excesso - dissolução do precipitadoprecipitado

- zona de equilíbrio - - zona de equilíbrio - precipitação máximaprecipitação máxima

Concentração de Ag

Excesso de Ag

Excesso de Ac

Equivalência

Imun

opre

cipi

taçã

o

PRECIPITAÇÃO

Imunodifusão

- difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Acsólido - complexo Ag-Ac

- simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexodifunde-se o outro - complexo

- dupla: ambos movem-se – encontro – complexodupla: ambos movem-se – encontro – complexo

- pode ser linear ou radialpode ser linear ou radial

Imunodifusão Radial Simples (Mancini)

- utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de Ac utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de Ac específicosespecíficos

- perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag3 concentrações conhecidas do Ag

- quantificação de [ ] em soro ou líquorquantificação de [ ] em soro ou líquor

- sensibilidade de 1 a 3 ug/ml de antígenosensibilidade de 1 a 3 ug/ml de antígeno

- uso: Ig séricas, proteína C-reativa e proteínas do sistema uso: Ig séricas, proteína C-reativa e proteínas do sistema complementocomplemento

- diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a concentração do Ag- construção de curva padrão permite determinar a conentração do Ag

Imunodifusão dupla (Ouchterlony)

- precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas indica ausência de Ag ou Acindica ausência de Ag ou Ac

- depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros do gel, temperatura, [ ] e pureza do ágardo gel, temperatura, [ ] e pureza do ágar

- camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – aplicação da amostraaplicação da amostra

- desvantagens: lenta e baixa sensibilidadedesvantagens: lenta e baixa sensibilidade

- Uso: vários sistemas antigênicos Uso: vários sistemas antigênicos artrite reumatóide, lupus, artrite reumatóide, lupus, esclerose sistêmica, caxumba esclerose sistêmica, caxumba

Nefelometria- muito usada em LACmuito usada em LAC

- Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz

- Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fasesnão necessita separação de fases

- Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de Ag muito concentradosinespecíficas, múltiplas diluições de Ag muito concentrados

- Sensibilidade - 1Sensibilidade - 1g/mlg/ml

- Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormôniose hormônios

PrincípioPrincípio- partículas em suspensão – desvio de luz incididapartículas em suspensão – desvio de luz incidida

- dispersão de luz incidente quantificada por um detectordispersão de luz incidente quantificada por um detector

Fonte de luz

Suspensão de Ac e Ag diluídos

Raios de luz focados

Raios de luz desviados e refletidos

Detector

- Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio-neônio ou xenônio, hélio-neônio ou laserlaser

- concentração -curva padrãoconcentração -curva padrão

Nefelômetro acoplado a computadorNefelômetro acoplado a computador

TurbidimetriaTurbidimetria- Ag+Ac em suspensão – Ag+Ac em suspensão – luz transmitida luz transmitida

- Detector - espectrofotômetroDetector - espectrofotômetro

- Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e automatizadaprecisa, econômica e automatizada

- Desvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvasDesvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvas

- Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albuminaUso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina

Fonte de luz branca

Espectrofotômetro de fibra óptica Absorção e espectro de

luz desviada e refletida

AglutinaçãoAglutinação- complexo Ag-Ac - agregados visíveiscomplexo Ag-Ac - agregados visíveis

- semi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitaçãosemi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitação

- sensibilização de suporte – látex, hemáciassensibilização de suporte – látex, hemácias

- vantagens: < custo, facilidade e rapidez - vantagens: < custo, facilidade e rapidez

- desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidadecomplexo formado e acessibilidade

- vários tipos vários tipos

Aglutinação direta- partículas antigênicas insolúveis íntegras ou fragmentadas- Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos- realizado em tubo ou lâmina- Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose - para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO)

Resultado positivo

Resultado positivo

Ag eritrocitário

Ac Anti-eritrócito

Reagente de Coombs

Aglutinação indireta ou passiva- Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes- hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes- outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose- detecta IgG e IgM / tratamento com 2-ME- lâmina ou microplaca em “V” ou “U”- Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide, proteína C reativa, ASLO

Esquema de realização de testes de aglutinação em placa

Aglutinação indireta (passiva)

Hemaglutinação passiva

Ac do soroAc do soro

Ag solúvel adsorvido ao Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)suporte (hemácia)

aglutinaçãoaglutinação

Reação de microfloculação- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)- RPR (Rapid Plasm Reagin) - suporte: cristais de colesterol - Ag: cardiolipina - placas escavadas- Uso: pesquisa de reaginas

Reação negativaReação negativa Reação positivaReação positiva

Resultado VDRL

Microscópio óptico 100x

TÉCNICAS COM TÉCNICAS COM REAGENTES MARCADOSREAGENTES MARCADOS

• Alta sensibilidadeAlta sensibilidade

• Boa especificidadeBoa especificidade

• Direta – detecção de AgDireta – detecção de Ag

• Indireta – detecção de AcIndireta – detecção de Ac

• Competição – amostra compete com reagente marcadoCompetição – amostra compete com reagente marcado

• Custo mais alto – produção dos reagentesCusto mais alto – produção dos reagentes

• Permitem automação completa ou não Permitem automação completa ou não

• Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag específicos para um determinado Ag

• Reagente marcado Reagente marcado Ag ou Ac Ag ou Ac

• Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligadoligado

Reagente marcadoReagente marcado• Marcação não modifica interação Ag-AcMarcação não modifica interação Ag-Ac• Alto custoAlto custo• Permite detecção de classes específicas de Ac para um Permite detecção de classes específicas de Ac para um

determinado Agdeterminado Ag• Tipo de marcador determina nome do testeTipo de marcador determina nome do teste

MARCADORMARCADOR• Radioisótopo Radioisótopo RADIOIMUNOENSAIO RADIOIMUNOENSAIO• Fluorocromo Fluorocromo IMUNOFLUORESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA• Enzima Enzima ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT

RadioimunoensaioRadioimunoensaio- - Primeira técnica com reagente marcadoPrimeira técnica com reagente marcado

- desenvolvido em - desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados com o hormônioem pacientes tratados com o hormônio

- radioisótopos - Iradioisótopos - I125 125 ou Iou I131 131 – ligação a resíduos de – ligação a resíduos de tirosina em proteínastirosina em proteínas

- vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramasdetecção em nano ou picogramas

- desvantagens: alto custo do teste, vida média dos desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional – radiosótoposreagentes e risco operacional – radiosótopos

- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios - Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios

interferente: fração não ligadainterferente: fração não ligada

Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com fase sólidasistema com fase sólida

- Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou - Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície contínua (tubos, discos e placas)superfície contínua (tubos, discos e placas)

Ac + traçador + Ag da amostra

carbono

PEG

Tipos de RadioimunoensaioTipos de Radioimunoensaio

Contador de radiação gamaContador de radiação gama

cintiladorescintiladores

ImunofluorescênciaImunofluorescência- Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag- Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag

Excitação (nm) Emissão (nm)Excitação (nm) Emissão (nm)• Fluoresceína FTIC 495 524Fluoresceína FTIC 495 524• • Texas Red 595 620Texas Red 595 620• R-ficoeritrina 565 574R-ficoeritrina 565 574

- desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada, dificuldade de automaçãolimitada, dificuldade de automação

- vantagens: específica e reprodutível vantagens: específica e reprodutível

- tipos – direta, indireta e citometria de fluxotipos – direta, indireta e citometria de fluxo

Reagentes necessáriosReagentes necessários• Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonaisAc marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais

• Ag ou amostras fixas em lâmina de vidroAg ou amostras fixas em lâmina de vidro

• Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a intensidade da emissão de fluorescência – melhoram a intensidade da emissão de fluorescência

• Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a visualização da fluorescência melhoram a visualização da fluorescência

• Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínimaLâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima

Microscópio de imunofluorescência Microscópio de imunofluorescência com epiluminaçãocom epiluminação

Filtro de excitação

lâmina

Fluorescência emitida

Filtro de emissão

Fonte de luz branca

câmera

Fibra ópticaFibra óptica

Microscópio de imunofluorescência Microscópio de imunofluorescência automatizadoautomatizado

Imunofluorescência diretaImunofluorescência direta• Conjugado - Ac marcado com fluorocromo Conjugado - Ac marcado com fluorocromo

• Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantescontrastantes

• Desvantagens: um conjugado para cada AgDesvantagens: um conjugado para cada Ag

• Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de peleUso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele

célula

Conjugado fluorescente

Adenocarcinoma de glândula salivar humana Adenocarcinoma de glândula salivar humana

http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/adenocarcinomahumansmall.htmlhttp://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/adenocarcinomahumansmall.html

ITCFITCF

diiodeto de diiodeto de propídiopropídio

http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/hivinfectedcellssmall.htmlhttp://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/hivinfectedcellssmall.html

Linfócitos infectados com HIV Linfócitos infectados com HIV

ITCFITCF

IFI para Sífilis – Treponema pallidum

Imunofluorescência indiretaImunofluorescência indireta• Conjugado Ac antiimunoglobulina específico – classesConjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes

• Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescênciafluorescência

• Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes doençasem diferentes doenças

• Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automaçãoe dificuldade de automação

• Uso: detecção de Ac para Uso: detecção de Ac para Treponema pallidumTreponema pallidum (FTA-ABS) (FTA-ABS), , Toxoplasma gondii, Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparumTrypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, , auto-Ac.auto-Ac.

Anticorpo

Antígeno

Reação primária

Reação secundária

Conjugado Anticorpo FITC

lavagem

lavagem

Microscópio de fluorescência

Conjugado fluoresncente

Anticorpo primário

Citosol

Citometria de fluxoCitometria de fluxoPRINCÍPIO: PRINCÍPIO: análise individual e simultânea de componentes análise individual e simultânea de componentes

celulares através da medição do desvio de luz incidente celulares através da medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais fluorescentes emitidos pela sobre uma célula e de sinais fluorescentes emitidos pela mesmamesma

• Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares de células por segundodiferentes em milhares de células por segundo

• Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamentoDesvantagens: alto custo, necessidade de treinamento

• Vários fluorocromosVários fluorocromos

• Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias de leucemias

Suspensão de mistura de células

Conjugado fluorescente

Feixe de laserDetector

Defletor

Células não- fluorescentes

Células fluorescentes

• Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos:Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos:

- baixo ângulo de dispersão – tamanho das células- baixo ângulo de dispersão – tamanho das células

- ângulo de dispersão de 90- ângulo de dispersão de 90oo – granulação das células – granulação das células

• Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por fotodetectores e convertida em sinais processados, por fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados e analisados por um computador quantificados e analisados por um computador

• Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um sistema de canais, originado histogramaspor um sistema de canais, originado histogramas

TécnicasTécnicas imun imunoenzimáticasoenzimáticas- - Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugadoAc ou Ag marcados com enzimas – conjugado

ENZIMAENZIMA- elevada especificidade- elevada especificidade

- fácil de ser obtida na forma purificada- fácil de ser obtida na forma purificada

- conjugação a Ag e Ac – sem interferências- conjugação a Ag e Ac – sem interferências

- produto de reação com substrato – fácil de ser - produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzimaquantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzima

- estável- estável

- custo acessível- custo acessível

- vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase- vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase

- determina o tipo de substrato- determina o tipo de substrato

SUBSTRATO CROMOGÊNICOSUBSTRATO CROMOGÊNICO- ao serem consumidos por enzimas geram produtos - ao serem consumidos por enzimas geram produtos

coloridos solúveis ou insolúveiscoloridos solúveis ou insolúveis

- Quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual - Quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação com padrãoou comparação com padrão

- depende do tipo da enzima utilizada- depende do tipo da enzima utilizada

Substrato

Produto colorido

solúvel ou insolúvel

PEROXIDASE PEROXIDASE - substrato H- substrato H22OO2 2 ligado a um cromógenoligado a um cromógeno

- cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB- cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB

- cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-- cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftolnaftol

FOSFATASE ALCALINAFOSFATASE ALCALINA

- cromógeno com produto solúvel - NPP- cromógeno com produto solúvel - NPP

- cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT- cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT

450450amareloamarelo

liláslilásP-NFFP-NFF

5-B-4-C-3-IF5-B-4-C-3-IFFosfatase Fosfatase alcalinaalcalina

492492laranja, azullaranja, azul

marrom, violetamarrom, violetaOPD, TMBOPD, TMBDAB, 4CNDAB, 4CN

HH22OO22PeroxidasePeroxidase

nmnmcorcorcromógenocromógenosubstratosubstratoenzimaenzima

SUBSTRATO FLUORIGÊNICOSSUBSTRATO FLUORIGÊNICOS- emitem luz fluorescente após serem consumidos pela - emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzimaenzima

- quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro- quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro

FOSFATASE ALCALINAFOSFATASE ALCALINA - 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4-- 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4-metilumbeliferona)metilumbeliferona)

excitação

Emissão

Fluorescência

SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTESUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE

- amplificação de sinal - amplificação de sinal hormônios e marcadores tumorais hormônios e marcadores tumorais

- emitem brilho após serem consumidos pela enzima- emitem brilho após serem consumidos pela enzima

- quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro- quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro

FOSFATASE ALCALINAFOSFATASE ALCALINA

- adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion - adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion (adamantildioexietano) (adamantildioexietano)

brilho

luminol

Immuno-DotImmuno-Dot- Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISAVariação do ELISA conhecida como Dot-ELISA- fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon náilon - substrato cromógeno – forma produto estável e substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – mancha (dot) insolúvel – mancha (dot) - pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-radiografiaradiografia- Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com sensibilidade e especificidade boascom sensibilidade e especificidade boas- Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicosepidemiológicos

Fracione o pente de acordo com o número de amostras

Colocar as amostras e os controles nos pocinhos da

fileira A

Colocar o pente na fileira A e incubar

segundo as instruções

Colocar o pente na fileira B e incubar

Incubar nas fileiras C, D e E. Reação com substrato na fileira F

Ler os resultados e comparar com o padrão

ELISAELISA- - capaz de detectar < [ ] Ag e Accapaz de detectar < [ ] Ag e Ac

- reagente ligado a uma enzimareagente ligado a uma enzima

- imobilização em fase sólida imobilização em fase sólida placa de ploiestireno placa de ploiestireno

- Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e adaptação a diferentes graus de baixo custo e adaptação a diferentes graus de automaçãoautomação

- tipos: direta, indireta, de captura e de competiçãotipos: direta, indireta, de captura e de competição

- Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinasinterleucinas

ResultadoResultado visual (qualitativo)visual (qualitativo)

densidade óptica (DO) densidade óptica (DO)

(quantificação / espectrofotômetro) (quantificação / espectrofotômetro)

Limiar de reatividade (“cut-off”)Limiar de reatividade (“cut-off”)

Titulação (diluição em série)Titulação (diluição em série)

AbsorbânciaAbsorbância

Unidade padrão (absorbância transformada em Unidade padrão (absorbância transformada em unidade)unidade)

Determinação de AgDeterminação de Ag

ELISA direto de capturaELISA direto de captura

ELISA direto de competiçãoELISA direto de competição

Determinação de AcDeterminação de Ac

ELISA indiretoELISA indireto

ELISA indireto de captura ELISA indireto de captura

ELISA indireto de competiçãoELISA indireto de competição

ELISA indiretoELISA indireto• Vantagens: único conjugado para vários sistemasVantagens: único conjugado para vários sistemas

• Uso: detecção de Ac de classes determinadas de Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placaacordo com Ag que sensibilizou a placa

Lavadora de Lavadora de microplacasmicroplacas

Leitora de Leitora de microplacas microplacas acoplada a acoplada a computadorcomputador

Western BlottingWestern Blotting

- iidentificação de proteínas reconhecidas por Acdentificação de proteínas reconhecidas por Ac

- separação das proteínas - PM - eletroforese em separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamidagel de poliacrilamida

- transferência eletroforética - nitrocelulose transferência eletroforética - nitrocelulose

- incubação com amostras - presença de Ac incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo formado – conjugado específicos - complexo formado – conjugado

- Visualização Visualização cromógeno - precipitado colorido cromógeno - precipitado colorido

- teste confirmatório- teste confirmatório

Emprego: Emprego: pesquisa de Ag ou Ac diagnóstico

qual proteína está sendo reconhecida diferentes perfis fase da doença

MUITO OBRIGADA, SUCESSO!Com carinho,

Profa Alessandra Pardini(ale_pardini@uol.com.br)