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Testes utilizados em Diagnóstico: Técnicas Imunológicas
e Métodos de Biologia Molecular
Profa Alessandra XavierPardini
Disciplina: Imunologia Clínica
Introdução:
Resposta Imunológica Específica
- é mais elaboradareconhecimento clonagem (multiplicação de células defesa) ativação celular - processo complexo
- células: ly T e B atacam especificamente o antígeno- resposta imunológica de memória
Sistema imune: - para a proteção e defesa- problemas podem ocorrer
Problemas/Disfunções- AUTOIMUNIDADE- IMUNODEFICIÊNCIAS- HIPERSENSIBILIDADE
Hipersensibilidade: - Reação exagerada, alergia = envolve as IgE, histamina, mastócitos- Diferentes tipos de alergenos- Cuidados com o paciente, acompanhamento, afastar o alergeno (não contato)- Testes: RAST (radioimuno) ELISA (enzimático/dosagem de IgE), testes cutâneos
Autoimunidade: - A reação ocorre contra o próprio organismo, é uma auto agressão,- Diferentes fatores envolvidos (pré-disposição genética, reação cruzada contra o
“self” (próprio), modificação do antígeno; falha na deleção de antígenos- Testes: imunofluorescência indireta (fluorocromos), ELISA (enzimático)- Tratamento: imunossupressor, diferentes drogas, exames periódicos
Imunodeficiências: - Falha da resposta imune, ly T e B (são as mais graves), resposta inata (menos
frequente)- Diagnóstico laboratorial com aplicação de diferentes técnicas –
imunofluorescência (fluorocromos), ELISA (enzimáticos)- Tratamento: deve-se fazer o acompanhamento do paciente por exames
periódicos, transplante de medula = acompanhamento, rejeição- Avaliação constante do paciente para determinação do tratamento Exemplos: HIV, resposta B, resposta T, resposta B e T (combinada)
Tolerância Imunológica: - Sistema imune torna-se tolerante, independente do estímulo- Tolerante a um determinado antígeno
Antígenos- Definição- Imunogenicidade- Antigenicidade- Epítopo
Considerar: reação cruzada, reação inespecífica = após ativação Ac de baixa e de alta avidez
Antígenos Naturais- herdados: eritrocitários e de Transplante- Realizar a investigação a fim de se evitar problemas transfusionais e diminuir
a chance de rejeição
Antígenos Naturais
- ERITROCITÁRIOS: tipagem de ABO-Rh, pela técnica de aglutinação direta
- TRANSPLANTE: pela técnica de ELISA pesquisa do anticorpo, pela técnica de PCR pesquisa do DNA (através de bandas) (deve-se observar a compatibilidade)
- Cuidados: controle da de reação, preparo da amostra, da técnica = qualidade na manipulação e coleta
- Compatibilidade (chega a 30%) – em relação ao transplante considerar o órgão
ANTICORPOS
Molécula de Ac Sítio de ligação do Ag símbolo
Sítio de ligação do AgSítio de ligação do Ag
antígeno Determinante antigênico (epítopo)
Cadeia leve
Cadeia pesada
Fab
Fc Região de dobradiça
Anticorpos:Classe, isótipo: Linfócito B ativado – plasmócitos – Ig
IgA – pesquisada nas secreções (IgA secretora)IgE – aumento em alergias, infecções parasitáriasIgM – aumento em fase agudaIgG – memória imunológica, passa pela placentaIgD – indica a maturação dos ly B
ANTICORPOS MONOCLONAIS
ANTICORPOS MONOCLONAIS Soro possui um grande número de anticorpos capazes de se ligarem a
um antígeno específico = soro imuneSão mensuráveis (diferentes diluições, de acordo com a técnica)Tentativa de se produzir um anticorpo específico para um
determinado epítopo = tecnologia dos anticorpos monoclonaisAnticorpos monoclonais: os anticorpos do preparado contêm apenas
anticorpos vindos de um mesmo clone de linófcito B, isto é, vindos de linfócitos com a mesma especificidade
Aumento da especificidadeGrande aplicação práticaExemplos: pesquisa de antígenos hepatite B (AgHBs, AgHBe, AgHBc)
(HIV) (antígenos em tecidos VHC), antígenos tumorais, antígenos de HLA (transplantes), linhagem linfocitária (CD4+, CD8+ = acompanhamento paciente HIV+ técnica de Citometria de Fluxo ou FACS)
APLICAÇÃO PRÁTICA DO ESTUDO DE ANTICORPOS E ANTÍGENOS
Imunização Passiva (Soros)São anticorpos pré-formados
Soroterapia
- Ac heterólogos – cavalos e coelhos, Ac homólogos - seres humanos, Ac monoclonais
- Primeira forma de terapia utilizadaImunidade temporária
NÃO gera memória imunológica
Imunização Ativa
(Antígenos preparados)
- O paciente recebe o antígeno que estimula a produção da resposta imune (mediada por anticorpos ou por células) pelo próprio paciente
Imunidade duradoura
GERA memória imunológica
(verificar para cada vacina/variável)
APLICAÇÃO DA IMUNOLOGIA CLÍNICA
Considerações:- Conhecer o Ag e o Ac = caracterização- Aplicação do teste sorológico – limiar de reatividade (cut-off)- Parâmetro sorológico – banco de sangue, laboratório de
análises clínicas- Sensibilidade- Especificidade- Falso-positivo / reação cruzada- Falso-negativo /janela sorológica
A – Limiar de máxima sensibilidade - triagemB – Limiar com máximas sensibilidade e especificidade – estudos epidemiológicosC – Limiar de máxima especificidade – diagnóstico
DETERMINÇÃO DO LIMIAR DE REATIVIDADE
Introdução- Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a
detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos
- Utilizam reagentes não marcados (precipitação, aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos)
- Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica
- Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas
- Anticorpos monoclonais- Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento Métodos:- aperfeiçoamento, consolidação do que já existe, tecnologias
emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação
- métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente
- Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso
- Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) = temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados
- As metas para o laboratório clínico devem melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados
- Controle de Qualidade – testes de máxima sensibilidade, máxima especificidade
TÉCNICAS COM REAGENTES MARCADOS
Técnicas de Reagentes Marcados
Alta sensibilidade
Boa especificidade
Direta – detecção de Ag
Indireta – detecção de Ac
Competição – amostra compete com reagente marcado
Custo mais alto – produção dos reagentes
Permitem automação completa ou não
Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag
Reagente marcado - Ag ou Ac
Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado
Reagente Marcado
Marcação não modifica interação Ag-Ac
Alto custo
Permite detecção de classes específicas de Ac para um determinado Ag
Tipo de marcador determina nome do teste
MARCADOR
Radioisótopo - RADIOIMUNOENSAIO
Fluorocromo - IMUNOFLUORESCÊNCIA
Enzima - ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
Radioimunoensaio
- - Primeira técnica com reagente marcado
- desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados com o hormônio
- radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em proteínas
- vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas
- desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional – radiosótopos
- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios
Princípio
quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não marcado presente na amostra através de ligação específica
medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida
- radiações e - contador de cintilação
- radiação - contador gama de cristal sólido
Realizado em 3 estágios
Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão
Estágio 2 – interpolação dos resultados
Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida)
interferente: fração não ligada
Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com fase sólida
- Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície contínua (tubos, discos e placas)
Ac + traçador + Ag da amostra
carbono
PEG
Tipos de Radioimunoensaio
Contador de radiação gama
cintiladores
Imunofluorescência
- Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag
Excitação (nm) Emissão (nm)• Fluoresceína FTIC 495 524Fluoresceína FTIC 495 524• • Texas Red 595 620Texas Red 595 620• • R-ficoeritrina 565 574R-ficoeritrina 565 574
desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada, dificuldade de automação
vantagens: específica e reprodutível
tipos – direta, indireta e citometria de fluxo
REAGENTES NECESSÁRIOS• Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais• Ag ou amostras fixas em lâmina de vidro• Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas
– melhoram a intensidade da emissão de fluorescência • Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo –
melhoram a visualização da fluorescência • Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima
Microscópio de imunofluorescência com epiluminação
Filtro de excitação
lâmina
Fluorescência emitida
Filtro de emissão
Fonte de luz branca
câmera
Fibra ópticaFibra óptica
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
• Conjugado - Ac marcado com fluorocromo
• Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes
• Desvantagens: um conjugado para cada Ag
• Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele
célula
Conjugado fluorescente
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETAConjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes
Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência
Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes doenças
Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automação
Uso: detecção de Ac para Treponema pallidum (FTA-ABS), Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, auto-Ac.
Anticorpo Antígen
o
Reação primária
Reação secundária
Conjugado Anticorpo FITC
lavagem
lavagem
Microscópio de fluorescência
IFI – PESQUISA DE ANTICORPO
CITOMETRIA DE FLUXO PRINCÍPIO: análise individual e simultânea de componentes celulares através da
medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais fluorescentes emitidos pela mesma
Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares de células por segundo
Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento
Vários fluorocromos
Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias, tamanho celular, granulosidade
Também chamada de FACS (fluoresecent-activated cell sorter)
Suspensão de mistura de células
Conjugado fluorescente
Feixe de laserDetector
Defletor
Células não- fluorescentes
Células fluorescentes
CITOMETRIA (FACS) PARA HIV
Técnicas imunoenzimáticas- - Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado - ENZIMA
- elevada especificidade
- fácil de ser obtida na forma purificada
- conjugação a Ag e Ac – sem interferências
- produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzima
- estável
- custo acessível
- vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase
- determina o tipo de substrato
SUBSTRATO CROMOGÊNICO
- ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis (ELISA) ou insolúveis (Western blotting)
- Quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual
ou comparação com padrão
- depende do tipo da enzima utilizada
Substrato
Produto colorido
solúvel ou insolúvel
PEROXIDASE
- substrato H2O2 ligado a um cromógeno
- cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB
- cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol
FOSFATASE ALCALINA
- cromógeno com produto solúvel - NPP
- cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT
450amarelo
lilásP-NFF
5-B-4-C-3-IFFosfatase alcalina
492laranja, azul
marrom, violetaOPD, TMBDAB, 4CN
H2O2Peroxidase
nmcorcromógenosubstratoenzima
Ensaio heterogêneo
- etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase sólida
FASE SÓLIDA
- conhecido como suporte
- tubos, microplacas, micropartículas ou tiras
- partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno
- micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção em fibra de vidro ou captura
- tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT
ELISA
- capaz de detectar pequenas concentrações de Ag e Ac
- reagente ligado a uma enzima
- imobilização em fase sólida - placa de ploiestireno
- Vantagens: maior sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e adaptação a diferentes graus de automação
- tipos: direta, indireta, de captura e de competição
- Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas
Resultado
visual (qualitativo)
densidade óptica (DO)
(quantificação / espectrofotômetro)
Limiar de reatividade (“cut-off”)
Titulação (diluição em série)
Absorbância
Unidade padrão (absorbância transformada em unidade)
ELISA indireto
Vantagens: único conjugado para vários sistemas
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa
Lavadora de microplacas
Leitora de microplacas acoplada a computador
Western Blotting
identificação de proteínas reconhecidas por Ac
separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamida
transferência eletroforética - nitrocelulose
incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo formado – conjugado
Visualização - cromógeno - precipitado colorido
- teste confirmatório
preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)
SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)
migração: pólo - pólo +
preparo da amostra (solubilização das proteínas)
tampão corrida
voltagem/amperagem
transferência (semi-seco; “over-night”)
membrana (nitrocelulose; PVDF)
Western blotting
Métodos de Biologia Molecular
Considerar:Avanços na área de Biologia MolecularIdentificação de uma seqüencia específica de DNA ou RNA para
diagnóstico
Método rápido e eficiente para amplificação de seqüencias específicas a partir de uma mistura complexa de seqüencias genômicas ou cDNA
Essas transformações induzem reestruturações importantes nas áreas da agricultura, medicina, farmácia, produção animal, meio ambiente, entre outras. Dentro deste contexto, a biotecnologia se destaca como
uma das atividades científicas, econômicas e tecnológicas mais promissoras do próximo século.
Nos últimos 30 anos o mundo vem testemunhando uma revolução biológica de dimensões nunca antes
vista. Processos em que a natureza poderia levar centenas de milhares de anos são agora realizados rapidamente com o auxilio da engenharia genética
e da biologia molecular.
Estrutura do DNA- O material genético de toda a vida neste planeta é formado por apenasseis componentes.
Acido Desoxirribonucleico (ADN, DNA):- Contém as instruções genéticas- Construção de proteínas e RNA- Componentes são: uma molécula de açúcar (desoxirribose), um grupamento no fosfato e
quatro bases nitrogenadas diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). - Adenina e Guanina são purinas / Citosina e Timina são pirimidinas- Adenina liga-se com Timina (A com T) e Guanina liga-se com Citosina (G com C) - A unidade essencial que forma a molécula do DNA é chamada nucleotídeo que mais
precisamente, desoxinucleotídeo. - Transmissão de características hereditáriasNo RNA há uma substituição de Timina por Uracila (U)
Importante:- As instruções codificadas nas sequências de bases nitrogenadas do DNA constituinte dos genes são transcritas
para moléculas de RNA, e destas, traduzidas em sequências de aminoácidos das proteínas.- RNA ribossômico, que constitue, juntamente com certas proteínas, minúsculos grânulos citoplasmaticos
denominados ribossomos, capazes de unir os aminoácidos entre si e formar as cadeias polipeptídicas que constituem as proteínas.
- RNA transportador, têm por função capturar aminoácidos livres nas célula, levando-os até os ribossomos, onde eles se unem para formar a molécula polipeptídica. Cada RNAt apresenta, em uma determinada região de sua molécula, uma trinca de bases denominada anticódon. O aminoácido transportado por um RNAt depende do seu anticódon. Por exemplo, moléculas de RNAt com anticódon AAA ou AAG transportam sempre o aminoácido fenilalanina; os RNAt com anticódons CCA, CCG, CCU ou CCC transportam somente glicina.
- RNA mensageiro, são cópias dos genes codificadores de proteínas e contêm, em sua sequência de bases nitrogenadas, as instruções sobre a ordem em que os aminoácidos devem ser unidos para produzir determinado polipeptídeo.
-
CONCLUSÃO,O QUE É O DNA?O DNA carrega todas as informações de suas características físicas que,
essencialmente, são determinadas pelas proteínas. Dessa forma, o DNA contém as instruções para fazer uma proteína.
No DNA, cada proteína é codificada por um gene (uma seqüência específica de nucleotídeos do DNA que especificam como uma única proteína será feita).
Especificamente, a ordem dos nucleotídeos dentro de um gene determina a ordem e os tipos dos aminoácidos que devem ser colocados juntos para formar uma proteína.
A seqüência específica dos aminoácidos na cadeia é o que diferencia uma proteína de outra. Essa seqüência é codificada no DNA, onde um gene se codifica para uma proteína.
Histórico- 1983- Kary Mullis- Prêmio Nobel de Química em 1993.- DNA polimerase - ocorre naturalmente em organismosvivos, onde tem a função de duplicar o DNA durante adivisão celular. A polimerase se liga a um DNA fita simples riando uma fita de DNA complementar.- Na época ainda não havia sido descoberta uma DNApolimerase termoestável. Processo inicial de Mullis eraineficiente, necessitava de muito tempo, atençãoconstante e grandes quantidades de DNA polimerase.- O processo foi melhorado
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.técnica “in vitro” – replicação do DNA
- Qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR
- A localização da seqüência alvo é feita pelos primers
- Oligonucleotídeos com 20-24 bases são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade
- O pareamento dos primers com a seqüência alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick
Alternância de temperaturaTécnica1. Desnaturação:94ºC – 96ºCSepara a dupla fita do templateem duas fitas simples
2. Pareamento:37ºC – 65ºCPrimers ligam-se em locaisespecíficos do DNA molde
3. Extensão:72ºCDNA polimerase usa os dNTPsadicionando-os a nova fita deacordo com a regra depareamento – polimerização.
LEITURA EM GEL DE AGAROSE – ANÁLISE DE BANDAS – ANÁLISE DOS PRODUTOS DE PCR
LEITURA EM GEL DE AGAROSE – ANÁLISE DE BANDAS – ANÁLISE DOS PRODUTOS DE PCR
Aplicações da Biologia Molecular:
Diagnóstico de doenças congênitasDetecção de infecçõesMonitorização de terapia contra o câncerSequencia de DNAForenseTransplante – resposta de HLA (antígenos naturais) – triagem de
doadores, verificar padrão de bandas
Atualmente,NAT – Técnica de Ácido Nucléico- Bio-Manguinhos: para a rede pública de saúde como também o próprio Ministério da Saúde (MS)-KIT NAT HIV/HCV
-Nome Comercial : Kit NAT HIV/HCV Bio-Manguinhos -Apresentação : Material fornecido para 96 reações. -Descrição da finalidade ou uso do produto: Teste para detecção de Ácido Nucléico de HIV (Vírus da Imunodeficiência Adquirida) e HCV (Vírus da hepatite C) em serviços de hemoterapia, visando diminuir o risco transfusional causado por esses agentes. (fonte: relatório 26 MS) (material já copiado aulas HIV/AIDS e Hepatites)
CLONAGEMA clonagem é a imitação perfeita de um mecanismo de reprodução
assexuada – ato multiplicador realizado por organismos unicelulares ou portadores de poucas células, sensíveis a qualquer mudança no meio ambiente.
Este método reprodutor gera seres geneticamente idênticos à matriz utilizada.
Um clone é uma cópia exata de uma planta ou animal, com todas as características do original, inclusive os defeitos.
1. DNA molde para amplificação
• tamanho da molécula
2. Escolha da vetor replicação
transcrição
expressão
• Plasmídeo, fago
3. Escolha da célula hospedeira
• Bactéria; Levedura; Inseto; Plantas; Animal
CLONAGEM
Teste de Paternidade - DNAAplicação: Investigar vínculo genético envolvendo filho, suposto
pai e/ou suposta mãe de um indivíduo. O DNA (ácido desoxirribonucléico) é uma substância que transmite as características hereditárias dos pais para os filhos. A maioria das informações genéticas é idêntica em todos os indivíduos da mesma espécie. Existem, entretanto, regiões repetitivas polimórficas, as STR´s (“short tandem repeat”), que se constituem em marcadores genéticos utilizados no teste de paternidade. Entre pais e filhos há semelhanças nas regiões polimórficas. Através da análise comparativa destas regiões do DNA de um indivíduo com o do suposto pai ou mãe é possível estabelecer o vínculo.
PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS RECOMBINANTES
O processo de obtenção destas substâncias é tão rígido quanto qualquer outra molécula medicamentosa. Além dos bioensaios para
verificar sua atividade biológica, são também verificados seus padrões de qualidade físico-químicos e microbiológicos garantindo segurança,
eficácia e estabilidade.
Em relação aos efeitos tóxicos, há uma grande preocupação em averiguar se estas biomoléculas possuem ações imunotóxicas, já que podem ser reconhecidas pelo sistema imunológico como invasores.
Terapia Gênica
Porém a maior limitação desta técnica ainda está vinculada ao vetor que entrega o gene terapêutico.
O atual objetivo das indústrias farmacêuticas é a procura por novos vetores, principalmente não virais.
Alguns aspectos do ponto de vista farmacêutico como: biodisponibilidade, formas e formulações farmacêuticas ideais, classificação terapêutica,
farmacocinética e farmacodinâmica, ainda são questões que nem sequer foram mencionadas de forma concreta.
A possibilidade de substituir genes ausentes ou defeituosos, por outra cópia normal dentro de uma célula
somática do organismo, demonstra uma manobra fantástica no sentido de eliminar as doenças humanas.
Agradecimentos
Profa Adelaide Vaz pelo material gentilmente cedido
BibliografiaPesquisa na internet (maio 2011)ABBAS A. K et all., Imunologia Básica Funções e Distúrbios do Sistema
Imune, ed revinter, 2003.CALICH V & VAZ C., Imunologia, ed Revinter, 2001. Pesquisa na internet em novembro 2012Pesquisa na internet em novembro 2013
