Testes utilizados em Imunologia Clínica –

Testes de Reagentes Marcados

Profa Alessandra Xavier Pardini

Imunologia Clínica

Alta sensibilidade

Boa especificidade

Direta – detecção de Ag

Indireta – detecção de Ac

Competição – amostra compete com reagente marcado

Custo mais alto – produção dos reagentes

Permitem automação completa ou não

Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag

Reagente marcado – Ag ou Ac

Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado

Reagente marcado- Marcação não modifica interação Ag-Ac- Alto custo- Permite detecção de classes específicas de Ac para um determinado

Ag- Tipo de marcador determina nome do teste

MARCADORRadioisótopo = RADIOIMUNOENSAIOFluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIAEnzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT

Radioimunoensaio

- Primeira técnica com reagente marcado

-desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados com o hormônio

- radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em proteínas

- vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas

- desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional – radiosótopos

- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios

Princípio

quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não marcado presente na amostra através de ligação específica

medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida

- radiações e - contador de cintilação

- radiação - contador gama de cristal sólido

Realizado em 3 estágiosEstágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão

Estágio 2 – interpolação dos resultados

Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida)

interferente: fração não ligada

Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com fase sólida

- Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície contínua (tubos, discos e placas)

Ac + traçador + Ag da amostra

carbono

PEG

Tipos de Radioimunoensaio

Contador de radiação gama

cintiladores

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Princípio:

Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.

Fluorocromos - São substâncias que, absorvem luz de um comprimento de onda

menor quando excitados com luz UV, emitem luz em comprimento de onda maior (fluorescência).

- Características: estabilidade, grande capacidade de absorção, absorção e fluorescência de luz no espectro visível, nenhuma interferência com a reação imunológica.

Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag

Excitação (nm) Emissão (nm)Fluoresceína FTIC 495 524Fluoresceína FTIC 495 524Texas Red 595 620Texas Red 595 620R-ficoeritrina 565 574R-ficoeritrina 565 574

- desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada, dificuldade de automação

- vantagens: específica e reprodutível

- tipos – direta, indireta e citometria de fluxo

Cuidados:

- padronização adequada do conjugado fluorescente (titulação)

- treinamento do pessoal que realizará a leitura, sendo subjetiva, deve ser padronizada para evitar erros que super ou subestimem a fluorescência

Reagentes necessários

Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais

Ag ou amostras fixas em lâmina de vidro

Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a intensidade da emissão de fluorescência

Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a visualização da fluorescência

Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima

São fatores que interferem na imunofluorescência:

- a qualidade do vidro/lâmina/lamínula - qualidade e tratamento dos Ag fixados antigenicidade e

acessibilidade - temperaturas e tempo de incubação- lavagens adequadas - montagem da preparação em glicerina alcalina - microscópio perfeitamente calibrado e limpo - corantes: diminuem a coloração de fundo, facilitando a

leitura da fluorescência (azul de Evans)

Microscópio- fonte de luz de alta intensidade- lâmpada de mercúrio ou halogênio- filtros de excitação (ativam a fluorescência)- filtros de barreira (remover interferentes)- microscópios de transiluminação- microscópios de epiiluiminação (apresentam a vantagem de

combinar a luz transmitida para exame de contraste de fase, análise da amostra em diferentes comprimentos de onda, no caso de utilização de mais de um fluorocromo) (a luz UV não tem chance de atravessar a ocular)

Microscópio de imunofluorescência com epiluminação

Filtro de excitação

lâmina

Fluorescência emitida

Filtro de emissão

Fonte de luz branca

câmera

Fibra ópticaFibra óptica

Microscópio de imunofluorescência automatizado

Reação de Imunofluorescência

Reação de Imunofluorescência diretaReação de Imunofluorescência indiretaReação de Imunofluorescência de capturaReação de Imunofluorescência amplificada com complementoReação de Imunofluorescência amplificada com sistema avidina-

biotina

Imunofluorescência direta

Conjugado - Ac marcado com fluorocromo

Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes

Desvantagens: um conjugado para cada Ag

Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele

célula

Conjugado fluorescente

Adenocarcinoma de glândula salivar humana

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ITCFITCF

diiodeto de propídio

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Linfócitos infectados com HIV

ITCF

Imunofluorescência indireta

- Conjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes

- Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência

- Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes doenças

- Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automação

Uso: detecção de Ac para Treponema pallidum (FTA-ABS), Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, auto-anticorpos.

Conjugado fluoresncente

Anticorpo primário

Citosol

Anticorpo

Antígeno

Reação primária

Reação secundária

Conjugado Anticorpo FITC

lavagem

lavagem

Microscópio de fluorescência

Fluorescência indireta para Sífilis

Fluorescência indireta para Chagas

Fluorescência indireta para HIV

Autoimune

anti-Células Epiteliais

CMV

Citometria de fluxo

Princípio:

análise individual e simultânea de componentes celulares através da medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais fluorescentes emitidos pela mesma

Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares de células por segundo

Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento

Vários fluorocromos

Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias

Suspensão de mistura de células

Conjugado fluorescente

Feixe de laserDetector

Defletor

Células não- fluorescentes

Células fluorescentes

Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos:

- baixo ângulo de dispersão – tamanho das células

- ângulo de dispersão de 90o – granulação das células

Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados e analisados por um computador

Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um sistema de canais, originado histogramas

Técnicas imunoenzimáticas

- Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado

ENZIMA

- elevada especificidade

- fácil de ser obtida na forma purificada

- conjugação a Ag e Ac – sem interferências

- produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzima

- estável

- custo acessível

- vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase

- determina o tipo de substrato

SUBSTRATO CROMOGÊNICO

- ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis ou insolúveis

- quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação com padrão

- depende do tipo da enzima utilizada

Substrato

Produto colorido

solúvel ou insolúvel

PEROXIDASE

- substrato H2O2 ligado a um cromógeno

- cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB

- cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol

FOSFATASE ALCALINA

- cromógeno com produto solúvel - NPP

- cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT

450450amareloamarelo

liláslilásP-NFFP-NFF

5-B-4-C-3-IF5-B-4-C-3-IFFosfatase Fosfatase alcalinaalcalina

492492laranja, azullaranja, azul

marrom, violetamarrom, violetaOPD, TMBOPD, TMBDAB, 4CNDAB, 4CN

HH22OO22PeroxidasePeroxidase

nmnmcorcorcromógenocromógenosubstratosubstratoenzimaenzima

SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS

- emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima

- quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro

FOSFATASE ALCALINA

- 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4-metilumbeliferona)

excitação

Emissão

Fluorescência

SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE

- amplificação de sinal hormônios e marcadores tumorais

- emitem brilho após serem consumidos pela enzima

- quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro

FOSFATASE ALCALINA

- adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion (adamantildioexietano)

brilho

luminol

Ensaio heterogêneo

- etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase sólida

FASE SÓLIDA

- conhecido como suporte

- tubos, microplacas, micropartículas ou tiras

- partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno

- micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção em fibra de vidro ou captura

- tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT

Immuno-Dot

Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA

fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon

substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – mancha (dot)

pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-radiografia

Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com sensibilidade e especificidade boas

Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicos

Fracione o pente de acordo com o número de amostras

Colocar as amostras e os controles nos pocinhos da

fileira A

Colocar o pente na fileira A e incubar

segundo as instruções

Colocar o pente na fileira B e incubar

Incubar nas fileiras C, D e E. Reação com substrato na fileira F

Ler os resultados e comparar com o padrão

ELISA

- capaz de detectar < [ ] Ag e Ac

reagente ligado a uma enzima

imobilização em fase sólida placa de ploiestireno

Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e adaptação a diferentes graus de automação

tipos: direta, indireta, de captura e de competição

Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas

Determinação de Ag

ELISA direto de captura

ELISA direto de competição

Determinação de Ac

ELISA indireto

ELISA indireto de captura

ELISA indireto de competição

ELISA direto de captura

conhecido como sanduícheApós a adição de um reagente, realiza-se etapa de lavagem para

retira reagente não ligadoVantagens: Desvantagens:Uso:

Ag na amostra

Incubação Incubação

Ac fixado na placa Conjugado Ac marcado

Lavagem

Adição do substrato,

revelação e leitura

ELISA direto de competição

Vantagens

Desvantagens

Uso

ELISA indireto

Vantagens: único conjugado para vários sistemas

Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

Resultado

visual (qualitativo)

densidade óptica (DO)

(quantificação / espectrofotômetro)

Limiar de reatividade (“cut-off”)

Titulação (diluição em série)

Absorbância

Unidade padrão (absorbância transformada em unidade)

ELISA indireto de captura

Vantagens: único conjugado para vários sistemas

Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

ELISA indireto de competição

Vantagens: único conjugado para vários sistemas

Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

Lavadora de microplacas

Leitora de microplacas acoplada a

computador

Western Blotting

identificação de proteínas reconhecidas por Ac

separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamida

transferência eletroforética - nitrocelulose

incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo formado – conjugado

Visualização = cromógeno - precipitado colorido

- teste confirmatório

EtapasEtapas preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)

SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)

migração: pólo - pólo +

preparo da amostra (solubilização das proteínas)

tampão corrida

voltagem/amperagem

transferência (semi-seco; “over-night”)

membrana (nitrocelulose; PVDF)

Emprego: Emprego: pesquisa de Ag ou Ac diagnóstico

qual proteína está sendo reconhecida diferentes perfis fase da doença