Bioquímica e Biologia Celular

UFV / XIX SIC / OUTUBRO DE 2009 / BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE AMILASES DE Aspergillus niger

AMANDA DOS SANTOS SILVA (Não Bolsista/UFV), GUILHERME JOSÉ RIBEIRO RODRIGUES (Não Bolsista/UFV), JOSÉ FABIANO DE SENA NETTO (Não Bolsista/UFV), VINICIUS FERREIRA DA PAIXAO (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

Amilases apresentam grande importância biotecnológica nas indústrias têxteis, químicas e farmacêuticas. As amilases secretadas por fungos da espécie Aspergillus niger são utilizadas industrialmente devido a fatores como fácil cultivo dos microrganismos e a termoestabilidade de suas enzimas. Diante disso, este trabalho visou produzir, extrair, purificar e caracterizar amilases de Aspergillus niger. Micélios de A. niger foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio BDA, dos quais após uma semana, conídios foram obtidos e transferidos para frascos com meio TLE e amido como única fonte de carbono. Esses frascos foram mantidos em agitador a 150 rpm e 27 °C. Após 24, 48, 72 e 96 horas de incubação, alíquotas foram coletadas para testes de atividade. A determinação da concentração de proteínas foi realizada pelo método de Bradford e a atividade amilolítica pelo método clássico do DNS. A etapa de purificação parcial do extrato bruto consistiu em uma cromatografia de troca aniônica, utilizando-se a resina DEAE-Sepharose. Foi realizado ainda ensaio de estabilidade de armazenamento, SDS-PAGE e caracterização bioquímica: ensaio de pH, efeito da temperatura e de íons metálicos do extrato bruto. O tempo de 72 horas mostrou-se como o de maior produção das amilases e o ensaio de estabilidade de armazenamento constatou a estocagem em freezer como o melhor meio para armazenamento, pois a enzima manteve sua atividade por 72 horas. Os ensaios de pH mostraram dois valores de pH ótimos 6,5 e 8,5, sugerindo a presença de pelo menos duas enzimas no extrato. A temperatura de atividade ótima foi de 60 °C e a presença de íons Zn+2 no meio de reação aumentou em 35,7 % a atividade enzimática. Nosso trabalho mostra a caracterização de amilases produzidas por uma cepa de A. niger isolada na UFV, que possuem propriedades interessantes para uso industrial.

(Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular )


PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS E CINÉTICO-ENZIMÁTICAS DE SERINO PROTEASES PRODUZIDAS POR Enterococcus mundtii ISOLADO DO TRATO INTESTINAL DA LAGARTA DA SOJA

AMANDA PETRINA SCOTÁ FERREIRA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), FRANCINY MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), FABRICIO RAINHA RIBEIRO (Bolsista CNPq/UFV), MAYARA DA FONSECA APOLINARIO (Bolsista CNPq/UFV), EDUARDO GÓES CORDEIRO (Bolsista CAPES/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Co-orientador/UFV)

A utilização de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas para a obtenção de plantas resistentes contra o ataque de insetos, a produção de inibidores sintéticos, peptídeos ou peptídeos miméticos são considerados como alternativas no controle de insetos-praga. Para que isso aconteça é importante que ocorra uma combinação de inibidores que cubra o espectro total de proteases intestinais do inseto. Dessa forma, deve ser considerada a fisiologia do inseto, à bioquímica da sua digestão, os microrganismos associados ao trato digestivo, e o conhecimento do sistema de proteases produzidas pela lagarta e pela microbiota associada. Recentemente foram isoladas diversas bactérias proteolíticas cultiváveis do intestino da lagarta-da-soja A. gemmatalis. Todas foram capazes de produzir quantidades significativas de proteases quando cultivadas em meio de cultura adequado. Neste contexto o presente trabalho fundamentou-se em caracterizar as serino proteases da bactéria E. mundtii isolada do trato intestinal de A. gemmatalis utilizando o substrato L-BApNA. A bactéria foi cultivada em meio de cultura constituído de infusão cérebro coração (BHI) acrescidos de 0,1% de soro albumina bovina (BSA). Verificou-se pronunciada atividade em pH 7,5 e temperatura de 30 ºC. O Km app e a Vmáx app foram 0,14 mM e 28,22 nM.s-

1respectivamente. Os inibidores de serino proteases TLCK (irreversível) e aprotinina (competitivo) diminuíram significativamente a atividade da protease bacteriana. Combinando o efeito do inibidor de metalo proteases EDTA com o efeito de íons cálcio obteve-se serino proteases cálcio-dependentes. Pespstatina A, inibidor de aspartil proteases e E-64 inibidor de cisteíno proteases não influenciaram as serino proteases bacteriana. Os resultados de caracterização cinética e de efeito de inibidores de proteases sobre a atividade das proteases produzidas por Enterococcus mundtii, concluem que essa bactéria sintetiza e excreta no lúmen intestinal de A. gemmatalis, enzimas da família das serino proteases.

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CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA PRESENTES NO VENENO DE Bothrops jararacussu

ANA CLARA ROSA SALVADOR (Não Bolsista/UFV), NATÁLIA CRISTINA SANTOS COSTA (Não Bolsista/UFV), EMÍLIO ITAMAR DE FREITAS CAMPOS (Bolsista BIC-Júnior/UFV), RENATO NEVES FEIO (Co-orientador/UFV), SERGIO OLIVEIRA DE PAULA (Co-orientador/UFV), LEANDRO LICURSI DE OLIVEIRA (Orientador/UFV)

A imunidade inata usa peptideos antimicrobianos (AMPs) como primeira linha de defesa contra microorganismos. Essas moléculas antimicrobianas matam diretamente um grande espectro de microorganismos, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e certos vírus. Essas moléculas interagem com o próprio hospedeiro desencadeando eventos que complementam seu papel como antibióticos. Uma grande quantidade de moléculas antimicrobianas tem sido identificadas em animais, plantas e microorganismos. Entre alguns membros dessa família estão incluidas as Defensinas, Hepcidinas, Histatinas e Catalecidinas. Com o objetivo de identificar proteinas com atividade antimicrobiana os componentes do veneno de cobra foram separados por gel filtração em coluna de Sephadex G-75 (100cm x 1,6cm). Posteriormente submetidas a cromatografia de troca iônica (Mono-Q), finalmente submetidas a cromatografia de fase reversa C18. Após cada passo de purificação as frações foram testadas quanto a sua atividade microbiana e reunidas quando positiva. Todos os picos que continham atividade antimicrobiana foram analisados por SDS-PAGE.Nos ultimos anos vários antimicrobianos tem sido descritos em diferentes venenos de diferentes animais e tradicionalmente estão ligados ao mecanismo de defesa do hospedeiro. Nesse estudo nós começamos a caracterizar proteínas com atividade antimicrobiana presente no veneno de Bothrops jararacussu. A análise estrutural bem como a sequência de aminoácido será realizada para melhor caracterização da proteína isolada.

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PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE AMILASES EXTRAÍDAS DE SEMENTES DE MILHO (ZEA MAYS)

ANANDA PEREIRA AGUILAR (Não Bolsista/UFV), NAARÁ GOULART REZENDE (Não Bolsista/UFV), IANA MORAIS SOUZA (Não Bolsista/UFV), WILIANE GARCIA DA SILVA (Não Bolsista/UFV), NAYRA FERNANDES SANTOS (Não Bolsista/UFV), XÊNIA MACEDO SOUTO (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

As amilases hidrolisam moléculas de amido liberando dextrinas e pequenos polímeros compostos de unidades de glicose. Estas enzimas possuem importância biotecnológica para as indústrias de fermentação, de alimentos, têxtil e de papel. Sementes em germinação são fontes promissoras de amilases, com base nisso o milho (Zea mays), uma das culturas mais difundidas em nosso país, foi utilizado como fonte para extração, purificação e caracterização parcial dessas enzimas. Neste trabalho as sementes de milho foram germinadas e a atividade de amilase foi acompanhada por dez dias utilizando o clássico método do DNS (ácido dinitrosalicílico). Durante o experimento observamos uma melhor atividade enzimática no quarto dia de germinação. Para obtenção do extrato enzimático 31,71 gramas de semente do quarto dia de germinação foram trituradas em tampão acetato de potássio 0,2 M pH 5,5, após trituração o extrato solúvel foi separado por centrifugação. Para a purificação parcial das amilases, foi utilizada cromatografia de troca iônica (DAE Sepharose). A coluna foi equilibrada com tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 e a amostra foi eluída com o mesmo tampão utilizando-se gradiente linear de NaCl de 0 a 1M. As frações que apresentaram melhor atividade específica foram reunidas em um “pool” de 20 mL obtendo-se um rendimento de purificação de aproximadamente 16%. Este “pool” foi caracterizado em relação ao efeito do pH, da temperatura, bem como dos parâmetros cinéticos. O pH e a temperatura ótima foram respectivamente 5 e 50 °C. Os parâmetros cinéticos observados pela curva de Michaelis Menten foram Km=0,327g/L e Vmax= 14,623 µmol/mL/min. Este trabalho demonstrou a obtenção e a caracterização parcial de amilases a partir de sementes de milho germinadas para serem utilizadas em diferentes processos industriais.

(Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular )


CONSTRUÇÃO DE QUIMERAS NTPDASE-1-GFP PARA ESTUDOS DE LOCALIZAÇÃO SUB-CELULAR EM Trypanosoma cruzi

BERNARDO PEREIRA MOREIRA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Co-orientador/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Orientador/UFV)

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa tem investido esforços na elucidação do papel das enzimas metabolizadoras de nucleotídeos extracelulares, também chamadas de ecto-nucleotidases, na biologia e interação parasita-hospedeiro dos protozoários Trypanosoma cruzi e Leishmania sp. (Fietto et al, 2004; Maioli et al, 2004). Inicialmente em T. cruzi foi comprovada a existência de ecto-nucleotidases presentes na superfície externa do parasita. Em seguida foi clonado um gene codificante de uma provável ecto-nucleotidase, denominada NTPDase-1 (Fietto et al, 2004). Neste trabalho, baseado na demonstração da maior capacidade ecto-ATPásica das formas infectivas (tripomastigotas) e em dados da literatura que correlacionam a capacidade ecto-ATPásica de parasitas com a virulência (Santos et al, 2009) sugerimos que também em T. cruzi a virulência e infectividade possam estar relacionados com uma maior capacidade ecto-nucleotidásica visto que os nucleotídeos extracelulares, especialmente ATP e seus metabólitos, agem como sinalizadores celulares e indiretamente controlam vários processos como a resposta imune e adesão celular. Especificamente neste projeto, nosso objetivo foi construir quimeras do gene codificante da NTPDase-1 ligado ao gene da proteína verde fluorescente (GFP), para assim podermos obter parasitos transfectados com estas quimeras e que possam ser utilizados em abordagens de localização subcelular da NTPDase-1 – GFP e acompanhamento real do processo infectivo, já que estes parasitos serão facilmente visíveis sob luz ultravioleta. A construção das quimeras foi obtida através da amplificação dos genes por PCR, usando primers específicos contendo sítios de restrição adequados e que posteriormente foram amplificados e ligados em um vetor de expressão em T. cruzi (pTREX). As quimeras serão usadas para transfectar os parasitos que serão objetos de vários outros estudos futuros.

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PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE DE DEBARYOMYCES HANSENII UFV-1

CAROLLINE FERNANDA RODRIGUES ASCENÇÃO (Bolsista FAPEMIG/UFV), VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Orientador/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE (Co-orientador/UFV)

α-Galactosidases catalisam a hidrólise de vários α-D-galactosídeos naturais e sintéticos, bem como moléculas mais complexas como oligo e polissacarídeos. Estas enzimas têm uma grande importância comercial devido à sua utilização em vários processos biocatalíticos, sendo largamente utilizadas na indústria de alimentos, papel, açucareira, além de práticas mais específicas como conversão de sangue B para O. Uma aplicação de destaque da α-galactosidase é o seu uso na hidrólise de oligossacarídeos presentes em produtos derivados de soja, convertendo-os em açúcares digeríveis e assim moderar as propriedades causadoras da flatulência. O presente trabalho teve como objetivo principal a produção e purificação da α-galactosidase extracelular de Debaryomyces hansenii UFV-1, uma vez que esta enzima apresentou alta capacidade de hidrólise de oligossacarídeos presentes em produtos de soja. A cepa de Debaryomyces hansenii utilizada, classificada como UFV-1, pertence à coleção de leveduras do Laboratório de Fisiologia de Microrganismos - BIOAGRO-UFV. Debaryomyces hansenii UFV-1 foi cultivada em meio mineral com extrato de levedura (MME), contendo galactose como fonte de carbono, por 31 h, a 30 oC.O extrato enzimático foi submetido à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-150 e posteriormente, à cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose, pH 5,5. As frações protéicas com atividade de α-galactosidase foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0 a 1 M. A α-galactosidase extracelular D. hansenii UFV-1 apresentou fator de purificação de 16,7 vezes, com um rendimento final de 58,4 %.Para confirmação das etapas de purificação da α -galactosidase extracelular de D. hansenii UFV-1, as frações que apresentaram atividade enzimática eluídas das colunas de Sephadex G-150 e DEAE-Sepharose, foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% sob condições desnaturantes.A análise eletroforética em gel de poliacrilamida indicou a presença de apenas uma banda protéica na fração enzimática proveniente da cromatografia de troca-iônica confirmando o alto grau de pureza da enzima.

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DIVERSIDADE GENÉTICA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DE ORIGEM BOVINA E DETECÇÃO DA PRESENÇA DE GENES QUE CODIFICAM ADESINAS

DANIELLE MENDES SILVA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), VICTOR LOPES RIBEIRO FAVARO (Bolsista/UFV), ANDREA DE OLIVEIRA BARROS RIBON (Orientador/UFV)

Staphylococcus aureus é um dos principais agentes etiológicos da mastite bovina causando significativa perda econômica para indústria leiteira devido à redução na qualidade do leite, perdas na produção, aumento no uso de medicamentos e nos gastos com serviços veterinários. Adesinas produzidas por S. aureus têm sido descritas como alvos promissores para desenvolvimento de vacinas. Como existe uma variação muito grande no tipo de adesina produzida pelas diferentes cepas existe a necessidade de conhecer a prevalência das principais adesinas, para que os resultados possam nortear a escolha de um candidato mais promissor para o desenvolvimento de uma vacina. Este trabalho teve como objetivos gerais estimar a diversidade genética dos isolados de S. aureus de origem bovina e detectar genes que codificam adesinas comumente associadas ao patógeno. Todas as bactérias estudadas foram confirmadas como sendo S. aureus pela amplificação de uma sequência do gene nuc relatada como espécie-específica. A diversidade genética dos isolados fornecidos pela Embrapa/CNPGL e pelo Laboratório de Imunovirologia/UFV foi estimada por meio da análise de loci polimórficos, usando reação em cadeia da polimerase multiplex. Verificou-se uma heterogeneidade genética considerável em populações naturais de S. aureus, que foi maior entre os isolados da Embrapa. Os vinte e quatro isolados estudados correspondem a dezessete cepas, que estão divididas em três grupos. Os sete isolados de Viçosa são na verdade duas cepas com distância genética de 60%, pertencentes a um mesmo subgrupo. O gene para adesina clfA foi amplificado em 29% das cepas, os genes clfB e fnbP em 17% e spa, em 47%. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que não existe uma adesina que ocorra em todas as cepas estudadas. Os genes clfB e fnbP estão presentes naquelas provenientes de Viçosa, porém novos estudos deverão ser conduzidos para verificar se esse padrão é observado em outras cepas.

(CNPq/FAPEMIG )


CARACTERIZAÇÃO DE HEMICELULASES ENVOLVIDAS NA SACARIFICAÇÃO DE BIOMASSA PARA PRODUÇÃO DE ETANOL.

DAYELLE SÂMILA PESSOTTI DE OLIVEIRA GONÇALVES (Bolsista CNPq/UFV), MAÍRA NICOLAU DE ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV), VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Co-orientador/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE (Orientador/UFV)

Produção de etanol a partir de material lignocelulósico é uma potencial alternativa para substituir combustíveis fósseis. Entretanto, a hidrólise da biomassa lignocelulósica é um dos gargalos deste processo devido à sua natureza recalcitrante. Para fermentação dos açúcares a etanol é necessária a hidrólise dos polissacarídeos que compõem a biomassa. Neste projeto avaliou-se o potencial de utilização dos fungos Acremonium sp. e Acremonium zeae para sacarificação enzimática de bagaço-de-cana. Os fungos foram crescidos em fermentação no estado sólido (SSF) utilizando como fonte de carbono o bagaço-de-cana e a palha de milho e em cultura submersa (SC) utilizando como fontes de carbono arabinose, xilana oat spelt, xilose, bagaço de cana moído e palha de milho moída. Alíquotas foram retiradas em intervalos pré-determinados e analisadas quanto à produção de α-L-arabinofuranosidase, β-xilosidase, α-galactosidase, xilanase, endoglicanase, celulase total e β-glicosidase. O bagaço de cana e a palha de milho induziram de maneira eficiente a produção de xilanase, FPase e endoglucanase nos dois fungos. A máxima hidrólise do substrato para xilanase foi obtida em pH 6,5 e uma temperatura de 50ºC. A maior atividade detectada de endoglucanase foi em pH 5,0 e 70°C e para FPase a atividade ótima foi em pH 6,0 e 55°C. A fonte de carbono que mais induziu a atividade de β-glicosidase de Acremonium sp. foi xilose, e sua atividade máxima ocorreu em pH 4,5 a 5,0 e 60°C. Três combinações com quantidades variadas de enzimas foram avaliadas quanto ao poder de hidrólise da biomassa. A maior quantidade de açúcar redutor produzida foi obtida utilizando bagaço-de-cana triturado e a solução enzimática na seguinte composição: 5 U/g (FPase/g biomassa) , 1,05 U/g (β-glicosidase/g biomassa) e 3,48 U/g (endoglucanase/g biomassa) durante aproximadamente 16 horas. Portanto conclui-se que os fungos isolados apresentam potencial para produção de celulases e hemicelulases e sacarificação do bagaço-de-cana.

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EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA DO CAPSÍDEO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO 2 E UTILIZAÇÃO COMO FERRRAMENTA DE DIAGNÓSTICO.

DIEGO DE ÁVILA MARTINS BRAGA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), JOÃO PAULO MACHADO (Bolsista CNPq/UFV), JULIANA EVANGELISTA BEZERRIL (Não Bolsista/UFV), PEDRO MARCUS PEREIRA VIDIGAL (Bolsista CNPq/UFV), MARLENE ISABEL VARGAS VILORIA (Co-orientador/UFV), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Co-orientador/UFV), ABELARDO SILVA JUNIOR (Co-orientador/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Orientador/UFV)

O circovirus suíno 2 (PCV2) é o principal agente causador da Síndrome Multisistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS) e está associado a diferentes síndromes em suínos. A manifestação destas síndromes associadas ao PCV2 é denominada “Doenças associadas ao circovírus suíno (PCVD)”. O objetivo deste trabalho foi padronizar a técnica de imunoistoquímica para a detecção do PCV2. Um sistema de expressão heteróloga da proteína do capsídeo do circovírus suíno 2 (PCV2) em bactérias Escherichia coli foi desenvolvido e a proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade de imobilização em metal (IMAC), confirmada por ensaio de Western blotting e dialisada para o reenovelamento protéico. Esta proteína foi inoculada em coelhos para a produção de um soro hiperimune anti-PCV2 e os anticorpos foram utilizados para a padronização da imunoistoquímica para a detecção do PCV2. Fragmentos de linfonodos de suínos foram selecionados e a imunohistoquímica foi padronizada por meio da incubação com o anticorpo anti-PCV2, como anticorpo primário, e com o anticorpo de cabra anti-IgG de coelho marcado com peroxidase, como anticorpo secundário. A revelação foi realizada utilizando solução de tetra-hidrocloreto de 3,5-diamino-benzidina (DAB) e os cortes foram contracorados com hematoxilina de Harris. As lâminas foram montadas com lamínulas e entellan para posterior visualização microscópica .Os resultados obtidos na imunoistoquímica se mostraram eficazes em detectar os antígenos virais presentes nos tecidos infectados pelo PCV2, porém não foi possível realizar a quantificação viral baseada na morfogênese dos tecidos marcados com os anticorpos. A técnica de imunoistoquímica que foi padronizada poderá ser aplicada no diagnóstico da infecção pelo PCV2, por meio da identificação direta de antígenos virais em lesões histológicas, e na validação de candidatos vacinais que se baseiam na proteína do capsídeo como antígeno estimulador, por meio da análise dos tecidos de animais vacinados.

(FAPEMIG e CNPq )


AVALIAÇÃO GENOTÓXICA POR CLIVAGEM PLASMIDIAL DE FOLHAS DA ESPÉCIE VEGETAL Bathysa cuspidata (St. Hil.) Hook. (Rubiaceae)

DOUGLAS DA COSTA GONTIJO (Bolsista FAPEMIG/UFV), CARLOS JOULBERT ALVES DE SOUZA (Não Bolsista/UFV), CAROLINA SOARES ARAÚJO (Não Bolsista/UFV), ALINE BIANCA DE PAIVA ABRANTES (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV), JOAO PAULO VIANA LEITE (Orientador/UFV)

Testes toxicológicos são necessários em estudos para validação de medicamentos fitoterápicos. Assim, a genotoxicidade avaliada por clivagem plasmidial apresenta-se como teste rápido no qual se observa a interação do DNA com compostos que possam oxidar e clivar o plasmídeo. Esta clivagem faz com que o plasmídeo perca sua forma superenovelada, passando a ter uma nova conformação, que é detectada visualmente em análise de gel de agarose. Visando investigar o efeito genotóxico de plantas popularmente usadas na medicina tradicional, extrato etanólico de folhas de Bathysa cuspidata (EFBC), espécie nativa do bioma Mata Atlântica, conhecida como “quina”, foi avaliado quanto ao seu potencial genotóxico. A espécie foi identificada por comparação de exsicatas no herbário da UFV. O extrato foi preparado por maceração durante sete dias em álcool etílico 95 GL. O solvente foi evaporado e o extrato etanólico diluído em dimetilsulfóxido. Para a realização do teste foi utilizado o plasmídeo pUC 18, de Escherichia coli que possui 2,7 kb, e contêm alto número de cópias dentro da célula. Três concentrações de EFBC (0,51; 1,03; 2,06 mg) foram utilizadas. 100 µg de DNA plasmidial foram incubados com as 3 diferentes concentrações do extrato por 2,5 horas, a 37°C. DNA plasmidial sem tratamento com extrato e DNA tratado com cloreto de estanho (agente genotóxico) foram usados, respectivamente, como controles negativo e positivo de clivagem, respectivamente. Após este período, o DNA tratado com os extratos foi precipitado, sendo, em seguida, realizada corrida em gel de agarose 0,8%. Os resultados indicaram genotoxicidade para as duas maiores doses do extrato testado. Assim, o teste de clivagem plasmidial detectou ação genotóxica do EFBC. Esses resultados mostram grande valor complementar na avaliação de genotoxicidade de plantas, uma vez que outros testes mutagênicos realizados em nosso laboratório para o mesmo extrato, não mostraram resultados positivos. (Apoio: FAPEMIG)

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ESTUDO MUTAGÊNICO In Vitro DA ESPÉCIE VEGETAL Bathysa cuspidata (St. Hil.) Hook. (Rubiaceae) COM Salmonella typhimurium (TESTE DE AMES)

DOUGLAS DA COSTA GONTIJO (Bolsista/UFV), LÍRIA GRANATO NUNES (Não Bolsista/UFV), CAROLINA SOARES ARAÚJO (Não Bolsista/UFV), CARLOS JOULBERT ALVES DE SOUZA (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV), JOAO PAULO VIANA LEITE (Orientador/UFV)

Atualmente, testes mutagênicos apresentam considerável importância, pois a legislação prevê que para o registro de um medicamento é necessário a apresentação de requisitos de segurança referentes à mutagenicidade. Assim, o teste in vitro de Ames se mostra eficaz no estudo de mutagênese, uma vez que sua avaliação é rápida e seus resultados muitas vezes coincidem com testes mutagênicos em modelos animais. A espécie Bathysa cuspidata (St. Hil.) Hook, nativa do bioma Mata Atlântica faz parte do receituário da medicina popular, entretanto, carece de estudos sobre sua segurança. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o potencial mutagênico in vitro de extratos etanólicos de folhas e cascas da espécie B. cuspidata. A espécie foi identificada por comparação de exsicatas no Herbário VIC da UFV. Os extratos foram obtidos por maceração durante sete dias em álcool etílico 95 GL. Para o teste de Ames foram utilizadas as linhagens TA98 e TA100 de S. typhimurium. Cinco concentrações dos extratos de folhas e cascas (0,51; 1,03; 2,06; 3,09 e 4,12 mg/placa) foram testadas sem e com fração metabólica S9, incubadas por 48 horas, a 37°C. Os ensaios foram conduzidos em triplicata, sendo calculada a média do número de revertentes na placa teste dividido pela média do número de reversões espontâneas para cada dose analisada. Um resultado ≥ 2 em pelo menos uma das doses testadas indica mutagênese. Os resultados indicaram mutagenicidade apenas para a menor dose do extrato da casca com metabolização S9 na linhagem TA100. Assim, o emprego do teste de Ames possibilitou uma rápida avaliação sobre a possível mutagenicidade das folhas e cascas de B. cuspidata, sendo observado o baixo potencial mutagênico do extrato de folhas, e a maior potencialidade mutagênica do extrato de cascas, devendo-se ter precaução quanto ao seu uso. (Apoio: FAPEMIG)

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Identificação de fatores de transcrição de soja (Glycine max) envolvidos no controle da expressão do gene GmNRP-B

FABIANA FREITAS MOREIRA (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Co-orientador/UFV), SILVANA PINHEIRO DADALTO (Não Bolsista/UFV), DAIANE MARIA CERQUEIRA (Não Bolsista/UFV), MURILO SIQUEIRA ALVES (Bolsista CAPES/UFV), PEDRO AUGUSTO BRAGA DOS REIS (Bolsista outra Instituição/UFV)

O controle da expressão gênica é um dos mecanismos moleculares mais utilizados pelas plantas para a regulação da resposta fisiológica a diferentes estresses. Recentemente, experimentos de hibridizações de microarranjos de DNA demonstraram que as vias de resposta ao estresse no retículo endoplamático e osmótico convergem no nível de transcrição aumentando sinergisticamente a expressão de um conjunto de genes, entre eles NRP (Asparagine Rich Protein). Neste trabalho, com o objetivo de identificar e caracterizar proteínas que controlam a expressão do gene NRP-B, foi construída uma fusão de transcrição com o promotor deste gene e os genes repórteres HIS3 e o da enzima β-galactosidase. Esta construção foi integrada no genoma de leveduras W303, resultando no transformante W303-pNRP-His/LacZ, que foi utilizado como hospedeiro para a transformação com uma biblioteca de cDNA de soja construída no vetor pEXP AD502. Após a varredura da biblioteca foi identificado um clone positivo que mostrou prototrofia à histidina e ativou a expressão do gene LacZ. O sequenciamento do DNA do clone positivo e a comparação de sua seqüência com o banco de dados do Phytozome mostrou que o gene codifica uma proteína similar a ERD15 de Arabidopsis. O mapeamento do sítio de ligação de GmERD15 ao promotor de NRP-B e o estudo do papel fisiológico desta interação estão em andamento em nosso laboratório.

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ANÁLISE FUNCIONAL DE SÍTIO DE RECRUTAMENTO DE SUBSTRATO ENVOLVIDO NA REGULAÇÃO DO RECEPTOR CINASE NIK1 DE ARABIDOPSIS.

FAHYME COSTA DA SILVA ALMEIDA (Não Bolsista/UFV), ANESIA APARECIDA DOS SANTOS (Não Bolsista/UFV), KENIA VIÇOSO GOMES LOPES (Bolsista CNPq/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Orientador/UFV)

A percepção de sinais através de receptores da superfície celular é um mecanismo comum entre os organismos vivos. Proteínas cinases (PK) possuem um papel fundamental em uma grande variedade de processos celulares. Estas proteínas catalisam a mesma reação química de fosforilação de uma ou mais proteínas ditas como substrato, através da transferência do grupamento -fosfato do ATP para um grupamento hidroxila. O genoma de Arabidopsis contem 417 seqüências de proteínas contendo a estrutura típica de um receptor cinase (Receptor Like Kinase - RLK) que contêm um domínio extracelular seguido de um domínio transmembrana e do domínio cinase. Dentre as RLK’s, 214 genes codificam para uma super classe de proteínas, contendo em sua região extracelular repetições ricas em leucina (Leucine-Rich-Repeat – LRR). Estas proteínas LRR-RLK’s estão envolvidas em uma grande variedade de processos biológicos como desenvolvimento, resistência a doenças e crescimento. Análises mutacionais da proteína NIK1 demonstraram que esta é uma autêntica LRR-RLK com atividade cinase precedida por transfosforilação e oligomerização, se encontra na membrana plasmática e atua na resposta antiviral. Estes experimentos também demonstraram que o domínio intracelular cinase é essencial para sua função e indicaram, através da deleção do domínio C-terminal da proteína NIK1, a presença de determinantes de atividade nesta região. Recentemente, demonstrou-se que a regulação da proteína NIK ocorre por fosforilação da alça de ativação. Deleções da região C-terminal de NIK indicou que esta pode atuar como ponto de recrutamento de substratos. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de construções da proteína NIK1 contendo substituições de quatro resíduos aminoacídicos da região carboxi-terminal de NIK1. Os quatro mutantes foram obtidos por mutagênese in situ e a expressão de tais mutantes como proteínas fusionadas a GST foram obtidas. No momento, as proteínas recombinantes estão sendo purificadas para a realização de ensaios de fosforilação in vitro.

(CNPq, FAPEMIG e FINEP )


AVALIAÇÃO DA QUALIDADE TECNOLÓGICA DE FEIJÃO, MILHO E TRIGO ATACADOS POR INSETOS-PRAGA

FERNANDA ROSA VIEIRA (Não Bolsista/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), FABRICIA QUEIROZ MENDES (Co-orientador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Co-orientador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), MONICA RIBEIRO PIROZI (Co-orientador/UFV), PAULO CESAR CORREA (Co-orientador/UFV), PATRICIA APARECIDA FONTES VIEIRA (Bolsista CNPq/UFV), SOLANGE MARA BIGONHA (Bolsista CAPES/UFV), ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV)

O ataque por insetos causam diversos prejuízos aos grãos, como a perda de peso, o aquecimento e conseqüente deterioração, a perda do valor de mercado e a perda do valor nutritivo do alimento O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de infestação, as alterações de umidade e massa específica aparente ao longo do período de armazenamento de grãos de duas variedades de feijão (jalo e radiante), milho e trigo na presença ou não do inseto-praga e tempo de cocção e capacidade de absorção de água para as duas variedades de feijão. Para os grãos de feijão, as análises foram feitas aos 0, 14, 28, 42, 56, 70, 77 e 84 dias de armazenamento e para os grãos de milho e trigo, aos 0, 14, 28, 42,49, 56, 63 e 72 dias. Grau de infestação foi determinado cortando uma amostra de 100 grãos e analisando individualmente, após 24h em molho. Foram considerados infestados grãos que continham larva, pupa ou inseto adulto e aqueles que apresentaram orifícios de saída do. Umidade foi determinada em estufa a 105º C. Massa específica aparente foi determinada utilizando-se uma balança de peso hectolitro. Para capacidade de absorção de água, 50 grãos foram pesados e embebidos em água por 16 horas e pesadas novamente. Tempo de cocção foi determinado utilizando o cozedor de Mattson A presença do inseto-praga causou aumento de umidade, devido ao rompimento do tegumento e aumento do metabolismo, e diminuição da massa específica aparente, pelo consumo dos grãos pelos insetos. Nos grãos de feijão, a presença de insetos provocou uma diminuição do tempo e cocção e da capacidade de absorção de água. O aumento da umidade, ocasionado pela presença do inseto, o que pode levar ao crescimento de microrganismos e, por conseguinte, a produção de micotoxinas, além das perdas econômicas. Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG

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O PROJETO GENOMA HUMANO COMO FONTE DE BIOPODER: UMA ANÁLISE BIOÉTICA

FERNANDA SILVA DE FARIA (Não Bolsista/UFV), ALUIZIO BOREM DE OLIVEIRA (Orientador/UFV)

Gene pode ser definido como a unidade funcional do material genético (DNA) responsável pela transmissão hereditária. Genoma, por sua vez, corresponde ao conjunto de genes e DNA intergênico de uma espécie. Neste sentido, o Projeto Genoma Humano (PGH) consistiu num programa tecnocientífico que objetivou conhecer todo o genoma do Homo sapiens, mapeando e sequenciando todo o DNA humano. O PGH foi iniciado oficialmente em 1990, nos EUA, e, previsto para durar quinze anos, acabou por ser concluído em 2003. Desde seu lançamento, entretanto, o PGH se vê acompanhado de diversas polêmicas de cunho ético/social. Afinal, o que se pode fazer com esse conhecimento? A bioética surgiu, concretamente, no início dos anos 1970, nos EUA. Foi Van Ressenlaer Potter, oncologista norte-americano, quem cunhou o neologismo bioethics num artigo em 1970 e, depois, publicou a obra que passou a ser referência inicial: Bioethics: bridge of the future (1971), através da qual o neologismo bioética se tornou conhecido internacionalmente. Simplificadamente, bioética pode ser definida como o estudo da moralidade do comportamento humano, visando assegurar a própria dignidade humana, em todos os setores da vida. Este trabalho, portanto, teve como objetivo levantar as principais questões éticas acerca do PGH e analisá-las à luz da bioética, por meio de pesquisa bibliográfica a fontes primárias e secundárias. Pôde-se observar que o PGH, embora represente uma enorme esperança no diagnóstico, tratamento e cura de doenças genéticas, também representa enorme fonte de poder, sobretudo para empresas de biotecnolgia. As principais formas de atuação deste “biopoder” estão diretamente relacionadas com a possibilidade do patenteamento de genes (o qual já é permitido nos EUA), com o acesso ilimitado às informações genéticas (fonte de discriminação), e também com as consequências e incertezas ligadas aos testes genéticos. Conclui-se que a discussão destas questões é urgente, tanto pela relevância bioética quanto pela atualidade.

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OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE PROTEASES DE Paecilomyces marquandii

FILIPPE ELIAS DE FREITAS SOARES (Não Bolsista/UFV), HUGO LEONARDO ANDRE GENIER (Não Bolsista/UFV), FABIANO DE PAULA PEREIRA MACHADO (Bolsista FAPEMIG/UFV), LARISSA FROEDE BRITO (Bolsista CNPq/UFV), LÍVIA DIAS DE QUEIRÓS (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), ROBERT WEINGART BARRETO (Co-orientador/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)

Paecilomyces marquandii pertence ao gênero Paecilomyces, que engloba fungos filamentosos de vários habitats, como solo, plantas mortas e produtos alimentícios. Este fungo produz proteases com potencial para aplicações biotecnológicas, entretanto o processo de produção carece de estudos. Portanto, a otimização dos fatores envolvidos na produção da enzima é de primordial importância devido ao impacto na viabilidade do processo. Este trabalho teve como objetivo otimizar a produção de proteases por fermentação utilizando o fungo Paecilomyces marquandii. O experimento foi conduzido no laboratório de Metabolismo e Fermentações do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. O fungo, previamente isolado, foi armazenado em meio PDA sob refrigeração. Esporos, produzidos pelo fungo repicado em meio PDA e mantido a 28ºC durante 7 dias, foram recolhidos em solução contendo 0,1% de Tween 80 e contados em câmara de Neubauer. O meio mínimo utilizado para a produção da enzima foi constituído, em gramas por litro, de: KH2PO4, 1,5; K2HPO4, 1,0; MgSO4.7H2O, 0,2; CaCl2.2H2O, 0,2; NaCl, 0,2; farelo de trigo como fonte de carbono e nitrogênio, 1 g. O meio foi inoculado com 106 esporos por mL e incubado em agitador rotatório. O pH inicial foi 6,0, a temperatura de 28ºC e 180 rpm de agitação. A produção da enzima foi avaliada em intervalos de 12 horas. Avaliou-se a melhor fonte de carbono entre farelo de trigo, amido solúvel, amido de milho, farelo de soja, resíduo de café, glicose e sacarose. As fontes de nitrogênio estudadas foram NaNO3, NH4Cl, farelo de soja, (NH4)2SO4, extrato de levedura, peptona caseína, triptona e NH4NO3. O sexto dia foi o de maior produção de protease e as melhores fontes de carbono e nitrogênio foram glicose e triptona, respectivamente. Esse estudo mostrou que Paecilomyces marquandii apresenta grande potencial para a produção de proteases.

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PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO PARCIAL E CARACTERIZAÇÃO DA AMILASE DE ARROZ (Oriza sativa).

GABRIEL UMAJI OKA (Não Bolsista/UFV), LUCIANA COUTINHO DE OLIVEIRA (Bolsista FAPEMIG/UFV), FERNANDA PRIETO BRUCKNER (Bolsista/UFV), THALITA DE FARIA MAIA (Não Bolsista/UFV), KENIA VIÇOSO GOMES LOPES (Bolsista CNPq/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)

Amilases possuem grande aplicabilidade Biotecnológica nas indústrias de alimentos, bebidas, papel, farmacêuticas dentre outras. Devido à sua grande importância na Biotecnologia, têm-se buscado fontes alternativas para a produção de amilases. O arroz (Oriza sativa) é geralmente utilizado como fonte de amido. Buscando utilizar sua própria maquinaria bioquímica, escolheu-se o arroz como fonte de amilase. Para determinação das melhores condições de produção de amilase, sementes de arroz foram separadas em 2 grandes grupos para germinação: previamente tratadas com ácido sulfúrico 50% durante 15 minutos e previamente tratadas com água destilada subdivididas em dois sub-grupos: expostos e não expostos à luz. O melhor perfil de atividade amilolítica foi obtido para o arroz submetido ao tratamento com H2SO4 exposto à luz. Após a germinação, foi realizada a extração da enzima por maceração com tampão acetato de Sódio 20 mM, pH 5,4. O extrato bruto foi purificado por precipitação diferencial com sulfato de amônio a 20 e 50 % e por cromatografia de exclusão molecular em resina Sephadex G25. Testes para determinação de temperatura e pH ótimos foram realizados pelo método do DNS variando-se a temperatura entre 20 e 70°C e valores de pH entre 3 e 8, utilizando-se o tampão Mcllvaine. As condições de maior atividade amilásica foram temperatura de 60°C e pH 5,0. Posteriormente, foram realizados testes de termoestabilidade a 60°C por 9:30h. A enzima permaneceu estável durante todo este período. Os parâmetros Km e Vmax aparentes foram determinados, obtendo-se os valores de 0,0476 mmol.L-1 e de 0,672 mmol de glicose.mL-1 min-1, respectivamente. Estes resultados mostram que o arroz apresenta um bom potencial para a produção de amilases.

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ESTIMATIVAS DE PARÂMETROS GENÉTICOS E GANHOS DE SELEÇÃO EM POPULAÇÕES F3:4 PARA AUMENTO DO TEOR DE ÁCIDO OLÉICO EM SEMENTES DE SOJA

GABRIELA ANTONIA DE FREITAS ROCHA (Bolsista CNPq/UFV), LORÊTA BUUDA DA MATTA (Bolsista CNPq/UFV), PEDRO IVO VIEIRA GOOD-GOD (Não Bolsista/UFV), EVERALDO GONCALVES DE BARROS (Co-orientador/UFV), MAURILIO ALVES MOREIRA (Orientador/UFV)

A soja possui características de grande interesse comercial, como teor médio de óleo (cerca de 20%) e alto teor de proteínas (40%). O aumento do teor de ácido oléico (C18:1) permite o aumento do índice de cetanos e da estabilidade oxidativa do biodiesel de soja. Este trabalho teve por objetivo: estimar parâmetros genéticos e o ganho de seleção para o teor de C18:1 em populações F3:4 dos cruzamentos entre (1) FA22 x CD219RR e (2) FA22 x Vencedora. O genitor FA22 apresenta alto teor de C18:1 (500 g kg-1). As variedades comerciais CD219RR e Vencedora apresentam baixo teor de C18:1 (< 250 g kg-1). O teor de C18:1 nas sementes de indivíduos da geração F3:4 foi determinado por cromatografia gasosa, analisados em bulks de 6 sementes. Foram analisadas nas gerações F3:4 156 plantas do cruzamento 1 e 135 plantas no cruzamento 2. A partir desses dados foram estimados os valores de herdabilidade, ganho de seleção direta e média dos indivíduos selecionados na população F3:4. No cruzamento 1 a herdabilidade foi estimada em 60% com ganho de seleção de 41%. O teor médio de C18:1 dos indivíduos selecionados foi de 317 g kg-1. Para a população 2, a herdabilidade foi de 44%; ganho de seleção de 25%; e teor médio de C18:1 dos indivíduos selecionados de 291 g kg-1. A alta herdabilidade observada no cruzamento 1 e 2 indica que a seleção para esse caráter pode ser realizada em gerações precoces. As predições de ganhos foram contrastantes nas duas populações, sendo que o cruzamento FA22 x CD219RR apresentou maior ganho predito. Esse parâmetro permite a seleção mais eficaz de indivíduos com altos teores de ácido oléico no cruzamento. Os indivíduos selecionados serão retrocruzados com as linhagens CD219RR e Vencedora para a obtenção da geração RC1F1, com intuito de recuperar o alto desempenho agronômico dos genitores recorrentes.

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PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE AMILASES DE Aspergillus niger

GUILHERME JOSÉ RIBEIRO RODRIGUES (Não Bolsista/UFV), AMANDA DOS SANTOS SILVA (Não Bolsista/UFV), JOSÉ FABIANO DE SENA NETTO (Não Bolsista/UFV), VINICIUS FERREIRA DA PAIXAO (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

Amilases apresentam grande importância biotecnológica nas indústrias têxteis, químicas e farmacêuticas. As amilases secretadas por fungos da espécie Aspergillus niger são utilizadas industrialmente devido a fatores como fácil cultivo dos microrganismos e a termoestabilidade de suas enzimas. Diante disso, este trabalho visou produzir, extrair, purificar e caracterizar amilases de Aspergillus niger. Micélios de A. niger foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio BDA. Após uma semana, conídios foram obtidos e transferidos para frascos com meio TLE e amido como única fonte de carbono. Esses frascos foram mantidos em agitador a 150 rpm e 27 °C. Após 24, 48, 72 e 96 horas de incubação, alíquotas foram coletadas para testes de atividade. A determinação da concentração de proteínas foi realizada pelo método de Bradford e a atividade amilolítica pelo método do DNS. A etapa de purificação parcial do extrato bruto consistiu em uma cromatografia de troca aniônica, utilizando-se a resina DEAE-Sepharose. Realizou-se ainda ensaio de estabilidade de armazenamento, SDS-PAGE e caracterização bioquímica: ensaio de pH, efeito da temperatura e de íons metálicos do extrato bruto. O tempo de 72 horas mostrou-se como o tempo de maior produção das amilases e o ensaio de estabilidade de armazenamento constatou que a estocagem em freezer como o melhor meio para armazenamento, pois manteve a atividade da enzima por 72 horas. Os ensaios de pH mostraram dois valores de pH ótimo 6,5 e 8,5, sugerindo a presença de pelo menos duas enzimas no extrato. A temperatura de atividade ótima foi 60 °C, ainda nossos resultados mostraram que a presença de íons Zn+2 no meio reacional aumentou em 35,7 % a atividade enzimática. Nosso trabalho mostra a caracterização de amilases produzidas por uma cepa de A. niger isolada na UFV, que possuem propriedades interessantes para uso industrial.

Apoio financeiro: Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. ()


Ehrlichia spp. EM CARRAPATOS COLETADOS EM ÁREA SOB FORTE PRESSÃO ANTRÓPICA NO MUNICÍPIO DE CARATINGA, ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL.

HIGO NASSER SANTANNA MOREIRA (Bolsista FAPEMIG/UFV), EDVALDO BARROS (Não Bolsista/UFV), THIAGO MAGALHÃES MALTA (Não Bolsista/UFV), NAYRA FERNANDES SANTOS (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), CLAUDIO LISIAS MAFRA DE SIQUEIRA (Orientador/UFV)

O gênero Ehrlichia compreende bactérias Gram-negativas, intracelulares obrigatórias, causadoras de ehrlichioses que acometem cães, eqüinos, ruminantes, felinos e o homem. São transmitidas via picada de carrapatos, infectando preferencialmente monócitos e granulócitos. Destaca-se a Ehrlichia canis, agente etiológico da Ehrlichiose canina em cães, cujo principal vetor é o carrapato do cão, Rhipicephalus sanguineus. Este trabalho investigou, pela técnica de nested-PCR, a presença de bactérias do gênero Ehrlichia em carrapatos coletados de uma área alterada por forte ação antrópica, no município de Caratinga-MG, através da amplificação de porções conservadas e variáveis do gene 16S rRNA. Foram coletados 955 carrapatos, organizados em 33 lotes, de acordo com origem, espécie e estádio de desenvolvimento. Os carrapatos foram coletados do ambiente e de animais domésticos (cinco cães e quatro eqüinos), levados para laboratório no DBB/UFV, onde foram identificados e separados. Procedeu-se à extração de DNA dos lotes pelo do método do fenol-clorofórmio. As amostras de DNA foram testadas por nested-PCR para presença de Ehrlichia spp. com primers ER5-3 e ER-R1 (1ª reação) e Ap-F1 e Ap-R1 (2ª reação) que amplificam uma porção de 1,4 kb conservada do gene 16S rRNA. Para a reação E. canis-específica, foram utilizados os primers ECC e ECB, que amplificam uma região hipervariável de 381pb do gene 16S rDNA. O resultado destas reações foi visualizado em gel de agarose 1,5%, fotodocumentado e analisado. Dos lotes testados, 5 foram positivos para Ehrlichia spp. (15,1%) sendo todos estes também positivos para E. canis. Três destes lotes consistiam de amostras de Rhipicephalus sanguineus, coletados de 2 cães da região. Os outros dois lotes positivos consistiam de Dermacentor nitens e Amblyomma cajennense. Conclui-se que D. nitens e A. cajennense também podem estar atuando como vetores de E. canis na região.

(University of Texas Medical Branch )


INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE Rickettsia spp. EM CARRAPATOS COLETADOS NA ÁREA DE INFLUÊNCIA DE UMA USINA HIDRELÉTRICA NA REGIÃO DO VALE DO RIO DOCE, ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL.

HIGO NASSER SANTANNA MOREIRA (Bolsista FAPEMIG/UFV), EDVALDO BARROS (Não Bolsista/UFV), THIAGO MAGALHÃES MALTA (Não Bolsista/UFV), LUIZA CARVALHO MOURÃO (Não Bolsista/UFV), CLAUDIO LISIAS MAFRA DE SIQUEIRA (Orientador/UFV)

Os carrapatos são ectoparasitas hematófagos, atuando como transmissores de enfermidades de importância médico-veterinária. Dentre estas, destaca-se a Febre Maculosa Brasileira (FMB), doença hemorrágica causada por bactérias do gênero Rickettsia, transmitidas principalmente por carrapatos do gênero Amblyomma, amplamente distribuídos na região Sudeste. A FMB apresenta elevado índice de mortalidade quando não tratada adequadamente. Este trabalho investigou, pela técnica da nested-PCR, a presença de riquétsias do grupo da FMB (GFM), em carrapatos coletados em área alterada por usina hidrelétrica no Vale do Rio Doce. Foram coletados 955 carrapatos, organizados em 33 lotes, de acordo com origem, espécie e estádio de desenvolvimento. Os carrapatos foram coletados do ambiente e de animais domésticos (cinco cães e quatro eqüinos), levados para laboratório no DBB/UFV, onde foram identificados e separados. Procedeu-se à extração de DNA dos lotes através do método do fenol-clorofórmio. Em seguida, as amostras foram testadas por nested-PCR com os primers 17K3 (forward) e 17K5 (reverse), para 1ª reação de amplificação, e respectivamente, 17K1 e 17K2, para 2ª reação, específicos para o gene codificante do antígeno de 17kDa, conservado entre riquétsias do GFM. O resultado destas reações foi visualizado em gel de agarose 1,5%, fotodocumentado e analisado. Dos carrapatos coletados do ambiente, o gênero mais encontrado foi o Amblyomma. Nos animais, foram encontrados: Amblyomma cajennense, Dermacentor nitens, Rhipicephalus microplus e Rhipicephalus sanguineus, além de larvas do gênero Ixodes. Sete lotes (21,2%) foram positivos, para riquétsias do GFM, sendo 1 lote coletado do ambiente (Amblyomma sp.) e os demais, de três eqüídeos (2 de Amblyomma cajennense e 2 de R. microplus) e de dois cães (2 de R. sanguineus). Conclui-se que riquétsias do GFM circulam na região, com os carrapatos A. cajennense, R. microplus e R. sanguineus podendo atuar como vetores.

(University of Texas Medical Branch )


PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO PARCIAL E CARACTERIZAÇÃO DAS AMILASES DO MILHO DE PIPOCA (Zea Mays)

HUGO LEONARDO ANDRE GENIER (Não Bolsista/UFV), FILIPPE ELIAS DE FREITAS SOARES (Não Bolsista/UFV), FERNANDA DE LIMA VALADARES (Não Bolsista/UFV), THALES HENRIQUE DE FREITAS COSTA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), VITOR DE OLIVEIRA SILVA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), LÍVIA MARIA LIMA LOPES (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)

O milho-pipoca, típico do continente americano, é bastante apreciado no Brasil. Durante a germinação o milho produz amilases para degradar suas reservas de amido e permitir o início do crescimento da plântula. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar parcialmente e caracterizar amilases do milho-pipoca. O experimento foi conduzido no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. As sementes utilizadas foram da linhagem DFT – 02 Barão de Viçosa, cedidas pelo Departamento de Solos. Os grãos foram mantidos em ambiente escuro à temperatura de 27°C. Aproximadamente 1g de milho foi coletado diariamente por sete dias após o início da incubação e a amilase produzida foi quantificada. Os grãos germinados foram macerados em almofariz usando-se tampão TRIS-HCl 0,1mol.L-1, pH 7, contendo NaCl 0,1mol.L-1 e CaCl2 10mmol.L-1. O macerado foi centrifugado a 4.000g durante 10 minutos, coletando-se o sobrenadante para realização dos ensaios. A determinação da atividade enzimática foi efetuada pelo método do 3,5 ácido dinitrosalicílico e o teor de proteínas pelo método de Bradford. O extrato enzimático bruto foi submetido a uma cromatografia de troca iônica (CM-Sepharose) selecionando as frações de maior atividade enzimática para o preparo do pool enzimático. Foram avaliados a temperatura e pH ótimos, o efeito de íons sobre a atividade catalítica da enzima e a sua termoestabilidade. Ao sexto dia obteve-se a maior atividade amilolítica. A temperatura de 50 °C e o pH entre 5,0 - 6,0 foram as melhores condições para a atividade enzimática. O íon cálcio ativou a enzima. O zinco, EDTA, magnésio e cobre inibiram a enzima. A 50°C a enzima perdeu sua atividade após duas horas de incubação. Outros estudos deverão ser conduzidos para melhor avaliar o potencial biotecnológico da amilase do milho-pipoca.

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IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS QUE INTERAGEM COM NIG (NSP-Interacting GTPase)

JOÃO PAULO BATISTA MACHADO (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), CLAUDINE MARCIA CARVALHO (Co-orientador/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Co-orientador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

Os geminivírus constituem um grande grupo de vírus de DNA que infectam plantas e, por replicarem no núcleo de células infectadas, requerem a atuação de proteínas virais de movimento para facilitar o transporte do DNA recém-replicado do núcleo para o citoplasma, e do citoplasma para as células adjacentes. No caso de geminivírus bissegmentados, estas funções são desempenhadas por NSP (nuclear shuttle protein) e MP (moviment protein), respectivamente. No entanto, o mecanismo pelo qual NSP media o movimento nucleocitoplasmático do DNA viral não é conhecido. Recentemente, foi identificada uma GTPase denominada NIG (NSP-Interacting GTPase) pela sua capacidade de interagir com NSP no sistema duplo híbrido de leveduras. Resultados anteriores mostraram que NIG interage com NSP in vivo (sob expressão transiente), e que quando co-expressas, há um redirecionamento da proteína viral do núcleo para o citoplasma. Diante disso, a proteína NIG pode estar amplamente relacionada ao transporte nucleocitoplasmático do genoma viral. Com o objetivo de determinar a função celular e, assim determinar se esta GTPase desempenha algum papel na translocação do genoma viral do núcleo para o citoplasma, utilizou-se o sistema duplo híbrido de leveduras para identificação de proteínas que interagem com o domínio carboxiterminal (Pro-Rich) de NIG. Para isto, utilizou-se uma biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana clonada no vetor pEXP-AD502. Para a triagem, foi utilizado como isca o clone pBD-Pro-Rich, no qual o cDNA da proteína truncada está fusionado ao domínio de ligação ao DNA de Gal4. A estirpe de levedura AH109, contendo pBD-Pro-Rich, foi transformada com a biblioteca de cDNA e os transformantes selecionados em meio seletivo (sem Leu, Trp e His e suplementado com 10mM 3AT). Foram isolados 10 clones que mostraram His prototrofia e atividade de β-galactosidase. Experimentos estão em progresso para a confirmação bioquímica das interações verificadas bem como o significado bioquímico das mesmas.

(CNPq, Fapemig e Finep )


AJUSTES DE METODOLOGIAS PARA ANÁLISE PEPTIDÔMICA DA RESPOSTA À INOCULAÇÃO POR Phakopsora pachyrhizi – IDENTIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS DE DEFESA

JOSÉ FABIANO DE SENA NETTO (Bolsista CNPq/UFV), MARIA CRISTINA BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), MARCOS JORGE DE MAGALHÃES JÚNIOR (Não Bolsista/UFV), MEIRE DE OLIVEIRA BARBOSA (Bolsista CAPES/UFV), MARIANA LIMA BORONI MARTINS (Bolsista FAPEMIG/UFV), REGINALDO DA SILVA ROMEIRO (Co-orientador/UFV)

Peptídeos antimicrobianos constituem um mecanismo de defesa ubíquo na natureza. A soja é acometida pela ferrugem asiática, causado pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, alterando o metabolismo da soja que responde sintetizando moléculas de defesa. Desse modo, o trabalho visa ajustar metodologias para identificar peptídeos e proteínas de baixas massas moleculares expressos diferencialmente em resposta à infecção causada pelo patógeno Phakopsora pachyrhizi. Folhas de soja feridas e folhas não feridas foram maceradas individualmente (Tris-HCl e inibidores de proteases), fracionadas com sulfato de amônio, o homogenato resultante foi centrifugado e o sobrenadante denominado Extrato Solúvel (ES). Cada precipitado foi extraído com LiCl, seguido de fracionamento com sulfato de amônio e centrifugado obtendo-se o Extrato de Parede Celular (EP). Os diferentes extratos foram ultrafiltrados, recuperando-se as seguintes frações para as plantas não-feridas: ES e EP >30 kDa; ES e EP 10-30 kDa; ES e EP 1-10 kDa. As plantas feridas originaram as frações ES e EP > 30 kDa; ES e EP 1-30 kDa. Para as plantas não feridas pôde-se observar um aspecto de aglomerado. SDS-Tricina-PAGE foi realizada para avaliar o fracionamento dos diferentes extratos. Para a fração ES 10-30 kDa foi verificado a presença de bandas protéicas em torno de 50 kDa. Esta banda foi eletroeluída e nova SDS-Tricina-PAGE foi realizada mostrando bandas protéicas de massas moleculares distintas, reforçando a hipótese de aglomeração protéica neste extrato. Ensaio de detecção de enzimas indicadoras do estado de indução de resistência mostrou diferenças estatísticas na produção de peroxidases e quitinases entre os tratamentos, evidenciando resposta da planta ao estresse submetido (ferimento). Atividades antimicrobianas de algumas frações de plantas feridas revelaram inibição do crescimento bacteriano superior a 50%, enquanto que as frações de plantas não feridas apresentaram um menor percentual. A metodologia proposta se mostrou adequada para análise peptidômica da resposta à inoculação por Phakopsora pachyrhizi. Suporte: CNPq, FAPEMIG, FINEP e CAPES.

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EXTRAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS EM RESÍDUO DE CAFÉ SECO E FERMENTADO

LÍVIA DIAS DE QUEIRÓS (Bolsista FAPEMIG/UFV), LARISSA FROEDE BRITO (Bolsista CNPq/UFV), ALINE FRANCINE SILVA (Não Bolsista/UFV), FABIANO DE PAULA PEREIRA MACHADO (Bolsista FAPEMIG/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)

Dentre os produtos agrícolas utilizados pelo homem, o café destaca-se no cenário mundial, constando como grande gerador de divisas e movimentando de 12 a 13 bilhões de dólares por ano. Segundo dados da Conab, a estimativa da produção de café no país será de aproximadamente 39 milhões de sacas para o ano de 2009. O resíduo do café é rico em polifenóis e compostos bioativos com ação antioxidante. Diversos estudos realizados com compostos fenólicos demonstram sua capacidade de captar radicais livres (atividade antioxidante) e seus efeitos na preservação de enfermidades cardiovasculares e circulatórias. O presente trabalho teve como objetivo determinar o melhor solvente para extrair e quantificar o teor de compostos fenólicos totais dos resíduos do café seco e fermentado por Monascus ruber CCT 1236. O teor de fenóis foi estimado utilizando-se o reagente de Folin-Ciocalteu, de acordo com a metodologia proposta por Singleton et al. (1999). A absorvância foi realizada em espectrofotômetro a 765 nm e foi utilizada uma curva padrão de ácido gálico para expressar os resultados em Equivalentes de Ácido Gálico (GAEs). Para definir a melhor extração foram testados diferentes sistemas com os solventes água e etanol e foram feitas extrações sucessivas para testar a eficiência da extração. De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que os teores mais elevados de fenóis totais foram detectados nos extratos de água/etanol na proporção de 6:4, enquanto o extrato etanólico apresentou os menores teores de fenóis. Portanto, a solução de água/etanol (6:4) foi a que se mostrou mais eficiente na extração de fenóis totais dos resíduos de café seco e fermentado.

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EXPRESSÂO HETERÓLOGA E OBTENÇÃO DE SORO POLICLONAL CONTRA TRANSFATORES NACS DE SOJA

LUCAS BOENO OLIVEIRA (Bolsista FAPEMIG/UFV), GUILHERME LUIZ PINHEIRO (Bolsista CNPq/UFV), ANESIA APARECIDA DOS SANTOS (Bolsista CNPq/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Orientador/UFV)

As proteínas NAC de soja são fatores transcricionais específicos de planta e envolvidos em desenvolvimento de órgãos e resposta a estresses. Recentemente, foi caracterizado um conjunto de transfatores NAC de soja induzidos por estresse abiótico. Este projeto se concentra na caracterização mais detalhada de três membros da superfamília NAC: ATAF2, GmNAC3 e GmNAC6. De maneira condizente com a função de transfatores, as proteínas fusionadas com YFP foram localizadas no núcleo de folhas de tabaco por microscopia confocal de fluorescência. A expressão transiente de GmNAC6 em folhas de tabaco resultou em morte celular e aumento da expressão de marcadores de senescência. Além disso, ATAF2 e GmNAC3 foram induzidos por tratamento com PEG enquanto ATAF2 e GmNAC6 foram induzidos por tratamento com tunicamicina, um portente indutor de estresses no retículo endoplasmático. Estes resultados demostram que os NACs descritos são fatores de transcrição funcionais não redundantes envolvidos em resposta à estresse abióticos e eventos de morte celular em soja. Os três genes, ATAF2, GmNAC3 e GmNAC6, foram clonados em pDEST17 e expressos em E. coli como proteínas fusionadas à uma cauda de histidina. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e usadas como antígeno para produzir anticorpos em coelhos. O antissoro obtido foi titulado por DotBlot utilizando as proteínas recombinantes como alvo de detecção. Os anticorpos foram obtidos com sucesso e serão usados em ensaios imunológicos para detecção dos transfatores em diferentes órgãos de plantas submetidas a condições normais e de estresses fisiológicos


IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS QUE INTERAGEM COM AS PROTEÍNAS RICAS EM ASPARAGINA (NRP-A E NRP-B) DE SOJA (Glycine max)

LUCIANA COUTINHO DE OLIVEIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), PEDRO AUGUSTO BRAGA DOS REIS (Bolsista CAPES/UFV), GUSTAVO LEÃO ROSADO (Bolsista CNPq/UFV), MURILO SIQUEIRA ALVES (Bolsista CAPES/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Co-orientador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

A Morte Celular Programada (PCD) envolve vias de sinalização que controlam a destruição das células com o mínimo dano às células vizinhas. Em plantas, a PCD ocorre em processos de senescência, embriogênese e durante a interação da planta com patógenos. Apesar do conhecimento de marcadores morfológicos e bioquímicos similares ao de mamíferos, não se sabe bem como é o controle da PCD, em especial, eventos relacionados com morte celular induzida por estresses abióticos. Recentemente, por análises de microarranjos de DNA, foi demonstrada uma conexão entre as vias de resposta a estresses no retículo e osmótico onde vários genes apresentaram expressão co-regulada pelos dois estresses. Entres estes, estão genes que codificam proteínas ricas em asparagina (NRPs). Com o intuito de caracterizar os componentes desta via integrativa, construiu-se uma biblioteca de cDNA de soja para varredura pelo sistema de duplo-híbrido. Para isso, plantas de soja foram submetidas a condições de estresse osmótico e no retículo endoplasmático. Posteriormente, o mRNA destas plantas foi extraído e utilizado para a síntese de cDNAs que foram clonados fusionados ao domínio de ativação do transfator Gal4 de leveduras utilizando o vetor pEXP-AD502. Procedeu-se à transformação de E.coli linhagem DH5α com a biblioteca de cDNA e a posterior extração de DNA plasmidial das colônias. Paralelamente, os cDNAs de NRP-A e NRP-B foram fusionados no domínio de ligação de GAL-4, gerando os clones pBD-NRP-A e pBD-NRP-B, que foram utilizados para transformação de leveduras AH109. As leveduras pré-transformadas com pBD-NRP-A e pBD_NRP-B foram utilizadas como hospedeiras para transformação com o cDNA da biblioteca preparada de soja para triagem de proteínas que interagem com NRP-A e NRP-B. Nesta varredura foram isolados 10 clones para cada proteína que foram sequenciados. Por comparação no banco de dados do Phytozome foi demonstrada a presença de proteínas envolvidas no metabolismo basal e fatores de transcrição.

(FAPEMIG, CNPq )


CARACTERIZAÇÃO DE GENÓTIPOS DE Coffea canephora POR MEIO DE MARCADORES RAPD

LUÍS FELIPE VENTORIM FERRÃO (Não Bolsista/UFV), Eveline Teixeira Caixeta (Orientador/), FLÁVIO DE FRANÇA SOUZA (Bolsista outra Instituição/UFV), EUNIZE MACIEL ZAMBOLIM (Co-orientador/UFV), NEY SUSSUMU SAKIYAMA (Co-orientador/UFV), LAERCIO ZAMBOLIM (Co-orientador/UFV)

O café canéfora originou-se no centro-oeste africano, é uma espécie diplóide (2n=22), alógama e auto-incompatível. Seus grãos produzem uma bebida de sabor e aroma neutros, com maior teor de cafeína e de sólidos solúveis. Tais características possibilitam o seu emprego na composição de blends com café arábica e na produção dos cafés solúveis. Os programas brasileiros de melhoramento genético de C. canephora são bem supridos por um importante pool gênico conservado nos Bancos de Germoplasma (BAGs) de diferentes instituições nacionais. Embora muitos desses acessos já tenham sido avaliados, é necessário mais informações sobre a diversidade e a estrutura genética dessas populações. Dessa forma, esse trabalho objetivou o estudo preliminar da diversidade genética entre acessos de C. canephora, usando marcadores RAPD. Avaliaram-se 83 acessos conservados na Estação Experimental da Embrapa Rondônia, em Ouro Preto do Oeste-RO, provenientes dos BAGs de várias instituições brasileiras de pesquisa, e de coletas no Estado de Rondônia. A análise molecular foi realizada no Laboratório de Biotecnologia do cafeeiro/UFV, utilizando os primers OPR-01, OPAM-07, OAS-09, OPX-05 e OPN-07. As marcas obtidas foram convertidas em dados binários, com os quais se obteve uma matriz de dissimilaridade, usando o complemento algébrico do índice de Jaccard. O dendograma foi construído por meio do método UPGMA, utilizando o programa computacional Treecon. Foram obtidas 26 marcas polimórficas, variando de três (OPR-01 e OPX-05) a nove (OPN-07) bandas por primer. O agrupamento resultou na formação de dois grupos principais, que correspondem aos tipos varietais Conilon e Robusta. No primeiro grupo, observaram-se três subgrupos, sendo, dois compostos por acessos de Conilon, dos BAGs do Instituto Agronômico de Campinas e da Embrapa, e o terceiro por híbridos espontâneos entre Conilons e Robustas, coletados em Rondônia. Dessa forma, conclui-se que o RAPD apresentou polimorfismo satisfatório, possibilitando uma razoável compreensão da diversidade genética do germoplasma avaliado.

(EMBRAPA café )


ESTABILIDADE DE DEXTRANASE DE Paecilomyces marquandii

MARIA ROMÉRIA DA SILVA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), FABIANO DE PAULA PEREIRA MACHADO (Bolsista FAPEMIG/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)

A cárie dentária é uma doença infecto-contagiosa grave que se inicia pela formação de placas bacterianas. A adesão de bactérias causadoras da cárie ao esmalte dos dentes é facilitada por dextranas produzidas pela microbiota bucal. Dextranases podem ser utilizadas para promover a hidrólise dessas dextranas impedindo a formação de placas iniciadoras da cárie. Estas enzimas são produzidas por diferentes tipos de microrganismos, dentre eles, os fungos se destacam como os maiores produtores. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estabilidade da enzima dextranase produzida pelo fungo Paecilomyces marquandii em creme dental para a prevenção de cáries dentárias. A determinação da atividade de dextranase foi feita mediante a quantificação de açúcares redutores formados a partir da hidrólise de dextrana (Método do DNS). Definiu-se uma unidade dextranásica (U/ml) como a quantidade de enzima capaz de produzir 1mM de açúcar redutor por minuto em pH 5,2 e a 40°C. A enzima foi produzida em meio líquido, utilizando dextrana como única fonte de carbono, e purificada pela técnica de cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose pH 6,0. Testou-se a estabilidade de dextranase quanto ao pH e à temperatura. A enzima manteve-se bastante estável na faixa de pH de 4,0 a 8,0 e às temperaturas de 0°C e ambiente. À temperatura de 55°C, a dextranase foi totalmente inativada. Posteriormente, selecionou-se um creme dental de marca comercial de pH aproximadamente 7,0, valor de pH no qual a enzima apresentou maior estabilidade. A enzima foi incubada nesse creme dental por 15 dias e teve a capacidade de manter cerca de 80% de sua atividade inicial. Este resultado é uma evidência de que, a dextranase produzida por P. marquandii,pode ser aplicada a cremes dentais com a finalidade de prevenir o surgimento de cáries.

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QUALIDADE PROTEICA DE GRÃOS QUE SOFRERAM O ATAQUE DE INSETOS PRAGA.

MAYARA DA FONSECA APOLINARIO (Bolsista CNPq/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), MONICA RIBEIRO PIROZI (Co-orientador/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Co-orientador/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), FABRICIA QUEIROZ MENDES (Co-orientador/UFV)

O ataque por insetos causam diversos prejuízos aos grãos, dentre eles a perda de peso do grão, o aquecimento e conseqüente deterioração, devido ao metabolismo do inseto, a perda do valor de mercado e a perda do valor nutritivo do alimento, em decorrência do consumo pelo inseto. O objetivo deste trabalho foi avaliar a digestibilidade, escore químico, PDCAAs, PER e NPR das farinhas de milho, trigo e duas variedades de feijões (jalo e radiante) infestados e não infestados. A avaliação da qualidade protéica foi conduzida por meio de ensaios biológicos, durante 14 dias, utilizando-se ratos machos, raça Wistar, recém desmamados. As dietas continham teores de 9 a 10% de proteína. Para o cálculo da digestibilidade, as dietas foram marcadas com índigo-carmim e as fezes coletadas do 8° ao 11° dia do experimento, acondicionadas individualmente sob refrigeração. Após o período de coleta, foram secas em estufa a 105°C durante 24 horas. Foram resfriadas, pesadas e moídas para determinação do teor de nitrogênio, utilizando o método semimicro Kjeldhal. PER e NPR foram calculados utilizando valores do consumo de ração e ganho de peso durante 14 dias. A análise de aminoácidos foi realizada utilizando-se o método feniltiocarbamil aminoácidos (PTC). Observou-se que a presença do inseto-praga não alterou a digestibilidade dos grãos analisados, porém houve redução do PER e do NPR para os grãos de feijão, fato que não foi observado para os grãos de milho e trigo. A variação do escore químico de aminoácidos foi maior para as farinhas de feijão do que as farinhas de milho e trigo. A qualidade nutricional de grãos é diminuída com o ataque de insetos, porém a família do inseto e a composição do grão influenciam esta alteração da qualidade. Apoio Financeiro: FAPEMIG, CAPES, CNPq

(CAPES, FAPEMIG e CNPQ )


Construção de adenovírus recombinantes como candidatos vacinais e agentes antivirais para o controle da circovirose suína.

MIKAEL MENEZES MOTTA SOARES (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), ORLANDO CHIARELLI NETO (Bolsista CAPES/UFV), PEDRO MARCUS PEREIRA VIDIGAL (Bolsista CNPq/UFV), Mauro Pires Moraes (Co-orientador/), JULIANA LOPES RANGEL FIETTO (Co-orientador/UFV), ABELARDO SILVA JUNIOR (Co-orientador/UFV), MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO (Orientador/UFV)

O circovirus suíno 2 (PCV2) é o principal agente causador da Síndrome Multisistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS) e está associado a diferentes síndromes em suínos. A proteína do capsídeo viral do PCV2 representa o principal alvo para o sistema imune do suíno, consistindo em um antígeno interessante para o desenvolvimento de candidatos vacinais. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi produzir adenovírus recombinantes que expressam a proteína do capsídeo do PCV2 e verificar a expressão in vitro desta proteína. Células da linhagem HEK293 foram transfectadas com o sistema de expressão gênica de adenovírus (pAd5-ORF2) que expressa a proteína do capsídeo do PCV2, previamente linearizado pela enzima PacI. A expressão da proteína viral in vitro foi confirmada pelos ensaios de imunoperoxidase em monocamada de células (IPMA), Western blotting e imunofluorescência (IFA). A partir dos ensaios de Western blotting e IPMA, foi possível detectar a expressão da proteína viral em cultura de células HEK 293 infectadas com o adenovírus recombinante não purificado. Estes resultados indicam que o sistema de expressão é funcional, sendo capaz de expressar a proteína do PCV2. O adenovírus recombinante foi multiplicado nas células HEK293, purificado utilizando ultra centrifugação em gradiente de cloreto de césio e diálise, titulado (2x108 TCID50/50µL) e analisado por IFA. A partir do ensaio de imunofluorescência, foi possível detectar a expressão da proteína do capsídeo viral do PCV2 em cultura de células HEK 293 infectadas com o adenovírus recombinante purificado. Estes resultados indicam que o sistema é funcional em cultura celular quando administrado na forma purificada, por meio de uma eficiente expressão da proteína do capsídeo do PCV2 após duas horas de inoculação com o adenovírus recombinante purificado. A expectativa deste trabalho é que este adenovírus recombinante possa resultar em uma vacina que contribua para o controle eficiente da infecção pelo PCV2 no Brasil.

(FAPEMIG e CNPq. )


CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICO-CINÉTICA DE CISTEÍNO PROTEASES PRESENTES NO INTESTINO MÉDIO DE LAGARTA DA SOJA

NATÁLIA CRISTINA SANTOS COSTA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), EDUARDO GOMES DE MENDONÇA (Bolsista CAPES/UFV), ZAIRA BRUNA HOFFMAM (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Co-orientador/UFV)

A caracterização enzimática é necessária para o entendimento da cinética com que a enzima realiza eficientemente seu processamento químico e os fatores que a afetam. Essa caracterização pode ser usada na busca de inibidores que interferem no processo digestivo de insetos. Assim, objetivou-se nesse trabalho caracterizar bioquímica e cineticamente cisteíno proteases do intestino médio de Anticarsia gemmatalis. Essa caracterização foi realizada usando o substrato sintético L-BApNA, o agente redutor β-mercaptoetanol, o inibidor de serino protease Benzamidina e o inibidor de aspartil protease Pepstatina A, para que somente cisteíno proteases atuassem. Duas frações do extrato enzimático foram caracterizadas, sendo as proteínas solúveis chamadas de Fração Solúvel e as proteínas ligadas à membrana, de Fração Insolúvel. Para Fração Solúvel, o maior valor de atividade ocorreu em pH 3,6 e para a Fração Insolúvel, tanto em pH 4,6 como em pH 8,0 o mesmo valor de atividade foi encontrado. O efeito da temperatura mostrou maior atividade à 45°C para Fração Solúvel e à 50°C para Fração Insolúvel. Os valores de KM app e Vmáx app foram 0,6368 mM e 42,56 nM.s-1 para

Fração Solúvel e 0,0413 mM e 10,85 nM.s-1 para Fração Insolúvel. Ao analisar o efeito de modificadores químicos, a Fração Solúvel mostrou-se insensível à Aprotinina e E-64, porém teve sua atividade aumentada pela adição de EDTA e levemente inibida pela adição de íons Ca2+, mostrando se tratar de enzimas independentes de íons metálicos para sua atividade. A Fração Insolúvel também foi insensível à Aprotinina, porém teve atividade parcialmente inibida por E-64. A adição de EDTA levou a uma redução nos valores de atividade, demonstrando a necessidade de íons metálicos para a atividade dessas enzimas, porém não se tratam de enzimas cálcio-dependentes, uma vez que sua atividade foi reduzida com a adição desse íon.

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ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE EXTRATOS PROTÉICOS E PEPTÍDICOS DA PLANTA CICATRIZANTE MIL FOLHAS

NAYARA GUSMÃO TESSAROLLO (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARIA CRISTINA BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), LANNA CLICIA CARRIJO (Não Bolsista/UFV), HEBRÉIA OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV), TÂNUS HENRIQUE ABDALLA PEREIRA (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), MARIANA LIMA BORONI MARTINS (Bolsista FAPEMIG/UFV), MEIRE DE OLIVEIRA BARBOSA (Bolsista CNPq/UFV), PATRÍCIA DIAS GAMES (Bolsista FAPEMIG/UFV), REGINALDO DA SILVA ROMEIRO (Co-orientador/UFV)

Peptídeos antimicrobianos constituem um mecanismo de defesa primário para diversos organismos, sendo expressos em plantas de forma constitutiva ou induzida. Achillea millefolium L. é uma planta cicatrizante com propriedades antiinflamatórias e antimicrobianas. Proteínas e peptídeos podem estar envolvidos nessas propriedades. O trabalho visa determinar o potencial antimicrobiano in vitro dos extratos protéicos de folhas da planta Mil Folhas. Folhas secas foram moídas e maceradas (Tris-HCl/benzamidina/PMSF/tiouréia). O homogenato foi centrifugado (20.000g/4oC/30min) e o sobrenadante denominado Extrato Solúvel (ES). O precipitado foi ressuspendido (LiCl/PMSF/benzamidina/tiouréia), centrifugado (20.000g/4oC/30min) e o sobrenadante denominado Extrato de Parede Celular (EP). ES e EP foram submetidos à ultrafiltração (30kDa/10kDa/1kDa), obtendo-se três frações: maior que 30kDa (ES/EP>30), entre 10 e 30kDa (ES/EP10-30) e entre 1 e 10kDa (ES/EP1-10). As frações foram fracionadas com sal, dessalinizadas e concentradas (1kDa). Por ser um extrato menos complexo e enriquecido com peptídeos e proteínas de parede celular, EP foi avaliado contra as bactérias Clavibacter michiganesis subsp. michiganensis e Ralstonia solanacearum. Para R.solanacearum, EP10-30 e EP1-10 apresentaram 18% de inibição. EP>30 não mostrou inibição significativa. Para C. michiganesis subsp. michiganensis, EP>30 apresentou inibição de 10%. EP10-30 não inibiu o crescimento microbiano e EP1-10 inibiu em 28%. EP1-10 e EP10-30 foram parcialmente purificadas (DEAE-Sepharose). Os picos das frações EP1-10 e EP10-30, foram concentrados, dessalinizados e avaliados contra cinco bactérias fitopatogênicas. Para EP1-10, a fração catiônica (FC) 1, EP1-10FC1, promoveu inibição total do crescimento da bactéria R. solanacearum. A fração aniônica (FA) 7, EP1-10FA7, apresentou inibição de 20% contra Erwinia carotovora subsp. carotovora e 25% contra Pseudomonas syringae pv tomato. Para EP10-30, EP10-30FA1 apresentou 82% e 32% de inibição contra R solanacearum e C. michiganesis subsp. michiganensis, respectivamente. EP10-30FA5 inibiu em 64% Xantomonas axonopodis pv phaseoli. A identificação de proteínas e peptídeos antimicrobianos corresponde a uma estratégia promissora para uso na defesa de plantas.

(FAPEMIG, CNPq, FINEP, CAPES )


AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE ACESSOS DE Jatropha curcas L. POR MEIO DE MARCADORES RAPD

NINA ROSA FERNANDES DINIZ (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), LUIZ ANTONIO DOS SANTOS DIAS (Orientador/UFV), ELLEN DE CARVALHO (Não Bolsista/)

Jatropha curcas L., conhecido como pinhão manso, é atualmente a principal espécie oleaginosa perene cultivada para produção de biodiesel, em todo o mundo. Trata-se de planta de porte arbustivo, relativamente rústica, de manejo simples, com alto teor de óleo nas sementes (38% em média) de alta qualidade para biodiesel, e favorável ao consórcio com cultivo alimentar (feijão), energético (amendoim ou gergelin) e pecuária (gramíneas forrageiras). Foram genotipados acessos de J. curcas L. e espécies aparentadas, presentes no banco de germoplasma (BAG) da Universidade Federal de Viçosa (UFV). A extração seguiu protocolo Doyle & Doyle (1990) modificado por Dias et al. (2007b). As reações de amplificação foram realizadas em um volume total de 15µL contendo 1,5mM de MgCl2, 100µM de cada dNTP, 0,4µM de primer, 25ng de DNA, tampão IB 25X (Phoneutria) e 1U de Taq DNA polimerase (Phoneutria). A amplificação foi realizada em termociclador (MJ research, PTC 100) programado para uma desnaturação inicial a 94ºC/1minuto, seguidos de 44 ciclos a 94ºC/1minuto, 35ºC/1minuto e 72ºC/2minutos, e uma etapa final de 72ºC/5minutos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% utilizando tampão TBE 0,5X, corados em solução de brometo de etídeo e fotografados sob luz ultravioleta utilizando-se o sistema de fotodocumentação Eagle Eye (Stratagene). Os 20 primers OPERON aplicados deram 174 bandas totais, sendo 128 polimórficas (73,56%). A análise estatística será feita com o auxílio do software Genes (Cruz 2006). Ainda se pretende consolidar a genotipagem por meio de mais marcadores RAPD, ISSR, SCAR e SSR, de forma acoplada ao programa de melhoramento de pinhão manso para que, antes que o plantio empírico, com o uso de propágulos de poucos genótipos e de origem desconhecida, ganhe escala, a pesquisa se consolide para ofertar sementes de genótipos superiores em produtividade de óleo.

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EFEITO PROTETOR DE BiPD DE SOJA CONTRA ESTRESSE ABIÓTICO EM ARABIDOPSIS

PAOLA DE AVELAR CARPINETTI (Bolsista PIBIC/CNPq/UFV), LUCAS BOENO OLIVEIRA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), JERUSA ARAÚJO QUINTÃO ARANTES FARIA (Bolsista CAPES/UFV), ANESIA APARECIDA DOS SANTOS (Bolsista CNPq/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Orientador/UFV)

Embora a função protetora do chaperone molecular BiP (binding protein) residente no RE tem sido extensivamente analisada em animais, pouco se sabe sobre a proteção mediada por BiP em plantas contra os agressores ambientais. Recentemente, nossa equipe de pesquisadores desenvolveu uma estratégia molecular de aquisição de tolerância à seca por meio da superexpressão do gene GmBiPD em soja e no sistema modelo N. tabacum, através de um mecanismo ainda desconhecido que está relacionado ao funcionamento do retículo endoplasmático. Entretanto, a elucidação do mecanismo pelo qual BiP promove tolerância à seca tem sido limitada uma vez que as plantas em estudo não possuem mutantes adequados e o genoma da soja não está totalmente seqüenciado etc. Em Arabidopsis, estudos genéticos são possíveis para elucidar os componentes da via protetora à seca mediada por BiP. Entre outras estratégias para decifrar esse mecanismo, uma alternativa consiste na transformação de Arabidopsis com um gene quimérico soyBiPD, contendo a região codificadora sob o controle do promotor 35S, através de transformação mediada por Agrobacterium. A incorporação do transgene soyBiPD foi confirmada pela análise de PCR das plântula transformadas. Níveis protéicos nas folhas de Arabidopsis foram analisadas por immublottings, no qual extratos de proteínas totais de plantas transgênicas foram separados por SDS-PAGE e analisados com anticorpos. Cinco linhagens transgênicas que exibiram superacumulação de soyBiPD sob condições normais de crescimento foram selecionadas para estudos posteriores. Para examinar a capacidade de superexpressão destas linhagens de induzir uma UPR (unfolded protein response) as plantas trangências foram tratadas com tunicamicina a expressão do soyBIPD, calreticulina (CRT) e calnexina (CNX), marcadores típicos da resposta a UPR, foram analisados.

(CNPq, Fapemig e Finep )


CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICO-CINÉTICA DE AMILASE DE MALTE DE CEVADA (Hordeum vulgare)

RAFAELA INÊS DE SOUZA LADEIRA (Não Bolsista/UFV), BRENDA RABELLO CAMARGO (Não Bolsista/UFV), TÂNUS HENRIQUE ABDALLA PEREIRA (Não Bolsista/UFV), ANA ANGÉLICA CANGUSSU BICALHO (Não Bolsista/UFV), SANDRA GROSSI GAVA (Não Bolsista/UFV), ISABELA ALVES DE MELO ZEFERINO (Não Bolsista/UFV), THÁBATA ELLEN DE SOUZA CAMPOS (Não Bolsista/UFV), ALLAN PEIXOTO DE FRANCO (Não Bolsista/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Co-orientador/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Orientador/UFV)

As amilases são enzimas que hidrolisam moléculas de amido liberando diversos produtos, incluindo dextrinas e polímeros compostos de unidades de glicose. Elas apresentam ampla importância comercial devido à sua aplicação em indústrias alimentícias, de fermentação, têxtil, de papel e de processamento de amido. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi extrair amilase de malte de cevada e caracterizá-la bioquímico-cineticamente. A atividade enzimática foi determinada pelo método de Fuwa. Para a caracterização bioquímica fez-se um ensaio de atividade enzimática em função do pH, com tampão McIlvaine na faixa de pH de 2 a 8. Realizou-se também ensaios de atividade enzimática em função da temperatura, testes de termoestabilidade a 30, 40 e 50°C e estudo da influência de íons na atividade enzimática. Os íons testados foram Zn2+ , Cu2+, Ca2+ ,Mg2+ e EDTA. Para a caracterização cinética, foram obtidos os valores de Km e Vmáx aparentes.O pH e temperatura ótimos da enzima foram 5,5 e 50°C, respectivamente. Não houve perdas significativas na atividade da enzima nas temperaturas testadas durante 6 horas. O Zn2+ e o EDTA a 10mM inibiram a atividade enzimática em mais de 50%, enquanto o Ca2+ e o Mg2+ a 2, 5 e 10mM aumentaram ligeiramente a atividade enzimática. Os valores de Km e Vmáx obtidos foram 0,3131 e 3,067 respectivamente. Pode-se concluir que o malte de cevada é uma boa fonte de amilase possibilitando a caracterização bioquímico-cinética dessa enzima presente em seu extrato bruto.

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SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE XILANASES DE Orpinomyces sp. PC-2 MAIS TERMOESTÁVEIS, MODIFICADAS POR “ERROR-PRONE-PCR”

RAFAELA ZANDONADE VENTORIM (Não Bolsista/UFV), LARISSA MATTOS TREVIZANO (Bolsista CAPES/UFV), VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Orientador/UFV)

Xilanases são enzimas que atuam na hidrólise de ligações internas da cadeia principal de xilana, polissacarídeo hemicelulósico mais abundante da parede celular de plantas. Dentre suas aplicações biotecnológicas, destacam-se a bioconversão de materiais lignocelulósicos em produtos fermentáveis para produção de etanol de segunda geração e branqueamento da polpa de celulose na indústria de papel. A enzima nativa foi mais eficiente em condições de pH 5,0-5,5 e temperatura de 50-55 ºC, mas os processos industriais são normalmente realizados em temperaturas elevadas e pH alcalino. Assim, o objetivo deste trabalho foi selecionar através de ciclos de screening, realizados em uma biblioteca de xynA mutante criada pela técnica de error-prone PCR, mutantes que apresentassem maior termoestabilidade. As colônias expressando xilanases mutantes, ativas após incubação a 60 ºC por uma hora, foram selecionadas pelo aparecimento de halo branco nas placas contendo o substrato azo-xilana-agarose 0,2% pH 6,5. As enzimas mutantes foram caracterizadas, em ensaios enzimáticos realizados em triplicata, para análise da atividade, do efeito da temperatura e termoestabilidade. O ensaio de atividade foi realizado a 40 ºC por 30 min utilizando substrato xilana de birchwood ressuspendido em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 6,5. O açúcar redutor liberado foi quantificado pelo método de DNS a 540 nm. Seis mutantes foram selecionados sendo que dois apresentaram maior termoestabilidade em relação à xilanase não mutada. Enquanto a enzima nativa perdeu 60% de sua atividade após 10 min de incubação a 60 ºC, os mutantes M4 e M6 mantiveram aproximadamente 50% de suas atividades após incubação a 60 ºC por 60 min. As enzimas mutantes e a xilanase não mutada apresentaram maior atividade a 60 ºC e em pH de 5,0-7,0. Pode-se concluir que a metodologia de evolução dirigida e os ensaios de atividade em placa foram eficientes para seleção de xilanases melhoradas apresentando maior termoestabilidade.

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AVALIAÇÃO DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE PLANTAS UTILIZANDO O TESTE DE LETALIDADE PARA Artemia salina

RAQUEL GARCIA DA SILVA (Não Bolsista/UFV), VIRGINIA RAMOS PIZZIOLO (Orientador/UFV), MARISA ALVES NOGUEIRA DIAZ (Co-orientador/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Co-orientador/UFV)

O teste de letalidade para larvas de Artemia salina tem sido utilizado rotineiramente em laboratórios de estudo fitoquímico de extratos de plantas na procura de substâncias bioativas. A larva de Artemia salina é um organismo animal menos complexo e pode ser usada em um monitoramento simples de avaliação de letalidade durante o fracionamento de extratos. O bioensaio é caracterizado como de baixo custo, devido ao fácil acesso aos ovos desse microcrustáceo no comércio, e por não exigir técnicas assépticas. Os extratos etanólicos de algumas espécies de plantas como Solanum paniculatum (jurubeba), Symphytum officinale (confrei) e Salvia officinalis (sálvia) foram submetidos ao teste de letalidade para Artemia salina objetivando analisar a sensibilidade desse organismo aos compostos bioativos dessas plantas medicinais. A metodologia utilizada foi a descrita por Meyer et al. (1982) com algumas modificações. Os ovos de Artemia salina foram colocados para eclosão em um processo de incubação de 48 h. Os extratos etanólicos foram submetidos a diluições seriadas com água em tubos de ensaio para obtenção em triplicata das concentrações finais de 1000 g/mL, 100 g/mL e 10 g/mL. A todos os tubos foram adicionados 2,0 mL de solução de sal marinho (38 g/L) e 10 larvas, e, após 24 h realizou-se a contagem do número de larvas sobreviventes. Os extratos obtidos de Solanum paniculatum, Symphytum officinale e Salvia officinalis apresentaram toxidade ao teste de Artemia salina.

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SUPEREXPRESSÃO DO GENE NAC3 DE SOJA (Glycine max) EM PLANTAS DE Arabidopsis thaliana

ROBERTA RIBEIRO COURA (Bolsista/UFV), ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES (Co-orientador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

As proteínas NAC constituem uma grande família de fatores de transcrição específicos de plantas e exibem uma ampla atuação em diversos processos fisiológicos como na resposta a estresses abióticos e bióticos. Recentemente foi descrito na literatura a participação dos transfatores NACs de soja na resposta a estresses bióticos e abióticos. Entre os diferentes genes NAC em soja foi demonstrado que o gene NAC3 é fortemente induzido por estresse osmótico. Sendo, portanto,um canditato para construção de plantas transgênicas tolerantes ao estresse osmótico, que acomete as plantas em situação de seca e estresse salino. Nesse trabalho nós estamos promovendo a transformação estável de plantas modelo (Arabidopsis thaliana) com o gene NAC3. Este experimento permitirá avaliar os efeitos da superexpressão deste gene na tolerância ao déficit hídrico e outras condições de estresses. As plantas Arabidopsis foram transformadas via mergulha floral com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor pK7NAC3 que permitirá a expressão do gene utilizando o promotor forte S35. Após a transformação, as sementes do DIP Floral, geração F0-NAC3, foram colhidas e plaqueadas em meio contendo o antibiótico kanamicina para seleção das plantas transformadas. A confirmação das plantas da geração F1, transformadas com o gene NAC3, foi verificada através da reação de PCR. As sementes F1-NAC3 foram colhidas e plaqueadas em meio com antibiótico kanamicina. Após a seleção, as plantas da geração F2 foram confirmadas por análise da reação de PCR e verificada a expressão da proteína NAC3 por RT-PCR. As sementes das plantas F2-NAC3 foram colhidas. Analisamos o fator de segregação independente do gene NAC3 nas sementes F1-NAC3 através do teste estatístico Qui-Quadrado. A avaliação da tolerância ao estresse osmótico das linhagens transgênicas está em andamento no nosso laboratório.

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PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES PARA HIDRÓLISE DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

SAMARA GRACIANE DA COSTA (Bolsista CNPq/UFV), MARIA ISABEL CRISTINA BATISTA MAYRINK (Não Bolsista/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE (Co-orientador/UFV), OLINTO LIPARINI PEREIRA (Co-orientador/UFV), VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Orientador/UFV)

O interesse mundial por biocombustíveis vem crescendo em virtude de uma maior preocupação com o desenvolvimento de fontes de energia limpas e renováveis. Um dos maiores desafios para que a produção de etanol de segunda geração torne-se economicamente viável, é diminuir o custo da produção de enzimas para a hidrólise de celuloses e hemiceluloses presentes em biomassas, assim é importante encontrar enzimas cada vez mais específicas e estáveis. Neste trabalho as espécies Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum e Aspergillus japonicus foram testadas em relação a sua capacidade de produção de Fpases, endoglucanases, celobiases, β-glicosidases, α-galactosidases, β-xilosidases e xilanases, quando cultivados em meio sólido contendo bagaço de cana como fonte de carbono e em meio líquido contendo farelo de trigo. Após produção as enzimas que se mostraram mais interessantes foram caracterizadas, avaliando temperatura ótima, pH ótimo e termoestabilidade e os extratos enzimáticos produzidos pelos fungos, utilizados para testes de sacarificação de bagaço de cana pré tratado, moído ou em lascas, em uma soluções de 5 ou 10% (p/v), a 35 e 50 0C, alíquotas foram retiradas em intervalos de 5 h. Os melhores resultados foram obtidos quando os fungos foram cultivados em meio líquido, Xilanases, endoglucanases, β-glicosidase e β-xilosidases dos três fungos foram caracterizadas, estas mostraram atividade mais alta em 50, 55, 60, e 55 0C respectivamente, e em pH entre 4.6 e 5.6, elas mostraram alta termoestabilidade em 50 0C. Na sacarificação uma eficiente hidrólise foi ativada em 5 h, a 50 0C para A. japonicus e em 29 h para P. chrysogenum e P. citrinum, para os três casos as soluções 10% (p/v) com bagaço triturado foram mais eficientes. Os três fungos avaliados mostraram ser bons produtores de celulases e hemicelulases nas condições propostas e a sacarificação mostrou-se satisfatória para os extratos utilizados.

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PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ANTIMICROBIANA DE PEPTÍDEOS DE PLANTAS CICATRIZANTES PARA USO COMERCIAL

TÂNUS HENRIQUE ABDALLA PEREIRA (Bolsista CNPq/UFV), MARIA CRISTINA BARACAT PEREIRA (Orientador/UFV), HEBRÉIA OLIVEIRA ALMEIDA (Bolsista CAPES/UFV), MEIRE DE OLIVEIRA BARBOSA (Bolsista CAPES/UFV), NAYARA GUSMÃO TESSAROLLO (Bolsista FAPEMIG/UFV), LANNA CLICIA CARRIJO (Não Bolsista/UFV), MARIANA LIMA BORONI MARTINS (Bolsista FAPEMIG/UFV), PATRÍCIA DIAS GAMES (Bolsista FAPEMIG/UFV), REGINALDO DA SILVA ROMEIRO (Co-orientador/UFV)

Os peptídeos catiônicos antimicrobianos (CAMPS) constituem uma estratégia de defesa eficiente e de baixo custo. Apresentam um amplo espectro antimicrobiano e são expressos constitutivamente ou induzidos por infecção. Este trabalho pretende detectar e ajustar uma metodologia para purificar CAMPS de plantas medicinais (especialmente cicatrizantes). As espécies avaliadas foram: Simphytum officinale; Malva parviflora; Achillea millefolium e Plantago major. Folhas (20 g) foram pulverizadas, maceradas em 80 mL de tampão de extração (Tris-HCl 100mM, adicionado de EDTA, PVPP, PMSF, benzamidina e tiouréia) (2h, 4°C) e centrifugadas (20300g, 4°C, 30min) . O sobrenadante (chamado Sb1) foi utilizado para preparar o extrato solúvel (ES). O precipitado foi lavado duas vezes com 80 mL de água, centrifugado e os dois sobrenadantes (Sb2 e Sb3) foram adicionados ao Sb1. Em paralelo, o precipitado foi extraído com 50 mL de LiCl (1,5M) e inibidores de proteases (4h, 4°C), após a centrifugação, o sobrenadante foi recuperado e usado para preparar extrato de parede celular (EP). Então, ES e EP foram purificados separadamente pelo mesmo protocolo: proteínas solúveis após precipitação de sulfato de amônio (35% sat.), aquecimento (80°C, 15min) e troca iônica (DEAE-Sepharose). Para verificar a presença de peptídeos, foi realizado SDS-TRICINA-PAGE, comparando espécies e extrações (ES e EP). Diferentes peptídeos foram observados: Plantago major apresentou duas grandes bandas em torno de 5-6 kDa forte, enquanto A. millefolium e M. parviflora apresentaram peptídeos maiores (10-13 kDa), e apenas M. parviflora, pequenos peptídeos (3-6 kDa). Sobre S. officinale, EP apresentou duas grandes bandas (6-13 kDa), enquanto ES, só uma maior. As frações catiônicas foram agrupadas em pool, dialisadas e submetidas a testes de inibição de patógenos. Dentre as plantas testadas, as que obtiveram os melhores resultados de inibição foram Confrei ( 11,2% para EP e 53,7% para ES) e Tanchagem (18,7% para EP e 17,7% para ES).

(CNPq, FAPEMIG, FINEP e CAPES )


FUNGOS DE PODRIDÃO BRANCA COMO USINAS PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS.

THIAGO AUGUSTO GONÇALVES (Não Bolsista/UFV), DANIEL LUCIANO FALKOSKI (Bolsista CAPES/UFV), ACELINO COUTO ALFENAS (Co-orientador/UFV), VALERIA MONTEZE GUIMARAES (Co-orientador/UFV), JORGE LUIZ COLODETTE (Co-orientador/UFV), SEBASTIAO TAVARES DE REZENDE (Orientador/UFV)

A obtenção de etanol a partir de resíduos lignocelulósicos requer pré-tratamentos eficientes e robustos coquetéis enzimáticos, ricos em celulases, para que a biomassa seja convertida a açúcares fermentescíveis. A produção de celulases e hemicelulases para aplicação em processos de sacarificação enzimática da biomassa é um dos principais gargalos para a implantação desta tecnologia e por isto , inúmeras pesquisas vêem sendo realizadas com o intuito de obter coquetéis enzimáticos mais eficientes com concomitante redução de custos de produção. Neste trabalho, os fungos de podridão branca Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J-2, Trametes sp. J-5 e J-129 (cepa ainda não identificada) foram crescidos durante 12 dias em meio líquido contendo 1% de glicose ou sabugo de milho como fonte de carbono. A cada quatro dias avaliou-se a produção das enzimas celulases (FPases, CMCases e beta-glicosidases), xilanases e lacases. Todos os microrganismos cresceram abundantemente em glicose, entretanto, a presença deste monossacarídeo promoveu uma forte repressão na produção de enzimas lignocelulolíticas, sugerindo que a produção e a excreção destas enzimas pelos microrganimos estudados pode ser inibida na presença de glicose. O sabugo de milho foi um forte indutor de enzimas lignocelulolíticas para todos os microrganismos. A cepa J-129 produziu 1072,0 U de xilanase por grama de fonte de carbono após 4 dias de cultivo. O fungo Trametes sp. J-5 apresentou destacada produção de celulases tendo se obtido 24,0, 121,0 e 22,0 U de FPase, CMCase e beta-glicosidase por g de fonte de carbono, respectivamente após 12 dias de cultivo. P. sanguineous teve destacada produção de lacases com uma atividade de 38,0 U.g-1 após 8 dias de cultivo. Os resultados obtidos nesta fase da pesquisa revelam que estas espécies fúngicas possuem grande potencial para produção de enzimas de interesse para aplicação em processos biotecnológicos.

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“ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DO PAPEL DO GENE SGS-3 NA INTERAÇÃO RICKETTSIA RICKETTSII-AMBLYOMMA CAJENNENSE”

THIAGO MAGALHÃES MALTA (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), CLAUDIO LISIAS MAFRA DE SIQUEIRA (Orientador/UFV), KARLA ANDRADE DE OLIVEIRA (Bolsista CNPq/UFV)

Carrapatos do gênero Amblyomma são responsabilizados pela manutenção enzoótica e veiculação de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa Brasileira, no homem. Sabe-se que em resposta à infecção por Rickettsia rickettsii moléculas são diferencialmente expressas em carrapatos. Dentre os genes diferencialmente expressos encontra se o Sgs-3, que é pouco expresso em resposta a uma infecção primária. Portanto, o presente projeto de trabalho se propõe à análise do gene Sgs-3 como tentativa de elucidar o mecanismo de infecção utilizado por Rickettsia rickettsii em seu carrapato vetor Amblyomma cajennense, buscando, por meio destes conhecimentos, o desenvolvimento de estratégias direcionadas ao controle da transmissão deste patógeno, dependentes de Sgs-3. Para isolar o gene Sgs-3 RNA total foi extraído de glândulas salivares de carrapatos adultos Amblyomma cajennense não infectados. Com intuito de obter a seqüencia completa do gene Sgs-3, foi realizado o RACE- PCR, que amplifica uma sequência de ácido nucléico de uma amostra de RNAm entre um conhecido local interno e uma sequência desconhecida, seja no terminal 3’ ou 5’ do RNAm . Para realização dessa técnica foram desenhados primers a partir da sequência parcial do gene Sgs-3 depositada no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) por Macaluso et al (2003). Foi obtido um fragmento de 500 pb, o qual foi posteriormente clonado e sequenciado. Avaliando-se a sequência obtida com o auxílio do aplicativo Blast X contra a tradução das sequências de nucleotídeos depositadas no GenBank, não foi encontrada nenhuma sequência similar. Uma das possibilidades para esse resultado está relacionada à seqüência depositada por Macaluso et al. (2003), a qual apresentou baixo score, indicando baixa similaridade, e alto E Value para proteína Sgs-3, o que implica em alta probabilidade desta seqüência ter se alinhado aleatoriamente com as seqüencias depositadas no banco de dados.

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PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE AMILASES DE SEMENTES DE Phalaris canariensis (L)

TONIELLI CRISTINA SOUSA DE LACERDA (Não Bolsista/UFV), LUCAS BORGES PEREIRA (Não Bolsista/UFV), ZAIRA BRUNA HOFFMAM (Não Bolsista/UFV), FLÁVIA REIS DE CARVALHO BATISTA (Não Bolsista/UFV), JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ (Co-orientador/UFV), LUCIANO GOMES FIETTO (Orientador/UFV)

As amilases constituem um conjunto de enzimas que catalisam a hidrólise de amido, um polímero de origem vegetal. Os estudos dessas enzimas têm crescido devido as suas aplicações biotecnológicas em diversos setores. Este projeto teve por objetivo avaliar a atividade amilásica em sementes de alpiste (Phalaris canariensis L.), produto largamente utilizado na alimentação de pássaros. Os grãos, elípticos e pequenos, contêm proteínas, óleos altamente insaturados (ácidos linoléico, oléico e palmítico), fibras solúveis e insolúveis e outros componentes, mas o principal é o amido, constituindo cerca de 61% da matéria seca. Sementes de alpiste foram germinadas para posterior extração de proteínas totais. A atividade amilásica do extrato bruto foi avaliada e medida ao longo de seis dias, de modo a determinar o tempo de germinação compatível com a maior produção de amilase. O extrato bruto, obtido das sementes em germinação após 96h, foi parcialmente purificado pelas técnicas de diálise, gel filtração e cromatografia de troca iônica. A atividade amilásica e o teor de proteínas totais foram medidos a cada passo pelos métodos do ácido 3,5-dinitrosalicílico e de Bradford, respectivamente. As enzimas parcialmente purificadas foram caracterizadas em termos de pH e temperatura ideais, KM e VMÁX. Ao final dos procedimentos de purificação, observou-se a presença de dois picos de atividade, mas apenas um deles foi caracterizado pelos parâmetros cinéticos acima citados por apresentar maior quantidade de material disponível para esses estudos. A melhor atividade enzimática foi observada em pH 5,0, a 50ºC, o que é, em certo grau, compatível com os valores encontrados na literatura para espécies da mesma família de P. canarienses. A caracterização parcial mostrou KM de

9,57x10-3 g/L e velocidade máxima de 1,58 U/mL e uma aparente estabilidade a repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Indicando que o alpiste é uma fonte promissora de amilase com grande potencial biotecnológico.

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EFEITO DA ALCACHOFRA (Cynara scolymus) NO NÍVEL DE COLESTEROL E TRIGLICERÍDEOS EM COELHOS COM ÚLCERA GÁSTRICA

VINÍCIUS GIORI FERRÃO (Bolsista FAPEMIG/UFV), TANIA TOLEDO DE OLIVEIRA (Orientador/UFV), ALOISIO DA SILVA PINTO (Não Bolsista/UFV), AGNALDO RODRIGUES DE MELO CHAVES (Bolsista CNPq/UFV), RICARDO ANTÔNIO ZATTI (Não Bolsista/UFV), Karina Zanoti Fonseca (Não Bolsista/), Maria Aparecida Leão (Não Bolsista/), Ana Paula Campos Teles (Não Bolsista/), Michele de Castro Morais (Não Bolsista/UNIVIÇOSA), Stephan Oliveira Ribeiro (Não Bolsista/UNIVIÇOSA), Tanus Jorge Nagem (Não Bolsista/)

A úlcera gástrica (UG) é uma doença que se caracteriza por lesões profundas da mucosa, em que os componentes dos tecidos epitelial e conjuntivo podem ser afetados. Um tratamento farmacológico para essa doença inclui o uso de medicamentos inibidores da bomba de prótons e de plantas medicinais, como a alcachofra, que apresentam ação gastroprotetora. A alcachofra (Cynara scolymus) possui a substância cinarina, que estimula a produção e liberação da bile. Esse estudo teve como objetivo avaliar o nível de colesterol e triglicerídeos no soro de coelhos com UG induzida experimentalmente, tratados com alcachofra. Foram utilizados 24 coelhos da raça Nova Zelândia, divididos aleatoriamente em 4 grupos de 6 animais, sendo o grupo I controle e os outros 3 grupos doentes. Os animais foram acondicionados em gaiolas individuais, recebendo ração comercial e água ad libitum. Após período de adaptação de 5 dias, realizou-se a indução da UG com a administração de 150 mg de ácido acetilsalicílico, por um período de 21 dias. Esta indução também pode provocar úlcera duodenal. O grupo II não recebeu tratamento, o grupo III recebeu 40 mg/dia de Omeprazol e o grupo IV recebeu 900 mg/dia de alcachofra. Coletaram-se amostras de sangue no 22° dia para análise dos constituintes. Os grupos tiveram teor de triglicerídeos 126,27; 51,60; 117,05 e 121,13 mg/dL, e de colesterol, 95,10; 44,13; 55,50 e 82,53 mg/dL, respectivamente. Os resultados apresentados permitiram concluir que, os animais com úlcera induzida tratados com alcachofra tiveram um aumento do nível plasmático de triglicerídeos e de colesterol, aproximando-se dos valores normais, o que pode ter afetado a absorção de gorduras a nível intestinal.

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Estudo Químico Biomonitorado de Extrato Acetato de Etila Obtido do Fungo Fitopatogênico Fusarium solani Visando o Isolamento de Compostos com Atividade Antibacteriana

VITOR ROMITO DE MENDONÇA (Bolsista CNPq/UFV), MARISA ALVES NOGUEIRA DIAZ (Orientador/UFV), NAARÁ GOULART REZENDE (Não Bolsista/UFV)

Os microrganismos são fontes quase inexploradas de produtos naturais. Apenas 1 % das bactérias e 5 % dos fungos são conhecidos. No caso dos fungos, as micotoxinas secretadas por eles são de relevância para a saúde animal, vegetal e humana. Algumas são de grande interesse, apresentando uma atividade farmacológica como antibiótico e antitumoral. O gênero Fusarium é um importante fitopatógeno que produz uma grande variedade de produtos do metabolismo secundário. Assim, o presente trabalho objetivou realizar um estudo químico e biológico do extrato de acetato de etila do fungo Fusarium solani. Foram realizados a obtenção do extrato e o fracionamento por cromatografia em camada preparativa, além de testes de atividade biológica contra as bactérias Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli, todas isoladas de mastite bovina. Os resultados mostram atividade antibacteriana para o extrato e para algumas frações obtidas do ensaio cromatográfico. Contudo não foi possível chegar a um produto isolado. Assim, os resultados mostram que o fungo Fusarium solani secreta compostos que apresentam atividade antibacteriana, de interesse biotecnológico.

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CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICO-CINÉTICA DE PROTEASES DIGESTIVAS TRIPSINA-LIKE DO INTESTINO MÉDIO DE LAGARTA DA SOJA ENVOLVIDA NO MECANISMO DE INTERAÇÃO PLANTA-INSETO

ZAIRA BRUNA HOFFMAM (Bolsista PROBIC/FAPEMIG/UFV), MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA (Orientador/UFV), DENISE TORRES DA CRUZ REIS (Bolsista FAPEMIG/UFV), LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO (Bolsista FAPEMIG/UFV), ANDERSON MARTINS PILON (Bolsista CNPq/UFV), LÍLIAN FERNANDES MOREIRA (Bolsista CNPq/UFV), GILSON PETRÔNIO DA PAIXÃO (Bolsista CAPES/UFV), ADRIANA MARIA PATARROYO VARGAS (Bolsista CNPq/UFV), JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA (Co-orientador/UFV), RAUL NARCISO CARVALHO GUEDES (Co-orientador/UFV)

A caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes à pragas. Nesse sentido a tripsina-like do intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi purificada e caracterizada. Dois passos cromatográficos de purificação foram utilizados, a coluna de p-aminobenzamidina–agarose e a coluna Resource Q. As frações mais ativas provenientes do segundo passo, correspondentes ao pico aniônico, foram reunidas e ao final desta etapa, a tripsina-like de Anticarsia gemmatalis apresentou um fator de purificação de 500 vezes com um rendimento de 52%. Amostras correspondentes à cada etapa de purificação foram submetidas à eletroforese, em gel de poliacrilamida 12,5 % sob condições desnaturantes, o qual mostrou a eficiência das etapas cromatográficas na separação da tripsina-like, resultando em uma redução das espécies protéicas presentes no extrato bruto até a observação de uma única banda na fração enzimática obtida. A massa estimada para a tripsina de A. gemmatalis foi de 24.9 KDa. Atividades consideráveis (acima de 75%) foram observadas na faixa de pH entre 8,0 e 9,5, sendo a atividade máxima quando o substrato L-BApNa foi testado. A atividade máxima utilizando-se o substrato L-TAME foi observada em pH 8,0. Na faixa compreendida entre pH 7,5 e 8,5 a enzima manteve atividade acima de 75%. Com o substrato L-BApNA, as maiores atividades (acima de 70%) foram detectadas entre 25°C e 40°C, sendo a maior atividade observada à 35°C. Com o substrato L-TAME a atividade máxima observada foi à temperatura de 25°C. Atividade superior a 80% da máxima foi mantida à 20 e 30°C. À temperatura de 40°C a enzima manteve apenas 14% da atividade máxima, sendo observado 42% da atividade à temperatura de 10°C. Os valores da constante cinética, KM, para os substratos L-BApNA e L-TAME foram 0,12 mM e 49µM, respectivamente. APOIO FINANCEIRO: CAPES, CNPq, FAPEMIG

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Bioquímica e Biologia Celular