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CAMILA SILVA DE AMORIM
AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA DO TECIDO PERIODONTAL DE
PACIENTES DIABÉTICOS
NOVA FRIBURGO
2015
1
CAMILA SILVA DE AMORIM
AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA DO TECIDO PERIODONTAL DE
PACIENTE DIABÉTICOS
Monografia apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense/ Campus Universitário de Nova Friburgo como requisito para realização do Trabalho de Conclusão do Curso de graduação em Odontologia.
Orientadora: PROFª. DRª. GABRIELA ALESSANDRA DA CRUZ GALHARDO
CAMARGO
Co-orientador: PROF. DR. VINICIUS D’ÁVILA BITENCOURT PASCOAL
Nova Friburgo
2015
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A524a Amorim, Camila Silva.
Avalição imunolódica do tecido periodontal de pacientes diabéticos. / Camila
silva Amorim ; Profª. Drª Gabriela Alessandra da Cruz Galhardo Camargo,
orientadora ; Prof. Dr Vinicius D'Ávila Bitencourt Pascoal, co-orientador. --
Nova Friburgo, RJ: [s.n.], 2015.
50f.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) –
Universidade Federal Fluminense, Campus Nova Friburgo, 2015.
1. Periodontia. 2. Doença periodontal. 3. Diabetes melito. I, Camargo,
Gabriela Alessandra da Cruz Galhardo, Orientadora. II. Pascoal, Vinicius
D'Ávila, Co-orientador. III. Título
CDD M617.632
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CAMILA SILVA DE AMORIM
AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA DO TECIDO PERIODONTAL DE PACIENTES
DIABÉTICOS
Monografia apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense/Campus de Nova Friburgo como Trabalho de Conclusão do Curso de Odontologia.
Aprovado em: / / 2015
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.:___________________________________________________________________
Instituição:______________________________Assinatura:__________________________
Prof. Dr.:___________________________________________________________________
Instituição:______________________________Assinatura:__________________________
Prof. Dr.:___________________________________________________________________
Instituição:______________________________Assinatura:__________________________
Nova Friburgo
2015
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DEDICATÓRIA
À Deus, por ter me dado sabedoria para conduzir este trabalho e ter colocado as
pessoas certas no meu caminho para que tudo ocorresse da melhor forma. À minha
família, por todo o amor e por estarem comigo a cada momento me vendo crescer, ao
Estéfano, por todo incentivo e partilha de experiências, aos meus amigos, que me
acompanharam ao longo de todo este tempo.
5
.
AGRADECIMENTO
À professora Gabriela, por toda transmissão de conhecimentos,
oportunidade de participar do seu projeto e pela cobrança para que eu
desse sempre o melhor de mim.
Ao professor Vinicius, pelo seu auxílio e colaboração com o
desenvolvimento da nossa pesquisa.
Ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC- IC
144591) pelo apoio financeiro durante a realização deste trabalho.
Aos demais professores da FOUFF/NF, pela contribuição com a minha
formação e sabedoria passada ao longo do curso, para que agora seja
concluído com sucesso.
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“Não sê indiferente às tuas mazelas, mas captura todos os teus sonhos e depõe sobre
eles o teu olhar. Pois limitações não determinam quem és, apenas que não és Deus.
Acreditar que podes um passo mais é o mínimo que fazes a ti e a tua breve estada
aqui. Existir é muito pouco, escolha o viver! Pois tua alma sempre pulsará querendo
transfigurar a existência”
“Caminhando para o infinito” (Sandro Arquejada)
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RESUMO
O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da expressão de citocinas no tecido periodontal de pacientes sem alterações sistêmicas (DP) e pacientes portadores de Diabetes Melito (DM), ambos com Doença Periodontal avançada. Foram selecionados 17 pacientes com indicação de exodontia por motivos periodontais, sendo 13 pacientes do grupo (DP) e 4 pacientes do grupo (DM). Após exame hematológico e clínico periodontal, prosseguiu-se a coleta do colar de tecido gengival por meio do retalho de Widman modificado, seguido de exodontia. As amostras obtidas foram armazenadas em RNAlater® (-200C) e processadas para obtenção de mRNA, seguido de cDNA. Posteriormente realizou-se a reação de polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR) para dosagem de citocinas IL-1b, IL-10, IL-6, NFKB1, TNF-α. Os resultados revelaram diferença estatisticamente significante (p<0,05 - Kruskal Wallis test) para os níveis de glicose e hemoglobina glicada (HbA1c), média de valores maiores para o grupo DM que comprovam a presença de Diabetes. Para as variáveis clínicas IP, IG, PS, RG e NIC não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p>0,05 – Kruskal Wallis test) o que demonstra uma uniformidade da doença periodontal entre os grupos. A expressão de citocinas também não apresentou diferença significativa entre os grupos (p>0,05 – Kruskal Wallis test), o que demonstra que a alteração sistêmica Diabetes Melito não foi capaz de influenciar a expressão dessas citocinas no tecido gengival. Concluímos desta forma, que não houve diferença entre grupos DP e DM em relação a expressão de citocinas avaliadas nos tecidos periodontais. Esses resultados devem ser vistos com cautela, devido ao número reduzido de amostras avaliadas. Palavras-chave: Doença periodontal; citocinas; diabetes melito; RNA; tecido.
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ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of the expression of cytokines in periodontal tissue of patients without systemic changes (DP) and patients with Diabetes Melito (DM), both with advanced Periodontal Disease. Were selected 17 patients with tooth extraction indication for periodontal reasons, 13 group patients (DP) and 4 group patients (DM). After hematological and periodontal clinical examination, was collected the gum tissue collar through the modified Widman flap, followed by extraction. The samples were stored in RNAlater® (-20°C) and processed for obtaining mRNA followed by cDNA. Subsequently held Polymerase Chain Reaction in Real- Time (RT-PCR) for dosing cytokine IL-1b, IL-10, IL-6, NF-KB1, TNF-α. The results revealed a statistically significant difference (p <0.05 - Kruskal Wallis test) for glucose levels and glycated hemoglobin (HbA1c), average higher values for the DM group that prove the presence of Diabetes. For clinical variables PI, GI, PD, MB, CAL, no statistically significant difference between groups (p> 0.05 - Kruskal Wallis test) which shows a uniformity of periodontal disease between the groups. The expression of cytokines also it was not significantly different between groups (p> 0.05 - Kruskal Wallis test), which shows that systemic change Diabetes Mellitus was unable to influence the expression of these cytokines in the gingival tissue. We conclude therefore that there was no difference between DP and DM groups compared the expression of cytokines assessed in periodontal tissues. These results should be viewed with caution due to the small number of samples evaluated. Key words: Periodontal disease; Cytokines; Diabetes mellitus; RNA; tissue.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 10
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 14
2.1. Aspectos periodontais ................................................................................... 14
2.2. O diabetes: diagnóstico e classificação ......................................................... 15
2.3. Relação bidirecional entre o DP e DM........................................................... 16
2.4. Interação AGE-RAGE.................................................................................... 18
2.5. Resposta imunológica ................................................................................... 19
2.6. Interleucinas .................................................................................................. 21
2.6.1. Fator de Necrose Tumoral- α (TNF- α) ...................................................... 21
2.6.2. Interleucina-6 (IL-6) ................................................................................... 22
2.6.3. Interleucina- 1b (IL-1b) .............................................................................. 22
2.6.4. Interleucina- 10 (IL-10) .............................................................................. 23
2.6.5. Fator Nuclear- Kb (NF-kB) ......................................................................... 23
3. METODOLOGIA ............................................................................................. 26
3.1. Seleção dos pacientes .................................................................................. 26
3.2. Exames clínico e laboratorial ......................................................................... 27
3.3. Coleta das amostras ..................................................................................... 27
3.4. Procedimentos laboratoriais .......................................................................... 28
3.4.1. Extração do RNA ........................................................................................ 28
3.4.2. Quantificação do RNA ................................................................................ 29
3.4.3. Produção de cDNA a partir do RNA .......................................................... 30
3.4.4. Real Time PCR .......................................................................................... 30
3.4.5. Análise estatística ...................................................................................... 31
4. RESULTADOS ............................................................................................... 32
5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 35
6. CONCLUSÃO ................................................................................................. 39
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 40
ANEXOS ......................................................................................................... 47
Anexo A ........................................................................................................... 47
Anexo B ........................................................................................................... 50
10
1 INTRODUÇÃO
A doença periodontal caracteriza-se pela destruição de osso alveolar, cemento
radicular e ligamento periodontal (LINDHE, LANG, KARRING, 2010) sendo um
processo inflamatório que ocorre no periodonto em resposta a antígenos bacterianos
do biofilme dental, que se acumulam ao longo da margem gengival (HERRING, 2006).
Embora seja iniciada e mantida por uma infecção bacteriana o aparecimento e
progressão da doença é resultante da resposta inflamatória do hospedeiro. Sua
manifestação inicial é a gengivite, caracterizada por hiperemia, edema, recessão e
sangramento gengival, se não tratada precocemente, ela pode evoluir para
periodontite (NANCI, 2006; SCANNAPIECO, 2004)
A periodontite caracteriza-se pela formação de bolsa periodontal, perda de
inserção conjuntiva, reabsorção do osso alveolar, em última análise, resultando na
perda do dente (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2005). Entretanto, nem toda gengivite
evolui para periodontite (TANNER et al, 1998), embora toda periodontite apresente
uma história prévia de gengivite (CARRANZA, NEWMAN, 1997; LINDHE, LANG,
KARRING, 2005).
O desenvolvimento da doença tenta ser impedido, por diversos mecanismos do
hospedeiro, através da resposta imune inata (inespecífica), constituída pela presença
de barreiras físicas, químicas, fagócitos, células natural killers e moléculas efetoras,
ou pela resposta formada por linfonodos, células apresentadoras de antígenos e
imunoglobulinas, sendo denominada resposta imune adquirida (específica) (WOLF,
RATEITSCHAK, RATEITSCHAK, 2006).
11
A resposta adquirida se divide em resposta imune humoral e imune celular. A
imunidade humoral é mediada pelos anticorpos produzidos por linfócitos B. A
imunidade mediada por célula se desenvolve para eliminar microrganismos
intracelulares, tais como vírus e algumas bactérias, os quais estão inacessíveis aos
anticorpos circulantes, sendo as células T as principais participantes deste processo.
As respostas imunes não são independentes. A resposta inata fornece a
primeira linha de defesa e pode interagir estimulando e guiando a adquirida que por
sua vez, usa mecanismos efetores da imunidade inata na eliminação de
microrganismos (ABBAS, LITCHMAN, PILLAI, 2008).
As células T e B são as principais células envolvidas na resposta imune
adquirida, estando presentes no infiltrado inflamatório de lesões periodontais,
juntamente com os plasmócitos (TATAKIS, KUMAR, 2005). As células T se dividem
em duas classes principais: uma que inclui linfócitos T citotóxicos (LTc), que matam
células infectadas por vírus e algumas bactérias e outra dos linfócitos T helper (LTh)
com função ativadora sobre outras células como macrófagos e linfócitos B (ABBAS,
LITCHMAN, PILLAI, 2008).
As células Th controlam a resposta contra antígenos bacterianos pela produção
de citocinas, as quais regulam o balanço entre uma resposta inflamatória não
protetora e uma resposta protetora com anticorpos. (TATAKIS, KUMAR, 2005). Ho e
Pai (2007) comentaram que as células Th1, Th2 e Th17 podem iniciar ou aumentar
uma resposta imune e, portanto, são referidas como células Th efetoras, já as células
T reguladoras (Treg), são capazes de produzir altos níveis de citocinas
antiinflamatórias, sendo capazes de inibir a proliferação e função das células efetoras.
As células Treg são definidas pela expressão das moléculas CD4+ e CD25+ e
do fator de transcrição FoxP3 (forkhead box P3), representando uma subpopulação
de linfócitos T, sendo imprescindíveis no controle da resposta imunológica ao
induzirem a supressão das células T efetoras (SOJKA, HUANG, FOWELL, 2008).
Supõe-se que existam pelo menos três mecanismos utilizados pelas células
Treg para exercerem sua função (MELO e CARVALHO, 2009.):
Por meio do contato físico (espaço-temporal) entre as células Treg e as células
CD4 efetoras, onde a molécula CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyteantigen 4) libera sinais
inibitórios ao se ligar ao receptor CD80 das células dendríticas ou células T ativadas
(SAKAGUCHI, 2004);
12
A partir do papel das citocinas inibitórias, como a interleucina-10 (IL-10) e o
fator de transformação do crescimento beta (TGF-β1). A IL-10 inibe a ativação das
células apresentadoras de antígeno (APC- antigen presenting cells), além de ser
antagonista do interferon gama (INF-γ), sendo considerada uma substância de
controle dos processos inflamatórios (PICCIRILLO, 2009);
A partir da competição por fatores de crescimento, sobretudo a IL-2, com as
células-alvo, onde o resultado dessa concorrência seria a apoptose celular deflagrada
por privação de citocinas (MELO e CARVALHO, 2009).
Ainda são descritos pelo menos dois tipos de Tregs: naturais e adaptativas
(BACCHETTA, GAMBINERI e RONCAROLO, 2007):
As células Treg naturais expressam constitutivamente a molécula de superfície
CD25+, sendo então denominadas linfócitos T CD4+CD25+ e são produzidas
naturalmente nos corpúsculos de Hassal no timo (SAKAGUCHI, 2005);
As células Treg adaptativas são geradas na periferia exercendo sua função
supressora a partir da liberação de citocinas, como IL-10 e TGF-β. (JONULEIT e
SCHMITT, 2003).
Nakajima et al. (2005) identificaram significativamente células Treg em lesões
de periodontite quando comparadas com lesões de gengivite, contudo estas células
também foram observadas em tecidos saudáveis, causando a especulação de que
nas lesões de gengivite, células Treg são responsáveis pelo controle imunológico,
evitando a destruição tecidual e nas lesões de periodontite estabelecidas estas células
podem ser recrutadas na tentativa de suprimir a destruição tecidual.
As células Th, sob diferentes estímulos podem assumir três diferentes fenótipos
(Th1, Th2, Th17) que podem ser distinguidos baseado no perfil de citocinas
produzidas por elas. As células Th1 produzem citocinas características denominadas
interleucina-2 (IL-2), interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral-beta (TNF-β),
interleucina-12 (IL-12); as células Th2 secretam ativamente interleucina-4 (IL-4),
interleucina-5 (IL-5), interleucina-10 (IL-10), interleucina-13 (IL-13) e as células Th17
secretam principalmente a interleucina-17 (IL-17) e interleucina-21 (IL-21) (JANEWAY
et al., 2007; CARDOSO et al., 2009).
A doença periodontal pode ser modificada por alguns fatores sistêmicos entre
eles o Diabetes Melito, que segundo Wehba (2004) apresentam associação
bidirecional, na qual o diabetes favorece o desenvolvimento da doença periodontal e
esta, quando não tratada, piora o controle metabólico do diabetes.
13
Os mecanismos que procuram explicar a associação entre diabetes e a doença
periodontal sugerem que pacientes diabéticos apresentam redução na função de
leucócitos polimorfonucleares e na quimiotaxia, redução da maturação e síntese de
colágeno, aumento da atividade de colagenase e formação de advanced glycation
endproducts (AGEs), nos quais podem se ligar a receptores de macrófagos e
monócitos resultando em aumento da secreção de fator de necrose tumoral- alfa
(TNF-), prostaglandinas E-2 (PGE2) e IL-6, considerada potente estimulador da
diferenciação de osteoclastos e reabsorção óssea, sendo portanto, inibidora da
formação óssea (LALLA et al., 2006).
Estes mecanismos sugerem uma alteração na resposta do hospedeiro
caracterizada por baixa resistência a infecção, deficiência de cicatrização e resposta
inflamatória exagerada. Justificando a destruição periodontal severa e o aumento de
perda dentária em diabéticos (LALLA et al., 2000).
Por existirem poucos relatos na literatura que revelem a associação entre
doença periodontal e a modulação da resposta inflamatória nos tecidos periodontais
de pacientes diabéticos com doença periodontal, justifica-se a realização de novas
pesquisas neste tema, afim de estudar a resposta imunológica frente a doença
periodontal em pacientes portadores de diabetes melito e pacientes sem alteração
sistêmica, procurando explicar a resposta do hospedeiro no processo da patogênese
periodontal.
Desta forma, esta pesquisa buscou avaliar o efeito do diabetes melito na
expressão das citocinas interleucina- 1b (IL-1b), IL-10, IL-6, NFKB1, TNF-α no tecido
gengival de pacientes portadores de doença periodontal, a fim de verificar a resposta
imunológica em pacientes portadores de doença periodontal modificada por fator
sistêmico diabetes melito (DM), observando sua similaridade à resposta imunológica
de pacientes portadores de doença periodontal sem envolvimento de fator sistêmico
(DP).
14
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 ASPECTOS PERIODONTAIS
O periodonto é definido como os tecidos de sustentação e revestimento
dentários, sendo composto por cemento, ligamento periodontal, processo alveolar e
gengivas (BARTOLD, NARAYANAN, 2006).
A doença periodontal é o processo inflamatório que ocorre no periodonto em
resposta a antígenos bacterianos do biofilme dental, que se acumulam ao longo da
margem gengival (HERRING, 2006). Sua manifestação inicial é a gengivite,
caracterizada por hiperemia, edema, recessão e sangramento gengival. Quando não
tratada precocemente, pode evoluir para periodontite que em sua forma mais grave
afeta estruturas mais profundas, causando reabsorção das fibras colágenas do
ligamento periodontal, do osso alveolar, abscessos, aumento da profundidade das
bolsas, maior mobilidade dentária e perda de dentes (NANCI, 2006; SCANNAPIECO,
2004).
A periodontite é uma doença inflamatória crônica na qual
a produção de citocinas pró-inflamatórias, particularmente IL-1b, IL-6 e TNF-α é
amplificado em resposta ao fator de virulênica das bactérias (SOCRANSKY et al.,
1998). A sobre-expressão destas citocinas é o que contribui para destruição do tecido
periodontal e eventualmente a perda de dentes (GRAVES, JIANG, GENCO, 2000).
Embora a periodontite seja uma doença localizada, pode ser um fator de risco
para doenças inflamatórias sistémicas, incluindo diabetes melito, doença cardíaca e
15
aterosclerose (SEYMOUR et al., 2007; KIM e AMAR, 2006). O diabetes pode gerar
complicações crônicas, como nefropatia, neuropatia e retinopatia, além de acometer
estruturas orais. A doença periodontal (DP) é a complicação oral mais importante,
sendo considerada a sexta complicação clássica do diabetes (KAWAMURA, 2002).
2.2 O DIABETES: DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO
O Diabetes Melito (DM) inclui doenças metabólicas caracterizadas por
hiperglicemia, resultante de defeitos na secreção de insulina e/ou em sua ação. A
hiperglicemia se manifesta por sintomas como poliúria, polidipsia, perda de peso,
polifagia e visão turva ou por complicações agudas que podem levar a risco de vida.
A hiperglicemia crônica está associada ao dano, disfunção e falência de vários órgãos,
especialmente olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (GROSS et al., 2001).
A classificação do diabetes melito permite o tratamento adequado e
compreende a seguinte classificação: DM tipo 1 e 2 e outros tipos: defeitos genéticos
da função da célula β pancreática, defeitos genéticos na ação da insulina, doenças do
pâncreas exócrino, entre elas, neoplasias, pancreatite e fibrose cística,
endocrinopatias, induzido por drogas (glicocorticóides, tiazídicos), infecções
(citomegalovírus, rubéola congênita), formas imunológicas incomuns (anticorpos
contra receptores da insulina), outras síndromes genéticas (síndrome de Down,
Turner, Prader Willi); e o diabetes gestacional (MARASCHIN, et al., 2010).
O diagnóstico mais frequente de diabetes é do tipo 1 e 2. O diabetes tipo 1, é
causado por uma deficiência absoluta da secreção de insulina. O diabetes tipo 2 é
mais prevalente e é causado por uma combinação da resistência à ação da insulina e
uma resposta inadequada na secreção de insulina. Nesta última categoria, a
hiperglicemia pode causar alterações patológicas e funcionais em vários tecidos-alvo,
porém a ausência de sintomas clínicos pode ser ausente por um longo período que
antecede o diagnóstico do diabetes. (ADA, 2009). Os termos “dependente de insulina”
e “não dependente de insulina” anteriormente atribuídos respectivamente aos dois
tipos mais frequentes de diabetes foram eliminados (GROSS et al., 2001).
A Academia Americana de Diabetes (2014) indica para o diagnóstico do
diabetes três exames laboratoriais sendo eles:
16
O teste oral de tolerância à glicose (também conhecido como curva glicêmica),
onde se verifica os níveis de glicose no sangue antes e 2 horas após ingerir uma carga
equivalente a 75 g de glicose anidra dissolvida em água. Este teste informa ao
profissional como o organismo processa a glicose. Indica-se diabetes em valores
iguais ou maiores que 200mg/dl;
Glicose plasmática em jejum, verificando os níveis de glicose no sangue após
jejum de pelo menos 8 horas antes do exame, geralmente sendo feito pela manhã,
antes do café. Possui valores de referência maiores ou iguais a 126mg/dL para
diabetes;
HbA1c, que mede a glicemia média dos últimos 2 a 3 meses. Algumas
vantagens de ser diagnosticado por este teste são não ser necessário jejum ou ingerir
a carga de glicose. O valor de referência para diagnóstico do diabetes é 6,5% ou mais.
Em 1997 e 2003, o Comitê de Peritos em Diagnóstico e Classificação da
Diabetes Mellitus reconheceu um grupo intermediário de indivíduos cujos níveis de
glicose não satisfazem os critérios para diabetes, porém são mais elevados do que
aqueles considerados normais. Estes indivíduos têm sido referidos como portadores
de pré-diabetes, indicando o risco relativamente elevado para a futuro
desenvolvimento do diabetes (ADA, 2014).
A Academia Americana de Diabetes (2014) indica os seguintes valores de
referência para que seja diagnosticado pré-diabetes: 100mg/dl à 125mg/dL para
glicose plasmática em jejum; 140mg/dL à 199mg/dl para o teste oral de tolerância à
glicose e valores entre 5.7–6.4% para os níveis de HbA1c. Estudos demonstram que
é possível diminuir significativamente a incidência de novos casos de diabetes através
de medidas de intervenção como a realização de exercício físico e redução de peso
em pacientes com alterações da homeostase glicêmica ainda não classificadas como
diabetes propriamente dito (GROSS et al., 2001).
2.2 RELAÇÃO BIDIRECIONAL ENTRE DOENÇA PERIODONTAL E
DIABETES MELITO
A doença periodontal e o diabetes melito apresentam associação bidirecional na
qual o diabetes favorece o desenvolvimento da doença periodontal e esta, quando
não tratada, piora o controle metabólico do diabetes (WEHBA, 2004). Diversos fatores
17
associados ao DM podem influenciar a progressão e extensão da doença periodontal:
tipo de diabetes, idade do paciente, maior duração da doença e controle metabólico
inadequado (WEHBA, 2004; MARIN, 2002).
As alterações do tecido conjuntivo e vascular prejudicam a cicatrização dos
tecidos normais, propiciando o desenvolvimento de doença periodontal (ALVES, et al.,
2007). Em tecidos como nervos, cristalino, rins e vasos sanguíneos, a hiperglicemia
resulta em aumento intracelular de glicose, que é então metabolizada pela aldose-
redutase, sendo reduzida a sorbitol (um tipo de poliol) e depois a frutose
(CRAWFORD, et al., 2000). Os níveis acumulados de sorbitol e frutose provocam
aumento da osmolaridade intracelular e influxo de água e, por fim, lesão celular
osmótica. Os níveis elevados de sorbitol associados a outros mecanismos como
glicação não enzimática, lesão oxidativa e formação de imunocomplexos são alguns
dos processos patogênicos desencadeadores da microangiopatia, hipoxia tecidual e
vasodilatação, que levam à agressão dos tecidos periodontais (LUGHETTI, et al.,
1999).
Simultaneamente, a infecção periodontal, condicionada por células fagocitárias
como monócitos, pode induzir a um estado crônico de resistência à insulina,
contribuindo para o ciclo de hiperglicemia. O acúmulo dos AGEs aumenta a trilha
clássica da destruição tecidual, resultando em doença periodontal mais grave e em
maior dificuldade de controlar a glicemia do diabético (SOUTHERLAND, et al., 2000).
Quanto a microbiota periodontal em pacientes portadores de DM ou
normogligêmicos, Lalla et al. (2006) afirma que a medida que o estado periodontal
clínico é por si só um determinante significativo sobre a esta, é difícil interpretar se as
diferenças qualitativas e quantitativas na microbiota periodontal são devidas ao
Diabetes, por si só, ou simplesmente por refletir a maior extensão e severidade da
periodontite em diabéticos. HERRING (2006) discute que a microbiota periodontal em
indivíduos com DM apresenta-se similar aos não-diabéticos, composta de bactérias
gram-negativas anaeróbicas como Actinobacillus, Bacteróides e Porphyromonas
(HERRING, 2006). Lalla et al. (2006) ainda diz que os resultados conflitantes
encontrados na literatura ao estabelecer quaisquer diferenças nos perfis de infecção
entre pacientes diabéticos e normoglicêmicos, não condena o conceito do Diabetes
como um importante fator de risco para doença periodontal, entretanto sugere que é
a resposta do hospedeiro que leva essencialmente à maior susceptibilidade a doença
periodontal em indivíduos diabéticos.
18
2.3 INTERAÇÃO AGE-RAGE
Os níveis elevados de glicose no sangue podem induzir a geração de produtos
finais da glicosilação avançada (AGEs), em grande parte irreversíveis (BROWNLEE,
CERAMI, VLASSARA, 1988). Os AGEs acumulam-se nos tecidos e no plasma ao
longo dos anos, mas a taxa de acumulação é aumentada no diabetes, ocorrendo de
forma mais precoce e intensa, fato que tem sido associado à patogênese de
complicações vasculares e às células inflamatórias que caracterizam esta desordem
(SCHMIDT et al., 1992).
O receptor para AGEs (RAGE) está expresso na superfície de vários tipos
celulares, como as células endoteliais, macrófagos e fibroblastos e cada tipo celular
apresenta uma resposta diferente, mas todas alteram a resposta inflamatória e
cicatricial normal do hospedeiro (PEPPA & VLASSARA, 2005). A interação dos AGEs
com RAGE nas superfícies celulares amplificam suas respostas inflamatórias frente
ao desafio microbiano, como ocorre na doença periodontal e outras doenças crônicas.
Ao se ligar ao seu receptor na célula, os AGEs alteram o metabolismo celular,
causando liberação de radicais de oxigênio, induzindo o chamado estado de estresse
oxidativo celular, responsável, em parte, por injúrias vasculares e também pelo
aumento da expressão da molécula de adesão vascular (VCAM-1), capaz de agregar
monócitos na parede endotelial, aumentando a chance de formação de trombos e
aterosclerose (SCHMIDT et al., 1995). Ocorre também aumento na produção de
citocinas como IL-1, IL-6 e TNF-α, além de enzimas como as MMPs
(metaloproteinases de matriz). Essas substâncias estimulam a transformação do
colágeno em compostos menos solúveis, mais resistentes à ação de enzimas e menos
flexíveis, o que contribui para a dificuldade de cicatrização encontrada em pacientes
diabéticos. Elas também ativam osteoclastos e colagenases, conduzindo à destruição
do osso e tecido conjuntivo, aumentando a progressão e severidade da doença
periodontal (GREGHI, 2002).
Lalla et al. (1998), criaram um modelo animal onde foram induzidos diabetes e
doença periodontal em ratos, e perceberam que ratos diabéticos apresentavam uma
aceleração da doença periodontal, maior acumulação de AGEs e maior expressão de
RAGE nas células inflamatórias. Os autores afirmaram que o aumento de AGE e
19
RAGE no tecido gengival é potencialmente um mecanismo de maior destruição
periodontal em diabéticos. Os macrófagos, portanto, sofrem estímulo na migração
para locais onde há aumento de AGEs, imobilizam-se nesses locais e podem interagir
com o AGE disponível, através do RAGE. Essa interação provoca distúrbios
intracelulares, levando a um aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias (IL-
1α, IL-6, TNF-α), além de alterar a capacidade dos macrófagos de realizar renovação
tecidual (LALLA et al., 1998; WEHBA et al., 2004).
A formação dos AGEs está relacionada ao tempo em que o organismo ficou
exposto à hiperglicemia. Portanto, quanto maior a duração do diabetes e pior o
controle glicêmico, maior será a quantidade desses produtos circulando e acumulados
nos tecidos periodontais (SOUTHERLAND, et al., 2000). O controle da glicemia
provavelmente é uma das poucas, se não a única, maneira de reduzir a formação dos
AGEs (RIVAS, 1999).
Stanko & Holla, (2014) afirmaram que o periodonto difere de outros tecidos e
órgãos, pois sofre agressão constante do biofilme dental. O diabetes resulta em
mudanças na função imunológica das células, incluindo neutrófilos, monócitos e
macrófagos. Aderência de neutrófilos, a quimiotaxia e fagocitose é muitas vezes
prejudicada, permitindo que as bactérias persistam nas bolsas periodontais,
aumentando significativamente a destruição periodontal. Além disso, os diabéticos
têm aumento de apoptose, a qual está associada com a prolongada cicatrização da
ferida. Ainda afirmam que monócitos e macrófagos podem ter um grau de capacidade
de resposta anormal para antígenos bacterianos em diabéticos, resultando em
significativo aumento na produção de citocinas pró - inflamatórias e mediadores. Estas
alterações de defesa do hospedeiro e os níveis aumentados de mediadores pró-
inflamatórios em diabéticos resultam no aumento da inflamação periodontal, e
também contribui para o pobre controle metabólico do diabetes, explicando, assim,
em parte, a relação bidirecional destas duas doenças.
2.4 RESPOSTA IMUNOLÓGICA
A resposta imunológica primária na periodontite ocorre após a colonização do
sulco gengival por patógenos periodontais. Os periodontopatógenos estimulam,
dentre outros mediadores inflamatórios, a produção de citocinas e quimiocinas pelo
20
epitélio gengival, que resulta na expressão de moléculas de adesão, aumento na
permeabilidade dos capilares gengivais e quimiotaxia de neutrófilos do epitélio
juncional para o sulco gengival. Esta resposta inicial, com a produção de citocinas e
quimiocinas específicas, promove a migração de um infiltrado inflamatório composto
por células T perivasculares e monócitos para o tecido conjuntivo. Caso a resposta
imunológica celular não consiga controlar a infecção, ocorre o recrutamento de células
B que se diferenciam em plasmócitos (FORD, GAMONAL e SEYMOUR, 2010).
As células B e os plasmócitos produzem e secretam imunoglobulinas, as quais
protegem o hospedeiro conferindo resistência bacteriana, inativando suas toxinas e
atuando como opsoninas a fim de facilitar a fagocitose pelos neutrófilos. Os anticorpos
podem regular positivamente a resposta imune. Se o resultado da diferenciação das
células B é a produção de anticorpos protetores, ocorre a eliminação do agente
causador e a doença periodontal não progride. A produção de anticorpos não
protetores poderia, então, resultar no colapso do tecido periodontal (GEMMELL e
SEYMOUR, 2004).
Gemmel e Seymour (2004), relataram que a resposta imune à infecção é
regulada por um balanço entre as citocinas geradas pelas respostas Th1 e Th2. As
citocinas da resposta Th1 aumentam a resposta mediada por célula, enquanto as
geradas pela resposta Th2 suprimem a resposta mediada por célula e aumentam a
resistência associada à imunidade humoral.
Estudos definiram também uma linhagem de células T efetoras, caracterizada
como uma subpopulação produtora de IL-17, nomeada como Th17, que desenvolve
sinais distintos, antagonizados pelos produtos da Th1 e Th2. (WEAVER et al., 2006).
Segundo Korn et al. (2007) a expansão e manutenção das células Th17, é controlada
pela interleucina-23 (IL-23), que aumenta a resposta Th1.
O reconhecimento desta subpopulação foi associado a funções distintas
executadas pelas células Th17, como a eliminação de patógenos que não foram
adequadamente exterminados pelas respostas Th1 e Th2. Observa-se também sua
associação com doenças inflamatórias crônicas e autoimunes (FARRAR, ASNAGLI,
MURPHY, 2002), sendo também encontrados níveis elevados de IL-17 no fluido
gengival de pacientes com periodontite (VERNAL et al., 2005)
A IL-17 é um regulador imunológico produzido por células T nos locais de
inflamação. A desregulação da IL-17 promove a osteoclastogênese por aumentar a
expressão de RANKL (ligante do receptor do NF-kB) em osteoblastos e células T CD4
21
+ estando associada com a perda óssea. Também contribui para a inflamação local,
recrutamento e ativando células imunes, que conduz ao aumento de citocinas
inflamatórias, tais como IL-1β e TNF-α, e RANKL (WEAVER et al., 2006).
2.6 INTERLEUCINAS Citocinas são moléculas protéicas, glicosiladas ou não, que enviam diversos
sinais estimulatórios, modulatórios ou mesmo inibitórios para as diferentes células do
sistema imunológico. Têm função autócrina agindo na própria célula produtora,
parácrina atuando em células próximas e endócrina quando sua ação é à distância
(VARELLA e FORTE, 2001). Como não é possível classificar as citocinas quanto à
célula de origem ou quanto à função biológica, elas foram agrupadas em interleucinas
(numeradas sequencialmente de IL-1 a IL-35), fatores de necrose tumoral (TNF),
quimiocinas (citocinas quimiotáticas), interferons (IFN) e fatores de crescimento
mesenquimal (SOMMER e WHITE, 2010).
2.6.1 Fator de Necrose Tumoral- α (TNF- α)
TNF-α é sintetizado principalmente por macrófagos, sendo que monócitos,
neutrófilos, células T e NK, após estimulação por lipopolissacarídeos, também o
sintetizam (TRACEY e CERAMI, 1993). Tal citocina exerce um papel na ativação dos
osteoclastos e estimula a reabsorção óssea. Ela também auxilia os leucócitos em sua
capacidade de adesão às células endoteliais, aumenta a sua capacidade de
fagocitose e a sua quimiotaxia (UEDA et al., 1995, TANI-ISHII et al., 1995, WANG et
al., 1997).
Para BOSTROM et al., 1998, o TNF-α está fortemente envolvido na patogênese
da doença periodontal como mediador da destruição tecidual. O TNF-α exerce efeitos
indiretos, destacando-se o estímulo à produção local de prostaglandina, além da
indução para a secreção de metaloproteinases, as quais realizam a dissolução da
matriz orgânica secretada pelo osteoblasto, resultando, também, em perda óssea
local (TANI-ISHII et al., 1995, WANG et al., 1997).
22
2.6.2 Interleucina- 6 (IL-6)
A IL-6 estimula a produção de imunoglobulinas pelos plasmócitos, sendo
secretada pelas células Th, monócitos, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais.
Nos sítios de inflamação gengival, ocorre aumento desta citocina, a qual desempenha
importante papel na reabsorção óssea (LINDHE, 1999). Esta interleucina influencia
na resposta imune específica e reações inflamatórias, sendo um dos maiores
mediadores da fase aguda da inflamação (HEINRICH, CASTELL, ANDUS, 1990).
Sabe-se que os sítios inflamatórios da periodontite apresentam níveis mais elevados
de IL-6, quando comparados àqueles da gengivite (YAMAZAKI et al., 1994).
Duarte et al. (2007), Venza et al. (2010) em suas pesquisas com biópsia
gengival encontraram níveis aumentados de IL-6 e TNF-α no tecido periodontal dos
grupos DM. Mesmo resultado encontrado por Kardesler et al. (2011), que após estudo
com fluido gengival sugeriram que as melhorias clínicas menos aparentes nos
pacientes diabéticos portadores de periodontite crônica antes de receber o tratamento
periodontal e três meses após, estão relacionadas aos maiores níveis de IL-6 e TNF-
α encontrados no fluido gengival.
2.6.3 Interleucina- 1b (IL-1b)
Monócitos e macrófagos são a principal fonte de IL-1, produzindo
principalmente IL-1b, enquanto os queratinócitos produzem IL-1a. Outros tipos
celulares podem produzir IL-1, como células endoteliais, fibroblastos, miócitos, células
de Langerhans e linfócitos B e T (DINARELLO, 1989).
A IL-1b exerce importante papel na atividade ósseo-reabsortiva na doença
periodontal, tendo sua atividade influenciada, porém, por outros fatores. São
encontrados níveis elevados desta citocina em pacientes portadores de doença
periodontal e artrite reumatóide, quando comparados a pacientes isentos destas
condições, nos estudos de Havemose-poulsen et al. (2005).
Pesquisas desenvolvidas por Holmlund et al. (2004), os quais avaliaram os
níveis destas citocinas no fluido gengival em pacientes portadores de doença
periodontal antes e depois do tratamento, encontraram níveis significativamente mais
baixos destas após a realização do tratamento periodontal.
23
Nos estudos de Cutler et al. (1999), com amostras de sangue periférico, tecido
gengival e fluido gengival de pacientes sistemicamente e periodontalmente saudáveis;
com doença periodontal; com bom controle do diabetes tipo 2 e doença periodontal;
com pobre controle do diabetes tipo 2 e saúde periodontal e pobre controle do diabetes
tipo 2 e doença periodontal, foi observado aumento de IL-1b no fluido gengival de
pacientes com doença periodontal independentemente do estado do diabetes, mas tal
diferença não foi encontrada na análise do tecido gengival.
2.6.4 Interleucina- 10 (IL-10)
A IL-10 é produzida principalmente por células CD8+ ativadas. Células Th1,
Th2 ativadas, linfócitos B, mastócitos e monócitos ativados por LPS
(lipopolissacarídeos) também podem produzir IL-10, consideradas fontes menos
importantes, sendo sua síntese inibida pela IL-4 e pela própria IL-10 (BENJAMIN,
KNOBLOK, DAYTON, 1992). Esta interleucina inibe as citocinas pró-inflamatórias,
principalmente TNF, IL-1 e IL-6, produzidas por macrófagos e monócitos ativados,
estimulando a produção endógena de citocinas anti-inflamatórias (ZHANG e AN,
2007).
Duarte et al, (2007) em sua pesquisa com biópsia gengival de pacientes
sistemicamente e periodontalmente saudáveis; sistemicamente saudáveis com
doença periodontal e pacientes diabéticos com doença periodontal que apresentavam
pobre ou bom controle glicêmico, encontraram menores níveis de IL-10 no tecido
periodontal de pacientes diabéticos, quando comparado à pacientes portadores de
doença periodontal sem apresentar diabetes. Os autores sugerem que o diabetes
resultou em níveis diminuídos do mRNA da IL-10 (anti-inflamatória) nos tecidos
gengivais, e tal influência pode desempenhar um papel crítico na destruição
periodontal modulada pelo diabetes melito. Mais tarde, Duarte et al. (2012), em
pesquisa semelhante com biópsia gengival não observou diferença na quantificação
de IL-10 entre os grupos.
2.6.5 Fator Nuclear- kB (NF-kb)
24
Alguns reguladores são essenciais para remodelação óssea, como também
para o desenvolvimento e ativação dos osteoclastos. Entre eles está o RANKL (ligante
do receptor do NF-kB), RANK (receptor ativador do NF-kB) e OPG (osteoprotegrina)
(THEILL, BOYLE E PENNINGER, 2002). RANKL é expresso por osteoblastos e por
outros tipos celulares, incluindo fibroblastos e linfócitos T e B. Em condições
patológicas, tais como a que ocorre na periodontite, a produção desta citocina é
desregulada, devido ao aumento de lipopolissacárido (LPS) e citocinas inflamatórias,
tais como IL-1, IL-6, que são conhecidos por induzir a produção de prostaglandina –
E2 (PGE2) por osteoblastos, esta PGE2 estimula a expressão de RANKL, levando à
diferenciação de osteoclastos (MATSUMOTO et al., 2012).
O receptor para RANKL é o RANK, expresso na superfície de células
hematopoiéticas progenitoras de osteoclastos, osteoclastos maduros e condrócitos.
In vitro, a ligação de RANK com RANKL resulta em osteoclastogêse a partir de células
progenitoras e na ativação dos osteoclastos maduros (HSU et al., 1999). OPG é uma
citocina que pertence à família do TNF e é produzida por osteoblastos e células do
estroma da medula óssea, sendo capaz de inibir a osteoclastogênese por competir
com RANK para se ligar a RANKL (TAKAYANAGI, 2005).
Em condições saudáveis, a OPG produzida se liga ao RANKL, inibindo a
formação de osteoclastos, evitando assim a reabsorção óssea. Durante a periodontite,
esta produção diminui e a proporção de OPG em relação ao RANKL fica maior
(CROTTI et al., 2003). Fato também observado em estudos, que indicam que RANKL
aumenta, enquanto OPG diminui na periodontite (COCHRAN, 2008). Dessa forma,
RANKL e OPG regulam a reabsorção óssea exercendo um controle positivo ou
negativo sobre a ativação do RANK presente nos osteoclastos (TAKAYANAGI, 2005).
Vernal et al., (2004), em sua pesquisa com fluido gengival concluiu com seus
resultados que a quantidade total de RANKL é significativamente aumentada na
doença periodontal, justificando seu papel na perda óssea desenvolvida nesta
doença, sendo a presença da DP o fator que aumenta sua expressão. A presença ou
ausência de Diabetes Melito não é determinante para expressão aumentada ou
diminuída do Ligante do receptor ativador do Fator Nuclear kB (RANKL) e sim a
presença ou ausência da DP.
Duarte et al., (2012), em seus estudos com tecido gengival de pacientes
sistemicamente e periodontalmente saudáveis; sistemicamente sudáveis com doença
periodontal; com pobre ou bom controle do diabetes melito e doença periodontal,
25
observaram que os grupo com doença periodontal apresentaram aumento na
expressão de RANKL e discutiram que o DM não afetou a expressão do Ligante do
receptor ativador do Fator Nuclear kB (RANKL).
26
3 METODOLOGIA
3.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES
Foram selecionados 17 pacientes, sendo, 04 pacientes com doença periodontal
modificada por fator sistêmico diabetes melito (DM) e 13 pacientes com doença
periodontal sem alterações sistêmicas (DP) que passaram pelo processo seletivo de
triagem na Área de Periodontia do Departamento de Odontologia Universidade
Federal Fluminense. Todos os voluntários foram submetidos a exame clínico para a
identificação da presença doença periodontal crônica em dentes com exodontia
indicada em pacientes com ou sem diabetes melito, sendo essa última condição única
de modificação da resposta periodontal frente ao biofilme dental bacteriano.
Foram excluídos desse estudo indivíduos que durante o exame clínico e de
anamnese apresentaram qualquer evidência de fatores modificadores sistêmicos da
doença periodontal que não seja o diabetes melito e que, portanto, possam interferir
diretamente na conclusão do trabalho (viés). Os fatores descritos na literatura incluem:
tabagismo, osteoporose tipos I e II, alcoolismo, imunossupressão adquirida ou
induzida, qualquer alteração descrita na literatura como potencial modificador do perfil
da doença periodontal, medicamentos que influenciam os tecidos periodontais.
Também amostras de mulheres grávidas ou lactantes, indivíduos que tenham tomado
antibióticos nos últimos 6 meses, manifestações clínicas de candidose bucal,
antiinflamatórios ou terapia hormonal de reposição hormonal, e/ou que tenham
recebido tratamento periodontal nos últimos seis meses anteriores ao procedimento.
27
Todos os voluntários foram obtidos do banco de dados da Clínica Odontológica da
Universidade Federal Fluminense – Campus Universitário de Nova Friburgo,
convidados a participar do estudo e assinaram o termo de consentimento
concordando com a sua participação na pesquisa após explicação do pesquisador
dos detalhes da pesquisa. Os voluntários desta pesquisa foram estritamente tratados
de acordo com a resolução CNS Nº 441/11 aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal Fluminense (CAAE 33417414.0.0000.5626)
(Anexo A).
3.2 EXAMES CLÍNICO E LABORATORIAL
Os pacientes foram submetidos à verificação dos parâmetros clínicos e
laboratoriais, sendo inicialmente encaminhados ao Hospital Raul Sertã para coleta de
amostra sanguínea para a verificação de glicemia em jejum e hemoglobina glicada
(HbA1c).
Posteriormente foi realizado exame clínico para verificar a história médico-dental
e aferir os parâmetros clínicos periodontais com auxílio de uma sonda periodontal
PCP-15 (Trinity®, Brasil). Os dados obtidos foram transferidos para uma ficha (Anexo
B) que continham o nome, idade, sexo, raça, sangramento à sondagem (SS),
recessão gengival (RG), nível de inserção clínica (NIC), profundidade de sondagem
(PS) nas faces: vestibular, disto-vestibular, mésio-vestibular, palatina/lingual, disto-
palatina/lingual, mésio-palatina/lingual do dente indicado à exodontia por motivos
periodontais.
A seguir foram calculadas as médias dos valores obtidos para cada avaliação
periodontal e transferidas para uma tabela juntamente às outras informações. Os
nomes dos pacientes foram substituídos por códigos de acordo com o grupo em que
se colocavam (DM ou DP) e com a ordem das fichas (1,2,3,4...).
3.3 COLETA DAS AMOSTRAS
A coleta das amostras foi realizada durante procedimentos cirúrgicos na clínica
de Periodontia Avançada, na Clínica Odontológica da Faculdade de Odontologia da
28
Universidade Federal Fluminense/ Campus Universitário de Nova Friburgo. Os dentes
com exodontia indicada selecionados para o estudo, receberam bloqueio regional com
Alphacaine ® (Lidocaína com Epinefrina 1:100.000 – DFL, Brasil, Rio de Janeiro, RJ),
sendo coletado antes da extração por meio de técnica convencional de exodontia,
1mm de gengiva marginal ao redor do elemento dental, por meio de retalho de
Widman Modificado.
Foi administrado Paracetamol 750mg de 6 em 6 horas por 48 horas para
controle da dor. Após 7 dias da cirurgia, cada paciente retornou para remoção de
sutura e avaliação do pós-operatório. O tecido gengival coletado foi armazenado em
RNA ladder® (Ambion, Austin, TX, EUA), meio que conserva as características do
RNA viáveis para análise, sendo imediatamente congelado a -800C a fim de
posteriormente dar continuidade aos procedimentos laboratoriais.
3.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
3.4.1 Extração do RNA
O mRNA das amostras foi extraído utilizando o reagente TRIzol® de acordo com
as especificações do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), que aprimorou o
inicialmente proposto por Chomczynski & Sacchi (1987):
Homogeneização das amostras
As amostras de tecido foram maceradas em um eppendorf juntamente com 0,5 mL de
TRIzol®, sendo acrescentado em duas vezes, ocorrendo uma homogeneização entre
elas.
Separação das fases
1. As amostras homogeneizadas foram incubadas durante 5 minutos à
temperatura ambiente para permitir a dissociação completa do complexo de
nucleoproteína.
2. Foi adicionado 0,1 mL de clorofórmio aos eppendorfs os quais foram fechados
com segurança e agitados vigorosamente à mão por 15 segundos.
29
3. Posteriormente foram incubados durante 2-3 minutos à temperatura ambiente,
sendo centrifugados a 12000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
4. A mistura separa-se numa fase mais baixa vermelha de fenol-clorofórmio, uma
interfase, e uma fase aquosa superior incolor. O mRNA permanece
exclusivamente na fase aquosa, que é pipetada, inclinando o tubo a 45°.
5. A fase aquosa de cada amostra foi transferida para um novo eppendorf.
Precipitação do RNA
1. Foi adicionado 0,25 mL de isopropanol 100% e incubado à temperatura
ambiente durante 10 minutos.
2. As amostras foram centrifugadas a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
Lavagem do RNA
1. O sobrenadante do eppendorf foi removido, deixando apenas o sedimento de
mRNA o qual foi lavado com 0,5 mL de etanol a 75%.
2. As amostras foram agidadas brevemente e em seguida, centrifugadas à 7500
x g durante 7 minutos a 4 °C, descartando a lavagem.
3. O pellet de mRNA foi seco por 5-10 minutos com o eppendorf aberto sobre a
bancada.
Ressuspensão do RNA
1. O Pellet do mRNA foi ressuspenso em água livre de RNase (água milli-Q),
passando a solução para cima e para baixo várias vezes, através de uma ponta
de pipeta.
3.4.2 Quantificação do RNA A quantificação do mRNA foi realizada utilizando o Qubit® 2.0 Fluorometer,
seguindo as especificações do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), com o
intuito de verificar se a concentração do mRNA obtido seria viável para a continuação
das etapas.
30
3.4.3 Produção de cDNA a partir do RNA Como a molécula de mRNA é instável para trabalhar de forma segura é necessário
transformá-la em cDNA ou seja o DNA complementar ao RNA original. Após essa
transformação seremos capazes de fazer análises mais especificas desta molécula e
assim interpretar as mudanças que ocorreram na célula. Foi utilizado o kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription de acordo com as especificações do fabricante
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
3.4.4 Real-Time Polymerase Chain Reaction – (RT-PCR)
A Reação de RT- PCR foi realizada no aparelho Eco Real-Time PCR (Illumina Inc.
San Diego, CA, EUA) utilizando os primers dos genes de interesse (GAPDH, HPRT,
IL-1b, IL-10, IL-6, NFKB1, TNF-α) apresentados na tabela 1, utilizando o sistema
SYBR Green Kit (ROCHE Diagnostic Co, Warrington- Reino Unido).
Os valores da expressão gênica foram corrigidos pelos valores dos genes HPRT
e GAPDH utilizados como controles endógenos (LIVAK e SCHMITTGEN, 2001). As
analises foram realizadas em triplicatas.
Tabela 1: Sequência de primer para cada gene.
GENE SEQUENCIA (5’ -3’)
GAPDH TCGGAGTCAACGGATTTGGTC
TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC
HPRT ATCCAAAGATGGTCAAGGTCG
GTATTCATTATAGTCAAGGGCATA
IL-1b TGCACCTGTACGATCACTGAAC
TTGTACAAAGGACATGGAGAACAC
IL-10 CTGCCTAACATGCTTCGAGA
TGGCAACCCAGGTAACCCTTA
IL-6 GATTCAATGAGGAGACTTGCC
TGTTCTGGAGGTACTCTAGGTA
NFKB1 AGAACAACCTGCAGCAGACT
31
TAGACACGTGTGGCCATTG
TNF-α AGCCTGTAGCCCATGTTGTAG
CTCTCAGCTCCACGCCATTG
*Todos os genes amplificam fragmentos menores do que 120 pb (pares de base). 3.4.5 Análises estatísticas
Foi realizado o teste de normalidade Shapiro-Wilk para todas as variáveis do
estudo. O teste selecionado foi o não paramétrico Kruskal Wallis considerando o nível
de significância de 5%. Após foi realizada estatística descritiva para obtenção dos
valores medianos. Todos os testes utilizaram o programa Statistix 10 (Versão Free
Trial, Tallahassee, FL, EUA)
32
4 RESULTADOS
Ao final do processamento laboratorial 10 amostras (6 do grupo DP e 4 do grupo
DM) apresentaram resultados satisfatórios e foram consideradas para o estudo.
Estando eles descritos a seguir:
A distribuição da frequência para variável idade no grupo DP foi de 16,66% na
faixa etária entre 20 e 30 anos, 33,33% entre 40 e 50 anos, 33,33% entre 50 e 60 anos
e 16,66% entre 60 e 70 anos. O grupo DM apresentou 25% da faixa etária de entre
40 e 50 anos, 25% entre 50 e 60 anos e 50% entre 60 e 70 anos.
Em relação ao sexo, o grupo DP apresentou 66,66% sexo feminino e 33,33% sexo
masculino. O grupo DM, 25% sexo feminino e 75% sexo masculino.
A distribuição da frequência para variável raça no grupo DP foi de 50% brancos,
33,33% pardos e 16,66% amarelos. No grupo DM, 75% brancos e 25% negros.
Em relação aos exames hematológicos solicitados aos pacientes, esses
apresentaram diferença estatisticamente significante (p<0,05 – Kruskal Wallis test)
entre eles, onde o grupo DM apresentou maiores índices, como demonstrado no
gráfico 1.
33
Gráfico 1: Avaliação da glicemia em jejum (G) e hemoglobina glicada (HbA1c) para os grupos
DP e DM. (*) Diferença estatisticamente significante entre os grupos DP e DM (p<0,05 –
Kruskal Wallis test).
Os dados clínicos obtidos através de exame clínico periodontal não
apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos DP e DM
(p>0,05 – Kruskal Wallis test)) e estão representados nos gráficos 2 e 3:
Gráfico 2: Avaliação do índice de Placa (IP) e Sangramento a sondagem (SS) para os grupos
DP e DM. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05 –
Kruskal Wallis test).
*
*
0
20
40
60
80
100
120
IP SS
%
DP DM
0
20
40
60
80
100
120
140
G HbA1c
mg/
dl
DP DM
*
*
34
Gráfico 3: Avaliação dos parâmetros clínicos periodontais; Profundidade de sondagem
(Psond), recessão gengival (RG) e Nível Clínico de Inserção (NIC) para os grupos DP e DM.
Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05 – Kruskal Wallis
test).
Os resultados encontrados após a dosagem de citocinas para as amostras
coletadas dos pacientes do grupo DP e DM estão demostrados no gráfico 4.
Gráfico 4: Avaliação da expressão de citocinas (IL-1b, IL-6, 1L-10, TNF-α, NFkB) nos tecidos
periodontais dos grupos DP e DM. Não houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos DP e DM (p>0,05 – Kruskal Wallis test).
0
1
2
3
4
5
6
7
Psond RG NIC
mm
DP DM
0
0.5
1
1.5
2
2.5
IL1β IL6 IL10 TNF-α NFkB
mg/
dl
DP DM
IL1b
35
5 DISCUSSÃO
Esse estudo avaliou a dosagem das citocinas IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-α, NF-kB no
tecido periodontal de pacientes portadores de Doença Periodontal com e sem
alteração sistêmica Diabetes Melito. Em geral os resultados demonstraram que não
houve diferença estatisticamente significante na expressão dessas citocinas nos dois
grupos avaliados.
Os exames laboratoriais comprovaram a diferença entre DP e DM (p<0,05 –
Kruskal Wallis test). Os resultados permitiram caracterizar os pacientes a fim de
agrupá-los da forma correta entre os grupos do estudo. Tendo em vista que o Diabetes
poderia influenciar a resposta na expressão gênica de citocinas no tecido periodontal
por desregular a resposta celular e humoral frente aos desafios microbianos, onde há
aumento da adesão das células do microrganismo para Diabéticos, além do fato de
alguns microrganismos tornarem-se mais virulentos em ambiente hiperglicêmico que
por sua vez, conduz a uma produção mais elevada de citocinas em repouso,
entretanto, posteriormente a estimulação da produção de citocinas é prejudicada
(GEERLINGS e HOEPELMAN, 1999).
Os resultados clínicos periodontais desse estudo, que não apresentou diferença
estatística (p>0,05 – Kruskal Wallis test) entre os grupos DP e DM nos parâmetros
Índice de Placa (IP), Sangramento a sondagem (SS), Profundidade de sondagem
(Psond), recessão gengival (RG) e Nível Clínico de Inserção (NIC), estão de acordo
com Lalla et al. (2006) que encontrou os mesmos resultados para Índice de Placa,
Sangramento a sondagem, Profundidade de sondagem e Nível Clínico de Inserção,
entre os grupos com Diabetes Melito e normoglicêmicos com condição periodontal
36
semelhante entre eles; Cruz et al. (2008), que não observaram diferença nos
parâmetros periodontais: Índice de Placa e Gengival, Profundidade de Sondagem,
Recessão Gengival e Nível Clínico de Inserção entre os grupos de diabéticos e
normoglicêmicos e Tervonen e Karjalainen (1997) que avaliaram 3 grupos de
diabéticos subdivididos considerando o controle metabólico e complicações
decorrentes do DM.
Porém discordam dos resultados de Aren et al. (2003), onde os grupos de crianças
diabéticas apresentaram maiores níveis de Índice de Placa, Sangramento a
Sondagem e Profundidade de Sondagem do que as crianças do grupo controle.
Campus et al. 2005 que observaram maior Profundidade de Sondagem, Sangramento
a Sondagem e Índice de Placa no grupo DM do que no grupo dos normoglicêmicos e
Guthmiler et al. (2001) também demonstraram maior Índice de Placa, Sangramento a
Sondagem, Profundidade de Sondagem, Recessão Gengival e Nível Clínico de
Inserção em pacientes gestantes portadoras de DM do que em gestantes saudáveis.
Quanto a dosagem das citocinas nos grupos avaliados neste estudo, Lalla et
al. (1998) afirmaram que o aumento de AGE e RAGE no tecido gengival é
potencialmente um mecanismo de maior destruição periodontal em diabéticos. A
interação dos AGEs com RAGE nas superfícies celulares amplificam suas respostas
inflamatórias frente ao desafio microbiano, como ocorre na doença periodontal e
outras doenças crônicas. Isso ocorre basicamente porque quando as células que
possuem os receptores são ativadas pelos AGEs, produzem maior quantidade de
citocinas como IL-1, IL-6 e TNF-α, além de enzimas como as MMPs
(metaloproteinases de matriz), responsáveis pela reabsorção óssea (GREGHI, 2002).
Dessa forma, em divergência do esperado para o grupo DM que seria maior
quantificação de IL-6 e TNF-α, esta pesquisa não encontrou diferença
estatisticamente significante entre os grupos DP e DM (p>0,05 – Kruskal Wallis test)
para a dosagem destas citocinas.
Entretanto, os dados desta pesquisa estão de acordo com os resultados de
Duarte et al. (2012) que apresentaram níveis semelhantes de IL-6 e TNF-α nos grupos
DP e DM, em concordância com os estudos de Cole et al. (2008) que não encontrou
diferença entre os grupos de pacientes com diabetes melito, pacientes saudáveis com
doença periodontal e pacientes totalmente saudáveis. Porém estes autores
encontraram maiores níveis de IL-6 para indivíduos com Diabetes Melito e doença
periodontal. Em discordância com as pesquisas anteriores estão os estudos de Duarte
37
et al. (2007), Venza et al. (2010) e Kardesler et al. (2011), que encontraram níveis
aumentados de IL-6 e TNF-α no tecido periodontal do grupo DM.
Para dosagem de IL-1b, não ocorreu diferença estatisticamente significante
entre os grupos DP e DM (p>0,05 – Kruskal Wallis test), resutado semelhante ao
encontrado por Cutler et al. (1999), que em seus estudos observaram aumento de IL-
1b no fluido gengival de pacientes com doença periodontal independentemente do
estado do diabetes, mas tal diferença não foi encontrada na análise do tecido
periodontal.
De acordo com a pesquisa de Duarte et al, (2012), estão os resultados da
quantificação de IL-10 em nosso estudo, onde não foi encontrada diferença
significativa entre os grupos (p>0,05 – Kruskal Wallis test). Porém em uma pesquisa
anterior Duarte et al, (2007) encontraram menores níveis de IL-10 no tecido
periodontal de pacientes diabéticos, quando comparado à pacientes portadores de
doença periodontal. Os autores sugerem que o diabetes resultou em níveis diminuídos
do mRNA da IL-10 (anti-inflamatória) nos tecidos gengivais, e tal influência pode
desempenhar um papel crítico na destruição periodontal modulada pelo diabetes
melito.
Os resultados para os níveis do Fator Nuclear KB - NF-Kb entre os grupos, foi
semelhante, não apresentando diferença estatisticamente significante (p>0,05 –
Kruskal Wallis test). Dado que se encontra de acordo com os estudos de Duarte et al.,
(2012), onde discutiram que o DM não afetou a expressão do Ligante do receptor
ativador do Fator Nuclear kB (RANKL). Sabe-se, como afirmado por Vernal et al.,
(2004), que a quantidade total de RANKL é significativamente aumentada na doença
periodontal, justificando seu papel na perda óssea desenvolvida nesta doença, sendo
a presença da DP o fator que aumenta sua expressão. A presença ou ausência de
Diabetes Melito não é determinante para expressão aumentada ou diminuída do
Ligante do receptor ativador do Fator Nuclear kB (RANKL) e sim a presença ou
ausência da DP, assunto discutido nesta sua pesquisa feita com fluido gengival.
Duarte et al. (2012), justificam que as discrepâncias de resultados encontradas
nos diferentes estudos, podem ser observadas devido as diferentes técnicas usadas
para a detecção dos mediadores e também outros fatores como tempo decorrido
desde a biopsia até a análise, duração e severidade da periodontite e DM, tipos de
tratamento do DM e história de tratamento da periodontite.
38
Com base nos dados apresentados, podemos concluir com esta pesquisa, que não
houve diferença estatisticamente significante na resposta imunológica nos tecidos
periodontais entre os grupos de pacientes portadores de doença periodontal (DP) e
pacientes portadores de doença periodontal modificado por fator sistêmico Diabetes
Melito (DM). Entretanto, apesar de não ter apresentado diferença entre os grupos, os
resultados devem ser vistos com cautela, devido ao número reduzido de amostras
avaliadas, sendo uma pretensão à continuidade dos estudos, aumentando o número
de amostras.
39
6 CONCLUSÃO
Não houve diferença entre grupos DP e DM em relação a expressão de citocinas
avaliadas nos tecidos periodontais. Esses resultados devem ser vistos com cautela,
devido ao número reduzido de amostras avaliadas.
40
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ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA
48
49
50
ANEXO B – FICHA CLÍNICA DOS PACIENTES
